Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

En hög genomströmning MHC II-bindningsanalys för kvantitativ analys av peptidepitoper

doi: 10.3791/51308 Published: March 25, 2014

ERRATUM NOTICE

Summary

Biokemiska analyser med rekombinanta humana MHC II molekyler kan ge snabba, kvantitativa insikter immunogen epitop identifiering, radering eller design. Här används en peptid-MHC-II-bindningsanalys skalas till 384-brunnsplattor beskrivas. Denna kostnadseffektiva format ska vara användbar när det gäller protein deimmunization och vaccin design och utveckling.

Abstract

Biokemiska analyser med rekombinanta humana MHC II molekyler kan ge snabba, kvantitativa insikter immunogen epitop identifiering, radering eller konstruktion 1,2. Här används en peptid-MHC-II-bindningsanalys skalas till 384-brunnsformat. Den nedskalad protokollet minskar reagenskostnaderna med 75% och är högre kapacitet än tidigare beskrivna 96-håls protokoll 1,3-5. Specifikt den experimentella designen tillåter robust och reproducerbar analys av upp till 15 peptider mot en MHC II allel per 384-brunnars ELISA-platta. Med användning av en enda vätskehanteringsrobot medger denna metod en forskare att analysera ungefär nittio testpeptider i tre exemplar över ett intervall av åtta koncentrationer och fyra MHC II allele typer i mindre än 48 timmar. Andra som arbetar inom områdena protein deimmunization eller vaccin design och utveckling kan finna protokollet för att vara användbara för att underlätta sitt eget arbete. I synnerhet steg-för-steg-instruktioner och visuellt formatav JUPITER bör tillåta andra användare att snabbt och enkelt skapa denna metod i sina egna labb.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Proteiner är den snabbast växande klass av terapeutiska medel 6, och den snabba expansionen av biotherapeutic rörledningar har fokuserat allt större uppmärksamhet på de utmaningar som är förknippade med utveckling och användning av proteinläkemedel. En unik övervägande härrör från det faktum att i en sund och fungerande immunförsvar är alla extracellulära proteiner som samplas av antigenpresenterande celler (APC). När internaliseras av APC: er, är ett protein som klyvs i små peptidfragment, och förmodade immunogena segment är laddade in i spåret av klass II MHC-proteiner (MHC-II). De peptid-MHC-II komplexen visas sedan på APC-ytan och sanna immunogena peptider, benämnda T-cellsepitoper, bilda ternära MHC II-peptid-T-cellreceptorkomplex med cognate CD4 T-cellytereceptorer 7. Denna kritiska erkännande händelse molekyl initierar en komplex signalkaskad som resulterar i T-cellaktivering, frigivning av cytokins, CD4 T-cell-medierad B-cellsmognad och slutligen produktionen av cirkulerande IgG-antikroppar som binder till och rensa den felande exogena proteinet. Således kan immunogena proteiner deimmunized genom att identifiera ingående T-cellepitoper och mutera viktiga rester som är ansvariga för MHC II komplexbildning. Den bär att notera är dock att T-cellepitoper kan vara många och brett fördelade över immunogena proteiner, och majoriteten av epitop-radera mutationer kan orsaka en oavsiktlig förlust av proteiners funktion eller stabilitet. Därför ingenjörs deimmunized biotherapies kan vara en komplicerad och tekniskt utmanande mål, men det finns flera exempel på framgångsrika T-cellepitop radering projekt 3,5,8-12. Till skillnad från ympning baserade "humanisering", som till stor del begränsat till antikroppsläkemedel, kan epitop radering appliceras på i stort sett alla proteiner mål oavsett sekvens, struktur, funktion, eller tillgången på homologooss mänskliga byggnadsställningar. Det första steget för att genomföra en sådan strategi är att identifiera viktiga peptidepitoper inbäddade inom målet proteinsekvensen.

Hög genomströmning biokemiska analyser med hjälp av syntetiska peptider och rekombinanta humana MHC II molekyler kan ge snabba preliminära insikter epitop identifiering och begränsning 1,3-5. Dessa ELISA typ analyser kan vara ett kraftfullt komplement till andra protein / vaccin design-och utvecklingsverktyg. Till exempel, en väletablerad experimentell strategi för epitopkartläggning relies på tid, arbete och resursintensiva ex vivo cellproliferationsanalyser 15. Kortfattat är den primära sekvensen av ett målprotein först delas upp i en panel av överlappande peptider, ofta 15-merer med 12 rester överlappar mellan intilliggande peptider. Peptiden Panelen är kemiskt syntetiserade och immunogeniciteten av varje peptid testas i en av flera olika immunanalyser som använder perifert blood mononukleära celler (PBMC) som isolerats från humana givare 13,14. För att ge större förtroende för resultaten, peptider vanligtvis testas i replikera med PBMC från 50 eller fler olika givare. I de fall deimmunization är det slutliga målet, är det arbete förvärras ytterligare genom behovet av att producera ytterligare paneler av muterade peptider och testa de nya peptidpanelerna i PBMC analyser innan några deimmunizing mutationer i full längd protein för efterföljande funktionsanalys 10. Även om dessa cellulära analyser återstår guldmyntfoten för att bedöma immunogena potentialen hos människor, kan effektiviteten i ett sådant uttömmande tillvägagångssätt kunna förbättras genom förfiltrering förmodade immunogena epitoper med hjälp av en snabb och hög kapacitet MHC II-peptidbindningsanalys.

På samma sätt kan biokemiska peptid-MHC II bindningsanalyser kombineras med prediktiv i silico metoder för att radikalt påskynda epitop identifieringsprocessen.Det finns en rad olika beräkningsverktyg för T-cell-epitop förutsägelse, exempel är ProPred 16, MHCPred 17 SVRMHC 18, ARB 19, SMM-align 20, NetMHCIIpan 21 samt egenutvecklade verktyg som EpiMatrix by EpiVax 22. Likaså har epitop prediktorer nyligen kombineras med andra bioinformatik och molekylära modelleringsverktyg för att ger integrerade protein deimmunization algoritmer som syftar till att minska risken för att deimmunizing mutationer kan störa proteinstruktur och funktion 23-26. Medan flera epitop prediktorer har visat sig vara någorlunda exakt 27,28, beräkningsresultat kräver alltid experimentell validering. Snabb, hög genomströmning och kostnadseffektiva experimentella metoder lämpar sig bäst som en preliminär filter för in silico epitop förutsägelser.

På liknande sätt kan epitop prediktorer köra antigen val för omvänd vaccinology 29,30. Till exempel, har framsteg inom bioinformatik gav hela genom skärmar som snabbt identifierar vaccinkandidater i form av hela proteiner eller peptidepitoper extraherade från patogena proteom. Även om detta gör det möjligt för tekniken förändra upptäckten och utvecklingen av skyddande vaccin, införs en ny utmaning i form av intractably stora listor med immunogena vaccinkandidater. Hög genomströmning peptid-MHC II bindningsanalyser kan guida epitop val genom att kvantifiera peptidbindningsaffinitet och bindande promiskuitet bland flera MHC II alleler. Som med protein deimmunization är sådana experimentella metoder i slutändan krävs för att validera beräknings förutsägelse av lovande vaccin leder.

Här används en peptid-MHC-II-bindningsanalys skalas till 384-brunnsformat beskrivas. Protokollet är starkt parallelliserad och minskar reagensmedelskostnaderna med 75% jämfört med tidigare beskrivna 96-brunnar format 1,3-5. Med ett och samma liquid hanteringsrobot, tillåter denna metod en forskare att enkelt analysera cirka nittio testpeptider i tre exemplar över ett intervall av åtta koncentrationer och fyra MHC II allel typer i mindre än 48 timmar. I denna artikel beskrivs installationen av en 384-brunnars ELISA-platta för analys av sju experimentella peptider mot en MHC II allel, men spridda räknare ark finns som kompletterande material för att enkelt skala försöket till valfritt antal önskade peptider och / eller MHC Il-molekyler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Fyra stora verksamheter omfattar peptid-MHC-II-bindningsanalys: 1-Bindning: Test peptiderna konkurrera med märkta kontrollpeptider för lösningsfas bindning av lösliga MHC II-proteiner. Bindning mäts över ett brett område av testpeptidkoncentrationer. 2-Capture: Efter bindningsreaktionen närmar sig jämvikt, är peptid-MHC II-komplexen fångas och separeras från obunden peptid och protein genom konformationsberoende erkännande med en immobiliserad antikropp. 3-Detection: Fångad kontroll peptid kvantitativt detekteras med hjälp av tidsupplöst fluorescens. 4-Analys: Spektroskopiska data bearbetas, plottades och analyserades för att fastställa dosberoende bindningsegenskaperna hos testpeptiden och MHC II-proteiner.

Vid olika stegen i proceduren nedan, är användningen av en vätskehanteringsrobot rekommenderas om det finns någon. Särskilt i en 384-brunnar, automatiserad dispensering och utspädning av vätskor minimerar användarfel, resulterar i merkonsekventa väl-till-bra volymer och ger smalare 95% konfidensintervall för IC 50-värden jämfört med manuell 96 brunnar analyser (data visas ej). Om en flytande hanteringsrobot inte är tillgänglig, de steg kommenterade med "(vätskehanteringsrobot)" kan göras för hand. På liknande sätt, om möjligt, är en automatiserad plattvätt som är kompatibel med den 384-brunnsformat rekommenderas. Detta standardiserar effektivt plattan tvättprocessen. Om en plåt bricka inte är tillgänglig, de steg kommenterade med "(plattvättare)" kan göras för hand.

1. Täck ELISA-plattan (Dag 1)

  1. Späd L243-antikropp lager (0,5 mg / ml) i boratbuffert till en arbetskoncentration av 10 pg / ml.
    1. För att belägga en enda 384-brunnsplatta, tillsätt 200 | il av stock antikropp till 9,8 ml boratbuffert. (Se kompletterande kalkylblad kalkylator för alternativa skalning).
  2. Addera 25 pl av L243-antikropp-lösning till varje brunn i en 384-well hög-bindande vit ELISA-platta. (Vätskehanterande robot)
  3. Förslut plattan med en polyesterfilm och inkubera över natten vid 4 ° C.
    Notera: Varje 384-brunnars ELISA-platta kan rymma upp till 15 testpeptider vid åtta späd för en MHC II-allel, liksom de positiva och negativa kontroller. Detta kommer i slutändan ge trefaldiga mätningar.

2. Gör testet peptid Späd (Dag 1)

  1. Börjar med en 10 mM lager av varje test peptid i DMSO, gör följande spädningsserie i citratfosfatbuffert använda 384-hålsplattor av polypropen (tabell 1). (Vätskehanterande robot)
    Obs: En full 384-väl polypropylen platta kräver tre separata ELISA-plattor. En tredjedel av en polypropen platta kommer att kräva endast en ELISA-platta (Figur 1).
Utspädning Antal Volym to ta från föregående spädning / lager Volym citratbuffert att lägga Konc. av Utspädning Konc. i bindningsreaktionen Konc. i neutraliserad ELISA
(Il) (Il) (PM) (PM) (PM)
1 0,7 35,1 195,531 97,765 48,883
2 14,3 14,3 97,765 48,883 24,441
3 7,1 28,7 19,389 9,695 4,847
4 14,3 14,3 9,695 4,847 2,424
5 7,1 28,7 1,923 0,961 0,481
6 14,3 14,3 0,961 0,481 0,24
7 7,1 28,7 0,191 0,095 0,048
8 14,3 14,3 0,095 0,048 0,024
Ta bort och kassera 7.1 l av peptidlösning från späd nummer 8.

Tabell 1. Framställning av testpeptid utspädningsserie.

Figur 1
Figur 1. Plate Karta över peptid-bindningsanalys. (A) Karta över peptid utspädningar i polypropylen 384-hålsplattor. Varje polypropylen platta rymmer tre grupper om 15 peptider i konkurrensbindningsreaktioner mot en sing le MHC II-allel. (B) Efter bindningsreaktionen närmar sig jämvikt, är varje peptidgrupp överföras, i tre exemplar, till en separat 384-brunnars ELISA-platta, som har förbelagts med anti-MHC II-antikroppen.

3. Förbered MHC II Master Mix (Dag 1)

  1. Gör reaktionsbufferten
    1. Addera 80 pl av 1 mM Pefa Bloc och 60 mg oktyl-β-D-glucopyranaside till 3920 ^ il citratfosfatbuffert. (Se kompletterande kalkylblad kalkylator för alternativa skalning).
  2. Späd utvalda MHC II-förrådslösningar till 101 nM i reaktionsbuffert med användning av ett 15 ml koniskt rör (tabell 2).
    Not: MHC Il-koncentrationen i slutändan kommer att vara 50 nM i bindningsreaktionen och 25 nM i den neutraliserade ELISA-analys. De MHC II lagerkoncentrationer varierar beroende på tillverkare partinummer. (Se kompletterande kalkylblad kalkylator).
"> MHC II Allel DRB1 *: 1501 MHC II Stock Koncentration (mg / ml) 1,3 MHC II Stock Koncentration (mM) 20 Vol. MHC II För att lägga (ml) 14,65 Vol. Reaction Buffer till Lägg (ml): 2885,35 MHC II Master Mix Koncentration (nM) 101

Tabell 2. Beredning av MHC II Master Mix.

4. Förbered de negativa och positiva kontroller (Dag 1)

  1. Lägg till 21,5 l av citratfosfatbuffert till "negativa kontrollen" väl av 384 brunnar polypropylen platta från steg 2,1 (Figur 1A).
  2. Lägg till 21,5 l av citratfosfatbuffert till "kontroll" väl av 384 brunnar polypropylen platta.
    Notera: den "positionentiva kontroll "kommer att slutföras i avsnitt 5 nedan.
  3. Avlägsna 49,5 pl av MHC II Master Mix från steg 3.2 och pipett i en 1,5 ml Eppendorf-rör.
  4. Tillsätt 0,5 l av citratbuffert till 49,5 pl av MHC II Master Mix från steg 4.3.
  5. Lägg 21,5 pl av koncentrationen justerade MHC II Master Mix från steg 4,4 till "negativ kontroll" brunn i 384-brunnars polypropylen plattan (Figur 1A).
    OBS: detta prov representerar nollsignalen negativ kontroll som innehåller MHC II protein, INGEN kontroll peptid, och NO prov peptid.

5. Lägg till lämplig kontroll peptid till MHC II Master Mix (Dag 1)

MHC II Allel DRB1 * Biotinylerad kontrollpeptid (Aminosyrarester) Sekvens
0101 Influensa-HA-B (306-318) Biotin-(Ahx) (Ahx) PRYVKQNTLKLAT-amid
0301 Myoglobin (137-148) Biotin-(Ahx) - (Ahx)-LFRKDIAAKYKE-OH
0401 YAR-B (1-14) Biotin-(Ahx) (Ahx) YARFQSQTTLKQKT-OH
0701 TetTox-B (830-843) Biotin-(Ahx) (Ahx) QYIKANSKFIGITE-OH
1101 Influensa-HA-B (306-318) Biotin-(Ahx) (Ahx) PRYVKQNTLKLAT-amid
1501 MBP-B (84-102) Biotin-(Ahx) (Ahx) NPVVHFFKNIVTPRTPPPS-OH

* Vi rekommenderar att beställa 10 mg skala för ekonomin.
Tabell 3. Kontroll Peptider för olika MHC II alleler. *

  1. Späd kontroll peptid (förvaras vid 400 ^ M i DMSO) 1:20 i färskt DMSO för att ge en utspädd aktie till 20 mikroM.
    1. Addera 25 pl 400 pM kontrollpeptid till475 pl DMSO. OBS: Detta är ett stort överskott, men möjliggör noggrann hantering av viskösa DMSO-lösningar.
  2. Späd kontroll peptid från steg 5,1 (20 mM) 1:100 i MHC II Master Mix från steg 3.2.
    1. Lägg till 28,8 l av kontroll peptid utspädd i steg 5.2 till de återstående 2,850.5 pl av MHC II Master Mix.
  3. Lägg till 21,5 l av MHC II Master Mix med kontrollpeptid (steg 5,2) till den positiva kontrollbrunnen för 384 brunnar polypropylen platta (steg 4,2) (Figur 1A). OBS: detta prov representerar den höga signalen positiv kontroll som innehåller MHC II protein, kontroll-peptid, och NO prov peptid.

6. Gör bindningsreaktionen (dag 1)

  1. Lägg MHC II Master Mix innehåller kontroll peptid (steg 5.2) till var och en av testpeptid spädningar (steg 2.1) i förhållandet 1:1 för att skapa bindningsreaktionen.
    1. Lägg till 21,5 l av MHC II Master Mix innehåller Control peptid från steg 5,2 till 21,5 l av varje test peptid utspädning från steg 2.1. (Vätskehanterande robot)
  2. Täta bindningsreaktionen med en polyesterfilm och inkubera 12 till 24 h i en icke-CO 2 kontrollerad inkubator vid 37 ° C utan skakning.

7. Neutralisera och Överför bindningsreaktionen (Dag 2)

  1. Ta bort 384-brunnars polypropylen platta innehållande bindningsreaktionen (steg 6,2) från 37 ° C inkubator.
  2. Späd bindningsreaktionen 1:01 med neutraliseringsbuffert. (Vätskehanterande robot)
    1. Lägg 43 pl av neutralisering buffert i varje bindningsreaktionen väl.
  3. Avlägsna ELISA-plattan (steg 1,3) från 4 ° C och tvättas 3x med 60 ml / brunn av PBS-0,05% Tween 20. (Plattvättare)
  4. Överför 25 ul av vardera neutraliserade bindningsreaktionen från steg 7,2 till tredubbla brunnar av antikroppsbelagda 384-brunnars ELISA-platta från steg 7,3. (Figur 1
  5. Täck ELISA-plattan med en polyesterfilm och placera i en 37 ° C inkubator i 2,5 h eller i en 4 ° C kylskåp över natten.

8. ELISA-utveckling (dag 2 eller 3)

  1. Avlägsna ELISA-platta från steg 7,5, tvätta 3 gånger med 60 | il / brunn av PBS-0,05% Tween. (Plattvättare)
  2. Utspädd Streptavidin-Europium stamlösning (0,1 mg / ml streptavidin, 7 Eu 3 + / streptavidin) 1000-faldigt i DELFIA-analysbuffert.
    1. För en 384-brunnsplatta, späd 10 | il streptavidin-europium i 10 ml analysbuffert.
  3. Addera 25 pl av det utspädda Streptavidin-Europium till varje brunn i 384-brunnars ELISA-platta från steg 8,1. (Vätskehanterande robot)
  4. Täck plattan med en polyesterfilm och plats i mörker vid rumstemperatur under 1 timme. OBS: Under 1 timme inkubation, ta bort Enhancement Lösning från kylskåpet och avsätta 10 ml / platta i mörker vid roOMs temperatur.
  5. Efter 1-h inkubation, tvätta 384-brunnars ELISA-platta från steg 8,3 3x med 60 | il / brunn av PBS-0,05% Tween. (Plattvättare)
  6. Addera 25 pl av förstärkningslösning till varje brunn i 384-brunnars ELISA-platta från steg 8,5. (Vätskehanterande robot)
  7. Täck över 384-brunnars ELISA-platta med en polyesterfilm och låta plattan att sitta i mörker vid rumstemperatur under 10-15 min.
  8. Efter 10-15 min inkubation, läs fluorescens av 384 brunnar ELISA-platta från steg 8.7 med hjälp av en tidsupplöst fluorescerande plattläsare med europium inställningar (till exempel Start Int: 200, Stopp Int:. 1.000, Ex 340, Em . 615, Cutoff: Ingen, PMT: Auto, Läser / Well: 50).

9. Dataanalys

  1. Mata in data i XY-format grafen med 3 likadana värden i sida vid sida kolonner (X = provpeptidkoncentration, Y = fluorescensmätning).
  2. Logga omvandla X-värdena för alla data: X = log (X)
  3. Montera logg transformed data med en plats kompetitiv bindningsmodell för att extrahera IC 50-värde.
  4. Bibehåll den nedre värde till den genomsnittliga negativa kontrollvärdet.
  5. Globalt passar toppvärdet och säkerställa att den globala passform parametern är under eller lika med den positiva kontrollen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den mogna peptidsekvensen av Enterobacter cloacae P99 beta-laktamas (BLA) (Genbank ID # X07274.1) analyserades med ProPred 16 för förmodade peptid bindemedel till MHC II-allel DRB1 * 1501 (tabell 4). ProPred identifierat 117 nonamer peptider med en obligatorisk P1 ankare rester (dvs M, L, I, V, F, Y eller W i position 1, vilket krävs för MHC II bindning 31). Vid ett tröskelvärde på 5%, peptider endast med poäng större än eller lika med 2,6 är sannolikt bindemedel. Således, vid tröskeln på 5%, är det bara de bästa 11-peptider förutspått att binda MHC II DRB1 * 1501.

Tabell 4
Tabell 4. Toppbetyg ProPred prognoser för BLA peptider och MHC II-allelen DRB1 * 1501.

En representativ panel av förutspådde epitopes valdes för analys i vårt MHC II-bindningsanalys (tabell 4, djärva poster). BLA peptidfragment av femton rester kemiskt syntetiserade så att förmodade nonamer MHC II epitoper var inbäddade i de syntetiska proteinfragment. Medan MHC II bindande spåret i sig rymmer bara nio aminosyror, tyder allt på att flankerande sekvenser kan påverka interaktioner peptid-MHC II, och syntetiska peptider av 15-20 rester är därför vanligen använda 15. För att representera komplexiteten i överlappande epitoper som kan uppstå i biologiskt förädlade proteinfragment, testade vi syntetiska sekvenser som innehöll (i) enkel förutsedda bindemedel, (ii) enkla förutsedda nonbinders, (iii) flera förutspådde bindemedel, (iv) flera förutspådde nonbinders, eller (v) en blandning av predikterade bindemedel och nonbinders (Tabeller 4 och 5).

Tabell 5 Tabell 5. Förteckning över kemiskt syntetiserade peptider.

Kapaciteten hos dessa syntetiska peptider för att konkurrera med den biotinylerade MBP-B-kontrollpeptiden (Tabell 3) för bindning till MHC-II-DRB1 * 1501 analyserades såsom beskrivs i protokollet ovan. Konkurrerande bindningskurvor för de syntetiska peptiderna visas i figur 2. IC 50-värdena beräknades genom anpassning av log-transformerade data genom att använda ett-site kompetitiv bindning, icke-linjär passning funktion av Prism (tabell 6). Som framgår av Figur 2, peptider partitionera naturligt in i tre grupper: starka pärmar med IC 50 <1 ^ M (peptider 2 och 10), måttliga pärmar med 1 ^ M ≤ IC 50 <100 pm (peptider 4, 9, 11 och 24 ), svaga pärmar med IC 50 ≥ 100 μ, M (peptid 31).

Figur 2
Figur 2. Konkurrens Binding Kurva av BLA peptider för MHC II-allelen DRB1 * 1501. Tight bindemedel är lämpliga med orange linjer, måttliga bindemedel gröna linjer, och den svaga bindemedel en rödbrun linje.

Peptid Rank IC50 (pM) 95% CI för IC 50 (M) Kvaliteten på Fit (R2)
2 0,1199 0,09404-0,1529 0,98
4 15,1 11,83-19,28 0,87
9 17,11 13,39-21,88 0,81
10 0,2743 0,2149-0,3502 0,98
11 10,49 8,252-13,34 0,98
24 4,787 3,769-6,082 0,96
31 190,6 137,7-263,9 0,80

Tabell 6. Beräknat IC 50 värdena av BLA peptidfragment för DRB1 * 1501.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Biotherapeutics har etablerat sig som en hörnsten i modern medicin, som representerar fyra av de fem som säljer droger i 2012 32. Den biofarmaci sektorn har visat stadig tillväxt under flera år 6, och den pågående utvecklingen av nya medel samt uppkomsten av biosimilars har expand biofarmaceutiska rörledningar. Om man ser framåt, bedöma och mildra immunogenicitet av proteinläkemedel kommer att bli en integrerad del av tidigt biotherapeutic utveckling. För att underlätta denna process, kan biotekniker använda sig av beräkningsmetoder för epitop förutsägelse 16-22 samt integrerade proteinkonstruktions algoritmer som syftar till att minska immunogenicitet bibehållen funktion 3,23-26. På samma sätt kan vaccin design och utveckling nytta av kraften i prediktiva algoritmer 4, och den fortsatta mognad av omvänd vaccinology förväntas ge skyddandeVaccin för ett brett spektrum av smittämnen som har gäckat tidigare ansträngningar 33. Medan dessa beräkningsverktyg har kapacitet att radikalt påskynda läkemedel och vaccin utvecklingsprocesser, måste resultaten av in silico förutsägelser slutligen filtreras ytterligare för att identifiera en lätthanterlig antal prestanda kandidater topp. Senaste framstegen inom kvantitativ peptid-MHC II-analys har inkluderat utveckling av jästcellytan displaysystem 34 och mikrokorn baserade Självlysande Oxygen Kanalise Immunoassays 35, men in vitro ELISA typ analyser förblir arbetshästen för att kvantifiera bindning mellan specifika MHC II och peptid par. Här används en mikroliterskala förfarande för snabb, kvantitativ, och kostnadseffektiv analys av peptid-epitop som binder till humana MHC-II immun molekyler beskrivits. Dessa metoder kan användas som ett tidigt stadium experimentella verktyg i Trattprocessen.

För purposes av demonstrationen, var följden av BLA analyseras för förmodade MHC II-bindande peptider med hjälp av ProPred webbserver. Sju av dessa peptider syntetiserades kemiskt och experimentellt testas för bindning till lösligt humant MHC II DRB1 * 1501. I likhet med andra analyser av prediktor noggrannhet 28, ProPred bindande förutsägelse korrelerar tämligen väl med experimentellt uppmätta IC 50 för DRB1 * 1501 MHC II-allelen. Det är också viktigt att notera att resultaten är känsliga för variationer i koncentrationerna och försiktighet bör vidtas för att säkerställa korrekta utspädningar av MHC, kontrollpeptider, och testpeptider. På samma sätt är en begränsning av den här metoden att IC-50-värden är angivna i förhållande till koncentrationerna av MHC-och kontrollpeptider. Bland BLA peptidprovuppsättning, den högst rankade ProPred epitop uppvisade den starkaste bindningen till rekombinanta DRB1 * 1501. Likaså alla andra förutspådde epitop bindemedel uppvisade måttliga till höga MHC II-tillhörighet. Som väntatsyntetiska peptider som innehåller överlapp förutsedda bindande epitoper och icke-bindande epitoper befanns binda MHC II i samtliga fall. Peptid 31, som sträckte sig över två av de lägst rankade förutsagda epitoper, visade sig vara den svagaste MHC II-bindemedlet. Peptid 24, dock visade sig binda MHC II med måttlig affinitet trots att det bara högt rankad konstituerande epitop (epitop 24) var inte ett förutspått bindemedel vid tröskeln på 5%. Intressant nog var epitop 24 identifierats i en tidigare studie som syftar till deimmunizing BLA 10. Under dessa experiment användes syntetiska peptiden 24 visat sig vara starkt immunogena i humana PBMC-analyser. Således, i detta fall, vår MHC II-bindningsanalys visade sig vara prediktiva för immunogenicitet medan ProPred inte. Sammantaget visar resultaten nyttan av beräknings förutsägelser i vägleda forskare mot sann immunogena epitoper, men understryker också vikten av hög genomströmning experimentella metoder som en integrerad del avprotein / vaccindesignprocessen.

Viktigt är det 384-väl experimentell design mycket parallelliserad och medger noggrann analys av upp till 15 peptider och en MHC II allel per 384 brunnar ELISA-plattan. Med hjälp av en enda vätskehanteringsrobot, tillåter denna metod en forskare för att analysera nittio testa peptider mot fyra MHC II allel typer i mindre än 48 timmar. Denna design inkluderar åtta olika provpeptidkoncentrationer och tre exemplar mätning vid varje koncentration. Därför är användaren säker på robusta och reproducerbara kvantitativa resultat. Andra som arbetar inom områdena proteinläkemedel och vaccin design och utveckling kan finna detta protokoll för att vara användbart för att underlätta deras arbete i protein deimmunization eller immunogenicitet analys.

Citrat-fosfatbuffert (22,2 mM citronsyra, 55,6 mM Dibasic Na 2 HPO 4, pH 5,4)
222 ml 0,1 M citronsyra
278 ml 0,2 M dibasiskt Na 2 HPO 4
500 ml MilliQ H2O
Blanda citronsyra, natriumfosfat, och 450 ml MilliQ H2O Justera pH till 5,4 och QS till 1 L.
Denna lösning är stabil vid rumstemperatur.
Bindningsreaktionsbuffert
Citratfosfatbuffert, pH 5,4 med 2% v / v 1 mM Pefabloc
1,5% vikt / volym oktyl-β-D-glucopyranaside
Använd direkt.
1 mM Pefabloc
1 ml MilliQ H2O
25 mg Pefabloc SC (pulver)
Gör alikvoter och förvara vid -20 ˚ C.
Boratbuffert formeln (12,5 mM natriumtetraboratdekahydrat, pH 8,2)
1,19 g natriumtetraborat-dekahydrat (Sigma)
250 ml MilliQ H2O
Lös natriumtetraboratdekahydrat i 225 ml MilliQ H2O Justera pH till 8,2 och qs till 250 ml.
Denna lösning är stabil vid rumstemperatur.
PBS-Tween (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4, 136,9 mM NaCl, 8,9 mM Na 2 HPO 4 • 7 H2O, 0,05% Tween, pH 7,4)
4,5 L MilliQ H2O 500 ml 10x Dulbeccos PBS (DPBS)
2,5 ml Tween 20
Denna lösning är stabil vid rumstemperatur.
Neutralization Buffer (50 mM Trizma-HCl, pH 8,0)
475 ml MilliQ H2O
25 ml 1 M Trizma HCI
Blanda och justera pH till 8,0
Denna lösning är stabil vid 4 ° C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Leonard Moise är anställd av och innehar optioner i EpiVax, Inc., ett privatägt bioteknikföretag som ligger i Providence, RI. Arbetet i denna forskningsrapport är fri från fördomar som kan vara förknippade med de kommersiella målen för företaget.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av NIH bidrag R01-GM-098.977 och R21-AI-098.122 till CBK och KEG. RSS stöddes delvis av en Luce Foundation Fellowship och delvis av en Thayer Innovation Program Fellowship från Thayer School of Engineering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Tetraborate Decahydrate Sigma 221732
Citric Acid Sigma C1901
Dibasic Sodium Phosphate Sigma S7907
Trizma HCl OmniPur 9310
Tween-20 Sigma P7949
100% DMSO Sigma D8418
Octyl-β-D-Glucopyranaside Fischer 29836-26-8
Pefa Bloc SCF Roche 1158591600
Dulbecco’s 10x Phosphate Buffered Saline Invitrogen 14200-166
DELFIA Assay Buffer Perkin Elmer 4002-0010
DELFIA Enhancement Buffer Perkin Elmer 4001-0010
Europium Labelled Streptavidin Perkin Elmer 1244-360
L243 anti-HLA-DR antibody Biolegend 307602
Biotinylated tracer peptides 21st Century Biochemicals Custom Order
Test peptides (1-4 mg, 85% purity) Genscript Custom Order
Purified HLA-DRB1 monomers (non-biotinylated) Benaroya Research Institute* Custom Order
384-well white EIA/RIA plate Thermo 460372
Polypropylene 384-well plate Costar 3656
Film, AxySeal, 80 µm, ELISA Applicator  Axygen Ascientific PCR-SP
MilliQ Water N/A N/A
Epimotion Liquid Handler (or similar) Eppendorf 5075
Select TS Plate Washer (or similar) BioTek 405
SpectraMax Gemini Microplate Reader (or similar) Molecular Devices N/A
*Recombinant human MHC II molecules can be obtained from the Benaroya Tetramer Core Laboratory.  See: https://www.benaroyaresearch.org/our-research/core-resources/tetramer-core-laboratory

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Steere, A. C., et al. Antibiotic-refractory Lyme arthritis is associated with HLA-DR molecules that bind a Borrelia burgdorferi peptide. J. Exp. Med. 203, 961-971 (2006).
  2. Raddrizzani, L., et al. Different modes of peptide interaction enable HLA-DQ and HLA-DR molecules to bind diverse peptide repertoires. J. Immunol. 159, 703-711 (1997).
  3. Osipovitch, D. C., et al. Design and analysis of immune-evading enzymes for ADEPT therapy. Protein Eng. Design. 25, 613-623 (2012).
  4. Moise, L., et al. In silico-accelerated identification of conserved and immunogenic variola/vaccinia T-cell epitopes. Vaccine. 27, 6471-6479 (2009).
  5. Moise, L., et al. Effect of HLA DR epitope de-immunization of Factor VIII in vitro and in vivo. Clin. Immunol. 142, 320-331 (2012).
  6. Aggarwal, S. R. What's fueling the biotech engine-2011 to 2012. Nat. Biotechnol. 30, 1191-1197 (2012).
  7. Trombetta, E. S., Mellman, I. Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo. Ann. Rev. Immunol. 23, 975-1028 (2005).
  8. Warmerdam, P. A. M., et al. Elimination of a human T-cell region in staphylokinase by T-cell screening and computer modeling. Thrombosis Haemostasis. 87, 666-673 (2002).
  9. Jones, T. D., et al. Identification and removal of a promiscuous CD4+T cell epitope from the C1 domain of factor VIII. J. Thrombosis Haemostasis. 3, 991-1000 (2005).
  10. Harding, F. A., et al. A beta-lactamase with reduced immunogenicity for the targeted delivery of chemotherapeutics using antibody-directed enzyme prodrug therapy. Mol. Cancer. 4, 1791-1800 (2005).
  11. Mazor, R., et al. Identification and elimination of an immunodominant T-cell epitope in recombinant immunotoxins based on Pseudomonas exotoxin A. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, E3597-E3603 (2012).
  12. Cantor, J. R., et al. Therapeutic enzyme deimmunization by combinatorial T-cell epitope removal using neutral drift. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 1272-1277 (2011).
  13. Kern, F., LiPira, G., Gratama, J. W., Manca, F., Roederer, M. Measuring Ag-specific immune responses: understanding immunopathogenesis and improving diagnostics in infectious disease, autoimmunity and cancer. Trends Immunol. 26, 477-484 (2005).
  14. Li Pira, G., Ivaldi, F., Moretti, P., Manca, F. High throughput T epitope mapping and vaccine development. J. Biomed. Biotechnol. 2010, 325720 (2010).
  15. Hoffmeister, B., et al. Mapping T cell epitopes by flow cytometry. Methods. 29, 270-281 (2003).
  16. Singh, H., Raghava, G. P. ProPred: prediction of HLA-DR binding sites. Bioinformatics. 17, 1236-1237 (2001).
  17. Guan, P., Doytchinova, I. A., Zygouri, C., Flower, D. R. MHCPred: bringing a quantitative dimension to the online prediction of MHC binding. Appl. Bioinformatics. 2, 63-66 (2003).
  18. Wan, J., et al. SVRMHC prediction server for MHC-binding peptides. BMC Bioinformatics. 7, 463 (2006).
  19. Bui, H. H., et al. Automated generation and evaluation of specific MHC binding predictive tools: ARB matrix applications. Immunogenetics. 57, 304-314 (2005).
  20. Nielsen, M., Lundegaard, C., Lund, O. Prediction of MHC class II binding affinity using SMM-align, a novel stabilization matrix alignment method. BMC Bioinformatics. 8, 238 (2007).
  21. Nielsen, M., Justesen, S., Lund, O., Lundegaard, C., Buus, S. NetMHCIIpan-2.0 - Improved pan-specific HLA-DR predictions using a novel concurrent alignment and weight optimization training procedure. Immun. Res. 6, 9 (2010).
  22. De Groot, A. S., Knopp, P. M., Martin, W. De-immunization of therapeutic proteins by T-cell epitope modification. Dev. Biol. 122, 171-194 (2005).
  23. Choi, Y., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. Structure-based redesign of proteins for minimal T-cell epitope content. J. Comput. Chem. 34, 879-891 (2013).
  24. Parker, A. S., Choi, Y., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. Structure-guided deimmunization of therapeutic proteins. J. Comput. Biol. 20, 152-165 (2013).
  25. Parker, A. S., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. Optimization of therapeutic proteins to delete T-cell epitopes while maintaining beneficial residue interactions. J. Bioinform. Comput. Biol. 9, 207-229 (2011).
  26. Parker, A. S., Zheng, W., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. Optimization algorithms for functional deimmunization of therapeutic proteins. BMC Bioinformatics. 11, 180 (2010).
  27. De Groot, A. S., Martin, W. Reducing risk, improving outcomes: Bioengineering less immunogenic protein therapeutics. Clin. Immunol. 131, 189-201 (2009).
  28. Wang, P., et al. A systematic assessment of MHC class II peptide binding predictions and evaluation of a consensus approach. PLoS Comput. Biol. 4, e1000048 (2008).
  29. Sette, A., Rappuoli, R. Reverse vaccinology: developing vaccines in the era of genomics. Immunity. 33, 530-541 (2010).
  30. Moise, L., Cousens, L., Fueyo, J., De Groot, A. S. Harnessing the power of genomics and immunoinformatics to produce improved vaccines. Expert Opin. Drug Discov. 6, 9-15 (2011).
  31. Sturniolo, T., et al. Generation of tissue-specific and promiscuous HLA ligand databases using DNA microarrays and virtual HLA class II matrices. Nat. Biotechnol. 17, 555-561 (1999).
  32. Biologic drugs set to top 2012 sales. Nat. Med. 18, 636 (2012).
  33. Seib, K. L., Zhao, X., Rappuoli, R. Developing vaccines in the era of genomics: a decade of reverse vaccinology. Clin. Microbiol. Infect. 18, 109-116 (2012).
  34. Jiang, W., Boder, E. T. High-throughput engineering and analysis of peptide binding to class II MHC. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 13258-13263 (2010).
  35. Justesen, S., Harndahl, M., Lamberth, K., Nielsen, L. -L. B., Buus, S. Functional recombinant MHC class II molecules and high-throughput peptide-binding assays. Immun. 5, 1-20 (2009).

Erratum

Formal Correction: Erratum: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes
Posted by JoVE Editors on 03/18/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes.  There were typos in the Protocol section and Table 2.

Step 3.1.1 in the Protocol was updated from:

Add 80 µl of 1 mM Pefa Bloc and 60 mg of octyl-β-D-glucopyranaside to 3,920 µl of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).

to:

Add 80 µl of 1 mM Pefa Bloc and 60 µg of octyl-β-D-glucopyranaside to 3,920 µl of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).

Step 5.2 in the Protocol was updated from:

Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 mM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.

to:

Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 µM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.

Table 2 was updated from:

MHC II Allele DRB1*: 1501
MHC II Stock Concentration (mg/ml) 1.3
MHC II Stock Concentration (mM) 20
Vol. MHC II Stock to Add (ml) 14.65
Vol. Reaction Buffer to Add (ml): 2885.35
MHC II Master Mix Concentration (nM) 101

to:

MHC II Allele DRB1*: 1501
MHC II Stock Concentration (mg/ml) 1.3
MHC II Stock Concentration (μM) 20
Vol. MHC II Stock to Add (μl) 14.65
Vol. Reaction Buffer to Add (μl): 2885.35
MHC II Master Mix Concentration (nM) 101
En hög genomströmning MHC II-bindningsanalys för kvantitativ analys av peptidepitoper
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Salvat, R., Moise, L., Bailey-Kellogg, C., Griswold, K. E. A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes. J. Vis. Exp. (85), e51308, doi:10.3791/51308 (2014).More

Salvat, R., Moise, L., Bailey-Kellogg, C., Griswold, K. E. A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes. J. Vis. Exp. (85), e51308, doi:10.3791/51308 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter