Summary
Bir tekrar oluşturulmuş temel membran üzerinde meme epitelyum hücreleri üç boyutlu kültür iyi huylu meme in vivo mimari özetlemek için, iyi huylu göğüs ve fenotipten malin fenotipi ayırt etmek için yararlı bir yöntemdir. Önemli olarak, bu sistem, diğer dokularda invaziv karsinomları incelemek için uygulanabilir.
Abstract
Invaziv meme karsinom metastaz komşu doku ve eğilimi işgali ile karakterize malign epitelyal tümörlerin bir grubuz. Kanser hücreleri ve bunların mikro arasındaki sinyallerin etkileşimi meme kanseri büyüme ve biyolojik davranışı 1 üzerinde güçlü bir etkiye sahip. Ancak, hücre dışı matrisin bu sinyallerin çoğu kaybolur ya da hücreler, bir tek tabaka iki boyutlu kültürü (2B) yetiştirilen onların İlgiye understudied edilir. Son yıllarda, bir tekrar oluşturulmuş temel membran üç boyutlu (3D) bir kültür iyi huylu ve habis meme hücrelerinin doku mimarisi özetlemek için tercih edilen bir yöntem olarak ortaya çıkmıştır. 3D yetiştirilen hücreler, hücre dışı matris arasındaki önemli ipuçları korumak ve fizyolojik olarak uygun ex vivo sistem 2,3 sağlar. Notun, 2D 4 kıyasla 3D yetiştirilen hücreler, farklı davranabilir düşündüren kanıtlar artmaktadır. 3D kültüretkin bir şekilde 3 dahil iyi huylu göğüs fenotipten malin fenotipi ayırt etmek için bir araç olarak ve hücresel ve moleküler sinyal destekleyen için kullanılabilir. Iyi huylu epitelyal hücrelerin ayırt edici özelliklerinden biri, apikal sitoplazma lümenine doğru ve bazal sitoplazma bazal membran üzerinde durmaktadır, böylece de polarize edilmiş olmasıdır. Bu apico-bazal polarite hücresel örgütsüzlük ve gelişigüzel çevreleyen dokudan infiltrasyonlar tübüllerini anastomoz ve dallanma oluşumu ile karakterize edilir invaziv meme kanserleri, kaybolur. Benign bezi ve invaziv karsinoma arasındaki bu histopatolojik farklılıklar 3D 6,7 çoğaltılabilir. Diğer moleküler ve hücre biyolojisi teknikleri, 3D Kültür ile birlikte hücre çoğalması, polarite ve apoptoz valide moleküler belirteçlerin ifade diferansiyel, tek yuvarlak asiner yapılardan niceliğinin gibi uygun okuma-çıkışları ya da kullanmae daha malign dönüşüm sırasında ve sorumlu sinyalizasyon tasvir için hücresel değişiklikleri anlamak için önemli bir araç sağlayabilir.
Introduction
Yeniden oluşturulmuş bazal zar üzerinde göğüs epitel hücrelerinin kültür üç boyutlu (3D) karmaşık fenotip ve normal meme ve meme kanseri 2,3 bağlantılı sinyal incelemek için önemli bir model sistem. Memenin fonksiyonel birim içine asinüs hangi dal küçük bir kanal oluşur terminal lobular kanal ünitesi (TDLU) 'dir. Acininin bir bazal membran 5 tarafından çevrelenmiş olan iki hücre tabakası, epitelyal ve myoepitelyal hücreler, oluşan yüksek derecede organize yapılar bulunmaktadır. Normal asinüs en ayırt edici özellikleri hücresel kutuplaşma, altta yatan bazal membran bağlanma ve özel hücre-hücre temas vardır. Bu karmaşık örgüt invaziv tümörlerde bozulur. Hücre mono tabakaları olarak yetiştirilen yaygın olarak kullanılan 2 boyutlu kültürler, asinüs oluşumu için izin yoktur. Bu nedenle, tek tabakalı bir kültür epitel hücreleri arasındaki karmaşık ilişkiyi yakalamak için bir sistem temin yoksundurnormal göğüs ve göğüs kanserinde kendi düzensizleşmesine. Meme hücrelerinin fonksiyonel tek tip epitel kültürleri çeşitli laboratuarlar 2,3 geliştirilmiştir. 3D kültür Engelbreth-Holm-Swarm fare sarkom hücrelerinden türetilen bir çözünebilir ekstresi ve ticari olarak mevcuttur, Matrigel üzerinde göğüs hücrelerinin büyümesini kapsar. Kolajen gibi diğer 3D katmanlarından Ben de kullanılmaktadır. Meme hücreleri hücreleri, Matrigel 2 gömülü kültürlenir 3D gömülü deneyi ile 3D kültürlenebilir. Alternatif olarak, hücreler de bu Matrigelin az bir hacim gerektirir, ve faz kontrast görüntüleme ile koloni oluşumunun zaman atlamalı izlenmesini kolaylaştırır ve in situ görüntüleme 2 için ideal olduğu gibi maliyetli 3D bindirme deneyi olarak adlandırılan, üst deneyine 3D kültür edilebilir -3. En iyi tahlil üzerinde 3D asinar fenotip ve gen ekspresyon profili 7 arasındaki ilişkiyi tanımlamak için kullanılmıştır.
3D kültür effectiv edilebilirely invaziv karsinom normal ve iyi huylu hücreleri ayırt etmek için kullanılır. Normal ve iyi huylu meme hücrelerinin invaziv karsinom hücreleri lümen hiçbir temizlenmesi ile üretken ve gelişigüzel büyümeye ise büyüme Matrigel merkezinde iyi tanımlanmış lümen polarize yapılar tutuklandı oluştururlar. E6/E7 insan meme epitelyum hücreleri ve fibrokistik değişiklikleri ile bir 36 yaşındaki hastadan izole edilmiş bir kendiliğinden ölümsüzleştirilmiş hücre hattı, başarılı bir 3D 3,8 olarak iyi huylu göğüs fenotipi geri almak için kullanılmış olan ve yapmış olduğu MCF10A hücre hattı, ölümsüzleştirilmiş Birkaç moleküllerin 8,9 onkojenik ve tümör baskılayıcı fonksiyonunu incelemek için bir model sistem. Bu iyi huylu hücre lentivirüs / retrovirüs tanıtımı ile, ilgilenilen gen (ler) işlemek için tasarlanmış olabilir. Ilgi konusu gen (ler), bir tümör bastırıcı ise ilgi konusu genin benign hücrelerde onkogen aşın ise, shRNA aracılık ettiği portatif ise kötü huylu bir dönüşüme yol açacaktırhabis bir fenotipe göstermelidir. Her iki durumda da 3 boyutlu olarak oluşturulmuş akinar yapılar habis dönüşüm yakalayabilir.
3D kaplama huylu tek hücreler küresel yapılar çoğalırlar ve yuvarlak oluşturmaya başlar. Gün 5-8 hücreleri, bu küresel toplam Matrigel ile temas halinde olan hücre çevreleyen bir polarize tabakası ve Matrigel ile temas eksikliği az polarize hücre, bir iç bir kitle halinde ayırt edecektir. Önümüzdeki 10-15 gün içinde iç hücreler apoptosis açık bir lümen oluşturarak ölmeye başlayacak. Malign hücreler gelişigüzel polaritelerini kaybetme büyüyecek. Son derece habis hücreler genellikle yapıları dallanma oluştururlar. Fenotip bu farklılıklar, zaman atlamalı faz kontrast görüntüleme ve yerinde ilgili moleküler belirteçlerin ile immünboyama tarafından yakalanabilir. En sık kullanılan işaretleyiciler çoğalma işaretleyici fosfo histon 3 ile apoptot ile kombinasyon halinde, alfa 6-integrin, bir taban kutup işaretleridiric işaretleyici kaspaz-3 ayrılır. İkincisi asinüs merkezinde, normal ve iyi huylu meme hücrelerinin bir özellik olarak lümen oluşumu olup olmadığını belirlemek için önemlidir. Diğer polarizasyon ve hücre-hücre temas belirteçleri GM130, laminin, şey, E-kadherin içerir. Seçenek olarak, göğüs kanseri hücre çizgileri, ilgi konusu geni işlemek için tasarlanmış olabilir. Tutuklandı daha büyümeye Bu durumda, eski haline dönme olarak iyi huylu fenotip olarak kullanılabilecek bir kanser fenotipi ayırt etmek okunur.
3D kültürü de dikkatle habis dönüşüm 10-11 katılan sinyalleme yolunu tanımlamak için kullanılabilir. Kullanılarak yukarıda salt çıkışları, farmakolojik inhibitörleri, bloke edici antikorlar veya rekombinant proteinleri söz habis dönüşüme neden olan moleküler sinyali de kesin olarak belirlemek olabilir kullanılabilir. Çeşitli laboratuvarların sürekli çabaları sayesinde RNA izole etmek ve aynı zamanda immunoblotlama ve immünohistokimyası için lizatlarını hazırlamak için 3 boyutlu hücreleri çıkarmak mümkündürnoprecipitation. Bu stratejiler, protokolde bir adım adım ve ayrıntılı bir şekilde tarif edilmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Malzemelerin hazırlanması ve Kültür Medya
- 4 ° CO / N. de (GFH) Matrigel azaltılmış Çözülme büyüme faktörü
- 37 ° C'de bir hücre hattı için gereken ortam tam Isınma MCF10A-ATCC ortamı kullanın; HME-Ham'ın F-12 ortamı,% 5 fetal inek serumu, 1 ug / ml hidrokortizon, 5 ug / ml insülin, 10 ng / ml EGF ve 100 ng / ml, kolera toksini ile takviye edilmiş; % 5 FBS, 2 ug / ml hidrokortizon ve 5 ug / ml insülin ile takviye SUM149-Ham'ın F-12 ortamı; ve MDA-MB-231-10% FBS DMEM-
- Buz üzerinde bir 8-iyi odasının slayt önceden soğutmak.
- Doku kültürü kaputu ve malzemeleri hazırlayın.
8-iyi Odası Slide 2. Üç Boyutlu Kültür
- Coat her GFR Matrigel 40 ul 8 oyuklu slayt de. Slayt merkezinde Matrigel ekleyin ve sonra bir P200 pipet kullanarak yayıldı. Kabarcıklar kaçınarak ve yol açabilir overspreading, mümkün olduğunca eşit yaymak için çalışınmenisküs oluşumu.
- % 5 CO2 altında 37 ° C 'de kuluçkaya bırakın. Matrigel katılaşan iken, hücreleri trypsinize toplamak ve 4 dakika boyunca doku kültürü santrifüj içinde 150 x dönerler.
- Hücre sayımı ve ilgili hücre hattının komple ortamı içinde 12,500 hücre / ml olacak şekilde seyreltin. % 2 GFR Matrigel ekleme ve Matrigel önceden kaplanmış slaytı her çukuruna 400 ul ekle.
- CO2 inkübatör slaytlar inkübe edin. 15 gün kadar her 4 th gün taze eksiksiz bir medya değişiklikleri ver.
- GFR Matrigel üzerinde büyüyen hücrelerin önleyici çalışmalar sırasında her üç günde bir taze inhibitörleri ile takviye edilmiş ortam değişiklikleri takip kaplama zamanda tam ortam için küçük molekül inhibitörleri eklemek için: farmakolojik inhibitörleri ile tedavi.
- Saflaştırılmış proteini ile tedavi:
- Hücreleri plaka aşağıdaki 2,1-2,3 adımları. Kültürler, serum starvati, ardından 4 gün boyunca büyümeye izin16 saat on.
- 5. günde, FBS serum açlık hücrelere ortam ilave% 0.1 'in saflaştırılmış proteinin uygun bir konsantrasyonu ile muamele hücreleri. 2 gün sonra, saflaştırılmış protein ile taze ortam değişikliği verin.
- 10. günde tam HME medya ile klimalı ortamı değiştirin. Kültürler, başka bir 5 gün için büyümeye izin verin.
- Matrigel yetiştirilen asiner yapılardan İmmünofloresan boyama:
- % 2 paraformaldehit,% 0.5 Triton X-100 ve 1 x PBS, pH 7.4 içinde 100 mM glisin hazırlayın. % 0.1 sığır serum albümini,% 0.2 triton X-100,% 0.05 Tween-20 ihtiva eden 1x PBS ihtiva immünofloresan tamponu (tampon IF) hazırlayın.
- Dikkatli klimalı medya aspire P200 pipet kullanın.
- 20 dakika boyunca oda sıcaklığında (RT),% 2 taze hazırlanmış paraformaldehit ile asinar yapıları tamir.
- 4 ° C'de 10 dakika boyunca% 0.5 Triton X-100 ile hücrelerin permeabilize
- Kültür yıkayıns üç adet 100 mM glisin, her bir yıkama için 10-15 dk kez.
- Oda sıcaklığında 1 saat için birinci blok adı IF tamponu içinde% 10 keçi serumu, ile hücrelerin bloke eder.
- 20 ug / ml keçi anti-fare F (ab '), 30 dakika boyunca birinci blok tamponu içinde 2 fragmanı olan kültürleri inkübe edin. Bu adım, Matrigel 'de immünoreaktif fare IgG türler engellemek için önemlidir.
- İkinci bloke çözeltisi içinde birincil antikor ile inkübe 4 ° C 'de (Birincil blok 20 ug / ml keçi anti-fare F (ab') 2 fragmanı) O / N
- 10-15 dakika hafifçe çalkalanarak her biri için IF tamponu ile üç kez yıkayın.
- 45 dakika boyunca IF tampon maddesi içinde floresan konjuge sekonder antikor ile inkübe edin.
- 10 dakika boyunca yıkama 3x hafifçe çalkalanarak IF tampon maddesi ile her biri.
- Çekirdekleri görselleştirmek için DAPI içeren anti-solmaya reaktif ile slaytlar monte edin.
- Slaytlar, oda sıcaklığında O / N kurumasını bekleyin.
- Görüntü elde etme: koloni mi konfokal görüntüler eldeMatrigel üzerinde yetiştirilen hücreler dsection. Daha fazla bilgi için Z istifleme ile asinar yapının tüm uzunluğu boyunca optik bölümleri bir dizi kazanır.
3. İmmunoblotting 2-iyi Odası Slaytlar Üç Boyutlu Kültür
- Buz üzerinde 2-iyi odasının slayt önceden soğutmak. Adımları 2,1-2,4 Matrigel 160 ul 2-çukurlu oda slayt örneğin kat için reaktifler arttırmak ve hücre / 1.6 ml Matrigel 2 oyuklu sürgünün her oyuğuna ilave edin.
- Üreticinin talimatlarına uygun olarak, ticari olarak temin edilebilen 3 boyutlu kültürü hücre hasat etme kiti kullanılarak Matrigel gelen asinar yapıları hasat.
- 1x ve 4 ° C'ye önceden soğutmak için yıkama, hücre ve hücre hasat tamponlar seyreltin Matrigel Yıkama ve yıkıldığında buz üzerinde yürütülmelidir.
- Hücre yıkama tamponu kullanılarak 3x asiner yapılar yıkayın.
- Hücre hasat met kullanılarak 15 ml santrifüj tüplerine asinüsü toplayınffer 4 ° C'de bir sallama düzeneği üzerinde 30 dakika kuluçkalandı ve ardından 1 ml pipet ile iyice süspansiyon karıştırın. Bu küçük parçalar halinde Matrigel kırmak ve hücre hasat tamponu içerisinde hücrelerin en yayınlayacak.
- Bir kültür santrifüj içinde 200 xg'de hücreleri Pelet. Bir P200 pipet ucu ile hücreleri topak haline hidrojelin yüzen katmanı kaldırın.
- Kit ile birlikte verilen, SDS numune tamponu içerisinde yeniden süspanse lizatları. RIPA liziz tamponu da kullanılabilir.
Malign vs Benign Meme Fenotipinin 4. Kantitasyonu
- 2,1-2,4 aşağıdaki adımları, her bir tedavi grubu için üç kopya halinde hücreleri büyütün.
- 5X veya bir slayt değiştiren ve bir bilgisayara bağlı bir faz kontrast mikroskop kullanılarak 10X çözünürlükte her kuyudan asiner yapılardan faz kontrast görüntüleri çekmek. Başka bir çerçeveden slayt hareket eden ve bu nedenle sürgünün odacıklı tüm kuyu kaplayarak görüntüleri al.
- Asiner yapılardan toplam sayısını,Tek bir yuvarlak yassı asinüs ve multiacinar yapıların veya organizasyon yoksun gelişigüzel büyüyen yapıların sayısı ve ondan çıkan dallanma süreçleri ile sayısı.
- Tek yuvarlak yassı asiner yapılardan vs malign yapıların yüzdesi ve sütun grafiği olarak arsa hesaplayın. Student t-testi ile önemini hesaplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
3D kültür etkili iyi huylu meme insan meme epitel hücre malin fenotipi ayırt etmek için kullanılabilir. Matrigel kaplı tek huylu hücreleri kolayca faz kontrast görüntüleme kullanarak bir düzlemde tek yuvarlak yassı asinüs olarak görüntülü olabilir organize küresel yapılar olarak büyür. Matrigel kaplı bir habis hücrelerin, gelişigüzel büyümesi çok yüksek bir kırılma indeksi göstermektedir ve bir düzlemde görüntüsü zordur. Şekil 1 'de gösterildiği gibi, yüksek düzeyde metastatik göğüs hücresi çizgileri SUM149 ve MDA-MB-231 onlardan kaynaklanan işlemler ile boru şekilli yapılar dallanmanın büyür ise, iyi huylu ve HME MCF10A hücreler küresel ideal asinüsü oluşturur. Benign fenotipten Böyle bir sapma olarak kullanılabilecek bir habis dönüşüm onaylamak için okunur ve bir tümör baskılayıcı olarak ya da bir tümör gibi bir promotör molekülün fonksiyonunu tanımlamak için kullanılabilir. Şekil 2, tümör baskılayıcı gen CCN6 t demonte (KD) 'de gösterildiği gibi,kötü huylu bir dönüşüm RIGGERS. Aşağı lentivirüstür dolayımlı transfeksiyonla CCN6 seviyelerini düzenlenmiş olması için tasarlanmış HME hücreleri çok erken kendi organizasyon kaybedersiniz. CCN6 KD hücreler dağınık bir fenotip gösterebilir ise 5. günde huylu kontrol hücreleri gibi mükemmel küresel yapılar büyüyen edildi. 15 günde huylu kontrol hücreleri büyüme tutuklandı ve KD hücreleri (Şekil 2) eğer izin büyümeye devam dağınık büyük tüp şeklinde yapılar oluşturmak için prolifically büyümek ise iyi tanımlanmış bir merkez lümen çevreleyen hücreler polarize katmanı göstermek olur.
Çeşitli moleküler işaretçileri habis meme fenotipe genel benign arasında ayırt etmek için avantajlı bir şekilde kullanılabilir. Iyi huylu meme farklılaşmış bir büyüme 3D kültür 15 günde bir fenotip tutuklandı gösterir. Acininin iyi Şekil 3, kontrol hücreleri de gösterildiği gibi laminin V ile imüno-boyama ile görselleştirilebilir bazal membranın bir birikimi var (Şekil 3) ile sınırlı olabilir.
Habis dönüşüm ile ilgili sinyal yolları farmakolojik inhibitörleri ve saflaştırılmış rekombinan insan (rh) proteinlerinin bir kombinasyonu kullanılarak tarif edilebilir. Şekil 4'te gösterildiği gibi, maligniteCCN6 KD HME hücrelerin t fenotip rhCCN6 protein ile eksojen işlemiyle tek yuvarlak asiner yapılardan için geri alınabilir. DAPI lekeli asinar yapıların orta bölümünde Konfokal görüntüleme açıkça rhCCN6 ile muamele CCN6 KD hücrelerde merkezi lümen ile polarize asinüsü göstermektedir. Benzer şekilde invaziv SUM149 ve P38 MAP kinaz inhibitörü ile muamele edilmiş MDA-MB-231 hücreleri habis bir fenotipe (Şekil 5A) 'de bir azalma göstermektedir. Fenotip gibi benign için dönme malign yapılar ile karşılaştırıldığında tek bir yuvarlak akinar yapıların yüzdesi hesaplanarak belirlenebilir. Inhibitörlerin spesifikliği AKT inhibitörlerinin MAP kinaz inhibitörü PD98059 ile tedavi tek bir yuvarlak akinar yapılar (Şekil 5B) için dikkate değer bir geri dönüşü gösterir ise CCN6 KD hücreleri üzerinde herhangi bir etki göstermek için başarısız olduğu gerçeği ile takdir edilebilir.
10 gün Matrigel'e yetişen habis meme hücrelerinde vs selim Şekil 1.. Faz kontrastlı görüntüler. Selim ölümsüzleştirdi insan meme epitel hücreleri (HME) ve kendiliğinden ölümsüzleştirdi MCF10A hücreler, herhangi bir çıkıntı yoksun tek bir yuvarlak yassı asinüs olarak büyür. Habis hücre çizgileri insan göğüs SUM149 ve MDA-MB-231 gibi çok düzensiz yapıları ise büyür. Ölçek çubuğu 100 mikron temsil eder. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Şekil 2.. HME-kontrol ve Matrigelin yetiştirilen CCN6 KD hücrelerinin Eşodaklı görüntüleme
Şekil 3.. Eşodaklı görüntüleme Beni'deki moleküler belirteçlerin ayırıcı ifadesini gösterirgn genel habis meme hücrelerinin. CCN6 KD HME hücreleri polarite ve hücre-hücre temas işaretleyici E-kaderin kaybı kaybı gösteren bazal polarite belirteç, alfa-6-integrin bazal membran, kaybının bozulması temsil eden, laminin V kaybı gösteriyor . Ancak kontrol hücreleri bazal membran birikimi (asinüs etrafında sağlam laminin tabaka), alfa 6 integrin bazal ekspresyonunu, GM130 apikal ekspresyonunu ve hücre-hücre birleşme kısmında E-kaderin varlığını göstermektedir. Ölçek çubuğu 50 mikron temsil eder. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Saflaştırılmış rekombinant insan CCN6 prot ile eksojen işlenerek CCN6 KD HME hücrelerin habis fenotipin Şekil 4. Tersein. CCN6 KD hücreleri 3D kültür olarak gelişigüzel invazif asinar yapıları büyür. Ancak, CCN6 KD hücreler 500 fenotip gibi daha iyi huylu gösteren, lümen temizlenmesi ile tek yuvarlak asinar fenotip rhCCN6 gösteri haline dönme ng / ml ile tedavi. Siyah ölçek çubuğu 100 mikron temsil eder ve sarı ölçek çubuğu 50 mikron temsil eder. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Küçük molekül inhibitörleri ile Şekil 5. Tedavi az malign veya fenotip gibi iyi huylu malign fenotip döner. A. P38 MAP kinaz inhibitörleri SB203850 (5 uM) ve SB202190 (10 uM) ile 2 yüksek metastatik göğüs hücre çizgileri SUM149 ve MDA-MB-231 tedavisi azaltır onlarınolarak malign davranış 3D tek yuvarlak asiner fenotip yansır. AKT inhibitörlerinin LY294002 (7.5 uM) ile muamele B. CCN6 KD HME hücreleri, Wortamannin (2 nM) herhangi bir etki gösterir, fakat MAP kinaz önleyicisi PD98059 (10 uM) ile muamele acinar organize yapılar, tek bir tur için fenotipini geri döner. büyük görüntülemek için görüntü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada bir tekrar oluşturulmuş temel membran üzerinde göğüs epitel hücrelerinin üç boyutlu kültür ve habis genel iyi huylu göğüs fenotip arasında ayrım yapmak için, bu sistemin yararını tanımlamışlardır. Bu sistem aynı zamanda, diğer glandular dokulardan kültür farklı hücre tipleri için kullanılabilir ve başarılı bir kaç 12-14 isim, kültür prostat epitel, bronşiyal epitel ve epitel hücrelerine tiroid kullanılmıştır bildirilmiştir. 3D kültür önemi, fizyolojik olarak uygun bir model olduğu gerçeğinde yatar. 3D kültür malign dönüşüm sırasında glandüler mimarisinin bozulmasına yol açar moleküler mekanizmaları içgörü kazanmak için bir araç sağlar. Ayrıca kanser tedavisi için yeni bir terapötik hedef taranmasında yararlı olabilir çalışan bir model sistem içerir. 2B kültür etkili olduğu bulunmuştur çok ilaç genellikle deneysel ve klinik applictai çok az bir etkiye sahipons 15. Örneğin 3D kültür olarak, in vivo olarak bileşiklerin etkisini tahmin etmek için önemli bir ön-klinik bir araç sağlayabilir.
3D kültür zorlu bir tekniktir ve dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. GFR Matrigel 3D hücrelerin kültürlenmesi için en yaygın olarak kullanılan katmanlarından olduğunu. Bu, 4 ° CO / H de çözülmüş alikotlandı ve ileride kullanılmak üzere -20 ° C de dondurulabilir. Tekrarlanan donma çözülme kaçınılmalıdır. GFR Matrigel 4 ° C'de sıvı olan, ancak, 37 ° C'de katılaşır ve taze ortam ile koşullandırılmış ortam değiştirilirken veya İmmünositokimya için hücreleri işlenirken işlemek için son derece zor olabilir. O her zaman Matrigel ile birlikte tüm asiner kültürlerin kaybına neden olarak klimalı ortamı çıkarmak için bir vakum aspiratör kullanmayın lütfen. Çok dallanma ağ oluşturmak MDA-MB-231 hücreleri gibi bazı agresif kanser hücre hatları halinde yapılar gibi Matrigel sur ayırmak olduğu görülmektediryüz ve genellikle değişken katıdır. Bakım ortamı çıkarırken, aksi halde kaybolacak bu kültürlerin dışında medya emmek için alınmalıdır.
Aynı derecede önemli, özellikle HME ve MCF10A gibi iyi huylu hücreleri için tek tabakalı kültürler halinde büyüyen hücrelerin bakımı ve geçiştir. Reçete medyadan izdiham veya sapma üzerinde 3D asiner oluşumunu etkileyebilir.
Bu, ticari olarak temin edilebilen 3 boyutlu kültürü hücre hasat etme kiti kullanılarak RNA ya da protein izolasyonu için işlemek için 3 boyutlu kültürlerden hücrelerin izole edilmesi mümkündür. Alternatif olarak, üç-boyutlu, doğrudan kültürleri gibi RIPA tamponu gibi deterjan bazlı liziz tamponu kullanılarak lize edilebilir (% 1 Nonidet P-40,% 0.2 SDS,% 0.5 sodyum deoksikolat, 150 mM sodyum klorür, 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 10 mM sodyum fluorür, 1 mM sodyum ortovanadat, 10 mM B-gliserofosfat, 5 ug / ml apoprotinin, 5 ug / ml löpeptin ve 100 uM fenilmetilsülfonil florit). Ancak protein resinikatyon, çünkü Matrigel içinde protein bolluğu bu durumda mümkün değildir. Bu durumda, protein lizatlan kararlı sitosolik, laktoz dehidrojenaz (LDH) gibi enzimler ve blot aktivitesini ölçmek için kullanılan kolorimetrik tahlilleri, aktin ya da tübülin GAPDH veya 3 gibi bir ev bakıcısı geni için yeniden sondaj olmalıdır normalize edilmelidir.
Ancak Matrigel işleminden hücre hasat 4 ° C de, uzun inkübasyon süresi gerektirir Bu, hücre yüzeyi proteinlerinin ekspresyonlarını etkileyebilir ve in situ imüno bu şekilde hücre yüzeyi proteinlerinin ekspresyonunu analiz etmek için daha uygun bir yöntemdir. Hafif bir sallama düzeneği üzerinde antikor için kuluçka imüno eşit asinüsü ancak en uygun hız boyama yardımcı olur ve aynı zamanda Matrigel çıkartılmasından yol açabilir gibi külbütör tür kritiktir. Antikor konsantrasyonu, optimizasyon ihtiyacı olabilir ama en antikorlar 1:100 konsantrasyonda etkin olduğu bulunmuştur. Bir morAntikorların e belirli bir liste tabloda sağlanmaktadır. Kendi özellikleri ile antikorları ayrıntılı bir listesi Debnath bulunabilir ve ark. Sıçan, tavşan ve fare gibi farklı hayvanlardan elde edilen birden çok birincil antikor ile inkübasyon 2 aynı anda gerçekleştirilebilir ancak herhangi bir çapraz reaktivite ekarte etmek için ilk olarak optimize edilmelidir .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir mali çıkarlarını beyan.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH hibe R01 CA107469, R01 CA125577 ve CG Kleer, Michigan Kanser Merkezi Destek Üniversitesi U01CA154224 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth Factor Reduced Matrigel | BD Biosciences | 354230 | Avoid repeat freeze thaw |
| Lab-Tek glass hamber slides 8-well | Thermo Fisher Scientific | 177402 | Precool on ice |
| Lab-Tek glass chamber slides 2-well | Thermo Fisher Scientific | 177380 | Precool on ice |
| Goat anti mouse F(ab´)2 fragment | Jackson Immunoresearch | 115-006-006 | |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| Fluorescent conjugated Alexa antibodies | Molecular Probes | Please look at molecular probes website | |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Molecular Probes | P36935 | |
| 3D Culture Cell Harvesting kit | Trevigen | 3448-020-k | |
| Anti-Apha-6-integrin | Fisher Scientific | MAB1378 | 1:100 dilution for IF |
| Anti-GM130 | BD Biosciences | 610822 | 1:100 dilution for IF |
| Anti-phospho-histone 3 (Ser10)FITC Conjugated | Fisher Scientific | 16-222 | 1:100 dilution for IF |
| Anti-Cleaved caspase 3 (Asp 175) | Cell Signaling | 9661s | 1:50 dilution for IF |
| Anti-E-cadherin | BD Biosciences | 610181 | 1:200 dilution for IF |
References
- Arendt, L. M., Rudnick, J. A., Keller, P. J., Kuperwasser, C. Stroma in breast development and disease. Semin. Cell Dev. Biol. 21, 11-18 (2009).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30, 256-268 (2003).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nat. Methods. 4, 359-365 (2007).
- Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 332, 821-828 (2010).
- Rosen, P. P. Rosen's breast pathology. Rosen, P. , 3rd edition, Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia, PA. (2008).
- Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay. Biochem. Cell Biol. 74, 833-851 (1996).
- Kenny, P. A., et al. The morphologies of breast cancer cell lines in three-dimensional assays correlate with their profiles of gene expression. Mol. Oncol. 1, 84-96 (2007).
- Pal, A., Huang, W., Li, X., Toy, K. A., Nikolovska-Coleska, Z., Kleer, C. G. CCN6 modulates BMP signaling via the Smad-independent TAK1/p38 pathway, acting to suppress metastasis of breast cancer. Cancer Res. 15, 4818-4828 (2012).
- Pal, A., Huang, W., Toy, K. A., Kleer, C. G. CCN6 knockdown disrupts acinar organization of breast cells in three-dimensional cultures through up-regulation of type III TGF-β receptor. Neoplasia. 14, 1067-1074 (2012).
- Wang, F., et al. Phenotypic reversion or death of cancer cells by altering signaling pathways in three-dimensional contexts. J. Natl. Cancer Inst. 94, 1494-1503 (2002).
- Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).
- Wang, R., et al. Three-dimensional co-culture models to study prostate cancer growth, progression, and metastasis to bone. Semin. Cancer Biol. 15, 353-364 (2005).
- Vaughan, M. B., Ramirez, R. D., Wright, W. E., Minna, J. D., Shay, J. W. A three-dimensional model of differentiation of immortalized human bronchial epithelial cells. Differentiation. 74, 141-148 (2006).
- Fata, J. E., Werb, Z., Bissell, M. J. Regulation of mammary gland branching morphogenesis by the extracellular matrix and its remodeling enzymes. Breast Cancer Res. 6, 1-11 (2004).
- Luca, A. C., et al. Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines. PLoS One. 8, 1-11 (2013).
