Summary
再構成基底膜上の乳房上皮細胞の三次元培養は、良性乳房のインビボアーキテクチャを再現するために、良性乳房表現型から悪性の表現型を区別するために有用な方法である。重要なことに、このシステムは、他の組織に浸潤癌を研究するために適用することができる。
Abstract
浸潤性乳癌の転移に隣接する組織や性向の侵入を特徴とする悪性上皮性腫瘍の一群である。癌細胞とそれらの微小環境との間の信号の相互作用は、乳癌の成長および生物学的挙動1に強力な影響を与える。しかし、細胞外マトリックスからのこれらの信号の大部分が失われたり、細胞を単層として2次元培養（2D）で栽培されている場合、その関連性が代役されています。近年では、再構成基底膜上の3次元（3D）培養物は、良性および悪性の乳房細胞の組織構造を再現するための選択の方法として浮上している。 3Dで増殖した細胞は、細胞外マトリックスからの重要な手がかりを保持し、生理学的に関連するex vivoでのシステム2,3を提供する。注目すべきは、2次元4と比較して、3Dで増殖させたときの細胞は異なる挙動を示すことを示唆している証拠が増えている。三次元培養効果的に3関与良性乳房表現型から悪性表現型を区別するための手段として、および細胞および分子のシグナル伝達を支えるために使用することができる。良性の上皮細胞の顕著な特徴の1つは、頂端細胞質内腔に向かってであり、基底細胞質は基底膜上に載るように、それらが偏光されることである。このapico - 基底極性がでたらめに周囲の間質に浸透細管を吻合及び分岐の細胞崩壊と形成を特徴としている浸潤性乳癌で失われます。良性腺と浸潤癌との間に、これらの病理組織学的な違いは、3D 6,7で再生することができる。単一ラウンド腺房構造の定量のような適切なリードアウトを用いて、又は他の分子および細胞生物学技術と組み合わせて、細胞増殖、およびアポトーシスの極性が検証分子マーカーの発現を差動に、3D culturEは、より良い悪性形質転換の際に、責任あるシグナリングの輪郭を描くための細胞の変化を理解するための重要なツールを提供することができます。
Introduction
再構成基底膜上の乳房上皮細胞の三次元培養（3D）は、複雑な表現型および正常乳房および乳癌2,3の関連するシグナリングを研究するための重要なモデル系である。乳房の機能ユニットは、腺房へ分岐する小さなダクトで構成され、端末のダクト小葉単位（TDLU）です。腺房は、基底膜によって囲まれている5つの細胞層、上皮細胞および筋上皮細胞からなる高度に組織化された構造である。正常な腺房の最も顕著な特徴は、細胞の分極、基盤となる基底膜への付着や、特殊な細胞間接触である。この複雑な組織は浸潤癌で破壊されている。細胞が単層として成長させた広く使用されている2次元培養は、腺房の形成を可能にしないでください。このように、単層培養上皮細胞との間の複雑な関係を捕捉するシステムを提供することに欠けている正常な乳房と乳がんでの規制緩和にある。乳房細胞の機能的単型上皮培養物をいくつかの研究室2,3に開発されている。三次元培養は、Engelbreth-Holm-Swarmマウス肉腫細胞由来の可溶化抽出物であり、市販されてマトリゲル上の乳房細胞の増殖を伴う。コラーゲンのような他の3D基層はIもまた使用される。乳癌細胞は、細胞がマトリゲル2で培養埋め込 まれている3D埋め込 みアッセイにより3次元で培養することができる。あるいは、細胞はまた、マトリゲルより少ない量を必要とし、位相コントラスト撮影によってコロニー形成の時間経過のモニタリングを容易にし、 その場イメージング 2 のために理想的であるように費用対効果のある、3Dオーバーレイアッセイ、いわゆる、トップアッセイに3Dで培養することができる-3。上部アッセイに3Dは腺房表現型および遺伝子発現プロファイル7との間の相関を定義するために使用されている。
3D文化がeffectivすることができますエリー浸潤癌から正常および良性の細胞を区別するために使用される。通常の良性乳腺細胞が浸潤癌細胞が内腔の無いクリアで多産し、無計画に成長する一方で成長がマトリゲル上の中心部にある、明確に定義されたルーメンと偏光構造を逮捕形成している。 E6/E7不死化ヒト乳腺上皮細胞および線維嚢胞性変化を有する36歳の患者から単離された自然発生的に不死化細胞株であるMCF10A細胞株は、正常な3D 3,8における良性乳房表現型を再捕捉するために使用されているとして役立ったいくつかの分子8,9の発癌と腫瘍抑制機能を研究するためのモデルシステム。これらの良性の細胞は、レンチウイルス/レトロウイルスを導入することによって、目的の遺伝子（単数または複数）を操作するために操作することができる。目的の遺伝子（群）は、腫瘍抑制因子である場合は、目的の遺伝子が良性細胞では癌遺伝子の過剰発現であるかのに対し、shRNAを媒介ノックダウンは、悪性形質転換につながる悪性の表現型を示すべきである。どちらの場合も、3Dで形成された腺房構造は、悪性形質転換をキャプチャすることができます。
3Dでメッキ良性単一細胞は増殖し、球状構造ラウンドフォルムを開始します。一日5-8による細胞のこの球状凝集体は、マトリゲルと接触している細胞の周囲の偏光層と、マトリゲルとの接触を欠く少ない極性細胞の内塊へと分化する。次の10〜15日に、内側の細胞はアポトーシスが明らかに管腔を形成することにより、死に始めます。悪性細胞は、それらの極性を失って無計画に成長します。悪性度の高い細胞は、通常、分岐構造を形成する。表現型におけるこれらの差異は、タイムラプス位相コントラスト撮影によりその場で関連する分子マーカーを用いた免疫染色によって捕捉することができる。最も一般的に使用されるマーカーは、増殖マーカーホスホ - ヒストン3およびapoptotと組み合わせて、α-6インテグリン、基底極性マーカーであるでICマーカーはカスパーゼ-3を切断した。後者は、腺房の中心、正常および良性の乳房細胞の機能における内腔の形成があるかどうかを決定することが重要である。他方の極性と細胞間接触マーカーはGM130、ラミニン、ERM、E-カドヘリンが含まれる。交互に乳癌細胞株は、目的の遺伝子を操作するために操作することができる。この場合、それ以上の成長への復帰は、良性の表現型は癌表現型と区別するために読むようにして使用することができ逮捕した。
三次元培養はまた、悪性形質転換注意深く10-11に関与するシグナル伝達経路を描写するために使用することができる。使用して、上記リードアウト、薬理学的阻害剤、遮断抗体又は組換えタンパク質を挙げるが悪性形質転換をもたらすシグナル伝達分子で突き止めることに使用することができる。種々の研究室からの継続的な努力とそれがRNAを単離し、また、免疫ブロット法および免疫のための溶解物を調製するために3Dから細胞を抽出することが可能であるnoprecipitation。これらの戦略は、プロトコルの段階的かつ詳細に説明されています。
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Protocol
1。材料の作製と培養培地
- 4℃のCO / Nの減少融解成長因子（GFR）マトリゲル
- 37℃での必要な細胞株について完全なメディアを温めるMCF10A-ATCCは、メディアを指定していました。 5％ウシ胎児血清を補充したHME-HamのF-12培地、1μg/ mlのヒドロコルチゾン、5μg/ mlのインスリン、10 ng / mlの上皮増殖因子、および100 ng / mlのコレラ毒素; 5％FBS、2μg/ mlのヒドロコルチゾン及び5μg/ mlのインスリンを補充したSUM149-ハムF-12培地;およびMDA-MB-231から10パーセントFBS-DMEM
- 氷上で8ウェルチャンバースライドを予冷。
- 組織培養フード、用品を準備します。
8ウェルチャンバースライド中の2。三次元培養
- コートGFRマトリゲル40μlの8ウェルスライドの各ウェル。スライドの中央にマトリゲルを追加してから、P200のピペットチップを使用して拡散。につながる可能性気泡やoverspreadingを避け、できるだけ均等に広がるようにしてくださいメニスカス形成。
- 5％CO 2下、37℃でスライドをインキュベートする。マトリゲルが固化されているときに、細胞をトリプシン処理し、収集し4分間組織培養遠心分離機で150×gでスピン。
- 細胞を計数し、各細胞株の完全培地中12,500細胞/ mlに希釈する。 2％GFRマトリゲルを追加し、マトリゲル予めコーティングチャンバースライドの各ウェルに400μLを加える。
- CO 2インキュベータ内でスライドをインキュベートします。 15日まで、すべての4 日目の新鮮な完全なメディアの変化を与える。
- 薬理学的阻害剤を用いた治療：研究の阻害剤は、GFRマトリゲル上で細胞を成長させながら、3日ごと阻害剤を補充した新鮮な培地の変化に続いて、メッキの際に完全なメディアへの小分子阻害剤を追加します。
- 精製タンパク質を用いた治療：
- 細胞プレート次は2.1から2.3を繰り返します。培養物は、血清starvati続く4日間増殖することができます16時間に。
- 5日目に、FBSは、血清飢餓細胞へのメディアの補足0.1％で精製されたタンパク質の適切な濃度で細胞を処理する。 2日後に精製したタンパク質を含む新鮮な培地交換を与えます。
- 10日目での完全なHMEメディアに馴化培地を交換してください。培養物は、別の5日間増殖することができます。
- マトリゲル上で増殖させた腺房構造の免疫蛍光染色。
- 2％パラホルムアルデヒド、0.5％トリトンX-100および1×PBS、pH7.4中の100mMグリシンを調製する。 0.1％ウシ血清アルブミン、0.2％トリトンX-100、0.05％のTween-20を含む1×PBSを含む、免疫蛍光緩衝液（緩衝液IF）を調製する。
- 慎重に条件培地を吸引するP200のピペットチップを使用してください。
- 20分間室温（RT）で2％、新たに調製したホルムアルデヒドで腺房の構造を修正します。
- 4℃で10分間、0.5％トリトンX-100で細胞を透過
- 文化を洗う100mMグリシンエチルで3回、各洗浄のために10〜15分だ。
- RTで1時間、一次ブロックと呼ばIF緩衝液中の10％ヤギ血清で細胞をブロックする。
- 20μg/ mlのヤギ抗マウスのF（ab '）30分間の一次ブロックバッファ内の2フラグメントと文化をインキュベートする。このステップは、マトリゲルで免疫反応性マウスIgG種をブロックすることが重要です。
- 第二のブロッキング溶液中で一次抗体と共にインキュベートし、4℃で（一次ブロック+20μg/ mlのヤギ抗マウスF（ab '）2フラグメント）O / N
- 10〜15分緩やかに揺り動かしながらそれぞれのIF緩衝液で3回洗浄する。
- 45分間のIFバッファ内の蛍光結合二次抗体でインキュベートする。
- 10分間の洗浄を3回穏やかに揺らしながらIF緩衝液を用いて、それぞれ。
- 核を可視化するために、DAPIを含有する抗退色試薬でスライドをマウントします。
- スライドを室温でO / Nを乾燥することができます。
- 画像収集：コロニー周辺で共焦点画像を取得マトリゲルの上に増殖した細胞のdsection。詳細については、Zスタッキングにより腺房構造の全長にわたって光学一連のセクションを取得する。
3。イムノ用2ウェルチャンバースライドで三次元培養
- 氷上で2ウェルチャンバースライドを予冷。 2.1〜2.4がマトリゲル160μlの2ウェルチャンバースライドなどのコートのための試薬 をスケールアップし、2ウェルスライドの各ウェルに混ぜ、細胞/マトリゲルの1.6ミリリットルを追加する手順に従います。
- 製造業者の説明書に従って市販の3D培養の細胞の回収キットを用いてマトリゲルから腺房構造を収穫。
- 1Xと4℃に予冷する細胞洗浄および細胞の回収バッファーを希釈マトリゲルの洗浄および脱落を氷上で行うべきである。
- 細胞洗浄用緩衝液を用いて3倍腺房構造を洗ってください。
- 細胞収穫BUを使用して15ミリリットル遠心チューブに腺房を収集ffer 4℃でロッカーで30分間インキュベートした1ミリリットルピペットでよく懸濁物を混ぜる。これを小片にマトリゲルを破壊し、細胞収穫バッファに細胞の大部分を解放します。
- 培養遠心機で200×gで細胞をペレット化。 P200のピペットチップでペレット化した細胞からのヒドロゲルの浮遊層を除去する。
- キットで提供SDSサンプル緩衝液中で溶解物を再懸濁する。 RIPA溶解緩衝液を使用することもできる。
悪性対良性乳房表現型の4。定量
- ステップ2.1から2.4以下の各治療セットに対して三連で細胞を成長させる。
- スライドシフタと、コンピュータに取り付けられた位相差顕微鏡を用いて5倍または10倍の解像度で各ウェルから腺房構造の位相コントラスト画像を撮影する。別のフレームからスライドを移動するため、チャンバースライドのウェル全体を覆うことにより、画像を取る。
- 腺房構造の合計数をカウントし、シングルラウンドフラット腺房およびmultiacinar構造や組織を欠いて無計画に成長している構造の数の、それから発せられる分岐プロセスと数。
- 棒グラフのような単一のラウンドフラット腺房構造の割合対悪性の構造とプロットを計算します。スチューデントのt検定で有意差を計算します。
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Representative Results
3D培養物を効果的に良性の乳房からのヒト乳房上皮細胞の悪性の表現型を区別するために使用することができる。マトリゲル上にプレートし、単一の良性細胞が簡単に位相コントラストイメージングを用いて1つの平面内でラウンドフラット腺房として画像化することができる組織化球状構造として成長。マトリゲル上に播種単一の悪性細胞が、偶然に成長する非常に高い屈折率を示し、一平面内の画像に困難である。 図1に示すように、高転移性乳癌細胞株SUM149及びMDA-MB-231はそれらから発せられるプロセスと管状構造の分岐として成長するのに対し、良性HMEおよびMCF10A細胞は球状探し腺房を形成する。悪性形質転換を確認するために読み出され、腫瘍抑制因子としてまたは腫瘍プロモーターとして分子の機能を定義するために使用することができるように、良性の表現型からのそのような偏差を用いることができる。 図2は 、腫瘍抑制遺伝子CCN6 tのノックダウン（KD）に示すように、悪性形質転換をリガー。 HME細胞は、非常に早い段階から自分の組織を失うレンチウイルス媒介トランスフェクションによりCCN6の下に規制値を有するように設計。 CCN6 KD細胞は、無秩序な表現型を示し、一方、5日目に良性の対照細胞は、完全な球状構造を成長した。 15日目までに良性の対照細胞は成長が逮捕され、KD細胞（ 図2）許可されている場合は成長を続けて無秩序な大規模な管状構造を形成するために多産に成長に対し、明確に定義された中央管腔を周囲の細胞の偏光層を示しているになる。
いくつかの分子マーカーは、悪性乳房対良性の表現型を区別するために有利に使用することができる。良性乳房は、分化成長が3D培養で15日目での表現型を逮捕示しています。腺房は、明らかに、図3に対照細胞に示されるように、ラミニンVで免疫染色することにより可視化することができる基底膜の沈着を有する図3）に限定されないことがあります。
悪性形質転換に関与するシグナル伝達経路を薬理学的阻害剤と精製された組換えヒト（rhの）タンパク質の組み合わせを使用して描写することができる。 図4に示すように、malignanCCN6 KD HME細胞のT細胞表現型はrhCCN6タンパク質による外因性処理することにより、一回の腺房構造に戻すことができます。 DAPI染色された腺房構造の中央部での共焦点イメージングは、明らかrhCCN6で処理CCN6 KD細胞内の中央腔と偏腺房を示しています。同様に侵襲SUM149及びP38 MAPキナーゼ阻害剤で処理MDA-MB-231細胞は、悪性の表現型（ 図5A）の減少を示す。様表現型への復帰は、良性、悪性の構造と比較して、単一の丸腺房構造の割合を計算することによって定量することができる。阻害剤の特異性は、AKT阻害剤は、MAPキナーゼ阻害剤PD98059での処置は、単一ラウンド腺房構造（ 図5B）に著しい逆戻りを示しているのに対し、CCN6 KD細胞に対する影響を示さないという事実によって理解することができる。
10日間のマトリゲル上で増殖させ、悪性乳腺細胞対良性の図1。位相コントラスト像。良性の不死化ヒト乳腺上皮細胞（HME）と自然に不死化したMCF10A細胞は、任意の突起部のない単一のラウンドフラット腺房として成長。悪性のヒト乳房細胞株SUM149及びMDA-MB-231は、非常に無秩序な構造を成長させる一方。スケールバーは、100μmを表しています。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図2。HME制御およびマトリゲル上で増殖させCCN6 KD細胞の共焦点イメージング
図3。共焦点イメージングはベニ中の分子マーカーの発現差異を示していますgnの対悪性の乳腺細胞がCCN6 KD HME細胞極性および細胞-細胞接触マーカーE-カドヘリンの喪失の損失を示す、基底膜の破壊を表す基底極性マーカーアルファ-6 -インテグリンの損失をラミニンVの損失を示す。しかし、対照細胞は、基底膜の沈着（腺房周辺の無傷ラミニン層）、アルファ6インテグリンの基礎発現、GM130の頂端発現および細胞 - 細胞接合部でのE-カドヘリンの存在を示す。スケールバーは50μmで表しています。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図4。精製組換えヒトCCN6 protの外因性の処理によるCCN6 KD HME細胞の悪性表現型の逆転EIN。CCN6のKD細胞は、3D培養のように無計画 、侵襲的な腺房構造を成長する。しかし、CCN6 KD細胞は、表現型のような、より良性のを示して、内腔のクリアを持つ単一のラウンド腺房表現型rhCCN6ショー復帰の500 ng / mlの処理した。黒のスケールバーは、100μmを表し、黄色のスケールバーは50μmで表しています。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図5。小分子阻害剤を用いた治療はあまり悪性または表現型などの良性に悪性表現型を元に戻す。A. P38 MAPキナーゼ阻害剤のSB203850（5μM）との2高転移性乳癌細胞株SUM149およびMDA-MB-231の治療およびSB202190（10μM）は、それらを軽減などの悪性の挙動は、3D上の単一のラウンド腺房表現型に反映されます。 AKT阻害剤LY294002（7.5μM）で処理されたB. CCN6 KD HME細胞、Wortamannin（2 nm）とは効果を示さないが、MAPキナーゼ阻害剤PD98059（10μM）での処理は腺房構造を組織し、単一のラウンドに表現型を戻りは。 拡大表示するには、ここをクリックしてください画像。
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Discussion
ここでは、再構成基底膜上の乳房上皮細胞の三次元培養および悪性対良性乳房表現型を区別するために、このシステムの有用性を記載している。このシステムはまた、他の腺組織由来の培養物の異なる細胞型に使用することができ、いくつかの正常12-14に名前を付けるために、培養前立腺上皮、気管支上皮、および甲状腺上皮細胞に使用されてきたことが報告されている。 3D培養の重要性は、それが生理学的に関連するモデルであるという事実にある。 3D培養は、悪性形質転換の間に腺構造の破壊につながる分子メカニズムへの洞察を得るための手段を提供する。それはまた、癌を治療するための新規治療標的をスクリーニングすることに役立つ可能性が現用モデル系を提供する。2D培養物において有効であることが見出されている多くの薬物は、しばしば、実験的および臨床的applictaiにほとんど影響を及ぼさないアドオン15。このような三次元培養としてインビボで化合物の効果を予測するための重要な前臨床ツールを提供することができる。
3D文化は挑戦的な技術であり、慎重に行われるべきである。 GFRマトリゲルは3Dで細胞を培養するための最も一般的に使用される基質である。それは、4℃のCO / Nで解凍し、等分し、将来の使用のために-20℃で凍結することができます。反復凍結融解は避けるべきである。 GFRマトリゲルは4℃で液体であるが、37℃で固化し、新鮮な培地で馴化培地を変更するとき、または免疫細胞化学のために細胞を処理している間に処理するために非常に困難な場合があります。それは常にマトリゲルと一緒に全体腺房文化の喪失につながるように馴化培地を除去するために真空吸引器を使用しないで下さい。これは、非常に分岐ネットワークを形成するMDA-MB-231細胞のようないくつかの攻撃的な癌細胞株の場合には様構造マトリゲルシュールから切り離すことができることが観察される顔と浮動しばしばです。お手入れは、メディアを除去しながら、そうでなければ、彼らは失われます、これらの培養物からメディアを吸うように注意すべきである。
同様に重要なのは、特に、HMEとMCF10Aのような良性の細胞のための単層培養として成長する細胞のケアと通路がある。所定のメディアから合流点や逸脱にわたり3Dで腺房の形成に影響することがあります。
これは、市販の三次元培養細胞の回収キットを用いてRNAまたはタンパク質の単離のために処理する3D培養物から細胞を単離することが可能である。交互に三次元培養は、直接そのようなRIPA緩衝液のような界面活性剤ベースの溶解バッファー（1％ノニデットP-40、0.2％SDS、0.5％デオキシコール酸ナトリウム、150mM塩化ナトリウム、50mMトリス-HCl、pH7.4を用いて溶解することができる10 mMのフッ化ナトリウム、1 mMのオルトバナジウム酸ナトリウム、10mMのB-グリセロリン酸、5μg/ mlのapoprotinin、5μg/ mlのロイペプチン、および100μMフッ化フェニル）。しかしタンパク質quantifi陽が原因マトリゲル中のタンパク質の量は、この場合には不可能である。このようにタンパク質溶解物は、ラクトースデヒドロゲナーゼ（LDH）のような安定なサイトゾル酵素の活性を測定するために使用される比色アッセイで正規化されるべきであり、ブロットをアクチン又はチューブリン又は3 GAPDHなどのハウスキーピング遺伝子について再プローブされるべきである。
しかしマトリゲルプロセスからの細胞の回収は、4℃で、長時間のインキュベーションを必要とするこれは、細胞表面タンパク質の発現プロファイルに影響を与える可能性およびin situ免疫染色等の細胞表面タンパク質の発現を分析するためのより適切な方法である。穏やかなロッカー上抗体インキュベーションを免疫染色のために均等に腺房が、最適な速度とロッカー種類を染色するのに役立ちます、それはまた、マトリゲルの脱落につながる可能性として非常に重要です。抗体濃度は、最適化を必要とするかもしれないが、ほとんどの抗体は、1:100の濃度で効率的であることが見出された。粗腐植抗体のE特定のリストが表に記載されている。その仕様を有する抗体の詳細なリストは、Debnath らに記載されています。ラット、ウサギやマウスのような別の動物から得られた複数の一次抗体と2の同時インキュベーションを行うことができますが、任意の交差反応性を除外するために最初に最適化する必要があります。
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Disclosures
著者らは、競合する経済的利益を宣言していません。
Acknowledgments
この作品は、NIHの助成金R01 CA107469、R01 CA125577、およびCGのKleer、ミシガン州のがんセンターのサポート大学がU01CA154224によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth Factor Reduced Matrigel | BD Biosciences | 354230 | Avoid repeat freeze thaw |
| Lab-Tek glass hamber slides 8-well | Thermo Fisher Scientific | 177402 | Precool on ice |
| Lab-Tek glass chamber slides 2-well | Thermo Fisher Scientific | 177380 | Precool on ice |
| Goat anti mouse F(ab´)2 fragment | Jackson Immunoresearch | 115-006-006 | |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| Fluorescent conjugated Alexa antibodies | Molecular Probes | Please look at molecular probes website | |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Molecular Probes | P36935 | |
| 3D Culture Cell Harvesting kit | Trevigen | 3448-020-k | |
| Anti-Apha-6-integrin | Fisher Scientific | MAB1378 | 1:100 dilution for IF |
| Anti-GM130 | BD Biosciences | 610822 | 1:100 dilution for IF |
| Anti-phospho-histone 3 (Ser10)FITC Conjugated | Fisher Scientific | 16-222 | 1:100 dilution for IF |
| Anti-Cleaved caspase 3 (Asp 175) | Cell Signaling | 9661s | 1:50 dilution for IF |
| Anti-E-cadherin | BD Biosciences | 610181 | 1:200 dilution for IF |
References
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