Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

ثلاثة الثقافات الأبعاد: أداة لدراسة الهندسة المعمارية عادي عنيبية مقابل التحول السرطاني للخلايا الثدي

Published: April 25, 2014 doi: 10.3791/51311
Automatic Translation
1, 2
1Department of Internal Medicine, University of Michigan Comprehensive Cancer Center, 2Department of Pathology, University of Michigan Comprehensive Cancer Center

Summary

ثلاثة الثقافة الأبعاد للخلايا الظهارية الثديية على الغشاء القاعدي المعاد هو طريقة مفيدة لتلخيص العمارة في الجسم الحي من الثدي حميدة، والتفريق بين النمط الظاهري الخبيثة من النمط الظاهري الثدي حميدة. الأهم من ذلك، هذا النظام يمكن تطبيقه على دراسة سرطان الغازية في الأنسجة الأخرى.

Abstract

سرطان الثدي الغازية هي مجموعة من الأورام الظهارية الخبيثة التي تتميز غزو الأنسجة المجاورة والميل إلى تنتشر. تفاعل الإشارات بين الخلايا السرطانية والمكروية التي تمارس تأثيرا قويا على نمو سرطان الثدي والسلوك البيولوجية 1. ومع ذلك، يتم فقدان معظم هذه الإشارات من المصفوفة خارج الخلية أو سلوكه أهميتها عندما تزرع الخلايا في الثقافة ثنائية الأبعاد (2D) كما أحادي الطبقة. في السنوات الأخيرة، برز ثلاثي الأبعاد (3D) الثقافة على الغشاء القاعدي المعاد كوسيلة لاختيار لألخص هندسة الأنسجة من خلايا الثدي الحميدة والخبيثة. الخلايا المزروعة في 3D الإبقاء على الإشارات الهامة من المصفوفة خارج الخلية وتوفير نظام فيفو السابقين 2،3 ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. من المذكرة، هناك أدلة متزايدة تشير إلى أن الخلايا تتصرف بشكل مختلف عندما نمت في 3D بالمقارنة مع 2D 4. الثقافة 3Dيمكن استخدامها بشكل فعال كوسيلة للتمييز الخبيث من النمط الظاهري النمط الظاهري الثدي حميدة والتي تدعم إشارات الخلوية والجزيئية المعنية 3. واحدة من الخصائص المميزة للخلايا الظهارية الحميدة هي أنها الاستقطاب بحيث السيتوبلازم قمي هو نحو التجويف وتقع السيتوبلازم القاعدية على الغشاء القاعدي. يتم فقدان هذه الأقطاب apico القاعدية سرطان الثدي في الغازية، التي تتميز الفوضى الخلوية وتشكيل anastomosing والمتفرعة الأنابيب التي تتسرب جزافا ستروما المحيطة بها. يمكن استنساخها هذه الاختلافات التشريحية المرضية بين الغدة الحميدة وسرطان الغازية في 3D 6،7. باستخدام قراءة عموميات المناسبة مثل تحديد الكميات من الهياكل عنيبية دورة واحدة، أو التفاضلية التعبير الواسمات الجزيئية التحقق من صحة لتكاثر الخلايا، والاستقطاب وموت الخلايا المبرمج في تركيبة مع تقنيات البيولوجيا الجزيئية والخلوية الأخرى، الثقافة 3Dه يمكن أن توفر أداة مهمة لفهم أفضل للتغيرات الخلوية خلال التحول الخبيث وترسيم إشارات المسؤولة.

Introduction

ثلاثة الثقافة الأبعاد (3D) في خلايا الثدي الظهارية على الغشاء القاعدي المعاد هو نظام نموذجا هاما لدراسة النمط الظاهري المعقدة والإشارات المرتبطة الثدي الطبيعية وسرطان الثدي 2،3. وحدة وظيفية من الثدي هو وحدة مفصص القناة محطة (TDLU) الذي يتكون من القناة الصغيرة التي فروع في عنيبات. وعنيبات ​​هي هياكل درجة عالية من التنظيم، يتكون من طبقتين الخلايا، والخلايا الظهارية عضلية ظهارية، والتي يحيط بها الغشاء القاعدي 5. أهم السمات المميزة لعنيبات ​​العادية هي الاستقطاب الخلوية، المرفق إلى الغشاء القاعدي الكامنة والاتصالات خلية خلية متخصصة. تعطل هذه المنظمة المعقدة في سرطان الغازية. ثقافات 2D تستخدم على نطاق واسع، حيث تزرع الخلايا كما الطبقات الوحيدة، لا تسمح لتشكيل عنيبات. وبالتالي، فإن الثقافة أحادي الطبقة يعاني من نقص في توفير نظام للقبض على العلاقة المعقدة بين الخلايا الظهاريةفي الثدي العادية والتحرر من القيود في سرطان الثدي. وقد تم تطوير الثقافات الظهارية monotypic الوظيفية للخلايا الثدي في العديد من المختبرات 2،3. ينطوي الثقافة 3D نمو خلايا الثدي على Matrigel، وهو مستخلص مشتق من solubilized Engelbreth-هولم-سرب خلايا فأر ساركوما ومتاح تجاريا. الطبقات التحتية 3D أخرى مثل الكولاجين تستخدم أيضا أنا. خلايا الثدي يمكن تربيتها في 3D بواسطة 3D مقايسة جزءا لا يتجزأ، حيث يتم استزراع الخلايا جزءا لا يتجزأ من Matrigel 2. بدلا من ذلك، الخلايا يمكن تربيتها من قبل 3D على رأس الفحص، وتسمى أيضا فحص 3D تراكب، والتي هي فعالة من حيث التكلفة لأنها تتطلب أقل من حجم Matrigel، ويسهل مرور الوقت مراقبة تشكيل مستعمرة من قبل التصوير النقيض من المرحلة، ويعتبر مثاليا لتصوير الوضع الطبيعي 2 في -3. تم استخدام 3D على رأس فحص لتحديد العلاقة بين النمط الظاهري عنيبية والتعبير الجيني الشخصي 7.

يمكن فعاليه الثقافة 3Dاعل تستخدم للتمييز بين الخلايا الطبيعية وحميدة من سرطان الغازية. خلايا الثدي العادية وحميدة تشكيل هياكل النمو القبض الاستقطاب مع التجويف واضحة المعالم في المركز على Matrigel في حين خلايا سرطان الغازية تنمو بغزارة وبشكل عشوائي مع عدم وجود تطهير التجويف. E6/E7 خلدت الخلايا الظهارية الثديية البشرية وخط الخلية MCF10A، الذي هو خط خلية خلد عفويا معزولا عن المريض 36 سنة مع التغيرات فيبروكيستيك، وقد استخدمت بنجاح لاستعادة النمط الظاهري الثدي حميدة في 3D 3،8 وكانت بمثابة نظام نموذجي لدراسة وظيفة القامع أنكجنيك والورم من عدة جزيئات 8،9. هذه الخلايا حميدة يمكن هندستها للتلاعب الجيني (ق) من الفائدة من خلال إدخال الفيروسة البطيئة / الارتجاعي. إذا كان الجين (ق) من الفائدة هو القامع الورم، وضربة قاضية shRNA بوساطة يؤدي إلى تحول خبيث في حين إذا كانت الجينات في المصالح هو من overexpression الجين الورمي في خلايا حميدةيجب أن يظهر النمط الظاهري الخبيثة. في كلتا الحالتين الهياكل عنيبية شكلت في 3D يمكن التقاط التحول الخبيث.

الخلايا واحد مطلي حميدة في 3D تبدأ في التكاثر وتشكيل الهياكل جولة كروية. بعد يوم 5-8 هذا الركام كروية من الخلايا سوف تفرق في طبقة المحيطة الاستقطاب من الخلايا التي هي في اتصال مع Matrigel، وكتلة من الخلايا الداخلية أقل الاستقطاب، والتي تفتقر اتصال مع Matrigel. في 10-15 يوما المقبلة سوف تبدأ الخلايا الداخلية للموت عن طريق موت الخلايا المبرمج تشكيل التجويف واضحة. الخلايا الخبيثة ستنمو فقدان جزافا قطبية بهم. الخلايا الخبيثة للغاية عادة تشكيل هياكل المتفرعة. هذه الاختلافات في النمط الظاهري يمكن التقاطها بواسطة الوقت الفاصل بين مرحلة التصوير وعلى النقيض من قبل في الموقع المناعية مع الواسمات الجزيئية ذات الصلة. علامات الأكثر شيوعا هي ألفا 6 إنتغرين، وقطبية علامة القاعدية، في تركيبة مع انتشار علامة الفوسفات هيستون-3 وapoptotجيم علامة المشقوق كاسباس 3. وهذا الأخير مهم لتحديد ما إذا كان هناك تشكيل التجويف في وسط عنيبات، وهي سمة من خلايا الثدي العادية وحميدة. وتشمل الاستقطاب والاتصال خلية خلية علامات أخرى GM130، laminin، إدارة مخاطر المؤسسات، E-كادهيرين. بالتناوب على خطوط خلايا سرطان الثدي يمكن هندستها لمعالجة الجينات في المصالح. في هذه الحالة الارتداد إلى المزيد من النمو القبض على النمط الظاهري حميدة يمكن أن تستخدم تلا تمييزها عن النمط الظاهري السرطان.

ويمكن أيضا أن تستخدم الثقافة 3D بعناية لترسيم مسارات الإشارات المشاركة في التحول الخبيث 10-11. باستخدام المذكورة أعلاه الرافضة قراءة، مثبطات الدوائية، والأجسام المضادة ومنع أو البروتينات المؤتلف ويمكن استخدام يتم تحديد في الإشارات الجزيئية التي تؤدي إلى التحول الخبيث. مع الجهود المستمرة من مختلف المختبرات فمن الممكن لاستخراج الخلايا من 3D لعزل الحمض النووي الريبي، وكذلك إعداد لست] لimmunoblotting واللقاحاتnoprecipitation. يتم وصف هذه الاستراتيجيات في خطوة بخطوة وبطريقة مفصلة في البروتوكول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد المواد والثقافة وسائل الإعلام

  1. عامل النمو ذوبان الجليد خفض (GFR) Matrigel عند 4 درجة CO / N.
  2. الاحماء وسائل الإعلام كاملة عن خط الخلية المطلوبة عند 37 درجة مئوية. MCF10A-ATCC المحدد وسائل الإعلام؛ HME-هام في F-12 المتوسطة تستكمل مع 5٪ مصل الجنين البقري، 1 ميكروغرام / مل الهيدروكورتيزون، 5 ميكروغرام / مل الأنسولين، 10 نانوغرام / مل عامل نمو البشرة، و 100 نانوغرام / مل بكتيريا الكوليرا؛ F-12-SUM149 وسائل الإعلام هام لتستكمل مع 5٪ FBS، 2 ميكروغرام / مل الهيدروكورتيزون و 5 ميكروغرام / مل الأنسولين؛ وMDA-MB-231-10٪ FBS-DMEM
  3. Precool شريحة الغرفة 8 جيدا على الجليد.
  4. إعداد الأنسجة غطاء الثقافة واللوازم.

2. ثلاثة الثقافة الأبعاد في 8 جيدا غرفة الشرائح

  1. معطف كل بئر من الشريحة 8 جيدا مع 40 ميكرولتر من Matrigel GFR. إضافة Matrigel في وسط الشريحة وانتشرت بعد ذلك باستخدام ماصة غيض P200. محاولة لنشر بالتساوي قدر الإمكان، وتجنب فقاعات وoverspreading التي يمكن أن تؤدي إلىتشكيل الغضروف المفصلي.
  2. احتضان الشرائح عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO 2. في حين أن Matrigel وترسيخ، يعرض للتريبسين الخلايا، وجمع وتدور في 150 x ج في زراعة الأنسجة الطرد المركزي لمدة 4 دقائق.
  3. عد الخلايا وتضعف إلى 12،500 خلية / مل في وسائل الإعلام كاملة من خط الخلية منها. إضافة GFR Matrigel إلى 2٪ وإضافة 400 ميكرولتر لكل بئر من الشريحة غرفة Matrigel precoated.
  4. احتضان الشرائح في حاضنة CO 2. تعطي التغييرات الطازجة وسائل الإعلام كاملة كل يوم 4 حتى ال 15 يوما.
  5. العلاج مع مثبطات دوائية: للدراسات المانع إضافة مثبطات جزيء صغير إلى وسائل الإعلام كاملة في وقت الطلاء تليها التغييرات وسائل الإعلام الجديدة تستكمل مع مثبطات كل ثلاثة أيام في حين تزايد الخلايا على Matrigel GFR.
  6. المعاملة مع البروتين النقي:
    1. لوحة الخلايا التالية الخطوات 2،1-2،3. السماح للثقافات أن ينمو لمدة 4 أيام تليها starvati المصلعلى لمدة 16 ساعة.
    2. في يوم 5، وعلاج الخلايا مع التركيز المناسب من البروتين المنقى في 0.1٪ FBS تستكمل وسائل الإعلام إلى مصل الخلايا جوعا. تعطي تغير وسائل الإعلام الجديدة مع البروتين النقي بعد أيام 2.
    3. في يوم 10 يحل محل وسائل الإعلام مكيفة مع وسائل الإعلام HME كاملة. السماح للثقافات أن ينمو لمدة 5 أيام أخرى.
  7. المناعي تلطيخ هياكل عنيبية نمت على Matrigel:
    1. إعداد بارافورمالدهيد 2٪، 0.5٪ تريتون X-100 و 100 ملي جليكاين في برنامج تلفزيوني 1X، ودرجة الحموضة 7.4. إعداد العازلة المناعي (IF العازلة) التي تضم برنامج تلفزيوني 1X تحتوي على 0.1٪ ألبومين المصل البقري، 0.2٪ تريتون X-100، 0.05٪ توين 20.
    2. استخدام غيض ماصة P200 لنضح بعناية وسائل الإعلام مكيفة.
    3. إصلاح هياكل عنيبية مع 2٪ الطازجة بارافورمالدهيد في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 20 دقيقة.
    4. Permeabilize الخلايا مع 0.5٪ تريتون X-100 لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
    5. غسل الثقافةق ثلاث مرات مع 100 ملي جليكاين، 10-15 دقيقة لكل غسل.
    6. منع الخلايا مع 10٪ مصل الماعز في المنطقة العازلة IF، ودعا كتلة الأولية، لمدة 1 ساعة على RT.
    7. احتضان الثقافات مع 20 ميكروغرام / مل الماعز المضادة الماوس F (أ ب ') 2 جزء في كتلة عازلة الأولية لمدة 30 دقيقة. هذه الخطوة مهمة لمنع الأنواع مفتش الماوس مناعيا في Matrigel.
    8. احتضان مع الأجسام المضادة الأولية في عرقلة الحل الثاني (كتلة الابتدائية +20 ميكروغرام / مل الماعز المضادة الماوس F (أ ب ') 2 جزء) O / N عند 4 درجة مئوية.
    9. يغسل ثلاث مرات مع العازلة IF لمدة 10-15 دقيقة لكل منهما مع هزاز لطيف.
    10. احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية مترافق فلوري في IF العازلة لمدة 45 دقيقة.
    11. غسل 3X لمدة 10 دقيقة مع كل IF العازلة مع هزاز لطيف.
    12. جبل الشرائح مع مكافحة تتلاشى كاشف تحتوي على دابي لتصور النوى.
    13. تسمح الشرائح لتجف O / N في RT.
    14. الحصول على الصور: الحصول على صور متحد البؤر في مستعمرة ميلdsection من الخلايا المزروعة على رأس Matrigel. للحصول على مزيد من المعلومات سلسلة من المقاطع البصرية في جميع أنحاء كامل طول الهيكل عنيبية بواسطة Z التراص.

3. ثلاثة الثقافة الأبعاد في 2 جيدا غرفة الشرائح لImmunoblotting

  1. Precool شريحة غرفة 2 جيدا على الجليد. اتبع الخطوات من 2،1-2،4 الارتقاء الكواشف ل2 جيدا غرفة الشريحة مثل معطف مع 160 ميكرولتر من Matrigel وإضافة 1.6 مل من خلية / Matrigel المزيج إلى كل بئر من الشريحة 2 جيدا.
  2. حصاد هياكل عنيبية من Matrigel باستخدام المتاحة تجاريا عدة الحصاد خلية ثقافة 3D باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
  3. تمييع غسل الخلايا وحصاد الخلايا المخازن المؤقتة إلى 1X و precool إلى 4 درجات مئوية. ينبغي أن يتم غسل وبإزاحة Matrigel خارجا على الجليد.
  4. غسل الهياكل عنيبية 3X باستخدام غسل العازلة الخلية.
  5. جمع عنيبات ​​إلى 15 مل أنابيب الطرد المركزي باستخدام بو حصاد الخلاياffer تليها 30 دقيقة الحضانة على الكرسي الهزاز في 4 درجات مئوية. مزيج التعليق بشكل جيد مع ماصة 1 مل. وهذا كسر Matrigel في قطع صغيرة والافراج عن معظم الخلايا في المخزن المؤقت حصاد الخلايا.
  6. بيليه الخلايا في 200 x ج في جهاز للطرد المركزي الثقافة. إزالة الطبقة العائمة من هيدروجيل من الخلايا مكعبات مع طرف ماصة P200.
  7. resuspend ولست] في SDS عينة العازلة المتوفرة مع الطقم. ويمكن أيضا أن تستخدم RIPA العازلة تحلل.

4. الكمي لمقابل خبيثة حميدة النمط الظاهري الثدي

  1. تنمو الخلايا في يثلث لكل مجموعة العلاج الخطوات التالية 2،1-2،4.
  2. التقاط صور النقيض من المرحلة هياكل عنيبية من كل بئر في 5X أو 10X القرار باستخدام المجهر النقيض من المرحلة تعلق على شيفتر الشريحة وجهاز كمبيوتر. اتخاذ الصور عن طريق تحريك الشريحة من إطار واحد إلى آخر، وبالتالي تغطي البئر بالكامل من الشريحة غرف.
  3. عد العدد الكلي للهياكل عنيبية،عدد واحد عنيبات ​​شقة المستديرة وعدد من الهياكل multiacinar أو هياكل المتزايد جزافا تفتقر إلى التنظيم ومع العمليات المتفرعة المنبثقة عنها.
  4. حساب النسبة المئوية من واحد هياكل عنيبية شقة جولة مقابل الهياكل الخبيثة والمؤامرة كما عمود الرسم البياني. حساب الأهمية التي كتبها t-اختبار الطالب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الثقافة 3D يمكن استخدامها بشكل فعال لتمييز النمط الظاهري الخبيثة في خلايا الثدي الظهارية البشرية من الثدي حميدة. الخلايا واحد مطلي على Matrigel حميدة تنمو هياكل كروية المنظمة التي يمكن بسهولة يمكن تصوير واحد كما عنيبات ​​شقة جولة في طائرة واحدة باستخدام التصوير النقيض من المرحلة. الخلايا الخبيثة واحد مطلي على Matrigel تنمو بشكل عشوائي، وتظهر معامل الانكسار عالية جدا ويصعب الصورة في طائرة واحدة. كما هو مبين في الشكل 1، وهانى حميدة والخلايا MCF10A تشكيل كروية عنيبات ​​أبحث بينما خطوط الخلايا الثدي النقيلي غاية SUM149 وMDA-MB-231 تنمو وتتفرع الهياكل الأنبوبية مع العمليات المنبثقة منها. مثل هذا الانحراف عن النمط الظاهري حميدة يمكن استخدامها بوصفها تلا لتأكيد التحول الخبيث، ويمكن استخدامها لتحديد وظيفة جزيء بمثابة القامع الورم أو كمشجع الورم. كما هو مبين في الشكل 2، وضربة قاضية (KD) من الجينات الكابتة للورم CCN6 رالحفارون التحول الخبيث. خلايا HME هندستها لوينظم أسفل مستويات CCN6 بواسطة الفيروسة البطيئة بوساطة ترنسفكأيشن تفقد منظمتهم من وقت مبكر جدا. في يوم 5 الخلايا السيطرة حميدة تنمو هياكل كروية كما الكمال في حين تظهر خلايا CCN6 دينار النمط الظاهري غير منظم. بعد يوم 15 الخلايا السيطرة حميدة أصبح النمو القبض عليهم وتظهر طبقة الاستقطاب من الخلايا المحيطة التجويف المركزي واضحة المعالم في حين أن الخلايا تنمو بغزارة دينار كويتي لتشكيل هياكل أنبوبية كبيرة غير منظمة والتي تستمر في النمو إذا سمحت (الشكل 2).

العديد من الواسمات الجزيئية يمكن استخدامها لميزة التفريق بين حميدة مقابل الخبيثة النمط الظاهري الثدي. يظهر الثدي حميدة نمو متباينة القبض النمط الظاهري بعد يوم 15 في الثقافة 3D. وعنيبات ​​ديك ترسب من الغشاء القاعدي الذي يمكن أن تصور من قبل المناعية مع laminin V كما هو مبين بوضوح في الخلايا تحكم في الشكل 3 (الشكل 3).

مسارات الإشارات المشاركة في التحول السرطاني ويمكن تحديد ذلك باستخدام مزيج من مثبطات الدوائية والبروتينات المنقى المؤتلف الإنسان (RH). كما هو مبين في الشكل 4 malignanر النمط الظاهري للخلايا CCN6 دينار HME يمكن عادت إلى هياكل عنيبية دورة واحدة عن طريق العلاج الخارجية مع البروتين rhCCN6. التصوير متحد البؤر في منتصف القسم للهياكل عنيبية دابي الملون تظهر بوضوح عنيبات ​​الاستقطاب مع التجويف المركزي في الخلايا CCN6 دينار تعامل مع rhCCN6. وبالمثل، فإن SUM149 الغازية وMDA-MB-231 الخلايا المعالجة مع P38 MAP مثبط كيناز يظهر انخفاض في النمط الظاهري الخبيثة (الشكل 5A). الارتداد إلى حميدة مثل النمط الظاهري يمكن أن يكون كميا عن طريق حساب النسبة المئوية للهياكل عنيبية دورة واحدة بالمقارنة مع الهياكل الخبيثة. خصوصية مثبطات يمكن تقدير من حقيقة أن مثبطات AKT تفشل في إظهار أي تأثير على الخلايا CCN6 دينار كويتي في حين العلاج مع PD98059 MAP مثبط كيناز يظهر الارتداد الملحوظ للهياكل عنيبية دورة واحدة (الشكل 5B).

الشكل 1 الشكل 1. الصور النقيض من المرحلة حميدة مقابل خلايا الثدي الخبيثة نمت على Matrigel لمدة 10 يوما. الخلايا حميدة خلد الإنسان الظهارية الثديية (HME) والخلايا MCF10A خلدت عفويا تنمو دورة واحدة عنيبات ​​مسطحة خالية من أي نتوء. في حين أن خطوط الخلايا الخبيثة الثدي البشري SUM149 وMDA-MB-231 تنمو هياكل كما غير منظم للغاية. يمثل شريط مقياس 100 ميكرون. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 2
الشكل 2. التصوير متحد البؤر من السيطرة HME والخلايا CCN6 دينار نمت على Matrigel اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 3
ويبين الشكل 3. التصوير متحد البؤر التعبير التفاضلي الواسمات الجزيئية في بنيGN مقابل خلايا الثدي الخبيثة. تظهر الخلايا CCN6 دينار HME فقدان laminin V، وهو ما يمثل اختلال الغشاء القاعدي، وفقدان القاعدية قطبية علامة ألفا-6-إنتغرين، مشيرا إلى فقدان القطبية وفقدان خلية خلية الاتصال علامة E-كادهيرين . ولكن الخلايا السيطرة تظهر ترسب الغشاء القاعدي (طبقة laminin سليمة حول عنيبات)، والتعبير القاعدية ألفا 6 إنتغرين والتعبير قمية من GM130 وجود E-كادهيرين في تقاطع خلية خلية. يمثل شريط النطاق 50 ميكرومتر. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 4
الشكل 4. عكس النمط الظاهري للخلايا الخبيثة CCN6 دينار HME عن طريق العلاج الخارجية مع المنقى المؤتلف الإنسان CCN6 البروتوكول الاضافيعين. الخلايا دينار CCN6 تنمو العشوائية كما والهياكل عنيبية الغازية في الثقافة 3D. ومع ذلك، وخلايا CCN6 دينار تعامل مع 500 نانوغرام / مل من rhCCN6 المعرض الارتداد إلى واحد الجولة عنيبية النمط الظاهري مع المقاصة من التجويف، مما يدل على أن أكثر اعتدالا مثل النمط الظاهري. يمثل شريط أسود على نطاق و100 ميكرون ويمثل شريط النطاق الأصفر 50 ميكرومتر. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 5
الرقم 5. العلاج مع مثبطات جزيء صغير تعود النمط الظاهري الخبيثة إلى أقل خبيثة أو حميدة مثل النمط الظاهري. A. علاج 2 النقيلي غاية خطوط الخلايا الثدي SUM149 وMDA-MB-231 مع P38 مثبطات كيناز MAP SB203850 (5 ميكرومتر) وSB202190 (10 ميكرومتر) يقلل بهموينعكس السلوك الخبيث كما في النمط الظاهري واحد عنيبية مستديرة حول 3D. خلايا B. CCN6 دينار HME تعامل مع مثبطات AKT LY294002 (7.5 ميكرومتر)، Wortamannin (2 نانومتر) لا يظهر أي تأثير ولكن العلاج مع خريطة مثبط كيناز PD98059 (10 ميكرومتر) يعود النمط الظاهري لدورة واحدة نظمت هياكل عنيبية. انقر هنا لعرض أكبر الصورة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وصفناها هنا ثقافة ثلاثية الأبعاد للخلايا الثدي الظهارية على الغشاء القاعدي المعاد وفائدة هذا النظام للتمييز بين الخبيث مقابل حميدة النمط الظاهري الثدي. ويمكن أيضا أن تستخدم هذا النظام لثقافة أنواع مختلفة من الخلايا من أنسجة غدية وأخرى تم الإبلاغ عن أن تكون قد استخدمت بنجاح لالظهارية الثقافة البروستاتا، الظهارية القصبية، والخلايا الظهارية الغدة الدرقية، وهذا غيض من فيض 12-14. أهمية الثقافة 3D يكمن في حقيقة أنه هو نموذج من الناحية الفسيولوجية ذات الصلة. يوفر ثقافة 3D وسيلة لاكتساب نظرة ثاقبة الآليات الجزيئية التي تؤدي إلى اختلال البنية غدي خلال التحول الخبيث. كما يوفر النظام نموذج العمل التي يمكن أن تكون مفيدة في الكشف أهداف علاجية جديدة لعلاج السرطان. العديد من الأدوية التي وجدت لتكون فعالة في ثقافة 2D غالبا ما يكون لها أثر يذكر في applictai التجريبية والسريريةإضافات 15. على هذا النحو الثقافة 3D يمكن أن توفر أداة هامة قبل السريرية للتنبؤ تأثير المركبات في الجسم الحي.

الثقافة 3D هي تقنية صعبة ويجب أن يتم تنفيذ بعناية. GFR Matrigel هو الطبقات التحتية الأكثر استخداما لزراعة الخلايا في 3D. يمكن إذابة عند 4 درجة CO / N، aliquoted ومجمدة في -20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. وينبغي تجنب تكرار تجميد ذوبان الجليد. GFR Matrigel هو السائل في 4 درجات مئوية ولكن يتصلب عند 37 درجة مئوية ويمكن أن يكون صعبا للغاية للتعامل مع وسائل الإعلام عند تغيير مشروطة مع وسائل الإعلام الجديدة أو أثناء معالجة خلايا مناعية ل. يرجى عدم استخدام الشافطة فراغ لإزالة وسائل الإعلام مكيفة لأنه يؤدي حتما إلى فقدان الثقافات عنيبية كامل مع Matrigel. ويلاحظ أنه في حالة بعض خطوط الخلايا السرطانية العدوانية مثل MDA-MB-231 الخلايا التي تشكل الشبكة المتفرعة جدا مثل هياكل Matrigel يمكن فصل من سورويواجه هو في كثير من الأحيان العائمة. ينبغي توخي الحذر لامتصاص سائل الإعلام للخروج من هذه الثقافات وإلا فإنها ستفقد أثناء إزالة وسائل الإعلام.

نفس القدر من الأهمية هو الرعاية ومرور الخلايا متنامية مع الثقافات أحادي الطبقة وخاصة بالنسبة للخلايا حميدة مثل HME وMCF10A. على التقاء أو الانحراف من وسائل الإعلام المقررة قد تؤثر على تشكيل عنيبية في 3D.

فمن الممكن لعزل الخلايا من الثقافات 3D لمعالجة RNA أو البروتين لعزل باستخدام المتاحة تجاريا عدة الحصاد خلية ثقافة 3D. بالتناوب الثقافات ثلاثية الأبعاد يمكن هي lysed مباشرة باستخدام المنظفات عازلة المستندة إلى تحلل مثل عازلة RIPA (1٪ Nonidet P-40، 0.2٪ SDS، 0.5٪ deoxycholate الصوديوم، كلوريد الصوديوم 150 ملم، و 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4، 10 ملي فلوريد الصوديوم، 1 ملم orthovanadate الصوديوم، و 10 ملي ب جليسروفوسفات، 5 ميكروغرام / مل apoprotinin، 5 ميكروغرام / مل leupeptin، و 100 ميكرومتر phenylmethylsulfonyl الفلورايد). ومع ذلك البروتين quantifiالموجبة ليس من الممكن في هذه الحالة بسبب وفرة البروتين في Matrigel. وبالتالي ينبغي تطبيع لست] البروتين مع ينبغي reprobed المقايسات اللونية المستخدمة لقياس نشاط الإنزيمات عصاري خلوي مستقرة، مثل نازعة اللاكتوز (LDH) والبقع لجين التدبير المنزلي مثل الأكتين أو تويولين أو GAPDH 3.

ولكن حصاد الخلايا من عملية Matrigel يتطلب فترة طويلة الحضانة مدة في 4 درجات مئوية. وهذا يمكن أن يؤثر على البيانات الشخصية التعبير عن بروتينات سطح الخلية وعلى هذا النحو المناعية في الموقع هي طريقة أكثر ملاءمة لتحليل التعبير عن بروتينات سطح الخلية. لالمناعية الأجسام المضادة الحضانة على الروك لطيف مفيد في تلطيخ بالتساوي عنيبات ​​لكن السرعة الأمثل ونوع الروك أمر بالغ الأهمية لأنها يمكن أن تؤدي أيضا إلى تهجير من Matrigel. تركيز الأجسام المضادة قد تحتاج الأمثل ولكن تم العثور على معظم الأجسام المضادة لتكون فعالة في 1:100 التركيز. A موريتم توفير البريد قائمة محددة من الأجسام المضادة في الجدول. ويمكن الاطلاع على قائمة مفصلة من الأجسام المضادة مع مواصفاتها في Debnath وآخرون يمكن أن يتم في وقت واحد مع 2 حضانة الأجسام المضادة الأولية أكثر من واحد تم الحصول عليها من الحيوانات المختلفة مثل الفئران والأرانب والفئران خارج ولكن ينبغي أن يكون الأمثل في البداية لاستبعاد أي تفاعل عبر .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01 CA107469، R01 CA125577، وU01CA154224 لCG Kleer، جامعة مركز السرطان دعم ميشيغان.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Growth Factor Reduced Matrigel BD Biosciences 354230 Avoid repeat freeze thaw 
Lab-Tek glass hamber slides 8-well Thermo Fisher Scientific 177402 Precool on ice 
Lab-Tek glass chamber slides 2-well  Thermo Fisher Scientific 177380 Precool on ice 
Goat anti mouse F(ab´)2 fragment Jackson Immunoresearch 115-006-006
Normal goat serum Jackson Immunoresearch 005-000-121
Fluorescent conjugated Alexa antibodies Molecular Probes Please look at molecular probes website
Prolong gold antifade reagent with DAPI Molecular Probes P36935
3D Culture Cell Harvesting kit Trevigen 3448-020-k
Anti-Apha-6-integrin Fisher Scientific MAB1378 1:100 dilution for IF
Anti-GM130 BD Biosciences 610822 1:100 dilution for IF
Anti-phospho-histone 3 (Ser10)FITC Conjugated Fisher Scientific 16-222 1:100 dilution for IF
Anti-Cleaved caspase 3 (Asp 175) Cell Signaling 9661s 1:50 dilution for IF
Anti-E-cadherin BD Biosciences 610181 1:200 dilution for IF

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arendt, L. M., Rudnick, J. A., Keller, P. J., Kuperwasser, C. Stroma in breast development and disease. Semin. Cell Dev. Biol. 21, 11-18 (2009).
  2. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30, 256-268 (2003).
  3. Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nat. Methods. 4, 359-365 (2007).
  4. Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 332, 821-828 (2010).
  5. Rosen, P. P. Rosen's breast pathology. Rosen, P. , 3rd edition, Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia, PA. (2008).
  6. Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay. Biochem. Cell Biol. 74, 833-851 (1996).
  7. Kenny, P. A., et al. The morphologies of breast cancer cell lines in three-dimensional assays correlate with their profiles of gene expression. Mol. Oncol. 1, 84-96 (2007).
  8. Pal, A., Huang, W., Li, X., Toy, K. A., Nikolovska-Coleska, Z., Kleer, C. G. CCN6 modulates BMP signaling via the Smad-independent TAK1/p38 pathway, acting to suppress metastasis of breast cancer. Cancer Res. 15, 4818-4828 (2012).
  9. Pal, A., Huang, W., Toy, K. A., Kleer, C. G. CCN6 knockdown disrupts acinar organization of breast cells in three-dimensional cultures through up-regulation of type III TGF-β receptor. Neoplasia. 14, 1067-1074 (2012).
  10. Wang, F., et al. Phenotypic reversion or death of cancer cells by altering signaling pathways in three-dimensional contexts. J. Natl. Cancer Inst. 94, 1494-1503 (2002).
  11. Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).
  12. Wang, R., et al. Three-dimensional co-culture models to study prostate cancer growth, progression, and metastasis to bone. Semin. Cancer Biol. 15, 353-364 (2005).
  13. Vaughan, M. B., Ramirez, R. D., Wright, W. E., Minna, J. D., Shay, J. W. A three-dimensional model of differentiation of immortalized human bronchial epithelial cells. Differentiation. 74, 141-148 (2006).
  14. Fata, J. E., Werb, Z., Bissell, M. J. Regulation of mammary gland branching morphogenesis by the extracellular matrix and its remodeling enzymes. Breast Cancer Res. 6, 1-11 (2004).
  15. Luca, A. C., et al. Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines. PLoS One. 8, 1-11 (2013).

Tags

الطب، العدد 86، والظروف المرضية والعلامات والأعراض، والأورام، ثلاث ثقافات الأبعاد، Matrigel، خلايا الثدي، النمط الظاهري الخبيثة، مما يشير
ثلاثة الثقافات الأبعاد: أداة لدراسة الهندسة المعمارية عادي عنيبية مقابل التحول السرطاني للخلايا الثدي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pal, A., Kleer, C. G. Three… More

Pal, A., Kleer, C. G. Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells. J. Vis. Exp. (86), e51311, doi:10.3791/51311 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter