Summary
Dreidimensionale Kultur von Säugetier-Epithelzellen auf einem rekonstituierten Basalmembran ist eine nützliche Methode, um die in vivo-Architektur der gutartigen Brust rekapitulieren und den malignen Phänotyp von gutartigen Brust Phänotyp zu differenzieren. Wichtiger ist, kann dieses System angewandt werden, um invasive Karzinome in anderen Geweben zu untersuchen.
Abstract
Invasive Mammakarzinome sind eine Gruppe von malignen epithelialen Tumoren gekennzeichnet durch die Invasion von benachbarten Geweben und Neigung zu metastasieren. Das Zusammenspiel von Signalen zwischen Krebszellen und ihrer Mikroumgebung übt einen starken Einfluss auf das Wachstum von Brustkrebs und biologischen Verhalten ein. Die meisten dieser Signale aus der extrazellulären Matrix verloren gehen oder ihre Relevanz under wird, wenn Zellen in einem zweidimensionalen Kultur (2D) als Monolayer gezüchtet. In den letzten Jahren hat dreidimensionale (3D) Kultur auf einer rekonstituierten Basalmembran als Methode der Wahl, um die Gewebearchitektur von benignen und malignen Brustzellen rekapitulieren entstanden. Zellen in 3D gewachsen behalten die wichtigen Signale aus der extrazellulären Matrix und einen physiologisch relevanten ex vivo-System 2,3. Zu beachten ist, gibt es immer mehr Hinweise darauf, dass Zellen verhalten sich anders, wenn im Vergleich zu 2D in 3D 4 gewachsen. 3D-Kulturkann effektiv als ein Mittel, um die malignen Phänotyp von der gutartigen Brust Phänotyp zu differenzieren und für die Untermauerung der zellulären und molekularen Signal verwendet werden 3 beteiligt. Eines der charakteristischen Merkmale von gutartigen epithelialen Zellen ist, dass sie polarisiert sind, so daß die apikale Zytoplasma zu dem Lumen und der basalen Zytoplasma ruht auf der Basalmembran. Diese apikal-basalen Polarität in der invasiven Mammakarzinome, die durch zelluläre Desorganisation und Bildung anastomosierenden und Verzweigung Tubuli, die planlos infiltriert das umgebende Stroma gekennzeichnet sind verloren. Diese histopathologischen Unterschiede zwischen gutartigen Drüse und invasives Karzinom in 3D 6,7 reproduziert werden. Mit den entsprechenden Lese-outs, wie die Quantifizierung der einzelnen Runde acinar Strukturen oder differentielle Expression von validierten molekulare Marker für Zellproliferation, Apoptose Polarität und in Kombination mit anderen molekularen und zellbiologischen Techniken, 3D-culturE kann ein wichtiges Instrument, um die zellulären Veränderungen während der malignen Transformation und für die Abgrenzung der zuständigen Melde besser zu verstehen ist.
Introduction
Dreidimensionale Kultur (3D) von Brust-Epithelzellen auf rekonstituierte Basalmembran ist ein wichtiges Modellsystem, um die komplexe Phänotyp und zugehörige Signalisierung der normalen Brust und Brustkrebs 2,3 studieren. Die funktionelle Einheit der Brust ist der Endkanal lobulären Einheit (TDLU), die von einer kleinen Leitung, die Verzweigungen in Acini besteht. Die Acini sind hochorganisierten Strukturen, zwei Zellschichten, Epithel und Myoepithelzellen, die durch eine Basalmembran 5 umgeben sind, besteht. Die prägnantesten Merkmale des normalen Azini sind zelluläre Polarisation, Anbringung an der zugrunde liegenden Basalmembran und spezialisierten Zell-Zell-Kontakten. Dieses komplizierte Organisation ist in invasiven Karzinomen gestört. Die weit verbreiteten 2D Kulturen, in denen Zellen werden als Monoschichten gezüchtet, nicht für die Bildung der Acini zu ermöglichen. Somit wird die Monoschichtkultur fehlen in der Bereitstellung eines Systems, um die komplexen Beziehungen zwischen Epithelzellen zu erfassenin normalen Brust und ihre Deregulierung bei Brustkrebs. Funktionelle monotypic epithelialen Kulturen der Brustzellen wurden in mehreren Laboratorien 2,3 entwickelt. 3D-Kultur geht das Wachstum von Brust-Zellen auf Matrigel, die eine gelösten Extrakt aus Engelbreth-Holm-Swarm-Maus-Sarkom-Zellen abgeleitet ist und im Handel erhältlich. Andere 3D-Substrate wie Kollagen I werden ebenfalls verwendet. Die Brust-Zellen in 3D mit 3D-Embedded-Test, bei dem Zellen kultiviert in Matrigel 2 eingebettet sind kultiviert werden. Alternativ können Zellen durch 3D auf Assay kultiviert werden, die auch als 3D-Overlay-Assay, die kostengünstig ist, wie es erfordert weniger Volumen von Matrigel und erleichtert Zeitraffer-Überwachung der Koloniebildung durch Phasenkontrast-Bildgebung und ist ideal für in situ-Bildgebung 2 -3. Die 3D auf Test ist verwendet worden, um die Korrelation zwischen der acinar Phänotyp und Genexpressionsprofil 7 definieren.
3D-Kultur kann effektiver werdenEly verwendet, um normale und benignen Zellen von invasiven Karzinomen zu unterscheiden. Normal-und gutartigen Brustzellen bilden Wachstum verhaftet polarisierten Strukturen mit einem gut definierten Hohlraum in der Mitte auf der Erwägung, dass Matrigel invasiven Karzinomzellen überaus produktiv und planlos wachsen ohne Lichtung des Lumens. E6/E7 verewigt menschlichen Brust Epithelzellen und MCF10A Zelllinie, die eine spontan immortalisierte Zelllinie aus einem 36-jährigen Patienten mit Mastopathie isoliert, wurden erfolgreich eingesetzt, um die gutartige Brust Phänotyp in 3D 3,8 zurückzuerobern und wurden als serviert wird, ist ein Modellsystem, um die onkogene und Tumor-Suppressor-Funktion von mehreren Molekülen 8,9 studieren. Diese gutartigen Zellen können verändert werden, um Gen (e) von Interesse durch die Einführung von Lentiviren / Retrovirus manipulieren. Wenn das Gen (e) von Interesse ist ein Tumorsuppressor, werden shRNA-vermittelten Knockdown zu einer malignen Transformation wohin führen, wenn das Gen von Interesse ist ein Onkogen-Überexpression in benignen Zellensollte einen malignen Phänotyp zeigen. In beiden Fällen sind die in 3D gebildet acinar Strukturen können die maligne Transformation zu erfassen.
Gutartige Einzelzellen in 3D vernickelt beginnen sich zu vermehren und bilden runde kugelförmige Strukturen. 5-8 Tage nach dieser sphärische Aggregat von Zellen wird in eine Umgebung polarisierte Schicht von Zellen, die in Kontakt mit dem Matrigel ist, und einer inneren Masse von weniger polarisierten Zellen, die Kontakt mit dem Matrigel fehlt unterscheiden. In den nächsten 10 bis 15 Tagen werden die inneren Zellen werden beginnen, durch Apoptose bildet eine klare Lumen sterben. Die malignen Zellen wachsen ihre Polarität planlos zu verlieren. Sehr bösartige Zellen bilden in der Regel Verzweigungsstrukturen. Diese Unterschiede im Phänotyp kann durch Zeitablauf Phasenkontrast-Bildgebung und durch in situ-Immunfärbung mit relevanten molekularen Marker erfasst werden. Die am häufigsten verwendeten Marker sind alpha 6-Integrin, eine basale Polaritätsmarkierung, in Verbindung mit dem Proliferationsmarker Phospho-Histon-3 und der apoptotic Marker Caspase-3 gespalten. Letzteres ist wichtig, um zu bestimmen, ob die Lumenbildung in der Mitte der Acini einem Merkmal der normalen und benignen Zellen. Andere Polarität und Zell-Zell-Kontakt Marker umfassen GM130, Laminin, ERM, E-Cadherin. Abwechselnd die Brustkrebszelllinien konstruiert werden, um das Gen von Interesse manipulieren. In diesem Fall wird eine Rückkehr zu mehr Wachstum verhaftet kann gutartig Phänotyp verwendet werden, wie ein ausgelesen, um von der Krebs-Phänotyp unterscheiden.
3D-Kultur kann auch verwendet werden, um sorgfältig die Signalwege in der malignen Transformation beteiligt 10-11 abzugrenzen. Mit Hilfe der oben genannten Lese-outs, pharmakologische Inhibitoren, blockierende Antikörper oder rekombinante Proteine kann auf molekularer Signal die zu malignen Transformation ermitteln werden kann. Mit anhaltenden Bemühungen von verschiedenen Labors ist es möglich, die Zellen zu extrahieren, um aus 3D-RNA isolieren und bereiten auch Lysate für Immunoblotting und Immunnoprecipitation. Diese Strategien werden in einer schrittweisen und detailliert in dem Protokoll beschrieben.
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Protocol
1. Herstellung von Materialien und Kultur Medien
- Tauwetter Wachstumsfaktor reduziert (GFR) Matrigel bei 4 ° CO / N.
- Warm up für komplette Medien erforderlich Zelllinie bei 37 ° C MCF10A-ATCC angegebenen Medien; Die HME-Ham F-12-Medium, ergänzt mit 5% fötalem Rinderserum, 1 ug / ml Hydrocortison, 5 ug / ml Insulin, 10 ng / ml epidermalen Wachstumsfaktor, und 100 ng / ml Cholera-Toxin; Die SUM149-Ham F-12 Medium mit 5% FBS, 2 &mgr; g / ml Hydrocortison und 5 ug / ml Insulin; und MDA-MB-231-10% haben FBS-DMEM
- Vorkühlung eine 8-Well-Kammer-Folie auf Eis.
- Bereiten Gewebekultur Kapuze und Zubehör.
2. Dreidimensional Kultur in 8-Well Chamber Slide
- Mantel jedes Well der 8-Well-Objektträger mit 40 ul GFR Matrigel. Fügen Sie den Matrigel in der Mitte der Folie und dann verteilt mit einem P200 Pipettenspitze. Versuchen Sie, so gleichmäßig wie möglich zu verbreiten, die Vermeidung von Blasen und Überspreizung, die dazu führen könnenMeniskusbildung.
- Die Objektträger bei 37 ° C unter 5% CO 2. Während die Matrigel verfestigt, trypsinize die Zellen, sammeln und Spin bei 150 xg in Gewebekulturzentrifuge für 4 min.
- Zählen Sie die Zellen und mit Wasser auf 12.500 Zellen / ml in kompletten Medien der jeweiligen Zelllinie. In GFR Matrigel bis 2%, und fügen Sie 400 ul in jede Vertiefung einer Matrigel schwemmt Kammer Rutsche.
- Inkubieren Sie die Folien in der CO 2-Inkubator. Geben frisch komplette Medien ändert sich jeden 4. Tag bis 15 Tage.
- Behandlung mit pharmakologischen Inhibitoren: Bei Inhibitorstudien hinzuzufügen Kleinmolekül-Inhibitoren der vollständigen Medien zum Zeitpunkt der Beschichtung, gefolgt von frischem Medium wechselt mit den Inhibitoren ergänzt alle drei Tage während der Anzucht der Zellen auf Matrigel GFR.
- Behandlung mit gereinigtem Protein:
- Platte die Zellen folgende Schritte 2.1-2.3. Ermöglichen, dass die Kulturen für 4 Tage, gefolgt von Serum wachsen starvatiauf 16 Stunden.
- Am Tag 5, behandeln Sie die Zellen mit entsprechenden Konzentration von gereinigten Protein in 0,1% FBS Medien, um den Serumversorgten Zellen. Geben frisch Medienwechsel mit gereinigtem Protein nach 2 Tagen.
- Am Tag 10 ersetzen den konditionierten Medien mit kompletter HME Medien. Lassen Sie die Kulturen für weitere 5 Tage wachsen.
- Immunfluoreszenzfärbung von auf Matrigel gewachsen acinar Strukturen:
- Herstellung von 2% Paraformaldehyd, 0,5% Triton X-100 und 100 mM Glycin in 1 × PBS, pH 7,4. Vorbereitung Immunpuffer (IF-Puffer), der aus 1x PBS, enthaltend 0,1% aufweist Rinderserumalbumin, 0,2% Triton X-100, 0,05% Tween-20.
- Verwenden Sie ein P200 Pipettenspitze sorgfältig absaugen konditionierten Medien.
- Befestigen Sie die acinar Strukturen mit 2% frisch zubereitet Para bei Raumtemperatur (RT) für 20 min.
- Permeabilisierung der Zellen mit 0,5% Triton X-100 für 10 min bei 4 ° C.
- Waschen Sie die Kulturs dreimal mit 100 mM Glycin, 10-15 Minuten für jede Waschung.
- Blockieren der Zellen mit 10% Ziegenserum in IF-Puffer, genannt Primärblock, für 1 h bei RT.
- Die Kulturen mit 20 &mgr; g / ml Ziege-anti-Maus F (ab ') 2-Fragment in der Grundblock-Puffer für 30 min inkubieren. Dieser Schritt ist wichtig, um die Maus-IgG immunreaktive Spezies in dem Matrigel blockieren.
- Inkubieren mit primärem Antikörper in der zweiten Blockierlösung (Primärblock +20 ug / ml Ziege-anti-Maus F (ab ') 2-Fragment) O / N bei 4 ° C.
- Dreimal für jeweils unter leichtem Schütteln 10-15 min mit IF-Puffer waschen.
- Inkubation mit fluoreszierenden konjugierten Sekundärantikörper in IF-Puffer für 45 min.
- Wash 3x für jeweils 10 Minuten mit IF-Puffer unter leichtem Schütteln.
- Montieren Sie die Folien mit Anti-Fade Reagenz, das DAPI, um die Kerne zu visualisieren.
- Lassen Sie die Folien in O / N bei RT trocknen.
- Bildaufnahme: Erfassung von konfokalen Bildern in der Kolonie midsection von Zellen auf Matrigel gewachsen. Für weitere Informationen zu erwerben eine Reihe von optischen Abschnitten über die gesamte Länge der Azinus-Struktur durch Z Stapeln.
3. Dreidimensional Kultur in 2-Kammer und Objektträger für Immunoblotting
- Vorkühlung eine 2-Kammer und Schlitten auf Eis. Befolgen Sie die Schritte 2.1-2.4 Aufstockung der Reagenzien für die 2-Kammer auch Dia zB Mantel mit 160 ul Matrigel und fügen Sie 1,6 ml Zell / Matrigel mischen, um jede Vertiefung der 2-und Rutsche.
- Ernten Sie die acinar Strukturen aus dem Matrigel Verwendung des kommerziell erhältlichen 3D-Kultur der Zellernte Kit folgenden Anweisungen des Herstellers.
- Verdünne die Zellen zu waschen und Zellernte Puffer 1x und Vorkühlung auf 4 ° C Waschen und Verdrängen von Matrigel sollten auf Eis durchgeführt werden.
- 3x mit dem Zellwaschpuffer waschen acinar Strukturen.
- Sammeln Sie die Acini in 15 ml Zentrifugenröhrchen mit Zellernte buffer durch 30 min Inkubation auf einem Schüttler bei 4 ° C, gefolgt Mix Suspension auch mit einer 1 ml Pipette. Dadurch wird die Matrigel in kleine Stücke brechen und die meisten der Zellen in der Zellernte-Puffer.
- Pelletieren Sie die Zellen bei 200 × g in einer Kultur zentrifugiert. Entfernen Sie die Schwimmschicht aus Hydrogel aus den pelletierten Zellen mit einem P200 Pipettenspitze.
- Resuspendieren der Lysate in SDS-Probenpuffer mit dem Kit bei. RIPA Lysepuffer können ebenfalls verwendet werden.
4. Quantifizierung von malignen vs Gutartige Brust Phänotyp
- Wachsen Zellen in dreifacher Ausführung für jede Behandlung Satz folgende Schritte 2.1-2.4.
- Nehmen Phasenkontrastbilder von acinar Strukturen aus jeder Vertiefung bei 5X oder 10X Auflösung mit einem Phasenkontrastmikroskop zu einer Folie Schieber und einen Computer angeschlossen ist. Nehmen die Bilder durch Bewegen des Schiebers von einem Rahmen zum anderen und somit über die gesamte Vertiefung der Kammerobjektträger.
- Zählen Sie die Anzahl der acinar Strukturen,die Anzahl der einzelnen runden flachen Acini und der Anzahl der multiacinar Strukturen oder planlos gewachsenen Strukturen fehlen Organisation und Prozesse mit Verzweigung von ihr ausgeht.
- Berechnen Sie den prozentualen Anteil der einzelnen runden flachen Strukturen acinar vs malignen Strukturen und Grundstück als Säulendiagramm. Berechnen Sie die Bedeutung von Student-t-Test.
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Representative Results
3D Kultur effektiv zur malignen Phänotyp von menschlichen Brustepithelzellen von gutartigen Brust unterscheiden. Einzel benignen Zellen auf Matrigel vergoldet wachsen, wie organisiert kugelförmige Gebilde, die leicht als einzige runde, flache Acini in einer Ebene mit Phasenkontrast-Abbildung abgebildet werden kann. Die einzelnen malignen Zellen auf Matrigel vergoldet wachsen planlos, zeigen sehr hohen Brechungsindex und sind in einer Ebene schwer zu Bild. Wie in Fig. 1 gezeigt, ist die benigne HME und MCF10A-Zellen bilden sphärische suchen Acini wohin stark metastasierenden Brustzelllinien SUM149 und MDA-MB-231 wachsen als Verzweigungsrohrkonstruktionen mit von ihnen ausgehenden Prozesse. Eine solche Abweichung von der gutartigen Phänotyp kann verwendet werden als ein ausgelesen, die maligne Transformation zu bestätigen und kann verwendet werden, um die Funktion eines Moleküls als Tumorsuppressor oder als Tumorpromotor definieren. Wie in Fig. 2, Zuschlags (KD) des Tumorsuppressorgens CCN6 t dargestelltRiggers eine maligne Transformation. HME-Zellen entwickelt, um herunterreguliert haben Ebenen CCN6 von Lentiviren vermittelte Transfektion verlieren ihre Organisation schon sehr früh. Am Tag 5 werden die Steuer gutartigen Zellen wurden als perfekte Kugelstrukturen wachsen, während die CCN6 KD-Zellen zeigen eine desorganisierte Phänotyp. Bis zum Tag 15 die Steuer gutartigen Zellen werden Wachstum festgenommen und zeigen eine polarisierte Schicht von Zellen umgibt eine gut definierte zentrale Lumen, während die KD Zellen wachsen produktiv zu unorganisiert großen röhrenförmigen Strukturen, die zu wachsen, wenn erlaubt (Abbildung 2) weiter zu bilden.
Verschiedene molekulare Marker können mit Vorteil verwendet, um zwischen den gutartigen gegen bösartigen Brust Phänotyp differenzieren. Die gutartige Brust zeigt ein differenziertes Wachstum verhaftet Phänotyp Tag 15 in 3D-Kultur. Die Acini eine Abscheidung der Basalmembran, die durch Immunfärbung mit Laminin V, wie deutlich in den Kontrollzellen in Fig. 3 gezeigt dargestellt werden kann (Abbildung 3) beschränkt werden.
Die Signalwege in der malignen Transformation beteiligt kann unter Verwendung einer Kombination von pharmakologischen Inhibitoren und gereinigte rekombinante menschliche (rh) Proteine abgegrenzt werden. Wie in Fig. 4 gezeigt die Malit Phänotyp CCN6 KD HME-Zellen können zu einzelnen Runde acinar Strukturen durch exogene Behandlung mit rhCCN6 Protein rückgängig gemacht werden. Die konfokale Bildgebung bei den mittleren Teil der DAPI acinar Strukturen zeigen deutlich polarisiert Acini mit zentralen Lumen in CCN6 KD Zellen mit rhCCN6 behandelt. Auch die invasive SUM149 und MDA-MB-231-Zellen, die mit p38-MAP-Kinase-Inhibitors behandelt zeigt die Verringerung der malignen Phänotyp (5A). Die Rückkehr zu einer gutartigen Phänotyp kann durch Berechnen des Prozentsatzes der einzelnen runden acinar Strukturen im Vergleich zu den malignen Strukturen quantifiziert werden. Die Spezifität der Inhibitoren kann durch die Tatsache, dass AKT-Hemmer nicht zu Auswirkungen auf CCN6 KD-Zellen zeigen, während die Behandlung mit dem MAP-Kinase-Inhibitor PD98059 zeigt eine bemerkenswerte Rückkehr zur einzigen Runde acinar Strukturen (5B) geschätzt.
Abbildung 1. Phasenkontrastbilder von gutartigen vs bösartigen Brust Zellen auf Matrigel für 10 Tage angewachsen. Die gutartige verewigt menschlichen Brust Epithelzellen (HME) und spontan immortalisierte MCF10A Zellen wachsen als Einzel runden flachen Acini ohne jeden Vorsprung. Während die malignen humanen Brustzelllinien SUM149 und MDA-MB-231 wachsen, wie sehr unorganisiert Strukturen. Maßstabsbalken entspricht 100 um. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
Abbildung 2. Konfokale Bildgebung von HME-Steuerung und CCN6 KD Zellen auf Matrigel gewachsen
Abbildung 3. Konfokale Bildgebung zeigt unterschiedliche Expression von molekularen Markern in benign gegen bösartigen Brustzellen. CCN6 KD HME Zellen zeigen, Verlust von Laminin V, die die Zerstörung der Basalmembran, Verlust der basalen Polarität Marker alpha-6-Integrin, was den Verlust der Polarität und der Verlust der Zell-Zell-Kontakt-Marker E-Cadherin . Doch die Kontrollzellen zeigen Ablagerung von Basalmembran (Laminin eine intakte Schicht um die Acini), basale Expression von Alpha-6-Integrin, apikale Expression von GM130 und das Vorhandensein von E-Cadherin an Zell-Zell-Kreuzung. Maßstabsbalken entspricht 50 um. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
4. Umkehrung des malignen Phänotyps von Zellen CCN6 KD HME durch exogene Behandlung mit gereinigtem rekombinantem menschlichem CCN6 protEin. CCN6 KD Zellen wachsen, wie planlos, invasive acinar Strukturen in 3D-Kultur. Allerdings CCN6 KD-Zellen mit 500 ng / ml rhCCN6 Show Rückkehr zur einzigen Runde acinar Phänotyp mit Ausgleich der Lumen, was auf eine gutartige ähnlichen Phänotyp behandelt. Schwarz Maßstab entspricht 100 um und gelbe Maßstab entspricht 50 um. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
Abbildung 5. Behandlung mit niedermolekularen Inhibitoren wieder den malignen Phänotyp weniger bösartig oder gutartig ähnlichen Phänotyp. A. Behandlung von 2 hoch metastatischen Brustkrebs-Zelllinien SUM149 und MDA-MB-231 mit p38-MAP-Kinaseinhibitoren SB203850 (5 uM) und SB202190 (10 &mgr; M) verringert ihrebösartige Verhalten wie in der einzigen Runde acinar Phänotyp auf 3D wider. B. CCN6 KD Zellen mit HME AKT-Hemmer LY294002 (7,5 uM) behandelt, Wortamannin (2 nM) zeigt keine Wirkung, aber die Behandlung mit MAP-Kinase-Inhibitor PD98059 (10 uM) kehrt zu den Phänotyp einzigen Runde organisiert acinar Strukturen. Klicken Sie hier, um zu vergrößern Bild.
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Discussion
Wir haben hier die dreidimensionale Kultur von Brustepithelzellen auf einer rekonstituierten Basalmembran und die Nützlichkeit des Systems, zwischen bösartigen gegen gutartige Brust Phänotyp differen beschrieben. Dieses System kann auch zur Bildung verschiedener Zelltypen anderer Drüsengewebe verwendet werden, und es wurde berichtet, um erfolgreich zu Kultur Prostata-Epithelzellen, bronchiale Epithelzellen und Schilddrüsen-Epithelzellen verwendet haben, um nur einige zu nennen 12-14. Die Bedeutung der 3D-Kultur liegt in der Tatsache, dass es ein physiologisch relevantes Modell. 3D-Kultur bietet die Möglichkeit, Einblicke in die molekularen Mechanismen, die zu einer Störung der Drüsen-Architektur während der malignen Transformation führt zu gewinnen. Es bietet auch eine Arbeitsmodellsystem, das hilfreich beim Screening neuer therapeutischer Targets zur Behandlung von Krebs sein kann. Viele Medikamente, die gefunden werden, um effektiv in 2D Kultur oft nur wenig Wirkung bei experimentellen und klinischen applictaions 15. Als solche 3D Kultur eine wichtige präklinische Werkzeug, um die Wirkung der Verbindungen in vivo vorherzusagen ist.
3D-Kultur ist eine anspruchsvolle Technik und sollte sorgfältig durchgeführt werden. GFR Matrigel ist die am häufigsten verwendeten Substrate zum Kultivieren von Zellen in 3D. Es kann bei 4 ° CO / N aufgetaut werden, aliquotiert und bei -20 ° C für die zukünftige Verwendung eingefroren. Wiederholtes Einfrieren Auftauen sollte vermieden werden. GFR Matrigel ist bei 4 ° C flüssig, sondern erstarrt bei 37 ° C und kann extrem schwierig sein, beim Wechsel konditionierten Medien durch frische Medien oder während der Verarbeitung der Zellen für Immunzytochemie zu handhaben. Bitte verwenden Sie nicht eine Vakuumsauger, den konditionierten Medien entfernen, da es führt unweigerlich zum Verlust der gesamten acinar Kulturen zusammen mit dem Matrigel. Es wird beobachtet, dass bei einigen aggressiven Krebszelllinien, wie MDA-MB-231-Zellen, die sehr Verzweigungsnetzwerk zu bilden, wie das Matrigel Strukturen können von der Oberfläche abzulösenGesicht und ist oftmals schweben. Es sollte darauf geachtet werden, um Medien aus diesen Kulturen saugen sonst werden sie beim Entfernen der Medien verloren.
Ebenso wichtig ist die Pflege und den Durchgang von Zellen, die als Monolayer-Kulturen vor allem für die gutartigen Zellen wie HME und MCF10A. Über Zusammenfluss oder Abweichung von der vorgeschriebenen Medien können die acinar Bildung in 3D zu beeinflussen.
Es ist möglich, Zellen, die aus 3D-Kulturen zu isolieren, um RNA-oder Protein-Isolierung unter Verwendung von kommerziell verfügbaren 3D Kulturzellerntesatz zu verarbeiten. Abwechselnd dreidimensionalen Kulturen direkt mit Waschmittel auf Basis-Lysepuffer wie RIPA-Puffer lysiert (1% Nonidet P-40, 0,2% SDS, 0,5% Natriumdesoxycholat, 150 mM Natriumchlorid, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM Natriumfluorid, 1 mM Natriumorthovanadat, 10 mM b-Glycerophosphat, 5 ug / ml apoprotinin, 5 ug / ml Leupeptin und 100 uM Phenylmethylsulfonylfluorid). Allerdings Protein QuantifizierungKation ist in diesem Fall nicht, weil der Proteinmenge in dem Matrigel möglich. Damit die Proteinlysaten sollte kolorimetrischen Assays verwendet, um die Aktivität stabil cytosolische Enzyme, wie Lactose-Dehydrogenase (LDH) und den Blots messen sollte ein Housekeeping-Gen wie Aktin oder Tubulin oder GAPDH 3 sondiert werden, normiert werden.
Die Zellernte aus dem Matrigel Verfahren erfordert jedoch lange Dauer der Inkubation bei 4 ° C Dies kann das Expressionsprofil der Zelloberflächenproteine beeinflussen und als solche in situ-Immunfärbung ist eine geeignete Methode, um die Expression von Zelloberflächenproteinen zu analysieren. Für die Immunfärbung Antikörper-Inkubation auf einem sanften Rocker ist hilfreich bei der gleichmäßig Färbung der Acini aber optimale Geschwindigkeit und die Wippe Art ist kritisch, da es auch auf die Herausziehen der Matrigel führen. Die Antikörperkonzentration kann die Optimierung benötigen, aber die meisten Antikörper gefunden wurden effizient zu sein bei 1:100 Konzentration. Ein more bestimmte Liste von Antikörpern ist in der Tabelle. Eine detaillierte Liste der Antikörper mit ihren Spezifikationen in Debnath gefunden werden et al. Können zwei gleichzeitige Inkubation mit mehr als einer von verschiedenen Tieren wie Ratten, Kaninchen und Maus erhaltenen Primärantikörpers durchgeführt werden, sollte aber zunächst optimiert, um auszuschließen Kreuzreaktivität werden .
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Disclosures
Die Autoren erklären, keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom NIH Zuschüsse R01 CA107469, R01 CA125577 und U01CA154224 CG Kleer, der University of Michigan Cancer Center Support unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth Factor Reduced Matrigel | BD Biosciences | 354230 | Avoid repeat freeze thaw |
| Lab-Tek glass hamber slides 8-well | Thermo Fisher Scientific | 177402 | Precool on ice |
| Lab-Tek glass chamber slides 2-well | Thermo Fisher Scientific | 177380 | Precool on ice |
| Goat anti mouse F(ab´)2 fragment | Jackson Immunoresearch | 115-006-006 | |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| Fluorescent conjugated Alexa antibodies | Molecular Probes | Please look at molecular probes website | |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Molecular Probes | P36935 | |
| 3D Culture Cell Harvesting kit | Trevigen | 3448-020-k | |
| Anti-Apha-6-integrin | Fisher Scientific | MAB1378 | 1:100 dilution for IF |
| Anti-GM130 | BD Biosciences | 610822 | 1:100 dilution for IF |
| Anti-phospho-histone 3 (Ser10)FITC Conjugated | Fisher Scientific | 16-222 | 1:100 dilution for IF |
| Anti-Cleaved caspase 3 (Asp 175) | Cell Signaling | 9661s | 1:50 dilution for IF |
| Anti-E-cadherin | BD Biosciences | 610181 | 1:200 dilution for IF |
References
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