Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Анализ связывания Высокая пропускная МНС II для количественного анализа пептидных эпитопов

doi: 10.3791/51308 Published: March 25, 2014

ERRATUM NOTICE

Summary

Биохимические анализы с рекомбинантных молекул MHC II человека может обеспечить быстрые, количественные понимание иммуногенному идентификации эпитопной, удаление или дизайн. Здесь, анализ связывания пептида-MHC II масштабируется до 384-луночных планшетах описывается. Это экономически эффективное формат должен оказаться полезным в области белка deimmunization и дизайна и разработки вакцины.

Abstract

Биохимические анализы с рекомбинантных молекул MHC II человека может обеспечить быстрые, количественные понимание иммуногенному идентификации эпитопной, удаление или дизайн 1,2. Здесь, анализ связывания пептида-MHC II масштабируется в формате 384-а. Уменьшено протокол снижает затраты реагентов на 75% и более высокую пропускную способность, чем описано выше протоколы 96-а 1,3-5. В частности, экспериментальная конструкция позволяет надежную и воспроизводимую анализ до 15 пептидов против одной МНС II аллеля на 384-а ELISA пластины. Использование одного обработки робота жидкости, этот метод позволяет исследователю анализировать примерно девяносто тестовые пептиды в трех экземплярах в диапазоне восьми концентраций и четырех типов аллелей MHC II менее чем за 48 часов. Другие работающие в области deimmunization белка или проектирования и разработки вакцины могут найти протокол, чтобы быть полезным в содействии их собственную работу. В частности, шаг за шагом инструкции и визуальном форматеЮпитера должны разрешить другим пользователям быстро и легко установить эту методологию в своих собственных лабораториях.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Белки являются самым быстрорастущим класс терапевтических агентов 6, и быстрое расширение биотерапевтических трубопроводов была сосредоточена больше внимания на проблемы, связанные с развитием и использованием белковых препаратов. Одной из уникальных рассмотрение проистекает из того факта, что в здоровой и функционирующей иммунной системе, все внеклеточные белки дискретизированных с помощью антиген-представляющих клеток (АРС). После интернализации АПК, белок расщепляется на небольших пептидных фрагментов, и предполагаемые иммуногенные сегменты будут загружены в паз класса II главного комплекса гистосовместимости (MHC белков II). Комплексы пептид-МНС II затем отображаются на поверхности АПК, и истинные иммуногенные пептиды, называемые Т-клеточные эпитопы, образуют тройные комплексы МНС II-пептид-Т-клеточного рецептора с родственными рецепторами клеточной поверхности CD4-Т-7. Это критическое событие молекулярное распознавание инициирует сигнальный каскад сложный, что приводит к активации Т-клеток, высвобождение цитокинасек, CD4 Т клеточный созревание В-клеток, и в конечном счете производство циркулирующих IgG антитела, которые связываются с и очистить нарушителя экзогенный белок. Таким образом, иммуногенные белки могут быть deimmunized путем выявления учредительные клеточные эпитопы Т и мутирует ключевые остатки, ответственные за образование комплекса MHC II. Он несет отметить, однако, что Т-клеточные эпитопы могут быть многочисленными и широко распространены по всему иммуногенных белков, и большинство эпитоп-удаление мутаций могут вызвать непреднамеренный потерю функции белка или стабильности. Поэтому, машиностроение deimmunized Biotherapies может быть сложным и технически сложной задачей, но существуют несколько примеров успешных Т-клеточный эпитоп на удаление проектов 3,5,8-12. В отличие от прививки на основе "гуманизации", которая в значительной степени ограничивается терапевтики антитела, Эпитоп удаление может быть применен к существу любая целевой белок независимо от последовательности, структура, функции, или наличие homologoнам человека леса. Первый шаг к реализации такого подхода является определение ключевых пептидных эпитопов, встроенных в последовательности белка-мишени.

Высокая пропускная способность биохимические анализы с использованием синтетических пептидов и рекомбинантных молекул MHC II человека может обеспечить быстрые предварительные глубокого анализа выявления эпитопной и смягчения 1,3-5. Эти анализы типа ИФА может быть мощным дополнением к другим проектирования и разработки инструментов белка / вакцин. Например, один хорошо известна экспериментальный подход к картирования эпитопов зависит от времени, труда и ресурсоемких Экс Vivo клеточной пролиферации анализов 15. Вкратце, первичной последовательности белка-мишени сначала разделена на панели перекрывающихся пептидов, часто 15-меров с 12 остатков перекрываются между соседними пептидов. Пептид панель химически синтезированы и иммуногенность каждого пептида был протестирован в одном из нескольких различных иммунологических, которые используют периферийное Blooг одноядерные клетки (РВМС), выделенные из человеческих доноров 13,14. Чтобы обеспечить большую уверенность в результатах, пептиды, как правило, проходят в репликации с РВМС от 50 и более различных доноров. В случаях, когда deimmunization является конечной целью, работа осложняется дополнительно в связи с необходимостью получения дополнительных панелей мутированных пептидов и испытать новые пептидные панелей в РВМС анализов, прежде чем внедрять любые deimmunizing мутаций в полноразмерного белка для последующего функционального анализа 10. Хотя эти клеточные анализы остаются золотым стандартом для оценки иммунного потенциала в человеческих пациентов, эффективность такого исчерпывающего подхода может быть улучшена путем предварительная фильтрация предполагаемые иммуногенные эпитопы с помощью быстрого и высокую пропускную способность MHC II-пептид св зывание.

Кроме того, биохимические анализы связывания пептид-МНС II могут быть объединены с предсказательной в методах кремний радикально ускорить процесс идентификации эпитопа.Там существует множество вычислительных средств для T прогнозирования клеток эпитопной; примеры включают ProPred 16, MHCPred 17, SVRMHC 18, АРБ 19, СММ-выровнять 20, NetMHCIIpan 21, а также собственные инструменты, такие как EpiMatrix по EpiVax 22. Кроме того, эпитопные предсказатели были недавно объединены с другими биоинформатики и молекулярных инструментов моделирования, и получают комплексные белковые алгоритмы deimmunization, направленные на снижение риска, что deimmunizing мутации могут нарушать работу структуру и функции белков 23-26. В то время как несколько эпитопные предсказатели оказались достаточно точными 27,28, результаты расчетов неизменно требуют экспериментальной проверки. Быстрая, высокая пропускная способность и экономически эффективным экспериментальные методы лучше всего подходят в качестве предварительного фильтра для в кремний предсказаний эпитопных.

В том же духе, эпитопные предсказатели может управлять выбор антигена для обратного vaccinoloгы 29,30. Например, прогресс в области биоинформатики дали весь геном экраны, которые быстро идентифицировать вакцин-кандидатов в виде целых белков или пептидных эпитопов патогенов, извлеченных из протеомов. Хотя это позволяет технология является перестройка открытие и развитие защитных вакцин, он вводит новый вызов в виде непреклонно больших списков кандидатов иммуногенных вакцин. Анализы связывания Высокая пропускная пептид-MHC II может вести выбор эпитопную путем количественного пептидный аффинность связывания и связывания распущенность среди множественных аллелей MHC II. Как и белка deimmunization, такие экспериментальные методы, в конечном счете требуется для проверки вычислительную прогноз перспективных приводит вакцин.

Здесь, анализ связывания пептида-MHC II масштабируется в формате 384-а описывается. Протокол является весьма параллельному и снижает затраты реагентов на 75% по сравнению с ранее описано 96-а форматы пластин 1,3-5. Использование одного Liquiд обработки робота, этот метод позволяет один исследователь легко анализировать приблизительно девяносто тестируемых пептидов в трех экземплярах в диапазоне концентраций и восемь четырех типов аллелей МНС II менее чем за 48 часов. В данной статье описывается настройка одной 384-а ELISA пластины для анализа семи экспериментальных пептидов против одной МНС II аллеля, но электронная таблица калькуляторы предоставляются как дополнительного материала таким образом, чтобы легко масштабировать эксперимент на любое количество нужных пептидов и / или MHC Молекулы II.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Четыре основные мероприятия включают в себя анализ связывания пептида-MHC II: 1-Переплет: тест-пептидов конкурировать с меченых пептидов контроля за фазу раствора связывания растворимых белков MHC II. Связывание измеряется в широком диапазоне концентраций пептида испытаний. 2-захвата: После реакции связывания приближается к равновесию, комплексы пептид-МНС II захвачены и отделяется от несвязанного пептида и белка путем конформационно-зависимые распознавания с иммобилизованным антителом. 3-обнаружения: Захваченные контрольный пептид количественно обнаружены с помощью временным разрешением флуоресценции. 4-анализ: Спектроскопические данные обрабатываются, построенные и проанализированы, чтобы установить дозозависимое связывающие свойства теста пептида и белка МНС II.

В различных этапов в процедуре, описанной ниже, использование жидкого обслуживание робота рекомендуется, если таковой имеется. В частности, в формате 384-а, автоматизированная дозирования и разбавление жидкостей минимизирует ошибки пользователя, результаты в болеепоследовательные хорошо в скважине объемы и дает менее 95% доверительных интервалов для IC 50 значений по сравнению с ручной анализов 96-а (данные не показаны). Если жидкость обработки робот не доступна, шаги с аннотацией "(жидкость обращении робота)" может быть сделано вручную. Точно так же, если это возможно, автоматизированная промывания планшетов, совместимый с форматом на 384-а рекомендуется. Это эффективно стандартизирует процесс стирки пластины. Если устройство для промывания планшетов не доступна, шаги с аннотацией "(пластины шайбой)" может быть сделано вручную.

1. Покройте плиты ИФА (день 1)

  1. Развести L243 антитела запас (0,5 мг / мл) в боратный буфер до рабочей концентрации 10 мкг / мл.
    1. Для пальто однодисковое 384-а, добавить 200 мкл фондовом антител к 9,8 мл боратного буфера. (См. дополнительный таблицы калькулятор для альтернативного масштабирования).
  2. Добавить 25 мкл раствора L243 антител в каждую лунку 384-жлокоть высокого связывания белый ELISA пластины. (Транспортная обработка робот жидкость)
  3. Уплотнение тарелку с полиэфирной пленкой и инкубировать в течение ночи при 4 ° С.
    Примечание: Каждый 384-а ИФА пластина может вместить до 15 тестируемых пептидов в восьми разведений для одной МНС II аллели, а также положительных и отрицательных контролей. Это в конечном счете дают по трехкратным измерениям.

2. Сделать тест-пептидов разведения (день 1)

  1. Начиная с 10 мМ исходного каждого тестируемого пептида в ДМСО, сделать следующий ряд разбавления в цитрат фосфатном буфере с помощью полипропиленовых пластин 384-а (табл. 1). (Транспортная обработка робот жидкость)
    Примечание: Полное полипропилен пластина 384-а требуется три отдельных ELISA пластины. Треть полипропиленовой пластины потребует только один ELISA пластины (рис. 1).
Разведение Количество Объем то занять от предварительного разбавления / складе Объем цитрат буфера, чтобы добавить Конц. разбавления Конц. в реакции связывания Конц. в нейтрализованы ELISA
(Мкл) (Мкл) (МкМ) (МкМ) (МкМ)
1 0.7 35.1 195,531 97,765 48,883
2 14.3 14.3 97,765 48,883 24,441
3 7.1 28.7 19,389 9.695 4,847
4 14.3 14.3 9.695 4,847 2,424
5 7.1 28.7 1.923 0.961 0,481
6 14.3 14.3 0.961 0,481 0.24
7 7.1 28.7 0.191 0.095 0.048
8 14.3 14.3 0.095 0.048 0.024
Снимите и выбросьте 7,1 мкл раствора пептида от разбавления номер 8.

Таблица 1. Получение пептидной серии разведений тест.

Рисунок 1
Рисунок 1. Пластинчатый Карта пептидных св зывание. (А) Карта пептидных разведений в полипропиленовых 384-луночных планшетах. Каждый из полипропилена пластины могут разместиться три группы из 15 пептидов в конкуренции связывания реакций против петь ле МНС II аллель. (Б) после Реакцию связывания приближается к равновесию, каждая группа пептид передается в трех экземплярах, в отдельный 384-луночный ELISA пластины, которая была предварительно покрытый анти-MHC II антител.

3. Подготовьте Master Mix МНС II (день 1)

  1. Сделать реакционного буфера
    1. Добавить 80 мкл 1 мМ Pefa Блока и 60 мг октил-β-D-glucopyranaside в 3920 мкл цитрат фосфатный буфер. (См. дополнительный таблицы калькулятор для альтернативного масштабирования).
  2. Развести выбранные растворы МНС II до 101 нМ в реакционного буфера, используя 15 мл коническую трубку (табл. 2).
    Примечание: концентрация MHC II в конечном счете будет 50 нМ в реакции связывания и 25 нМ в нейтрализованного ELISA анализе. Концентрации фондовые МНС II будет варьироваться в зависимости от числа производитель много. (См. дополнительный таблицы калькулятор).
"> MHC II аллель DRB1 *: 1501 Концентрация со MHC II (мг / мл) 1.3 MHC II со Концентрация (мМ) 20 Том MHC II Фондовой Добавить (мл) 14.65 Том Реакция Буфер Добавить (мл): 2885,35 MHC II Master Mix Концентрация (нМ) 101

Таблица 2. Подготовка МНС II мастер-микса.

4. Подготовьте Отрицательный и положительный контроли (день 1)

  1. Добавить 21,5 мкл цитрат фосфатного буфера в "отрицательный контроль" лунку полипропиленовый планшет 384-а со стадии 2.1 (рис. 1А).
  2. Добавить 21,5 мкл цитрат фосфатного буфера в "положительный контроль" лунку полипропиленовый планшет 384-а.
    Примечание: "позиконтроль TIVE "будет завершена в разделе 5 ниже.
  3. Удалить 49,5 мкл Master Mix МНС II с шагом 3,2 и пипеткой в ​​1,5 мл пробирку Эппендорфа.
  4. Добавить 0,5 мкл цитратного буфера с 49,5 мкл Master Mix МНС II, начиная с шага 4.3.
  5. Добавить 21,5 мкл концентрации скорректированных МНС II Master Mix, начиная с шага 4.4 в "отрицательный контроль" лунку полипропиленовый планшет 384-а (рис. 1А).
    Примечание: этот образец представляет собой отрицательный контроль нулевой сигнал, содержащий МНС II белок, никакого контроля пептид, и ни один тест пептид.

5. Добавить подходящего контрольного пептида в Master Mix МНС II (День 1)

MHC II аллель DRB1 * Биотинилированный управления Пептид (Остатки) Последовательность
0101 Грипп-ГА-B (306-318) Биотин-(Ahx) (Ahx) PRYVKQNTLKLAT-карбоновой кислоты
0301 Миоглобин (137-148) Биотин-(Ahx) - (Ahx)-OH LFRKDIAAKYKE
0401 ЯР-B (1-14) Биотин-(Ahx) (Ahx) YARFQSQTTLKQKT-ОН
0701 TetTox-B (830-843) Биотин-(Ahx) (Ahx) QYIKANSKFIGITE-ОН
1101 Грипп-ГА-B (306-318) Биотин-(Ahx) (Ahx) PRYVKQNTLKLAT-карбоновой кислоты
1501 MBP-B (84-102) Биотин-(Ahx) (Ahx) NPVVHFFKNIVTPRTPPPS-ОН

* Мы рекомендуем заказывать 10 мг шкалу для экономики.
Таблица 3. Контроль Пептиды для различных МНС II аллелей. *

  1. Развести пептид управления (сохраненную в 400 мкМ в ДМСО) в 1:20 свежей ДМСО дл получени разбавленного запас на 20 мкм.
    1. Добавить 25 мкл 400 управления мкМ пептида475 мкл ДМСО. Примечание: это большой избыток, но позволяет точно обработку вязких растворов ДМСО.
  2. Далее разбавить контрольный пептид, начиная с шага 5.1 (20 мм) 1:100 в Master Mix МНС II, начиная с шага 3.2.
    1. Добавить 28,8 мкл контрольного пептида разводненной в шаге 5.2 до остальных 2,850.5 мкл Master Mix МНС II.
  3. Добавить 21,5 мкл Master Mix МНС II с контрольным пептидом (этап 5.2) к положительной контрольной лунке полипропиленового пластины 384-луночный (этап 4.2) (рис. 1А). Примечание: этот образец представляет собой положительный контроль высокого сигналов, содержащий МНС II белок, контрольный пептид, и никакие испытания пептида.

6. Сделать реакции связывания (День 1)

  1. Добавьте Master Mix MHC II, содержащий контрольным пептидом (этап 5.2) для каждого из разведений тест пептид (шаг 2,1) в соотношении 1:1 для создания реакции связывания.
    1. Добавить 21,5 мкл МНС II Master Mix, содержащие ConТролль Пептид с шага 5.2 до 21,5 мкл каждого разведения Тест пептида со стадии 2.1. (Транспортная обработка робот жидкость)
  2. Уплотнение реакции связывания с полиэфирной пленкой и инкубировать 12-24 ч в инкубаторе с контролируемой помимо СО 2 при 37 ° С без встряхивания.

7. Нейтрализовать и переноса реакции связывания (День 2)

  1. Извлеките полипропиленовый планшет 384-луночный, содержащий реакции связывания (этап 6.2) из ​​инкубатора 37 ° C.
  2. Развести реакции связывания 1:1 нейтрализации буфера. (Транспортная обработка робот жидкость)
    1. Добавить 43 мкл нейтрализации буфера для каждого реакции связывания хорошо.
  3. Снимите ELISA пластины (шаг 1.3) от 4 ° С и промыть 3 раза с 60 мл / лунку PBS-0,05% Tween 20. (Устройство для промывания планшетов)
  4. Передача 25 мкл каждого нейтрализованного реакции связывания со стадии 7.2 в трех лунок антитела покрытием 384-а ELISA пластины со стадии 7.3. (Рис. 1
  5. Накройте ELISA пластины с полиэфирной пленкой и поместить в 37 ° C инкубаторе в течение 2,5 ч или в холодильнике 4 ° С в течение ночи.

8. ELISA развития (день 2 или 3)

  1. Снимите ELISA пластины с шага 7.5, промыть 3 раза 60 мкл / лунку PBS-0,05% Твин. (Устройство для промывания планшетов)
  2. Развести стрептавидином Европий маточного раствора (0,1 мг / мл стрептавидин, 7 Eu 3 + / стрептавидин) в 1000 раз в DELFIA буфером.
    1. С одной 384-луночный планшет, разбавленной 10 мкл стрептавидин-европий в 10 мл аналитического буфера.
  3. Добавить 25 мкл разбавленного стрептавидин-европия в каждую лунку 384-луночного ELISA пластины с шагом 8,1. (Транспортная обработка робот жидкость)
  4. Закройте планшет с полиэфирной пленкой и поставить в темноте при комнатной температуре в течение 1 часа. Примечание: Во время 1 ч инкубации удалить усиливающего раствора из холодильника и отложите в сторону 10 мл / пластина в темноте при роТемпература ом.
  5. После 1-часовой инкубации, мыть 384-луночный ELISA пластины с шагом 8,3 3х с 60 мкл / лунку PBS-0,05% Твин. (Устройство для промывания планшетов)
  6. Добавить 25 мкл усиливающего раствора в каждую лунку по 384-а ELISA пластины с шага 8.5. (Транспортная обработка робот жидкость)
  7. Накройте 384-а ELISA пластины с полиэфирной пленкой и дайте пластины сидеть в темноте при комнатной температуре в течение 10-15 мин.
  8. После минутной инкубации 10-15, читать флуоресценцию 384-а ELISA пластины со стадии 8.7, используя время решены флуоресцентный ридер с настройками европия (например, начало Int: 200, остановка Int:. 1000, экс 340, Em . 615, среза: Нет, PMT: Авто, Читает / Ну: 50).

9. Анализ данных

  1. Введите данные в формате XY графа с 3 значений повторных в бок-о-бок столбцов (X = концентрационных пептид тест, Y = измерений флуоресценции).
  2. Войти преобразования значения х для всех данных: Х = Журнал (Х)
  3. Установите тра журналовnsformed данные с одного сайта конкурентного связывания модели, чтобы извлечь значение IC 50.
  4. Ограничить нижнее значение к среднему значению отрицательного контроля.
  5. Во всем мире соответствовать верхнее значение и гарантировать, что глобальный параметр в форме ниже или равна положительного контроля.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Зрелый пептид последовательность из Enterobacter клоаки P99 бета-лактамазы (BLA) (GenBank ID # X07274.1) анализировали с ProPred 16 для предполагаемых пептидных связующих до МНС II аллеля DRB1 * 1501 (табл. 4). ProPred определены 117 нонамера пептиды с обязательным Р1 якоря остатка (т.е. M, L, I, V, F, Y или W в положении 1, который необходим для MHC II связывания 31). В 5% порога, только пептиды с баллами больше или равно 2,6 вероятные связующие. Таким образом, на 5%-ного порога, только верхние 11 пептиды предсказано, чтобы связать МНС II DRB1 * 1501.

Таблица 4
Таблица 4. Лучшие забил ProPred прогнозы на бла пептидов и МНС II аллеля DRB1 * 1501.

Репрезентативной выборки прогнозируемого epitopES был выбран для анализа в нашей МНС II анализе связывания (табл. 4, выделенные пункты). BLA пептидные фрагменты пятнадцать остатков были химически синтезированы таким образом, что эпитопы предполагаемый нонамера MHC II были внедрены в синтетических фрагментов белка. В то время как связывание сам паз МНС II вмещает только девять аминокислот, данные свидетельствуют о том, что фланговые последовательности могут влиять взаимодействия пептид-MHC II, и синтетические пептиды 15-20 остатков поэтому обычно используются 15. Чтобы представить сложность перекрывающихся эпитопов, которые могут возникнуть в биологически обрабатываемых фрагментов белка, мы протестировали синтетические последовательности, которые содержали (I) одиночных предсказанные связующие, (II) одиночных предсказанные nonbinders, (III) множественный предсказано связующие, (IV) множественный предсказанные nonbinders, или (V) смесь связующих и предсказанных nonbinders (табл. 4 и 5).

Таблица 5 Таблица 5. Список химически синтезированные пептиды.

Способность этих синтетических пептидов конкурировать с биотинилированным пептидом управления MBP-B (табл. 3) за связывание с MHC II DRB1 * 1501, анализировали, как описано в приведенном выше протокола. Конкурентные кривые для связывания синтетических пептидов показаны на рисунке 2. IC 50 рассчитывали путем подбора данные журнала-преобразуется с использованием одного-сайт конкурентное связывание, нелинейный подходят функцию Prism (табл. 6). Как видно на рисунке 2, пептиды, естественно разделить на три группы: сильные связующие с IC 50 <1 мкм (пептиды 2 и 10); умеренные связующие с 1 мкМ ≤ IC 50 <100 мкм (пептидов 4, 9, 11 и 24 ); слабые связующие с IC 50 ≥ 100 μ; M (пептид 31).

Рисунок 2
Рисунок 2. Конкурентного связывания Кривая BLA пептидов для МНС II аллеля DRB1 * 1501. Tight связующие подходят с оранжевыми линиями, умеренные связующие зелеными линиями, а также слабой связующего бордовые линии.

Пептид ранг ИК 50 (мкМ) 95% ДИ для IC 50 (мкМ) Качество Fit (R 2)
2 0,1199 0.09404-0.1529 0.98
4 15.1 11.83-19.28 0.87
9 17.11 13.39-21.88 0.81
10 0,2743 0.2149-0.3502 0.98
11 10.49 8.252-13.34 0.98
24 4,787 3.769-6.082 0.96
31 190.6 137.7-263.9 0.80

Таблица 6. Рассчитано IC 50 значения бла пептидных фрагментов для DRB1 * 1501.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Биотерапевтических зарекомендовали себя в качестве краеугольного камня современной медицины, представляющие четыре из пяти лучших продающих наркотики в 2012 году 32. Сектор биофармацевтика показал устойчивый рост в течение нескольких лет 6, и постоянное развитие новых препаратов, а также появление биоподобий расширила биофармацевтических трубопроводов. Заглядывая в будущее, оценки и смягчения иммуногенность белков терапии станет неотъемлемой частью развития биотерапевтический ранней стадии. Для облегчения этого процесса, биотехнологи могут воспользоваться вычислительных методов прогнозирования эпитопной 16-22, а также интегрированные алгоритмы проектирования белка, направленных на снижение иммуногенности при сохранении функции 3,23-26. Кроме того, дизайн и разработка вакцин может заработать на силе прогнозных алгоритмов 4, и продолжал созревание обратной вакцинологии ожидается выход защитнаяВакцины для широкого спектра инфекционных агентов, которые ускользает предыдущие усилия 33. Хотя эти вычислительные инструменты имеют возможность радикально ускорить процессы наркотиков и разработка вакцин, результаты в предсказаниях кремний в конечном счете, должны быть отфильтрованы далее с тем, чтобы определить сговорчивым количество лучших кандидатов исполнительского. Последние достижения в области количественного анализа пептид-МНС II включили развитие инженерных поверхности дрожжевых клеток систем отображения 34 и микрошарика основе Люминесцентные Кислород Ченнелинг иммуноанализах 35, но в пробирке ELISA типа анализы остаются рабочая лошадка для количественного связывания между конкретной MHC II и пептидных пар. Здесь процедура мкл шкала для быстрого, количественного, и экономически эффективного анализа эпитопа пептида связывания иммунных молекул MHC II человека описывается. Эти методы могут быть использованы в качестве ранней стадии экспериментального инструмента в процессе воронкообразной.

Для пуrposes из демонстрации, последовательность BLA анализировали на предполагаемых связывающих пептидов МНС II, использующих веб-сервер ProPred. Семь из этих пептидов были химически синтезированы и экспериментально испытана на связывание с растворимого человеческого МНС II DRB1 * 1501. Как и в других анализах точностью предсказателя 28, ProPred связывания предсказание коррелирует достаточно хорошо с экспериментально измеренной IC 50 для МНС II аллеля DRB1 * 1501. Важно также отметить, что результаты чувствительны к изменениям в концентрации и следует позаботиться, чтобы обеспечить точные разведения MHC, контроль пептиды и тест-пептидов. Кроме того, ограничение этого метода является то, что значения IC50 по сравнению с концентрациями MHC и контрольными пептидами. Среди BLA пептидной тестового набора, самый высокий рейтинг ProPred Эпитоп выставлены сильное связывание с рекомбинантным DRB1 * 1501. Аналогичным образом, все другие предсказанные эпитоп связующие выставлены от умеренных до высоких сродства MHC II. Как и ожидалось,синтетические пептиды, содержащие перекрывающиеся предсказанные связывания эпитопов и чему не обязывающие эпитопы были найдены для связывания МНС II во всех случаях. Пептид 31, которая охватывает два низкий рейтинг предсказанные эпитопы, оказался самым слабым МНС II связующего. Пептид 24, однако, было установлено, связать МНС II с умеренной аффинностью несмотря на то, что его только высокий рейтинг составной Эпитоп (Эпитоп 24) не был предсказан связующее на 5%-ный порог. Интересно, Эпитоп 24 была определена в предыдущем исследовании, направленной на deimmunizing BLA 10. В этих экспериментах, синтетический пептид 24 было показано, что высокую иммуногенность в человеческих РВМС анализов. Таким образом, в этом одном случае наш анализ связывания МНС II оказалась прогнозирования иммуногенности в то время как ProPred не было. В совокупности результаты продемонстрировать полезность вычислительных предсказаний в руководящих исследователей по отношению к вероятных иммуногенных эпитопов, но они также подчеркивают важность высокой пропускной экспериментальных методов, как неотъемлемого компонентапроцесс проектирования белка / вакцина.

Важно, что это 384-а опытно-конструкторских очень параллельному и позволяет тщательный анализ до 15 пептидов и одной МНС II аллеля на 384-а ELISA пластины. Использование одного обработки робота жидкости, этот метод позволяет исследователю анализировать девяносто тестовые пептиды против четырех типов аллелей MHC II в менее чем 48 часов. Эта конструкция включает в себя восемь различных концентраций тест пептидные и измерение трех экземплярах для каждой концентрации. Таким образом, пользователь может быть уверен надежные и воспроизводимые количественные результаты. Другие работающие в области белковых терапевтических или проектирования и разработки вакцины могут найти этот протокол, чтобы быть полезным в облегчение их работы в deimmunization белка или анализа иммуногенности.

Цитрат фосфатный буфер (22,2 мМ лимонной кислоты, 55,6 мМ Двухосновный Na 2 HPO 4, рН 5,4)
222 мл 0,1 М лимонной кислоты
278 мл 0,2 М двухосновного Na 2 HPO 4
500 мл MilliQ H 2 O
Смешайте лимонную кислоту, фосфат натрия и 450 мл MilliQ H 2 O. Отрегулируйте рН до 5,4 и QS до 1 л
Этот раствор стабилен при комнатной температуре.
Привязка буфера Реакция
Цитрат фосфатный буфер, рН 5,4 с 2% объем / объем 1 мМ Pefabloc
1,5% вес / объем октил-β-D-glucopyranaside
Используйте сразу.
1 мМ Pefabloc
1 мл MilliQ H 2 O
25 мг Pefabloc SC (порошок)
Сделать аликвоты и хранить при температуре -20 ˚ С.
Борат буфера Формула (12,5 мМ тетраборат натриядекагидрат, рН 8,2)
Декагидрат тетраборат 1,19 г натрия (Sigma)
250 мл MilliQ H 2 O
Растворите декагидрат тетраборат натрия в 225 мл MilliQ H 2 O. Отрегулируйте рН до 8,2 и сколько необходимо до 250 мл.
Этот раствор стабилен при комнатной температуре.
PBS-Tween (2,7 мМ KCl, 1,5 мМ KH 2 PO 4, 136,9 мМ NaCl, 8,9 мМ Na 2 HPO 4 • 7H 2 O, 0,05% Твин, рН 7,4)
4,5 л MilliQ H 2 O 500 мл 10x Дульбекко PBS (DPBS)
2,5 мл Tween 20
Этот раствор стабилен при комнатной температуре.
Нейтрализация буфера (50 мМ Trizma HCl, рН 8,0)
475 мл MilliQ H 2 O
25 мл 1 М Trizma HCl
Смешать и довести рН до 8,0
Этот раствор стабилен при 4 ° С.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Леонард Моисей работает на и держит опционы на акции EpiVax, Inc, компании в частной собственности биотехнологии, расположенный в Провиденсе, Род-Айленд. Работа содержится в данном отчете непредвзятыми, которые могут быть связаны с коммерческими целями компании.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана NIH гранты R01-GM-098977 и R21-AI-098122 для ЦБК и бочкой. RSS частично поддержана на стипендии Фонда Luce и частично за счет программы Тайер Инновации стипендий от Thayer техническая школа.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Tetraborate Decahydrate Sigma 221732
Citric Acid Sigma C1901
Dibasic Sodium Phosphate Sigma S7907
Trizma HCl OmniPur 9310
Tween-20 Sigma P7949
100% DMSO Sigma D8418
Octyl-β-D-Glucopyranaside Fischer 29836-26-8
Pefa Bloc SCF Roche 1158591600
Dulbecco’s 10x Phosphate Buffered Saline Invitrogen 14200-166
DELFIA Assay Buffer Perkin Elmer 4002-0010
DELFIA Enhancement Buffer Perkin Elmer 4001-0010
Europium Labelled Streptavidin Perkin Elmer 1244-360
L243 anti-HLA-DR antibody Biolegend 307602
Biotinylated tracer peptides 21st Century Biochemicals Custom Order
Test peptides (1-4 mg, 85% purity) Genscript Custom Order
Purified HLA-DRB1 monomers (non-biotinylated) Benaroya Research Institute* Custom Order
384-well white EIA/RIA plate Thermo 460372
Polypropylene 384-well plate Costar 3656
Film, AxySeal, 80 µm, ELISA Applicator  Axygen Ascientific PCR-SP
MilliQ Water N/A N/A
Epimotion Liquid Handler (or similar) Eppendorf 5075
Select TS Plate Washer (or similar) BioTek 405
SpectraMax Gemini Microplate Reader (or similar) Molecular Devices N/A
*Recombinant human MHC II molecules can be obtained from the Benaroya Tetramer Core Laboratory.  See: https://www.benaroyaresearch.org/our-research/core-resources/tetramer-core-laboratory

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Steere, A. C., et al. Antibiotic-refractory Lyme arthritis is associated with HLA-DR molecules that bind a Borrelia burgdorferi peptide. J. Exp. Med. 203, 961-971 (2006).
  2. Raddrizzani, L., et al. Different modes of peptide interaction enable HLA-DQ and HLA-DR molecules to bind diverse peptide repertoires. J. Immunol. 159, 703-711 (1997).
  3. Osipovitch, D. C., et al. Design and analysis of immune-evading enzymes for ADEPT therapy. Protein Eng. Design. 25, 613-623 (2012).
  4. Moise, L., et al. In silico-accelerated identification of conserved and immunogenic variola/vaccinia T-cell epitopes. Vaccine. 27, 6471-6479 (2009).
  5. Moise, L., et al. Effect of HLA DR epitope de-immunization of Factor VIII in vitro and in vivo. Clin. Immunol. 142, 320-331 (2012).
  6. Aggarwal, S. R. What's fueling the biotech engine-2011 to 2012. Nat. Biotechnol. 30, 1191-1197 (2012).
  7. Trombetta, E. S., Mellman, I. Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo. Ann. Rev. Immunol. 23, 975-1028 (2005).
  8. Warmerdam, P. A. M., et al. Elimination of a human T-cell region in staphylokinase by T-cell screening and computer modeling. Thrombosis Haemostasis. 87, 666-673 (2002).
  9. Jones, T. D., et al. Identification and removal of a promiscuous CD4+T cell epitope from the C1 domain of factor VIII. J. Thrombosis Haemostasis. 3, 991-1000 (2005).
  10. Harding, F. A., et al. A beta-lactamase with reduced immunogenicity for the targeted delivery of chemotherapeutics using antibody-directed enzyme prodrug therapy. Mol. Cancer. 4, 1791-1800 (2005).
  11. Mazor, R., et al. Identification and elimination of an immunodominant T-cell epitope in recombinant immunotoxins based on Pseudomonas exotoxin A. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, E3597-E3603 (2012).
  12. Cantor, J. R., et al. Therapeutic enzyme deimmunization by combinatorial T-cell epitope removal using neutral drift. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 1272-1277 (2011).
  13. Kern, F., LiPira, G., Gratama, J. W., Manca, F., Roederer, M. Measuring Ag-specific immune responses: understanding immunopathogenesis and improving diagnostics in infectious disease, autoimmunity and cancer. Trends Immunol. 26, 477-484 (2005).
  14. Li Pira, G., Ivaldi, F., Moretti, P., Manca, F. High throughput T epitope mapping and vaccine development. J. Biomed. Biotechnol. 2010, 325720 (2010).
  15. Hoffmeister, B., et al. Mapping T cell epitopes by flow cytometry. Methods. 29, 270-281 (2003).
  16. Singh, H., Raghava, G. P. ProPred: prediction of HLA-DR binding sites. Bioinformatics. 17, 1236-1237 (2001).
  17. Guan, P., Doytchinova, I. A., Zygouri, C., Flower, D. R. MHCPred: bringing a quantitative dimension to the online prediction of MHC binding. Appl. Bioinformatics. 2, 63-66 (2003).
  18. Wan, J., et al. SVRMHC prediction server for MHC-binding peptides. BMC Bioinformatics. 7, 463 (2006).
  19. Bui, H. H., et al. Automated generation and evaluation of specific MHC binding predictive tools: ARB matrix applications. Immunogenetics. 57, 304-314 (2005).
  20. Nielsen, M., Lundegaard, C., Lund, O. Prediction of MHC class II binding affinity using SMM-align, a novel stabilization matrix alignment method. BMC Bioinformatics. 8, 238 (2007).
  21. Nielsen, M., Justesen, S., Lund, O., Lundegaard, C., Buus, S. NetMHCIIpan-2.0 - Improved pan-specific HLA-DR predictions using a novel concurrent alignment and weight optimization training procedure. Immun. Res. 6, 9 (2010).
  22. De Groot, A. S., Knopp, P. M., Martin, W. De-immunization of therapeutic proteins by T-cell epitope modification. Dev. Biol. 122, 171-194 (2005).
  23. Choi, Y., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. Structure-based redesign of proteins for minimal T-cell epitope content. J. Comput. Chem. 34, 879-891 (2013).
  24. Parker, A. S., Choi, Y., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. Structure-guided deimmunization of therapeutic proteins. J. Comput. Biol. 20, 152-165 (2013).
  25. Parker, A. S., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. Optimization of therapeutic proteins to delete T-cell epitopes while maintaining beneficial residue interactions. J. Bioinform. Comput. Biol. 9, 207-229 (2011).
  26. Parker, A. S., Zheng, W., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. Optimization algorithms for functional deimmunization of therapeutic proteins. BMC Bioinformatics. 11, 180 (2010).
  27. De Groot, A. S., Martin, W. Reducing risk, improving outcomes: Bioengineering less immunogenic protein therapeutics. Clin. Immunol. 131, 189-201 (2009).
  28. Wang, P., et al. A systematic assessment of MHC class II peptide binding predictions and evaluation of a consensus approach. PLoS Comput. Biol. 4, e1000048 (2008).
  29. Sette, A., Rappuoli, R. Reverse vaccinology: developing vaccines in the era of genomics. Immunity. 33, 530-541 (2010).
  30. Moise, L., Cousens, L., Fueyo, J., De Groot, A. S. Harnessing the power of genomics and immunoinformatics to produce improved vaccines. Expert Opin. Drug Discov. 6, 9-15 (2011).
  31. Sturniolo, T., et al. Generation of tissue-specific and promiscuous HLA ligand databases using DNA microarrays and virtual HLA class II matrices. Nat. Biotechnol. 17, 555-561 (1999).
  32. Biologic drugs set to top 2012 sales. Nat. Med. 18, 636 (2012).
  33. Seib, K. L., Zhao, X., Rappuoli, R. Developing vaccines in the era of genomics: a decade of reverse vaccinology. Clin. Microbiol. Infect. 18, 109-116 (2012).
  34. Jiang, W., Boder, E. T. High-throughput engineering and analysis of peptide binding to class II MHC. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 13258-13263 (2010).
  35. Justesen, S., Harndahl, M., Lamberth, K., Nielsen, L. -L. B., Buus, S. Functional recombinant MHC class II molecules and high-throughput peptide-binding assays. Immun. 5, 1-20 (2009).

Erratum

Formal Correction: Erratum: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes
Posted by JoVE Editors on 03/18/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes.  There were typos in the Protocol section and Table 2.

Step 3.1.1 in the Protocol was updated from:

Add 80 µl of 1 mM Pefa Bloc and 60 mg of octyl-β-D-glucopyranaside to 3,920 µl of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).

to:

Add 80 µl of 1 mM Pefa Bloc and 60 µg of octyl-β-D-glucopyranaside to 3,920 µl of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).

Step 5.2 in the Protocol was updated from:

Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 mM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.

to:

Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 µM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.

Table 2 was updated from:

MHC II Allele DRB1*: 1501
MHC II Stock Concentration (mg/ml) 1.3
MHC II Stock Concentration (mM) 20
Vol. MHC II Stock to Add (ml) 14.65
Vol. Reaction Buffer to Add (ml): 2885.35
MHC II Master Mix Concentration (nM) 101

to:

MHC II Allele DRB1*: 1501
MHC II Stock Concentration (mg/ml) 1.3
MHC II Stock Concentration (μM) 20
Vol. MHC II Stock to Add (μl) 14.65
Vol. Reaction Buffer to Add (μl): 2885.35
MHC II Master Mix Concentration (nM) 101
Анализ связывания Высокая пропускная МНС II для количественного анализа пептидных эпитопов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Salvat, R., Moise, L., Bailey-Kellogg, C., Griswold, K. E. A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes. J. Vis. Exp. (85), e51308, doi:10.3791/51308 (2014).More

Salvat, R., Moise, L., Bailey-Kellogg, C., Griswold, K. E. A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes. J. Vis. Exp. (85), e51308, doi:10.3791/51308 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter