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Biology

Um Ensaio de Ligação de Alto Rendimento II do MHC para análise quantitativa de Peptide Epitopes

Published: March 25, 2014 doi: 10.3791/51308
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Thayer School of Engineering, Dartmouth College, 2Institute for Immunology and Informatics, University of Rhode Island, 3Department of Computer Science, Dartmouth College

ERRATUM NOTICE

Summary

Ensaios bioquímicos com moléculas recombinantes humanos MHC II pode proporcionar rápidos, insights quantitativos em identificação epítopo imunogênico, exclusão ou design. Aqui, um ensaio de ligação ao péptido de MHC-II dimensionado para placas de 384 poços é descrito. Este formato de baixo custo deve ser útil nos campos da deimmunization proteína e design e desenvolvimento de vacinas.

Abstract

Ensaios bioquímicos com moléculas recombinantes humanos MHC II pode proporcionar rápidos, insights quantitativos em identificação epítopo imunogênico, exclusão ou desenho 1,2. Aqui, um ensaio de ligação ao péptido de MHC-II é dimensionado para o formato de 384 poços. O protocolo reduzida reduz o custo dos reagentes de 75% e é mais elevado do que o rendimento descrito anteriormente protocolos de 96 poços 1,3-5. Especificamente, o delineamento experimental permite uma análise robusta e reprodutível de até 15 péptidos contra um alelo de MHC II por 384 poços de placas de ELISA. Utilizando uma única manipulação robô líquido, este método permite que um investigador para analisar aproximadamente noventa péptidos de teste, em triplicado, durante um intervalo de oito concentrações e quatro tipos de alelos do MHC II, em menos de 48 horas. Outros que trabalham nas áreas de deimmunization proteína ou projeto e desenvolvimento de vacinas pode achar o protocolo a ser útil para facilitar o seu próprio trabalho. Em particular, as instruções passo-a-passo eo formato visualde Jove deve permitir que outros usuários para estabelecer de forma rápida e facilmente esta metodologia em seus próprios laboratórios.

Introduction

As proteínas são a classe que mais cresce de agentes terapêuticos 6, e da rápida expansão de dutos bioterapêuticos tem se concentrado cada vez mais atenção sobre os desafios associados com o desenvolvimento e uso de drogas de proteína. Uma consideração única deriva do facto de que, em um sistema imunitário saudável e funcionamento, todas as proteínas extracelulares são recolhidos por células apresentadoras de antígenos (APCs). Uma vez internalizado por APCs, uma proteína é clivada em fragmentos de péptidos pequenos, e segmentos imunogénicas putativos são carregados para dentro da ranhura de classe II principais proteínas do complexo de histocompatibilidade (MHC II). Os complexos de péptido-MHC II são, então, exibidos na superfície da APC, e os verdadeiros péptidos imunogénicos, denominados epitopos de células T, receptores de células formar complexos ternários II do MHC-peptídeo T-CD4 com receptores da superfície celular cognato 7. Este evento crítico reconhecimento molecular inicia uma cascata de sinalização complexo, que resulta na activação de células T, a libertação de citocinas, a maturação de células B mediada por células T CD4 e, finalmente, a produção de anticorpos IgG circulantes que se ligam e limpar a proteína exógena ofensivo. Assim, as proteínas imunogénicas pode ser deimmunized por identificar epitopos de células T constituintes e mutando resíduos chave responsáveis ​​pela formação de complexos MHC II. Vale a pena notar, no entanto, que os epitopos de células T podem ser numerosas e amplamente distribuídos em todo proteínas imunogénicas, e a maioria das mutações-exclusão de epitopo são susceptíveis de provocar uma perda inadvertida da função da proteína ou estabilidade. Portanto, engenharia deimmunized bioterapias pode ser um objetivo complexo e tecnicamente difícil, mas existem vários exemplos de sucesso T epitopos de células projetos de eliminação 3,5,8-12. Ao contrário à base de enxerto de "humanização", o qual é restrita a terapêutica do anticorpo, epitopo deleção pode ser aplicado a essencialmente qualquer proteína alvo, independentemente da sequência, estrutura, função ou disponibilidade de homólogonos andaimes humanos. O primeiro passo para implementar tal abordagem é a identificação de epítopos peptídicos principais incorporados dentro da sequência da proteína alvo.

Alto rendimento ensaios bioquímicos, utilizando peptídeos sintéticos e moléculas recombinantes humanos MHC II pode proporcionar rápidas idéias preliminares para identificação e mitigação epítopo 1,3-5. Estes ensaios do tipo ELISA pode ser um poderoso complemento de outros design e desenvolvimento de ferramentas de proteína / vacinas. Por exemplo, uma bem estabelecida abordagem experimental para mapeamento de epítopos depende de tempo, trabalho e recursos intensivos ex vivo ensaios de proliferação celular 15. Resumidamente, a sequência primária de uma proteína-alvo é primeiramente dividido em um painel de péptidos que se sobrepõem, muitas vezes de 15-meros com 12 resíduos de sobreposição entre os péptidos adjacentes. O painel de péptidos quimicamente sintetizados e a imunogenicidade de cada peptídeo é testado em um de vários imunoensaios diferentes que empregam bloo periféricaAs células mononucleares de d (PBMC) isoladas a partir de dadores humanos 13,14. Para proporcionar uma maior confiança nos resultados, os peptídeos são normalmente testadas em replicar com PBMC de 50 ou mais doadores diferentes. Nos casos em que deimmunization é o objetivo final, o trabalho é agravado ainda mais pela necessidade de produzir painéis adicionais de peptídeos mutantes e testar os novos painéis de peptídeos em ensaios de PBMC antes de introduzir quaisquer mutações deimmunizing na proteína de comprimento total para a análise funcional posterior 10. Embora estes ensaios celulares continuam a ser o padrão-ouro para avaliar o potencial imunogênico em pacientes humanos, a eficiência de uma abordagem exaustiva pode ser melhorada através de pré-filtragem epítopos imunogênicos putativos usando uma rápida e alta taxa de transferência ensaio de ligação MHC II-peptídeo.

Da mesma forma, os ensaios de ligação bioquímicas péptido-MHC II pode ser combinado com métodos de previsão em silico para acelerar o processo de identificação radicalmente epitopo.Existem uma variedade de ferramentas computacionais para a predição epitopo de célula T; exemplos incluem ProPred 16, MHCPred 17, SVRMHC 18, ARB 19, SMM-alinhar 20, NetMHCIIpan 21, bem como ferramentas proprietárias, como EpiMatrix por EpiVax 22. Da mesma forma, os preditores de epítopos foram recentemente combinada com outras ferramentas de bioinformática e modelagem molecular para produzir algoritmos deimmunization proteína integrados projetados para reduzir o risco de que as mutações deimmunizing pode afectar a estrutura e função da proteína 23-26. Enquanto vários preditores epitopos têm provado ser razoavelmente precisa 27,28, resultados computacionais invariavelmente necessitam de validação experimental. Rápido, alto rendimento, e de baixo custo métodos experimentais são mais adequados como um filtro preliminar no previsões epítopos silico.

Na mesma linha, os preditores de epítopos pode dirigir seleção antígeno para vaccinolo reversagy 29,30. Por exemplo, os avanços em bioinformática produziram telas genoma inteiro que identifica rapidamente os candidatos de vacina sob a forma de proteínas inteiras ou epitopos peptídicos extraídos do proteoma dos agentes patogénicos. Embora esta tecnologia capacitadora está reformulando a descoberta e desenvolvimento de vacinas protetoras, introduz um novo desafio na forma de intratável grandes listas de candidatos a vacinas imunogênicas. Ensaios de ligação alta capacidade peptídeo-MHC II podem orientar a seleção epítopo quantificando afinidade de ligação de peptídeos e promiscuidade de ligação entre alelos múltiplos MHC II. Tal como acontece com deimmunization proteína, tais métodos experimentais são em última instância é necessária para validar previsão computacional de ligações vacina promissora.

Aqui, um ensaio de ligação ao péptido de MHC-II em escala para o formato de 384 poços é descrito. O protocolo é altamente paralelizado e reduz o custo dos reagentes por 75% em relação ao anteriormente descrito 96 cavidades formatos de placa 1,3-5. Usando um único liquid manuseamento robô, este método permite que um investigador para analisar facilmente aproximadamente noventa péptidos de teste, em triplicado, durante um intervalo de oito concentrações e quatro tipos de alelos do MHC II, em menos de 48 horas. Este artigo descreve a configuração de uma placa de 384 poços de ELISA para análise de sete péptidos experimentais contra um alelo de MHC II, mas calculadoras folha distribuídos são fornecidos como material suplementar, de modo a dimensionar facilmente o experimento de qualquer número de péptidos e / ou MHC desejadas moléculas II.

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Protocol

Quatro principais atividades compreendem o ensaio de ligação peptídeo-MHC II: 1-Encadernação: peptídeos de teste competir com peptídeos de controle marcados para a ligação fase de solução de proteínas MHC II solúveis. A ligação é medida ao longo de uma vasta gama de concentrações de péptidos de teste. 2-Captura: Após a reacção de ligação se aproxima do equilíbrio, complexos de péptido-MHC II são capturadas e separadas a partir do péptido não ligado e proteína de reconhecimento dependente da conformação com um anticorpo imobilizado. 3-Detecção: capturado péptido de controlo é quantitativamente detectados utilizando a fluorescência resolvida no tempo. 4-Análise: Os dados espectroscópicos são processados, traçados e analisados ​​para determinar as propriedades de ligação dependente da dose de péptido de teste e proteínas do MHC II.

Em vários passos no procedimento abaixo, a utilização de um robô de manipulação líquido é recomendada quando se está disponível. Particularmente em um formato de 384 poços, de distribuição automatizada e diluição de líquidos minimiza erros de utilizador, os resultados em maisconsistentes bem aos poços volumes, e produz mais estreitos intervalos de confiança de 95% para os valores de IC50 em comparação com ensaios manuais de 96 poços (dados não mostrados). Se um robô de manipulação de líquidos não estiver disponível, os passos anotados com "(líquido manipulação robô)" pode ser feito à mão. Do mesmo modo, se possível, um lavador automático de placas, que é compatível com o formato de 384 poços é recomendado. Isso efetivamente padroniza o processo de lavagem da placa. Se uma anilha de chapa não está disponível, as etapas anotados com "(placa de lavagem)" pode ser feito à mão.

1. Cubra a placa ELISA (Dia 1)

  1. Dilui-se anticorpo L243 estoque (0,5 mg / ml) em tampão borato a uma concentração de trabalho de 10 ug / ml.
    1. Para revestir uma única placa de 384 poços, adicione 200 mL de anticorpo estoque para 9,8 ml de tampão borato. (Veja calculadora planilha complementar para o dimensionamento alternativa).
  2. Adicionar 25 ul da solução do anticorpo L243 a cada poço de um 384-well alta de ligação placa ELISA branco. (Manipulação de líquidos robô)
  3. Selar a placa com uma película de poliéster e incubar durante a noite a 4 ° C.
    Nota: Cada placa de ELISA de 384 poços podem acomodar até 15 péptidos de teste em oito diluições para um alelo de MHC II, bem como os controlos positivos e negativos. Isto vai dar finalmente medições em triplicado.

2. Adicione o teste de peptídeo diluições (Dia 1)

  1. Começando com um estoque de 10 mM de cada péptido de teste em DMSO, fazer a seguinte diluição em série em tampão de citrato-fosfato, utilizando placas de polipropileno de 384 cavidades (Tabela 1). (Manipulação de líquidos robô)
    Nota: Um prato cheio de polipropileno de 384 cavidades requer três placas de ELISA separados. Um terço de uma placa de polipropileno, exigirão apenas uma placa de ELISA (Figura 1).
Número de diluição Volume to tirar de diluição / estoque antes Volume de tampão citrato para adicionar Conc. de diluição Conc. na reação de ligação Conc. em Neutralized ELISA
(Ul) (Ul) (UM) (UM) (UM)
1 0,7 35.1 195,531 97,765 48,883
2 14,3 14,3 97,765 48,883 24,441
3 7.1 28,7 19,389 9,695 4,847
4 14,3 14,3 9,695 4,847 2.424
5 7.1 28,7 1.923 0,961 0,481
6 14,3 14,3 0,961 0,481 0,24
7 7.1 28,7 0,191 0,095 0,048
8 14,3 14,3 0,095 0,048 0,024
Remova e descarte 7.1 ml de solução de peptídeo a partir do número de diluição 8.

Tabela 1. Preparação do péptido teste da série de diluição.

Figura 1
Figura 1. Placa Mapa do péptido Ensaio de Ligação. (A) Mapa das diluições de peptídeos em placas de polipropileno de 384 cavidades. Cada placa de polipropileno pode acomodar três grupos de 15 peptídeos nas reações de ligação da competição contra a cantar le alelo MHC II. (B) Depois de a reacção de ligação se aproxima do equilíbrio, cada grupo de péptidos são transferidos, em triplicado, numa placa de 384 poços de ELISA separado que foi pré-revestido com um anticorpo anti-MHC de classe II.

3. Prepare o MHC II Master Mix (Dia 1)

  1. Faça o Tampão de reacção
    1. Adicionar 80 ul de 1 mM PEFA bloco e 60 mg de octil-β-D-glucopyranaside a 3920 ul de tampão fosfato citrato. (Veja calculadora planilha complementar para o dimensionamento alternativa).
  2. Diluir as soluções de selecionados MHC II a 101 nm de Tampão de Reacção usando um tubo de 15 ml (Tabela 2).
    Nota: concentração de MHC II será finalmente de 50 nM na reacção de ligação e 25 nM no ensaio ELISA neutralizado. As concentrações de amostra de MHC II irá variar de acordo com o número do lote do fabricante. (Veja calculadora planilha suplementar).
"> MHC da classe II de alelos DRB1 *: 1501 II do MHC da Concentração (mg / ml) 1.3 II do MHC da Concentração (mM) 20 Vol. II MHC Para adicionar (ml) 14.65 Vol. Tampão de reacção para adicionar (ml): 2.885,35 MHC II Mistura Concentração (nM) 101

Tabela 2. Preparação de mistura principal MHC II.

4. Prepare os controles negativo e positivo (dia 1)

  1. Adicionar 21.5 ul de tampão fosfato citrato para o "controlo negativo" poço da placa de polipropileno de 384 cavidades a partir do passo 2.1 (Figura 1A).
  2. Adicionar 21.5 ul de tampão fosfato citrato para o "controlo positivo" poço da placa de polipropileno de 384 cavidades.
    Nota: a "posiçãocontrole tiva "será concluída na seção 5, a seguir.
  3. Remover 49,5 mL da MHC II Master Mix a partir do passo 3.2 e pipeta para um tubo de 1,5 ml Eppendorf.
  4. Adicionar 0,5 mL de tampão citrato para os 49,5 mL do MHC II Master Mix a partir do passo 4.3.
  5. Adicionar 21.5 ul de concentração ajustada MHC II Mistura do passo 4.4 para o "controlo negativo" poço da placa de polipropileno de 384 cavidades (Figura 1A).
    Nota: esta amostra representa o controle negativo do sinal de zero que contém proteína MHC II, NO peptídeo controle, e NÃO peptídeo teste.

5. Adicionar a um controlo adequado Peptide ao MHC II Master Mix (Dia 1)

MHC da classe II de alelos DRB1 * Biotinylated Controle Peptide (Resíduos) Seqüência
0101 Flu-HA-B (306-318) Biotina-(Ahx) (Ahx) PRYVKQNTLKLAT-amida
0301 A mioglobina (137-148) Biotina-(Ahx) - (Ahx)-OH-LFRKDIAAKYKE
0401 YAR-B (1-14) Biotina-(Ahx) (Ahx)-OH YARFQSQTTLKQKT
0701 TetTox-B (830-843) Biotina-(Ahx) (Ahx)-OH QYIKANSKFIGITE
1101 Flu-HA-B (306-318) Biotina-(Ahx) (Ahx)-amida PRYVKQNTLKLAT
1501 MBP-B (84-102) Biotina-(Ahx) (Ahx)-OH NPVVHFFKNIVTPRTPPPS

* Recomendamos 10 mg escala encomendar para a economia.
Tabela 3. Peptídeos de controle para diversas MHC II alelos. *

  1. Dilui-se o péptido de controlo (armazenada a 400 uM em DMSO) a 1:20 em DMSO fresco para produzir um estoque diluído a 20 uM.
    1. Adicionar 25 uL de 400 uM de péptido de controle475 ul de DMSO. Nota: este é um grande excesso, mas permite uma manipulação precisa de soluções em DMSO viscosos.
  2. Além disso diluir o Peptídeo de Controle do passo 5.1 (20 mM) de 1:100 para o MHC II Master Mix a partir do passo 3.2.
    1. Adicionar 28.8 ul de Controlo Peptide diluídas no passo 5.2 para os restantes 2,850.5 ul de MHC II Master Mix.
  3. Adicionar 21.5 ul de MHC II Master Mix com o péptido de controlo (passo 5.2) para o poço de controlo positivo da placa de polipropileno de 384 cavidades (passo 4.2) (Figura 1A). Nota: esta amostra representa o controle positivo de alto sinal contendo proteína MHC II, peptídeo controle, e NÃO peptídeo teste.

6. Faça a reação de ligação (Dia 1)

  1. Adicionar a mistura padrão de MHC II contendo Controlo Péptido (passo 5.2), para cada uma das diluições de teste peptídicos (passo 2.1) em uma proporção de 1:1 para criar a reacção de ligação.
    1. Adicionar 21,5 mL de MHC II Master Mix contendo Control peptídeo do passo 5,2-21,5 ul de cada diluição de teste com peptídeo do passo 2.1. (Manipulação de líquidos robô)
  2. Selar a reacção de ligação com um filme de poliéster e incubar 12-24 horas em um não-CO 2 incubador controlado a 37 ° C sem agitação.

7. Neutralizar e transferir a reação de ligação (dia 2)

  1. Remova a placa de polipropileno de 384 cavidades contendo a reacção de ligação (passo 6.2) da incubadora a 37 ° C.
  2. Diluir a 1:01 reação de ligação com Neutralização Buffer. (Manipulação de líquidos robô)
    1. Adicionar 43 mL do tampão de neutralização para cada reacção de ligação bem.
  3. Remova a placa de ELISA (passo 1.3) a partir de 4 ° C e lavar 3x com 60 mL / poço de PBS-Tween 20 0,05%. (Lavadora)
  4. Transferir 25 uL de cada reacção de ligação neutralizada do passo 7.2 em poços em triplicado de a placa revestida de anticorpo de 384 poços de ELISA a partir do passo 7.3. (Figura 1
  5. Cobrir a placa de ELISA com uma película de poliéster e, em lugar de uma incubadora a 37 ° C durante 2,5 horas ou num frigorífico a 4 ° C durante a noite.

8. Desenvolvimento de ELISA (Dia 2 ou 3)

  1. Remova a placa de ELISA a partir do passo 7.5, lava-se 3 vezes com 60 ul / poço de PBS-Tween a 0,05%. (Lavadora)
  2. Diluir solução Estreptavidina-európio estoque (0,1 mg / ml de estreptavidina, 7 Eu 3 + / estreptavidina) 1000 vezes no tampão de ensaio de DELFIA.
    1. Para uma placa de 384 poços, diluem-se 10 ul de estreptavidina-európio, em 10 ml de Tampão de Ensaio.
  3. Adicionar 25 ul da diluído Estreptavidina-európio a cada poço da placa de 384 poços de ELISA a partir do passo 8.1. (Manipulação de líquidos robô)
  4. Cobrir a placa com uma película de poliéster e lugar no escuro e à temperatura ambiente durante 1 hora. Nota: Durante a incubação de 1 hora, retire a solução Aperfeiçoamento da geladeira e reserve 10 ml / placa no escuro a rotemperatura om.
  5. A seguir à incubação de 1 h, lavar a placa de 384 poços de ELISA a partir do passo 8.3 3x com 60 ul / poço de PBS-Tween a 0,05%. (Lavadora)
  6. Adicionar 25 ul de solução de melhoria para cada poço da placa de 384 poços de ELISA a partir do passo 8.5. (Manipulação de líquidos robô)
  7. Cobrir a placa ELISA de 384 poços com um filme de poliéster e permitir que a placa de sentar-se no escuro à temperatura ambiente por 10-15 min.
  8. Após a incubação de 10-15 min, ler a fluorescência da placa de 384 poços de ELISA a partir do passo 8.7 utilizando um leitor fluorescente resolvida no tempo com as configurações de placa de európio (por exemplo, Start Int.: 200, Pare Int.:. 1,000, Ex 340, Em . 615, Cutoff: Nenhum, PMT: Auto, Lê / Bem: 50).

9. Análise de Dados

  1. Insira os dados em formato de gráfico XY com 3 valores replicar em colunas lado a lado (X = teste de concentração peptídeo; Y = medição de fluorescência).
  2. Entrar transformar os valores de X para todos os dados: X = log (X)
  3. Coloque os tra lognsformed dados com o modelo de ligação competitiva de um local para extrair o valor de IC 50.
  4. Restringir o valor inferior ao valor médio de controlo negativo.
  5. Globalmente ajustar o valor superior e assegurar que o parâmetro global ajuste é inferior ou igual ao do controlo positivo.

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Representative Results

A sequência do péptido maduro de Enterobacter cloacae P99 beta-lactamase (BLA) (GenBank ID # X07274.1) foi analisada com ProPred 16 por ligantes peptídicos putativos para MHC II alelo DRB1 * 1501 (Tabela 4). ProPred identificado 117 peptídeos nonâmero com um resíduo P1 âncora obrigatória (isto é, uma M, L, I, V, F, Y ou W na posição 1, que é necessária para MHC II 31 de ligação). Em um limiar de 5%, apenas peptídeos com pontuação maior ou igual a 2,6 são ligantes prováveis. Assim, no limiar de 5%, apenas os melhores 11 péptidos são previstas para ligar MHC II DRB1 * 1501.

Tabela 4
Tabela 4. Melhor pontuação ProPred previsões para peptídeos BLA e MHC II alelo DRB1 * 1501.

Um painel representativo de epitop previstoes foi selecionado para análise em nosso ensaio de ligação MHC II (Tabela 4, as entradas em negrito). Fragmentos peptídicos BLA de quinze resíduos foram sintetizados quimicamente de tal modo que os epítopos nonâmero putativo MHC II foram incorporados nos fragmentos de proteínas sintéticas. Enquanto o sulco de ligação do MHC II si acomoda apenas nove aminoácidos, a evidência sugere que as sequências flanqueadoras podem influenciar as interacções peptídeo-MHC II, e peptídeos sintéticos de 15-20 resíduos, por conseguinte, são comumente empregado 15. Para representar a complexidade de sobreposição de epitopos que possam ocorrer em fragmentos de proteína biologicamente processados, testamos seqüências sintéticas que continham (i) simples ligantes previstos, (ii) simples nonbinders previstos, (iii) múltiplo previsto ligantes, (iv) múltipla previstos nonbinders, ou (v) uma mistura de ligantes previstos e nonbinders (Tabelas 4 e 5).

Tabela 5 Tabela 5. Lista de péptidos sintetizados quimicamente.

A capacidade destes peptídeos sintéticos para competir com o péptido de controlo de MBP-B biotinilado (Tabela 3) para a ligação a MHC da classe II DRB1 * 1501 foi analisada como descrito no protocolo acima. As curvas de ligação competitiva para os peptídeos sintéticos estão apresentados na Figura 2. Os valores de IC50 foram calculados por adaptação dos dados transformados em logaritmo utilizando um local de ligação competitiva, a função de ajuste não linear de prisma (Tabela 6). Como pode ser visto na Figura 2, os péptidos particionar naturalmente em três grupos: fortes aglutinantes com IC 50 <1 uM (péptidos 2 e 10); ligantes moderadas com 1 uM ≤ IC50 <100 iM (peptídeos 4, 9, 11, e 24 ); ligantes fracos com IC50 ≥ 100 μ; M (péptido 31).

Figura 2
Figura 2. Curva de ligação competitiva de BLA Peptídeos para MHC II alelo DRB1 * 1501. Ligantes apertadas estão aptos com linhas laranja, pastas moderadas linhas verdes, e o ligante fraco uma linha marrom.

Peptide Ranking IC 50 (uM) IC 95% para o IC 50 (uM) Qualidade de ajuste (R 2)
2 0,1199 ,09404-0,1529 0,98
4 15.1 11,83-19,28 0,87
9 17.11 13,39-21,88 0,81
10 0,2743 ,2149-,3502 0,98
11 10.49 8,252-13,34 0,98
24 4.787 3,769-6,082 0,96
31 190,6 137,7-263,9 0,80

Tabela 6. Calculado valores de IC 50 de fragmentos peptídicos BLA para DRB1 * 1501.

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Discussion

Biotherapeutics se estabeleceram como um dos pilares da medicina moderna, o que representa quatro dos cinco melhores vendendo drogas em 2012 32. O setor biopharmaceutics tem mostrado um crescimento sustentado por vários anos 6, eo desenvolvimento contínuo de novos agentes, bem como o surgimento de biossimilares ampliou pipelines biofarmacêutica. Olhando para o futuro, avaliar e mitigar a imunogenicidade de proteínas terapêuticas vai se tornar parte integrante da fase inicial de desenvolvimento bioterapêutico. Para facilitar este processo, biotecnólogos podem recorrer a métodos computacionais para predição epitopo 16-22, bem como algoritmos de projeto de proteínas integradas que visam reduzir a imunogenicidade, mantendo a função 3,23-26. Da mesma forma, design e desenvolvimento de vacinas pode capitalizar o poder de algoritmos de previsão 4, ea maturação continuada de vacinologia reversa é esperado para produzir proteçãoVacinas para uma ampla variedade de agentes infecciosos que iludiu os esforços anteriores 33. Embora estas ferramentas computacionais têm a capacidade de acelerar radicalmente processos de drogas e de desenvolvimento de vacinas, os resultados em previsões de silico em última análise deve ser filtrada mais, de modo a identificar um número manejável de melhores candidatos desempenho. Os recentes avanços na análise quantitativa peptídeo-MHC II incluíram o desenvolvimento de sistemas de engenharia de superfície celular de levedura de exibição 34 e microbead base de oxigénio luminescentes Canalização imunoensaios 35, mas in vitro tipo ELISA permanecer o carro-chefe para quantificar a ligação entre específica MHC II e pares peptídicas. Aqui, um processo microlitro escala para uma análise eficaz rápido, quantitativo, e custos de ligação de péptidos a moléculas de MHC II imunes humanos epitopo está descrito. Estes métodos podem ser utilizados como uma ferramenta experimental fase inicial do processo de afunilamento.

Para o purposes de demonstração, a seqüência de BLA foi analisada por peptídeos de ligação MHC II putativos utilizando o servidor web ProPred. Sete destes péptidos foram sintetizados quimicamente e testado experimentalmente para a ligação a MHC II humana solúvel DRB1 * 1501. Semelhante a outras análises de precisão preditor 28, ProPred previsão ligação correlacionada razoavelmente bem com medida experimentalmente IC 50 para o alelo DRB1 * 1501 MHC II. Também é importante observar que os resultados são sensíveis às variações nas concentrações e deve ser tomado cuidado para assegurar diluições precisas de MHC, os péptidos de controlo e os péptidos de teste. Do mesmo modo, uma limitação deste método é que os valores de IC50 são em relação às concentrações de MHC e péptidos de controlo. Entre o peptídeo conjunto de teste BLA, a melhor classificação ProPred epítopo exibiu a mais forte ligação a recombinante DRB1 * 1501. Da mesma forma, todos os outros ligantes de epitopos previstos exibiu afinidades moderada a MHC II elevados. Como esperado,péptidos sintéticos que contêm epitopos de ligação sobrepostos preditos e epítopos não ligantes foram encontrados para ligar MHC II em todos os casos. Peptídeo 31, que durou dois do ranking mais baixo epítopos previstos, provou ser o mais fraco fichário MHC II. Péptido 24, no entanto, foi encontrada para ligar MHC II com afinidade moderada apesar do facto de que o seu epítopo constituinte apenas muito espesso (epitopo 24) não foi um ligante previsto no limiar de 5%. Curiosamente, epítopo 24 foi identificado em um estudo anterior que visa deimmunizing BLA 10. Nestas experiências, o péptido sintético de 24 foi mostrado ser altamente imunogénica em ensaios de PBMC humanos. Assim, neste caso, um, o nosso ensaio de ligação ao MHC da classe II provaram ser preditivo de imunogenicidade enquanto ProPred não. No total, os resultados demonstram a utilidade das previsões computacionais em orientar os pesquisadores no sentido de prováveis ​​epítopos imunogênicos, mas também ressaltam a importância de alto rendimento métodos experimentais como um componente integral doo processo de design de proteína / vacina.

Importante, este desenho de 384 poços experimental é altamente paralelizado e permite a análise rigorosa de péptidos até 15 e um alelo de MHC II por 384 poços de placas de ELISA. Utilizando uma única manipulação robô líquido, este método permite que um investigador para analisar noventa péptidos de teste contra quatro tipos de alelos do MHC II, em menos de 48 horas. Este projeto inclui oito concentrações diferentes de peptídeos teste e medição triplicado em cada concentração. Portanto, o usuário é assegurada resultados quantitativos robustas e reproduzíveis. Outros que trabalham nas áreas de terapias de proteína ou de design e desenvolvimento de vacinas pode encontrar este protocolo para ser útil para facilitar o seu trabalho em deimmunization proteína ou análise de imunogenicidade.

Citrato de tampão fosfato (22,2 mM de ácido cítrico, 55,6 mM dibásico de Na 2 HPO 4, pH 5,4)
222 ml de ácido cítrico 0,1 M
278 ml de 0,2 M de Na 2 HPO dibásico 4
500 ml MilliQ H2O
Misturar o ácido cítrico, fosfato de sódio, e 450 ml de H 2 O. MilliQ Ajustar o pH para 5,4 e qs para 1 L.
Esta solução é estável à temperatura ambiente.
Binding Buffer Reaction
Citrato de tampão fosfato, pH 5,4 com Pefabloc 2% v / v de 1 mM
1,5% w / v de Octil-β-D-glucopyranaside
Use imediatamente.
Pefabloc 1 mM
1 ml MilliQ H2O
25 mg de Pefabloc SC (pó)
Faça alíquotas e armazenar a -20 ˚ C.
Borato Tampão de Fórmula (tetraborato de sódio 12,5 mMdeca-hidratado, pH 8,2)
Tetraborato de 1,19 g de sódio (Sigma)
250 ml MilliQ H2O
Dissolve-se o tetraborato de sódio deca-hidratado em 225 ml de H 2 O. MilliQ Ajustar o pH para 8,2 e qs para 250 ml.
Esta solução é estável à temperatura ambiente.
PBS-Tween (KCl 2,7 mM, 1,5 mM, KH 2 PO 4, NaCl 136,9 mM, 8,9 mM de Na 2 HPO 4 • 7H 2 O, 0,05% de Tween, pH 7,4)
4,5 L MilliQ H2O 500 ml de 10x de PBS de Dulbecco (DPBS)
2,5 ml de Tween 20
Esta solução é estável à temperatura ambiente.
Neutralização tampão (50 mM de HCl Trizma, pH 8,0)
475 ml MilliQ H2O
25 ml de 1 M de HCl Trizma
Misturar e ajustar o pH para 8,0
Esta solução é estável a 4 ° C.

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Disclosures

Leonard Moise é empregado por e possui opções de ações em EpiVax, Inc., uma empresa de biotecnologia de propriedade privada localizada em Providence, RI. O trabalho contidas neste relatório de pesquisa é livre de qualquer preconceito que possa ser associada com as metas comerciais da empresa.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pelo NIH concede R01-GM-098977 e R21-AI-098122 a CBK e KEG. RSS foi apoiado em parte por uma Luce Foundation Fellowship e, em parte, por um Fellowship Thayer Programa de Inovação da Escola de Engenharia Thayer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Tetraborate Decahydrate Sigma 221732
Citric Acid Sigma C1901
Dibasic Sodium Phosphate Sigma S7907
Trizma HCl OmniPur 9310
Tween-20 Sigma P7949
100% DMSO Sigma D8418
Octyl-β-D-Glucopyranaside Fischer 29836-26-8
Pefa Bloc SCF Roche 1158591600
Dulbecco’s 10x Phosphate Buffered Saline Invitrogen 14200-166
DELFIA Assay Buffer Perkin Elmer 4002-0010
DELFIA Enhancement Buffer Perkin Elmer 4001-0010
Europium Labelled Streptavidin Perkin Elmer 1244-360
L243 anti-HLA-DR antibody Biolegend 307602
Biotinylated tracer peptides 21st Century Biochemicals Custom Order
Test peptides (1-4 mg, 85% purity) Genscript Custom Order
Purified HLA-DRB1 monomers (non-biotinylated) Benaroya Research Institute* Custom Order
384-well white EIA/RIA plate Thermo 460372
Polypropylene 384-well plate Costar 3656
Film, AxySeal, 80 µm, ELISA Applicator  Axygen Ascientific PCR-SP
MilliQ Water N/A N/A
Epimotion Liquid Handler (or similar) Eppendorf 5075
Select TS Plate Washer (or similar) BioTek 405
SpectraMax Gemini Microplate Reader (or similar) Molecular Devices N/A
*Recombinant human MHC II molecules can be obtained from the Benaroya Tetramer Core Laboratory.  See: https://www.benaroyaresearch.org/our-research/core-resources/tetramer-core-laboratory

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References

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Bioquímica Edição 85 Imunoensaio imunogenicidade de proteínas MHC II epítopos de células T Tela de Alto Rendimento Deimmunization Vaccine projeto

Erratum

Formal Correction: Erratum: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes
Posted by JoVE Editors on 03/18/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes.  There were typos in the Protocol section and Table 2.

Step 3.1.1 in the Protocol was updated from:

Add 80 µl of 1 mM Pefa Bloc and 60 mg of octyl-β-D-glucopyranaside to 3,920 µl of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).

to:

Add 80 µl of 1 mM Pefa Bloc and 60 µg of octyl-β-D-glucopyranaside to 3,920 µl of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).

Step 5.2 in the Protocol was updated from:

Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 mM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.

to:

Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 µM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.

Table 2 was updated from:

MHC II Allele DRB1*: 1501
MHC II Stock Concentration (mg/ml) 1.3
MHC II Stock Concentration (mM) 20
Vol. MHC II Stock to Add (ml) 14.65
Vol. Reaction Buffer to Add (ml): 2885.35
MHC II Master Mix Concentration (nM) 101

to:

MHC II Allele DRB1*: 1501
MHC II Stock Concentration (mg/ml) 1.3
MHC II Stock Concentration (μM) 20
Vol. MHC II Stock to Add (μl) 14.65
Vol. Reaction Buffer to Add (μl): 2885.35
MHC II Master Mix Concentration (nM) 101
Um Ensaio de Ligação de Alto Rendimento II do MHC para análise quantitativa de Peptide Epitopes
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Salvat, R., Moise, L.,… More

Salvat, R., Moise, L., Bailey-Kellogg, C., Griswold, K. E. A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes. J. Vis. Exp. (85), e51308, doi:10.3791/51308 (2014).

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