Summary
Tredimensjonal kultur av melke epitelceller på en rekonstituert basalmembran er en nyttig metode for å rekapitulere in vivo arkitektur av godartet bryst, og for å skille den ondartede fenotype fra godartet bryst fenotype. Viktigere, kan dette systemet bli anvendt for å studere invasive karsinomer i andre vev.
Abstract
Invasiv brystcarsinomer er en gruppe av ondartede epiteliale tumorer karakterisert ved invasjon av tilgrensende vev og tilbøyelighet til å metastasere. Samspillet av signaler mellom kreftceller og deres mikromiljøet utøver en sterk innflytelse på brystkreft vekst og biologisk atferd en. Imidlertid er de fleste av disse signaler fra den ekstracellulære matriks er tapt eller deres relevans er studert når cellene er dyrket i kultur todimensjonal (2D) som et monolag. I de senere årene har tredimensjonale (3D) kultur på en rekonstituert basalmembran dukket opp som en metode for valg å rekapitulere den vevsarkitektur av godartede og ondartede brystcellene. Celler dyrket i 3D beholde de viktige signaler fra den ekstracellulære matriks og gir en fysiologisk relevant ex vivo-system 2,3. Av notatet, det er økende bevis som tyder på at cellene oppfører seg annerledes når de dyrkes i 3D i forhold til 2D fire. 3D kulturkan være effektivt brukes som et middel til å differensiere ondartet fenotype fra godartet bryst fenotype og for å underbygge den cellulære og molekylære signal involvert tre. En av de karakteristiske egenskapene til benigne epiteliale celler er at de er polarisert slik at den apikale cytoplasma ligger mot hulrommet og den basale cytoplasma hviler på basalmembranen. Dette apico-basal polaritet er tapt i invasive brystcarsinomer, som er preget av mobilnettet uorden og dannelse av anastomering og forgrening tubuli som måfå til det omliggende stroma. Disse histopatologiske forskjeller mellom godartet kjertel og invasive carcinoma kan reproduseres i 3D 6,7. Ved hjelp av de aktuelle lese-outs som kvantifisering av enkelt runde acinar strukturer, eller forskjells uttrykk for validerte molekylære markører for celledelingen, polaritet og apoptose i kombinasjon med andre molekylære og cellebiologiske teknikker, 3D kulturelte kan gi et viktig verktøy for å bedre forstå de cellulære forandringer under malign transformasjon og for opptegning av ansvarlig signalering.
Introduction
Tredimensjonal kultur (3D) av bryst epitelceller på rekonstituert basalmembran er en viktig modellsystem for å studere den komplekse fenotype og tilhørende signalisering av normalt bryst-og brystkreft 2,3. Den funksjonelle enhet av brystkreft er terminalkanalen lobul enhet (TDLU) som består av en liten kanal som grener inn acini. De acini er svært organiserte strukturer, bestående av to cellelag, epiteliale og korg celler, som er omgitt av en basalmembran fem. De mest karakteristiske trekk ved normale acini er mobilnettet polarisering, vedlegg til den underliggende basalmembran og spesialiserte celle-celle kontakter. Denne intrikate organisasjonen blir forstyrret i invasive karsinomer. De mest brukte 2D kulturer, der cellene er dyrket som monolayers, ikke tillater for dannelsen av acini. Således er monolag-dyrknings-mangler i å gi et system for å fange opp den intrikate forholdet mellom epitelcelleri normal bryst og deres deregulering i brystkreft. Funksjonelle monotypisk epitel kulturer av brystkreft celler har blitt utviklet i flere laboratorier 2,3. 3D kultur omfatter vekst av bryst-celler på Matrigel, som er et solubilisert ekstrakt avledet fra Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkom-celler, og er tilgjengelig kommersielt. Andre 3D grunnen som kollagen Jeg er også brukt. De bryst celler kan dyrkes i 3D av 3D innebygd analysen, der cellene dyrkes innebygd i Matrigel to. Alternativt kan cellene dyrkes ved 3D oppå analyse, også kjent som 3D-overleggsanalyse, noe som er kostnadseffektivt og den krever mindre volum av Matrigel, og letter tidsforløp overvåking av kolonidannelse ved fasekontrast avbildning og er ideell for in situ avbildning 2 -3. 3D på toppen analysen har blitt brukt til å definere sammenhengen mellom acinar fenotype og genuttrykk profil 7.
3D kultur kan effektiviEly brukes til å skille normale og godartede celler fra invasive carcinoma. Normal og godartede brystcellene danner vekst arrestert polariserte strukturer med en veldefinert lumen i sentrum på Matrigel mens invasive carcinoma celler vokse frodig og måfå uten clearing av lumen. E6/E7 udødeliggjort menneskelige mammary epitelceller og MCF10A cellelinje, som er et spontant udødeliggjort cellelinje isolert fra en 36 år gammel pasient med fibrocystic endringer, har blitt brukt til å gjenerobre den godartet bryst fenotype i 3D 3,8 og har fungert som et modellsystem for å studere den onkogene og tumor suppressor funksjon av flere molekyler 8,9. Disse godartet cellene kan bli konstruert for å manipulere gen (er) av interesse ved innføring av lentivirus / retrovirus. Hvis genet (er) av interesse er en tumor suppressor, vil shRNA-mediert knockdown føre til malign transformasjon mens hvis genet av interesse er et onkogen overekspresjon i godartede cellerbør vise en ondartet fenotype. I begge tilfeller acinar strukturer dannet i 3D kan fange malign transformasjon.
Godartede enkeltceller belagt i 3D begynner å spre seg og danne runde sfæriske strukturer. Etter dag 5-8 denne sfæriske aggregat av celler vil differensiere til et området polarisert lag av celler som er i kontakt med Matrigel, og en indre masse av mindre polariserte celler, som mangler kontakt med Matrigel. I de neste 10-15 dagene de indre cellene begynner å dø ved apoptose danner en klar lumen. De ondartede celler vil vokse måfå miste sin polaritet. Svært ondartede celler danner vanligvis forgrening strukturer. Disse forskjellene i fenotype kan bli fanget av tid forfalle fase kontrast bildebehandling og ved in situ farging med relevante molekylære markører. De mest brukte markører er alpha 6-integrin, en basal polaritet markør, i kombinasjon med spredning markør fosfo-histon-3 og apoptotic markør kløyvde caspase-3. Det siste er viktig for å bestemme om det finnes hulrom formasjonen i midten av acini, en funksjon av normale og godartet bryst-celler. Andre polaritet og celle-celle kontakt markører GM130, laminin, ERM, E-cadherin. Alternativt brystkreft cellelinjer kan være konstruert for å manipulere genet av interesse. I dette tilfelle tilbakevending til en mer vekst stanses benign fenotype kan brukes som en lest ut for å skille fra kreften fenotype.
3D kultur kan også være nøye brukes til å avgrense de signalveier involvert i malign transformasjon 10-11. Ved hjelp av de ovenfor nevnte avlesinger, farmakologiske inhibitorer, blokkering antistoffer eller rekombinante proteiner kan bli brukt kan fastslå at den molekylære signalering som fører til malign transformasjon. Med fortsatt innsats fra ulike laboratorier er det mulig å hente ut cellene fra 3D å isolere RNA og også forberede lysates for immunoblotting og immungnoprecipitation. Slike strategier er beskrevet i en trinnvis og detaljert måte i protokollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Utarbeidelse av materialer og Kultur Media
- Tine vekstfaktor redusert (GFR) Matrigel ved 4 ° CO / N.
- Varm opp komplette media for nødvendig cellelinje ved 37 ° C. MCF10A-ATCC spesifisert media; HME-Hams F-12 medium supplert med 5% føtalt bovint serum, 1 ug / ml hydrokortison, 5 ug / ml insulin, 10 ng / ml epidermal vekstfaktor, og 100 ng / ml koleratoksin; SUM149-Kams F-12 media supplert med 5% FBS, 2 mikrogram / ml hydrokortison og 5 mikrogram / ml insulin; og MDA-MB-231-10% FBS-DMEM
- Precool en åtte-brønns kammer lysbilde på is.
- Forbered vev kultur hette og forsyninger.
2. Tredimensjonal kultur i åtte-brønns Chamber Slide
- Coat hver brønn av 8-vel lysbilde med 40 pl av GFR Matrigel. Tilsett Matrigel i sentrum av lysbildet og deretter spredt ved hjelp av en P200 pipettespissen. Prøv å spre så jevnt som mulig, unngå bobler og overspreading som kan føre tilmeniskdannelse.
- Inkuber objektglassene ved 37 ° C under 5% CO2. Mens Matrigel er stivner og trypsinize cellene, samle og spinne på 150 xg i vev kultur sentrifuger i 4 min.
- Telle celler og fortynne til 12500 celler / ml i komplette media av den respektive cellelinje. Legg GFR Matrigel til 2% og tilsett 400 ul til hver brønn av en Matrigel forbelagt kammer lysbilde.
- Inkuber lysbilder i CO 2 inkubator. Gi ferske komplett medie endringer hver 4. dag frem til 15 dager.
- Behandling med farmakologiske inhibitorer: For inhibitor studier legge små molekyl-inhibitorer for det komplette mediet ved plating fulgt av ferske media endringer supplert med inhibitorene etter tre dager under veksten av cellene på GFR Matrigel.
- Behandling med renset protein:
- Plate cellene følgende trinn 02.01 til 02.03. Tillat kulturer å vokse i 4 dager etterfulgt av serum starvation i 16 timer.
- På dag 5, behandle cellene med passende konsentrasjon av renset protein i 0,1% FBS supplert medier til serum-sultet celler. Gi friskt media forandring med renset protein etter 2 dager.
- På dagen 10 erstatte den betingede media med komplett HME media. Tillat kulturer å vokse i ytterligere fem dager.
- Immunfluorescens farging av acinar strukturer dyrket på Matrigel:
- Forbered 2% para-formaldehyd, 0,5% Triton X-100 og 100 mM glycin i 1 x PBS, pH 7,4. Forbered immunfluorescens buffer (IF buffer) som består av 1 x PBS inneholdende 0,1% bovint serumalbumin, 0,2% triton X-100, 0,05% Tween-20.
- Bruk en P200 pipette til å suge forsiktig den betingede media.
- Fest acinar strukturer med 2% nylaget paraformaldehyde ved romtemperatur (RT) i 20 min.
- Permeabilize cellene med 0,5% Triton X-100 i 10 min ved 4 ° C.
- Vask kulturens tre ganger med 100 mM glysin, 10-15 min for hver vask.
- Blokker av cellene med 10% geiteserum i IF-buffer, som kalles primær blokk, i 1 time ved RT.
- Inkuber kulturer med 20 pg / ml geite-anti mus F (ab ') 2-fragmentet i primærblokken buffer i 30 min. Dette trinn er viktig for å blokkere de immunoreaktive mus IgG-arter i Matrigel.
- Inkuber med primært antistoff i det andre blokkeringsløsning (primær blokk 20 ug / ml geit-anti mus F (ab ') 2-fragment) O / N ved 4 ° C.
- Vask tre ganger med IF buffer for 10-15 min hver med milde rocking.
- Inkuber med fluorescerende konjugerte sekundære antistoffer i IF buffer for 45 min.
- Vask 3x for 10 min hver med IF buffer med milde rocking.
- Monter lysbildene med anti-fade reagens som inneholder DAPI å visualisere kjerner.
- Tillat lysbildene tørke O / N på RT.
- Bilde oppkjøpet: Innhente confocal bilder på kolonien midsection av celler dyrket på toppen av Matrigel. For mer informasjon erverve en serie av optiske seksjoner gjennom hele lengden av acinar strukturen av Z stabling.
Tre. Tredimensjonal Kultur i 2-vel Chamber Bakke til Immunoblotting
- Precool en 2-vel kammer lysbilde på is. Følg trinn 2.1 til 2.4 oppskalering av reagensene for 2-vel kammer glide f.eks belegge med 160 pl av Matrigel og tilsett 1,6 ml av celle / Matrigel blanding til hver brønn av den 2-vel lysbilde.
- Høste acinar strukturer fra Matrigel bruker kommersielt tilgjengelige 3D kultur celle høsting kit etter produsentens anvisninger.
- Fortynne celle vask og celle høsting buffere til 1x og precool til 4 ° C. Vasking og løsner Matrigel bør utføres på is.
- Vask acinar strukturer 3x hjelp av cellevaskebuffer.
- Samle acini i 15 ml sentrifugerør hjelp celle høsting buffer, etterfulgt av 30 min inkubering på en vippe ved 4 ° C. Bland suspensjonen godt med en 1 ml-pipette. Dette vil bryte av Matrigel i små stykker og frigjør mesteparten av cellene i cellehøste buffer.
- Pellet cellene ved 200 x g i en kultur sentrifuge. Fjern den flytende lag av hydrogel fra pelleterte celler med en P200 pipettespissen.
- Suspender lysatene i SDS sample buffer som følger med settet. RIPA-lyseringsbuffer kan også brukes.
4. Kvantifisering av ondartet vs Benign Breast Fenotype
- Grow celler i triplicates for hver behandling sett følge trinn 02.01 til 02.04.
- Ta fase bilder kontrast av acinar strukturer fra hver brønn ved 5X eller 10X oppløsning ved hjelp av en fase kontrast mikroskop festet til et lysbilde shifter og en datamaskin. Ta bildene ved å dra glidebryteren fra en ramme til en annen, og dermed dekker hele godt av kamret lysbildet.
- Telle det totale antall acinar strukturer,antall enkelt runde flate acini og antallet multiacinar strukturer eller måfå voksende konstruksjoner mangler organisasjon og med forgreninger prosesser som går ut fra den.
- Beregn prosentandelen av én runde flat acinar strukturer vs ondartede strukturer og tomten som en kolonne graf. Beregne betydningen av Student t-test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
3D kultur kan være effektivt brukes til å skille ondartet fenotype av menneskelige brystkreft epitelceller fra godartet bryst. Enkelt godartede celler belagt på Matrigel vokse som organiserte sfæriske strukturer som lett kan avbildes som enkelt runde flat acini i ett plan ved hjelp av fase kontrast bildebehandling. Enkelt ondartede celler sådd ut på Matrigel vokse måfå, viser meget høy brytningsindeks og er vanskelige å bilde i ett plan. Som vist i figur 1, godartet HME og MCF10A cellene danner sfæriske ser acini mens sterkt metastatisk brystcellelinjer SUM149 og MDA-MB-231 vokser som forgrening rørformede strukturer med prosesser som går ut fra dem. Et slikt avvik fra den benign fenotype kan brukes som en lest ut for å bekrefte ondartet transformasjon, og kan brukes til å definere funksjonen av et molekyl som et tumor suppressor eller som en tumor promoter. Som vist i figur 2, knockdown (KD) for tumorsuppressorgen CCN6 triggere en ondartet transformasjon. HME celler konstruert for å ha ned regulert nivåer av CCN6 av lentivirus mediert transfeksjon miste sin organisasjon fra veldig tidlig. På dagen fem godartet kontroll celler vokste som perfekte sfæriske strukturer mens CCN6 KD cellene vise en uorganisert fenotype. Ved dag 15 godartet kontrollcellene blir vekst arrestert og vise en polarisert lag av celler som omgir en veldefinert sentrale lumen mens KD cellene vokser frodig å danne uorganisert store rørformede strukturer som fortsetter å vokse hvis lov (figur 2).
Flere molekylære markører kan med fordel brukes til å skille mellom godartet g. malign bryst fenotype. Den godartet bryst viser en differensiert vekst arrestert fenotype etter dag 15 i 3D kultur. De acini har en avsetning av basalmembran som kan bli visualisert ved farging med laminin V som er tydelig vist i kontrollceller i Figur 3 (figur 3).
De signalbaner som er involvert i den maligne transformasjon kan være avgrenset ved hjelp av en kombinasjon av farmakologiske inhibitorer og renset rekombinant human (rf) proteiner. Som vist i figur 4 den malignant fenotype av CCN6 KD HME-celler kan bli tilbakestilt til én runde acinar strukturer ved eksogene behandling med rhCCN6 protein. Confocal bildebehandling på midtpartiet av DAPI farget acinar strukturer viser tydelig polarisert acini med sentrale lumen i CCN6 KD celler behandlet med rhCCN6. Tilsvarende den invasive SUM149 og MDA-MB-231-celler behandlet med P38 MAP kinase inhibitor viser reduksjonen i den maligne fenotype (Fig. 5A). Hjemfall til en godartet som fenotype kan kvantifiseres ved å beregne hvor stor prosentandel av single runde acinar strukturer i forhold til de ondartede strukturer. Spesifisiteten av de inhibitorer kan bli verdsatt ved at AKT-inhibitorer ikke viser noen virkning på CCN6 KD-celler, mens behandling med MAP kinase inhibitor PD98059 viser en bemerkelsesverdig tilbakevending til enkelt runde acinar strukturer (figur 5B).
Bilder av godartet vs ondartet brystkreft celler dyrket på Matrigel for 10 dager Figur 1. Fase kontrast. Godartet udødeliggjort menneskelige mammary epitelceller (HME) og spontant udødelig MCF10A celler vokse som enkelt runde flat acini blottet for enhver utstikket. Mens de ondartede menneskelige brystkreft cellelinjer SUM149 og MDA-MB-231 vokse som svært uorganiserte strukturer. Scale bar representerer 100 mikrometer. Klikk her for å se større bilde.
Figur 2. Confocal avbildning av HME-kontroll og CCN6 KD celler dyrket på Matrigel
Figur 3. Confocal avbildning viser differensial uttrykk av molekylære markører i Benign g. maligne brystceller. CCN6 KD HME-celler viser tap av laminin V, som representerer forstyrrelser i basalmembranen, tap av basal polaritet markør alfa-6-integrin, noe som indikerer tapet av polaritet og tap av celle-celle kontakt markør E-cadherin . Men kontrollcellene viser deponering av basalmembran (en intakt laminin lag rundt acini), basal uttrykk for alpha 6 inte, apikale uttrykk for GM130 og tilstedeværelse av E-cadherin på celle-celle krysset. Scale bar representerer 50 mikrometer. Klikk her for å se større bilde.
Figur 4. Reversering av ondartet fenotype av CCN6 KD HME celler ved eksogene behandling med renset rekombinant humant CCN6 protein. CCN6 KD celler vokse som tilfeldig, invasive acinar strukturer i 3D kultur. Men CCN6 KD celler behandlet med 500 ng / ml rhCCN6 showet hjemfall til enkelt runde acinar fenotype med clearing av lumen, noe som indikerer en mer godartet som fenotype. Svart skala bar representerer 100 mikrometer og gul skala bar representerer 50 mikrometer. Klikk her for å se større bilde.
Figur 5. Behandling med små molekyl hemmere tilbake ondartet fenotype til mindre ondartet eller godartet som fenotype. A. Behandling av to svært metastatisk brystkreft cellelinjer SUM149 og MDA-MB-231 med p38 MAP kinase hemmere SB203850 (5 mm) og SB202190 (10 mm) reduserer sinondartet atferd som gjenspeiles i den enkelt runde acinar fenotype på 3D. B. CCN6 KD HME celler behandlet med AKT hemmere LY294002 (7,5 mm), Wortamannin (2 nM) viser ingen effekt, men behandling med MAP kinase inhibitor PD98059 (10 mm) går tilbake fenotypen til én runde organisert acinar strukturer. Klikk her for å se større versjon image.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har beskrevet den tredimensjonale kulturen av bryst epitel-celler i et rekonstituert basalmembran og nytten av dette systemet til å skille mellom ondartede vs benign bryst fenotype. Dette systemet kan også brukes til å kultur forskjellige celletyper fra andre glandulært vev, og er blitt rapportert å ha blitt brukt til kultur prostata epitelial, bronkiale epitelceller, og skjoldbrusk epitelceller, for å nevne noen av 12-14. Betydningen av 3D-kulturen ligger i det faktum at det er en fysiologisk relevant modell. 3D kultur gir et middel til å få innsikt i de molekylære mekanismene som fører til avbrudd av kjertel arkitektur i løpet av malign transformasjon. Det gir også en fungerende modell system som kan være nyttig i screening nye terapeutiske mål for behandling av kreft. Mange legemidler som er funnet å være effektive i 2D kultur ofte har liten effekt i eksperimentell og klinisk applictaions 15. Som sådan 3D kulturen kan være et viktig verktøy for preklinisk å forutsi effekten av forbindelsene in vivo.
3D-kulturen er en utfordrende teknikk og bør utføres nøye. GFR Matrigel er den mest brukte substratet for dyrking celler i 3D. Det kan tines ved 4 ° CO / N, alikvoteres og fryses ved -20 ° C for fremtidig bruk. Gjentatt frysetining bør unngås. GFR Matrigel er flytende ved 4 ° C, men størkner ved 37 ° C og kan være meget vanskelig å håndtere ved endring av kondisjonert media med friskt media eller ved behandling av cellene for immunocytokjemi. Vennligst ikke bruk et vakuum vifte for å fjerne den betingede media som det alltid fører til tap av hele acinar kulturer sammen med Matrigel. Det er observert at i tilfelle noen aggressive kreftcellelinjer som MDA-MB-231 celler som danner svært forgrening nettverk lignende strukturer på Matrigel kan løsne fra suransikt og er ofte flytende. Forsiktighet bør utvises for å suge media ut av disse kulturene ellers vil de gå tapt mens du fjerner media.
Like viktig er det omsorg og passering av celler som vokser som ettlagskulturer spesielt for de godartede cellene som HME og MCF10A. Over samløpet eller avvik fra den foreskrevne medier kan påvirke acinar formasjonen i 3D.
Det er mulig å isolere celler fra 3D-kulturer for å behandle for RNA eller protein isolert ved hjelp av kommersielt tilgjengelige 3D kulturcelleinnhøstingsutstyr. Vekselvis tredimensjonale kulturene kan være direkte lysert ved hjelp av vaskemiddel basert-lyseringsbuffer som RIPA-buffer (1% Nonidet P-40, 0,2% SDS, 0,5% natrium-deoksycholat, 150 mM natriumklorid, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM natriumfluorid, 1 mM natrium-orthovanadate, 10 mM b-glyserofosfat, 5 ug / ml apoprotinin, 5 ug / ml leupeptin og 100 mM fenylmethyl-sulfonylfluorid). Men protein kvantifiseringkation er ikke mulig i dette tilfellet på grunn av protein overflod i Matrigel. Således protein lysatene skal bli normalisert med kolorimetriske assays som brukes for å måle aktiviteten av stabile cytosoliske enzymer, for eksempel laktose-dehydrogenase (LDH) og blotter bør reprobed for en husholdningsgenet som aktin eller tubulin, eller GAPDH 3.
Imidlertid cellehøstingen fra Matrigel prosessen krever langvarig inkubering ved 4 ° C. Dette kan påvirke ekspresjon profil av celleoverflateproteiner og som et slikt in situ farging er en mer hensiktsmessig metode til å analysere ekspresjonen av celleoverflateproteiner. For farging antistoff inkubasjon på en svak rocker er nyttig i jevnt farging acini men optimal hastighet og rocker slag er kritisk som det kan også føre til løsner den Matrigel. Antistoffkonsentrasjonen kan trenge optimalisering, men de fleste antistoffer som ble funnet å være effektivt ved konsentrasjonen 1:100. En more spesifikk liste av antistoffer er gitt i tabellen. En detaljert liste av antistoffer med sine spesifikasjoner kan bli funnet i Debnath et al. 2. Samtidig inkubering med mer enn én primær antistoff oppnådd fra forskjellige dyr som rotte, kanin-og muse kan utføres, men bør være optimalisert i første omgang å utelukke noen kryssreaktivitet .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIH stipend R01 CA107469, R01 CA125577, og U01CA154224 til CG Kleer, University of Michigans Cancer Center Support.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth Factor Reduced Matrigel | BD Biosciences | 354230 | Avoid repeat freeze thaw |
| Lab-Tek glass hamber slides 8-well | Thermo Fisher Scientific | 177402 | Precool on ice |
| Lab-Tek glass chamber slides 2-well | Thermo Fisher Scientific | 177380 | Precool on ice |
| Goat anti mouse F(ab´)2 fragment | Jackson Immunoresearch | 115-006-006 | |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| Fluorescent conjugated Alexa antibodies | Molecular Probes | Please look at molecular probes website | |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Molecular Probes | P36935 | |
| 3D Culture Cell Harvesting kit | Trevigen | 3448-020-k | |
| Anti-Apha-6-integrin | Fisher Scientific | MAB1378 | 1:100 dilution for IF |
| Anti-GM130 | BD Biosciences | 610822 | 1:100 dilution for IF |
| Anti-phospho-histone 3 (Ser10)FITC Conjugated | Fisher Scientific | 16-222 | 1:100 dilution for IF |
| Anti-Cleaved caspase 3 (Asp 175) | Cell Signaling | 9661s | 1:50 dilution for IF |
| Anti-E-cadherin | BD Biosciences | 610181 | 1:200 dilution for IF |
References
- Arendt, L. M., Rudnick, J. A., Keller, P. J., Kuperwasser, C. Stroma in breast development and disease. Semin. Cell Dev. Biol. 21, 11-18 (2009).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30, 256-268 (2003).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nat. Methods. 4, 359-365 (2007).
- Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 332, 821-828 (2010).
- Rosen, P. P. Rosen's breast pathology. Rosen, P. , 3rd edition, Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia, PA. (2008).
- Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay. Biochem. Cell Biol. 74, 833-851 (1996).
- Kenny, P. A., et al. The morphologies of breast cancer cell lines in three-dimensional assays correlate with their profiles of gene expression. Mol. Oncol. 1, 84-96 (2007).
- Pal, A., Huang, W., Li, X., Toy, K. A., Nikolovska-Coleska, Z., Kleer, C. G. CCN6 modulates BMP signaling via the Smad-independent TAK1/p38 pathway, acting to suppress metastasis of breast cancer. Cancer Res. 15, 4818-4828 (2012).
- Pal, A., Huang, W., Toy, K. A., Kleer, C. G. CCN6 knockdown disrupts acinar organization of breast cells in three-dimensional cultures through up-regulation of type III TGF-β receptor. Neoplasia. 14, 1067-1074 (2012).
- Wang, F., et al. Phenotypic reversion or death of cancer cells by altering signaling pathways in three-dimensional contexts. J. Natl. Cancer Inst. 94, 1494-1503 (2002).
- Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).
- Wang, R., et al. Three-dimensional co-culture models to study prostate cancer growth, progression, and metastasis to bone. Semin. Cancer Biol. 15, 353-364 (2005).
- Vaughan, M. B., Ramirez, R. D., Wright, W. E., Minna, J. D., Shay, J. W. A three-dimensional model of differentiation of immortalized human bronchial epithelial cells. Differentiation. 74, 141-148 (2006).
- Fata, J. E., Werb, Z., Bissell, M. J. Regulation of mammary gland branching morphogenesis by the extracellular matrix and its remodeling enzymes. Breast Cancer Res. 6, 1-11 (2004).
- Luca, A. C., et al. Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines. PLoS One. 8, 1-11 (2013).
