Summary
שלוש תרבות ממדית של תאי אפיתל החלב בקרום במרתף מחדש היא שיטה שימושית לשחזר את ארכיטקטורת vivo של השד השפיר, וכדי לבדל את הפנוטיפ הממאיר מפנוטיפ שפיר בשד. חשוב מכך, מערכת זו יכולה להיות מיושמת ללמוד קרצינומות פולשני ברקמות אחרות.
Abstract
קרצינומות שד פולשני הן קבוצה של גידולי אפיתל ממאירים מאופיינת בחדירה לרקמות סמוכות ונטייה לגרורות. משחק הגומלין של אותות בין תאים סרטניים והמיקרו שלהם השפעה חזקה על צמיחת סרטן השד והתנהגות 1 ביולוגית. עם זאת, רובם של אותות הבאים מהמטריצה תאית אבדו או את הרלוונטיות שלהם היא understudied כאשר תאים גדלים בשתי תרבות ממדית (2D) כשכבה. בשנים האחרונות, שלוש תרבות ממדים (3D) בקרום במרתף מחדש התפתחה כשיטת בחירה לשחזר את ארכיטקטורת הרקמה של תאים בשד שפירים וממאירים. תאים שגודלו ב3D לשמר את הרמזים החשובים מהמטריצה תאית ולספק לשעבר vivo 2,3 מערכת רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. ראוי לציין, שיש ראיות הולכות ומצטברים מצביעים על כך שהתאים מתנהגים בצורה שונה כאשר גדלו ב3D לעומת 4 2D. תרבות 3Dניתן להשתמש ביעילות כאמצעי לבדל את הפנוטיפ הממאיר מפנוטיפ שפיר בשד ושבסיס האיתות התאית ומולקולרית מעורב 3. אחד מסימני ההיכר של תאי אפיתל השפירים הוא שהם מקוטבים כך שהציטופלסמה הפסגה היא לכיוון הלום וציטופלסמה הבסיסית נשענת על הקרום במרתף. קוטביות apico-הבסיסי הזה אבוד, בקרצינומות שד פולשני, המתאפיינים בחוסר ארגון והיווצרות anastomosing והסתעפות צינוריות שאקראי מחלחל stroma סביב סלולריים. הבדלים אלה בין histopathological בלוטה שפירה וקרצינומה פולשנית יכולים להיות מועתק ב3D 6,7. שימוש בקריאת פסקי המתאימים כמו לכמת את מבני acinar סיבוב בודדים, או דיפרנציאלי ביטוי של סמנים מולקולריים תוקף להתפשטות תאים, קוטביות ואפופטוזיס בשילוב עם טכניקות אחרות מולקולריות וביולוגיה של תא, תרבות 3Dדואר יכול לספק כלי חשוב כדי להבין טוב יותר את השינויים התאיים בשינוי ממאיר ומגדיר את האיתות אחראית.
Introduction
שלוש תרבות ממדי (3D) של תאי אפיתל שד על קרום במרתף מחדש היא מערכת מודל חשובה ללמוד את הפנוטיפ המורכב והאיתות קשורה של שד נורמלי וסרטן השד 2,3. היחידה התפקודית של שד היא יחידת מסוף צינור lobular (TDLU) אשר מורכבת מצינור קטן שסניפים לacini. Acini הם מבנים מאורגנים מאוד, מורכב משתי שכבות תאים, תאי אפיתל וmyoepithelial, אשר מוקפות בקרום במרתף 5. התכונות הייחודיות ביותר של acini הנורמלי הן קיטוב סלולארי, קובץ מצורף לקרום במרתף המשמש כבסיס וקשר מיוחד תאי תאים. ארגון מורכב זו מופר בקרצינומות פולשנית. תרבויות 2D בשימוש נרחב, שבו תאים גדלים כמו monolayers, אל תאפשר להיווצרות של acini. לפיכך, תרבות monolayer חסרה במתן מערכת כדי ללכוד את מערכת היחסים המורכבות שבין תאי האפיתלבשד נורמלי והסרת הפיקוח שלהם בסרטן השד. תרבויות אפיתל monotypic תפקודיות של תאי שד פותחו במספר מעבדות 2,3. תרבות 3D כוללת את הצמיחה של תאי שד על Matrigel, שהוא תמצית solubilized שמקורם בתאי סרקומה עכבר Engelbreth-Holm-נחיל והוא זמין באופן מסחרי. מצע 3D אחר כמו קולגן אני גם נמצא בשימוש. יכולים להיות מתורבת תאי השד ב-3D על ידי assay 3D המשובץ, שבו תאים בתרבית מוטבעת בMatrigel 2. לחלופין, יכולים להיות מתורבת תאים על ידי 3D על assay העליון, המכונים גם assay כיסוי 3D, אשר הוא עלות האפקטיבית כפי שהוא דורש נפח קטן יותר של Matrigel, ומאפשר ניטור זמן לשגות של הקמת מושבה על ידי הדמיה בניגוד שלב והוא אידיאלי באתר הדמיה 2 -3. 3D על assay העליון נעשה שימוש כדי להגדיר את המתאם בין פנוטיפ acinar ופרופיל ביטוי גני 7.
תרבות 3D ניתן effectivאיליי משמש להבחנה בין תאים נורמלים ושפירים מקרצינומה פולשנית. תאי שד נורמלים ושפירים בצורת צמיחה נעצרה מבנים מקוטבים עם לומן מוגדר היטב במרכז בMatrigel ואילו תאי קרצינומה פולשנית לגדול בשפע ואקראי ללא סליקה של לומן. E6/E7 הונצח תאים אנושיים אפיתל החלב וקו סלולרי MCF10A, שהוא קו סלולרי הונצח באופן ספונטני שבודד מחולה 36 שנה ישנה עם שינויי fibrocystic, שימש בהצלחה לשחזר את הפנוטיפ שפיר בשד ב3D 3,8 ושמש מערכת מודל ללמוד את התפקיד המדכא בשעור וגידול של מספר מולקולות 8,9. יכול להיות מהונדסים לתאים שפירים אלה כדי לתפעל גן (ים) של עניין על ידי ההקדמה של lentivirus / רטרווירוס. אם הגן (ים) של עניין הוא מדכאי סרטן, מציאה shRNA תיווך תוביל לשינוי ממאיר ואילו אם הגן של עניין הוא ביטוי יתר של אונקוגן בתאים שפיריםצריך להראות פנוטיפ ממאיר. בשני המקרים מבני acinar נוצרו ב3D יכולים ללכוד את השינוי הממאיר.
תאים בודדים שפירים מצופים ב3D להתחיל להתרבות וליצור סביב מבנים כדוריים. ביום 5-8 במצטבר כדורי זה של תאים להתמיין לשכבה המקיפה מקוטבת של תאים שנמצאת במגע עם Matrigel, ומסה פנימית של תאים פחות מקוטבים, אשר חוסר מגע עם Matrigel. בימים הקרובים 10-15 התאים הפנימיים יתחילו למות על ידי אפופטוזיס להרכיב לומן ברור. התאים הממאירים יגדלו באקראי לאבד את הקוטביות שלהם. תאים מאוד ממאירים בדרך כלל בצורת הסתעפות מבנים. הבדלים אלה בפנוטיפ יכולים להיות שנתפסו על ידי הדמיה בניגוד שלב זמן לשגות ועל ידי באתר immunostaining עם סמנים מולקולריים רלוונטיים. הסמנים הנפוצים ביותר הם אלפא 6 integrin, סמן קוטביות בסיסי, בשילוב עם סמן התפשטות phospho-היסטון 3 וapoptotסמן ic ביקע caspase-3. זו האחרונה היא חשובה כדי לקבוע אם יש היווצרות לומן במרכז acini, תכונה של תאי שד נורמלים ושפירים. סמני קוטביות וקשר תאי תאים אחרים כוללים GM130, laminin, ERM, E-cadherin. לחלופין יכולות להיות מהונדסות שורות תאי סרטן השד כדי לתפעל את הגן של עניין. במקרה הזה חזרה לצמיחה יותר נעצרה פנוטיפ השפיר יכול לשמש כהקריא להבחין בין פנוטיפ הסרטן.
גם תרבות 3D ניתן להשתמש בזהירות כדי להתוות את מסלולי האיתות מעורבים בשינוי ממאיר 10-11. שימוש שהוזכר לעיל לקרוא-outs, מעכבים תרופתיים, נוגדני חסימה או חלבונים רקומביננטיים יכול לשמש להיות להצביע באיתות המולקולרית המובילה לשינוי ממאיר. עם מאמצים מתמשכים ממעבדות שונות שניתן לחלץ התאים מ3D לבודד RNA וגם להכין lysates לimmunoblotting אימונוגלובולינnoprecipitation. אסטרטגיות אלה מתוארות בשלבים ובאופן מפורט בפרוטוקול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת החומרים ותרבות מדיה
- גורם גדילת הפשרה מופחת (GFR) Matrigel על 4 מעלות CO / נ
- להתחמם מדיה מלאה לשורת תאים הנדרשת על 37 ° C. MCF10A-ATCC שצוינה בתקשורת; המדיום של HME-Ham-F-12 בתוספת 5% בסרום שור עוברי, 1 מיקרוגרם / מיליליטר הידרוקורטיזון, 5 מיקרוגרם / מיליליטר אינסולין, 10 ng / גורם גדילה באפידרמיס מיליליטר, ו100 רעלן הכולרה ng / מיליליטר; התקשורת של SUM149-Ham-F-12 FBS בתוספת 5%, 2 הידרוקורטיזון מיקרוגרם / מיליליטר ו 5 מיקרוגרם / מיליליטר אינסולין; ומד"א-MB-231-10% FBS-DMEM
- Precool שקופיות קאמריות 8 היטב על קרח.
- הכן את מכסה המנוע בתרבית רקמה ואספקה.
2. שלוש ממדי תרבות ב8 היטב שקופיות קאמרית
- מעיל היטב בכל שקופית 8 היטב עם 40 μl של GFR Matrigel. הוסף את Matrigel במרכז השקופית ולאחר מכן להפיץ באמצעות פיפטה קצה P200. נסה להפיץ בצורה שווה ככל האפשר, תוך הימנעות בועות ופורשים אשר יכול להובילהיווצרות מניסקוס.
- דגירה השקופיות ב37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO 2. בעוד Matrigel הוא החיזוק, trypsinize התאים, לאסוף ולסובב ב XG 150 בצנטריפוגה תרבית רקמה למשך 4 דקות.
- ספירת התאים ו לדלל את 12,500 תאים / מיליליטר בתקשורת של הקו הסלולרי בהתאמה מלאה. הוספת GFR Matrigel עד 2% ולהוסיף 400 μl היטב בכל חדר שקופיות Matrigel precoated.
- דגירה השקופיות בחממת CO 2. תן שינויי מדיה שלמים טריים כל יום 4 עד ה 15 ימים.
- טיפול במעכבים תרופתיים: ללימודי מעכב להוסיף מעכבי מולקולה קטנים לתקשורת להשלים בזמן ציפוי אחרי שינויי תקשורת טריים בתוספת מעכבים כל שלושה ימים בזמן שהולכים וגדלו תאים על GFR Matrigel.
- טיפול עם חלבון מטוהר:
- פלייט התאים הבאים על השלבים 2.1-2.3. אפשר התרבויות לגדול במשך 4 ימים ואחריו starvati סרוםל16 שעות.
- ביום 5, טיפול בתאים עם ריכוז מתאים של חלבון מטוהר ב0.1% FBS בתוספת תקשורת לתאים מורעבים בסרום. תן שינוי תקשורת טרי עם חלבון מטוהר אחרי 2 ימים.
- ביום 10 להחליף את התקשורת ממוזגת עם תקשורת HME מלאה. אפשר התרבויות לגדול לעוד 5 ימים.
- מכתים immunofluorescence של מבני acinar גדלו על Matrigel:
- הכן paraformaldehyde 2%, 0.5% טריטון X-100 ו100 גליצין מ"מ 1x PBS, pH 7.4. הכן את חיץ immunofluorescence (IF חיץ) שכולל של 1x PBS המכילים 0.1% אלבומין בסרום שור, 0.2% X-100 טריטון, Tween-20 0.05%.
- השתמש בקצה פיפטה P200 כדי לשאוב את התקשורת המותנה בזהירות.
- תקן את מבני acinar עם 2% paraformaldehyde מוכן טרי בטמפרטורת חדר (RT) עבור 20 דקות.
- Permeabilize התאים עם 0.5% טריטון X-100 10 דקות ב 4 ° C.
- שטוף את התרבותזמנים של שלושה עם גליצין 100 מ"מ, 10-15 דקות לכל שטיפה.
- לחסום את התאים עם 10% נסיוב עזים במאגר אם, בשם בלוק ראשוני, במשך שעה 1 ב RT.
- דגירה התרבויות עם עכבר אנטי 20 מיקרוגרם / עז מיליליטר F (ab ') 2 שבר במאגר בלוק העיקרי ל30 דקות. שלב זה חשוב כדי לחסום את מיני IgG עכבר immunoreactive בMatrigel.
- דגירה עם נוגדן ראשוני בפתרון החסימה השני (עכבר אנטי +20 / מיליליטר עז בלוק ראשי מיקרוגרם F (ab ') 2 שבר) O / N ב 4 ° C.
- לשטוף שלוש פעמים עם חיץ IF עבור 10-15 דקות כל אחד עם נדנדה עדינה.
- דגירה עם נוגדני ניאון מצומדות משניים בIF חיץ 45 דקות.
- 3x לשטוף 10 דקות כל אחד עם חיץ IF עם נדנדה עדינה.
- הר השקופיות עם מגיב אנטי לדעוך מכיל DAPI לדמיין את הגרעינים.
- אפשר השקופיות לייבוש O / N ב RT.
- רכישת תמונה: לרכוש תמונות confocal במיל המושבהdsection של תאים שגודל על גבי Matrigel. לקבלת מידע נוסף לרכוש סדרה של סעיפים אופטיים לאורך כל אורכו של מבנה acinar ידי לערום Z.
3. שלוש ממדי תרבות ב2 היטב לשכת שקופיות לimmunoblotting
- Precool שקופיות קאמריות 2 היטב על קרח. בצע את פעולות 2.1-2.4 דרוג את ריאגנטים לחדר שקופיות למשל מעיל 2 היטב עם 160 μl של Matrigel ולהוסיף 1.6 מיליליטר של התא / Matrigel לערבב היטב בכל השקופית 2 היטב.
- קציר מבני acinar מMatrigel באמצעות ערכת קצירת תא תרבות 3D זמינה המסחרית בעקבות הוראות יצרן.
- לדלל את המאגרים לשטוף תא וקציר התא ל1x וprecool עד 4 ° C. כביסה ודחיקה של Matrigel צריכה להתבצע על קרח.
- שטוף מבני acinar 3x באמצעות החיץ לשטוף תא.
- לאסוף acini ל15 צינורות צנטריפוגה מיליליטר באמצעות bu קצירת תאffer ואחריו 30 דגירה דקות על כיסא נדנדה ב 4 ° C. מערבבים את ההשעיה גם עם טפטפת 1 מיליליטר. זה ישבור את Matrigel בחתיכות קטנות ולשחרר את רוב התאים במאגר קצירת תא.
- גלולה התאים ב XG 200 בצנטריפוגה בתרבות. הסר את השכבה הצפה של הידרוג'ל מתאי pelleted עם קצה פיפטה P200.
- Resuspend lysates בחיץ מדגם SDS מצורף לערכה. יכול לשמש גם מאגר תמוגה ריפה.
4. כימות של הפנוטיפ שד שפיר לעומת ממאיר
- לגדל תאים בtriplicates עבור כל קבוצת טיפול בעקבות צעדי 2.1-2.4.
- קח את התמונות בניגוד שלב של מבני acinar מכל הטוב ב5X או 10X רזולוציה באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב מצורף למחלף שקופיות ומחשב. קח את התמונות על ידי העברת השקופיות מפריים אחד למשנהו ובכך מכסים את כולו גם של שקופית תאיים.
- לספור את המספר הכולל של מבני acinar,מספר acini אחת עגול ושטוח ומספר מבני multiacinar או המבנים גדל באקראי חסר ארגון ועם תהליכי הסתעפות הבוקעים ממנה.
- לחשב את אחוז המבנים בודדים עגולים acinar השטוח לעומת המבנים ממאירים ועלילה כגרף עמודות. לחשב את המשמעות על ידי מבחן t של הסטודנט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תרבות 3D ניתן להשתמש ביעילות כדי לבדל את הפנוטיפ ממאיר של תאי אפיתל שד אנושיים מהשד השפיר. תאים שפירים יחיד מצופים על Matrigel לגדול כמבנים כדוריים מאורגנים שיכול בקלות להיות צילמו כacini שטוח סיבוב בודד במישור אחד באמצעות הדמיה בניגוד שלב. התאים הממאירים בודדים מצופים על Matrigel לגדול באקראי, להראות מקדמת שבירה גבוהה מאוד וקשה לתדמיתה במישור אחד. כפי שניתן לראות בתרשים 1, HME השפיר ותאי MCF10A יוצרים acini מחפש כדורי ואילו שורות תאי שד גרורתי מאוד SUM149 ומד"א-MB-231 לגדול כהסתעפות מבנים צינורי עם תהליכים נובעים מהם. כגון סטייה מפנוטיפ השפיר יכולה לשמש כהקריא כדי לאשר את השינוי הממאיר וניתן להשתמש בם כדי להגדיר את הפונקציה של מולקולה כמדכאי סרטן או כמקדם גידול. כפי שניתן לראות בתרשים 2, מציאה (KD) של t CCN6 גן מדכא גידוליםקודחי שינוי ממאיר. תאי HME המהונדסים שלמטה מוסדרים רמות של CCN6 ידי transfection תיווך lentivirus לאבד הארגון שלהם מהשלב מוקדם מאוד. ביום 5 תאי שליטה השפירים גדלו מבנים כדוריים מושלמים ואילו תאי CCN6 KD להראות פנוטיפ לא מאורגן. ביום 15 בתאי השליטה השפירים הפכו צמיחה נעצרה ולהראות שכבה מקוטבת של תאים המקיפים את החלל מרכזי מוגדר היטב ואילו תאי KD לגדול בשפע ליצירת מבנים צינוריים גדולים לא מאורגנים אשר ממשיכים לגדול אם מותר (איור 2).
כמה סמנים מולקולריים יכולים לשמש לטובה להבדיל בין השפיר לעומת פנוטיפ שד הממאיר. השד השפיר מציג צמיחה מובחנת נעצרה על ידי פנוטיפ יום 15 בתרבות 3D. יש לי acini תצהיר של קרום במרתף שניתן דמיינו ידי immunostaining עם V laminin כמוצג בבירור בתאי שליטה באיור 3 (איור 3).
מסלולי האיתות מעורבים בשינוי הממאיר יכולים להיות שמסומן באמצעות שילוב של מעכבים תרופתיים וחלבונים אנושיים מטוהר רקומביננטי (RH). כפי שניתן לראות באיור 4 malignanפנוטיפ t של תאי CCN6 KD HME ניתן חזר למבני acinar סיבוב אחד על ידי טיפול אקסוגניים עם חלבון rhCCN6. ההדמיה confocal באמצע הקטע של מבני acinar DAPI המוכתמים מראה בבירור acini המקוטב עם לומן מרכזי בתאי CCN6 KD טופלו rhCCN6. כמו SUM149 פולשנית ומד"א-MB-231 תאים שטופלו עם מעכב קינאז MAP P38 ניתן לראות את הירידה בפנוטיפ הממאיר (איור 5 א). חזרה לשפיר כמו הפנוטיפ ניתן לכמת על ידי חישוב אחוז ממבני acinar סיבוב בודדים בהשוואה למבנים הממאירים. הספציפיות של מעכבים יכולות להיות מוערכת על ידי העובדה כי מעכבי AKT נכשלים להראות כל השפעה על תאי CCN6 KD ואילו טיפול עם PD98059 מעכבי קינאז המפה מראה חזרה מדהים ליחיד מבנים העגולים acinar (איור 5).
איור 1. ניגוד שלב תמונות של שפיר לעומת תאי שד ממאירים גדלו על Matrigel ל10 ימים. התאים השפירים הנציחו אדם החלב אפיתל (HME) ותאי MCF10A הונצחו באופן ספונטני לגדול כסיבוב בודד acini השטוח נטול כל בליטה. בעוד ששורות תאי שד האנושיות הממאירות SUM149 ומד"א-MB-231 לגדול מבנים כמאורגנים מאוד. בר סולם מייצג 100 מיקרומטר. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 2. הדמיה confocal של HME שליטה ותאי CCN6 KD גדלו על Matrigel
איור 3. Confocal הדמיה מראה ביטוי ההפרש של סמנים מולקולריים בבניםGN לעומת תאי שד ממאירים. תאי CCN6 KD HME להראות אובדן של V laminin, המייצג את השיבוש של קרום במרתף, אובדן אלפא-6-integrin סמן קוטביות הבסיסי, המציין אובדן הקוטביות ואובדן E-cadherin סמן קשר תאי תאים . עם זאת תאי השליטה להראות בתצהירו של קרום במרתף (שכבת laminin שלמה סביב acini), ביטוי בסיס של אלפא 6 integrin, ביטוי קודקוד של GM130 ונוכחות של E-cadherin בצומת תאי תאים. בר סולם מייצג 50 מיקרומטר. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 4. ביטול הפנוטיפ הממאיר של תאי CCN6 KD HME ידי טיפול אקסוגניים עם prot CCN6 האנושי רקומביננטי מטוהרעין. תאי KD CCN6 לגדול מבנים אקראיים כ, פולשני acinar בתרבות 3D. עם זאת, תאי CCN6 KD טופלו 500 ננוגרם / מיליליטר של חזרה להראות rhCCN6 לפנוטיפ acinar העגול היחיד עם קרחת של לומן, המציינים שפיר יותר כמו הפנוטיפ. סרגל קנה מידה שחור מייצג 100 מיקרומטר וסרגל קנה מידה צהובה מייצג 50 מיקרומטר. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 5. טיפול עם מעכבי מולקולה קטנים לחזור פנוטיפ הממאיר פחות ממאיר או שפירים כמו הפנוטיפ. א טיפול של 2 שורות תאי שד גרורתי מאוד SUM149 ומד"א-MB-231 עם SB203850 מעכבי קינאז MAP P38 (5 מיקרומטר) וSB202190 (10 מיקרומטר) מפחית אותםהתנהגות ממארת כפי שבאה לידי ביטוי בפנוטיפ acinar הסיבוב הבודד על 3D. תאי B. CCN6 KD HME טופלו במעכבי AKT LY294002 (7.5 מיקרומטר), Wortamannin (ננומטר 2) לא מראה שום השפעה אבל טיפול עם PD98059 kinase MAP מעכב (10 מיקרומטר) חוזר פנוטיפ לסיבוב בודד מאורגן מבני acinar. לחץ כאן לצפייה גדולה יותר תמונה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שתארנו כאן התרבות תלת ממדים של תאי אפיתל שד על קרום במרתף מחדש ואת השימושיות של מערכת זו כדי להבדיל בין פנוטיפ שפיר בשד לעומת ממאיר. גם מערכת זו יכולה לשמש לתרבות סוגי תאים שונים מרקמות בלוטות אחרות וכבר דווחה כי שימשה בהצלחה לאפיתל ערמונית התרבות, אפיתל הסימפונות, ותאי האפיתל של בלוטת התריס, עד כמה שם 12-14. חשיבותה של תרבות 3D טמונה בעובדה שמדובר בדגם מבחינה פיזיולוגית רלוונטי. תרבות 3D מספקת אמצעי כדי להשיג תובנות המנגנונים המולקולריים המובילים לשיבוש ארכיטקטורת הבלוטות במהלך השינוי הממאיר. כמו כן, מספקת מערכת מודל עבודה שיכולה להיות מועיל בהקרנת מטרות טיפוליות חדשניות לטיפול בסרטן. רבות תרופות אשר נמצאו יעיל בתרבות 2D לעתים קרובות יש השפעה מועטת בapplictai הניסיוני והקליני15 פיירפוקס. כתרבות 3D כזה יכול לספק כלי קליני חשוב לחזות את ההשפעה של תרכובות in vivo.
תרבות 3D היא טכניקה מאתגרת ויש לבצעו בזהירות. GFR Matrigel הוא מצע הנפוץ ביותר לתאי culturing ב-3D. זה יכול להיות מופשר על 4 מעלות CO / N, aliquoted וקפוא ב-20 ° C לשימוש עתידי. יש להימנע מהפשרת הקפאה חוזרת ונשנית. GFR Matrigel הוא נוזלי על 4 מעלות צלזיוס, אך מתקשה ב37 מעלות צלזיוס ויכול להיות קשה מאוד להתמודד בעת שינוי תקשורת ממוזגת עם תקשורת טרי או בעת עיבוד התאים לimmunocytochemistry. נא לא להשתמש בaspirator ואקום כדי להסיר את התקשורת המותנה כפי שתמיד גורם לאובדן של תרבויות acinar כל יחד עם Matrigel. הוא ציין כי במקרה של כמה שורות תאי הסרטן אגרסיביות כמו מד"א-MB-231 תאים אשר יוצרים רשת מאוד הסתעפות כמו מבנים Matrigel יכול להתנתק מsurלהתמודד, ולעתים קרובות היא פעמים צפות. יש להקפיד למצוץ תקשורת מהתרבויות האלה אחרת הם ילכו לאיבוד תוך הסרת אמצעי התקשורת.
חשוב לא פחות הוא הטיפול והמעבר של תאים הולך וגדל ככל תרבויות monolayer במיוחד לתאים שפירים כמו HME וMCF10A. במהלך מפגש או סטייה מהתקשורת שנקבעה עשויות להשפיע על היווצרות acinar ב-3D.
אפשר לבודד תאים מתרבויות 3D לעבד לבידוד RNA או חלבון באמצעות ערכת קצירת תא תרבות 3D זמינה מסחרי. לחלופין תרבויות תלת ממדים ניתן lysed ישירות באמצעות חיץ מבוסס תמוגה חומרי ניקוי כגון חיץ ריפה (1% Nonidet P-40, 0.2% SDS, 0.5% deoxycholate נתרן, כלוריד 150 מ"מ נתרן, 50 מ"מ טריס-HCl, pH 7.4, 10 מ"מ פלואוריד הנתרן, נתרן orthovanadate 1 מ"מ, ב-glycerophosphate 10 מ"מ, 5 מיקרוגרם / מיליליטר apoprotinin, 5 מיקרוגרם / מיליליטר leupeptin, ו100 פלואוריד phenylmethylsulfonyl מיקרומטר). עם זאת quantifi החלבוןקטיון אינו אפשרי במקרה זה בגלל שפע חלבון בMatrigel. כך lysates החלבון צריך להיות מנורמל עם מבחני colorimetric משמשים למדידת הפעילות של אנזימים יציבים cytosolic, כגון דהידרוגנז לקטוז (LDH) והכתמים יש reprobed לגן משק כמו אקטין או טובולין או GAPDH 3.
עם זאת קצירת התאים מתהליך Matrigel דורשת דגירה משך זמן ארוכה ב 4 ° C. הדבר עלול להשפיע על פרופיל הביטוי של החלבונים בתא שטח ובתור שכזו בimmunostaining אתר היא שיטה מתאימה יותר כדי לנתח את הביטוי של חלבונים בתא שטח. לimmunostaining דגירה נוגדן על כיסא נדנדה עדינה הוא מועיל באופן שווה מכתים את acini אבל מהירות אופטימלית וסוג הנדנדה הוא קריטי כמו שזה גם יכול להוביל לדחיקה של Matrigel. ריכוז הנוגדנים עשוי להזדקק אופטימיזציה אבל רוב הנוגדנים נמצאו להיות יעיל ב1:100 ריכוז. מוררשימה ספציפית דואר של נוגדנים מסופקת בטבלה. ניתן למצוא רשימה מפורטת של נוגדנים עם המפרטים שלהם בDebnath et al. 2 דגירה סימולטני עם נוגדן ראשוני יותר מפעם אחת שהתקבל מבעלי חיים שונים כמו עכברוש, ארנב ועכבר יכול להתבצע אך צריך להיות מותאמת בתחילה כדי לשלול כל תגובתיות צולבת .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH R01 CA107469, R01 CA125577, וU01CA154224 לCG Kleer, האוניברסיטה של סרטן מרכז התמיכה של מישיגן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth Factor Reduced Matrigel | BD Biosciences | 354230 | Avoid repeat freeze thaw |
| Lab-Tek glass hamber slides 8-well | Thermo Fisher Scientific | 177402 | Precool on ice |
| Lab-Tek glass chamber slides 2-well | Thermo Fisher Scientific | 177380 | Precool on ice |
| Goat anti mouse F(ab´)2 fragment | Jackson Immunoresearch | 115-006-006 | |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| Fluorescent conjugated Alexa antibodies | Molecular Probes | Please look at molecular probes website | |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Molecular Probes | P36935 | |
| 3D Culture Cell Harvesting kit | Trevigen | 3448-020-k | |
| Anti-Apha-6-integrin | Fisher Scientific | MAB1378 | 1:100 dilution for IF |
| Anti-GM130 | BD Biosciences | 610822 | 1:100 dilution for IF |
| Anti-phospho-histone 3 (Ser10)FITC Conjugated | Fisher Scientific | 16-222 | 1:100 dilution for IF |
| Anti-Cleaved caspase 3 (Asp 175) | Cell Signaling | 9661s | 1:50 dilution for IF |
| Anti-E-cadherin | BD Biosciences | 610181 | 1:200 dilution for IF |
References
- Arendt, L. M., Rudnick, J. A., Keller, P. J., Kuperwasser, C. Stroma in breast development and disease. Semin. Cell Dev. Biol. 21, 11-18 (2009).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30, 256-268 (2003).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nat. Methods. 4, 359-365 (2007).
- Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 332, 821-828 (2010).
- Rosen, P. P. Rosen's breast pathology. Rosen, P. , 3rd edition, Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia, PA. (2008).
- Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay. Biochem. Cell Biol. 74, 833-851 (1996).
- Kenny, P. A., et al. The morphologies of breast cancer cell lines in three-dimensional assays correlate with their profiles of gene expression. Mol. Oncol. 1, 84-96 (2007).
- Pal, A., Huang, W., Li, X., Toy, K. A., Nikolovska-Coleska, Z., Kleer, C. G. CCN6 modulates BMP signaling via the Smad-independent TAK1/p38 pathway, acting to suppress metastasis of breast cancer. Cancer Res. 15, 4818-4828 (2012).
- Pal, A., Huang, W., Toy, K. A., Kleer, C. G. CCN6 knockdown disrupts acinar organization of breast cells in three-dimensional cultures through up-regulation of type III TGF-β receptor. Neoplasia. 14, 1067-1074 (2012).
- Wang, F., et al. Phenotypic reversion or death of cancer cells by altering signaling pathways in three-dimensional contexts. J. Natl. Cancer Inst. 94, 1494-1503 (2002).
- Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).
- Wang, R., et al. Three-dimensional co-culture models to study prostate cancer growth, progression, and metastasis to bone. Semin. Cancer Biol. 15, 353-364 (2005).
- Vaughan, M. B., Ramirez, R. D., Wright, W. E., Minna, J. D., Shay, J. W. A three-dimensional model of differentiation of immortalized human bronchial epithelial cells. Differentiation. 74, 141-148 (2006).
- Fata, J. E., Werb, Z., Bissell, M. J. Regulation of mammary gland branching morphogenesis by the extracellular matrix and its remodeling enzymes. Breast Cancer Res. 6, 1-11 (2004).
- Luca, A. C., et al. Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines. PLoS One. 8, 1-11 (2013).
