Summary
Трехмерная культура эпителиальных клеток молочной железы на восстановленного базальной мембраны является полезным методом резюмировать архитектуру в естественных условиях доброкачественной груди, и дифференцировать злокачественные фенотипа от фенотипа доброкачественной молочной железы. Важно отметить, что эта система может быть применена для изучения инвазивных карцином в других тканях.
Abstract
Инвазивным раком молочной железы представляют собой группу злокачественных эпителиальных опухолей характеризуется вторжения в соседние ткани и склонность к метастазированию. Взаимодействие сигналов между раковыми клетками и их микросреды оказывает мощное влияние на рост рака молочной железы и биологическое поведение 1. Тем не менее, большинство из этих сигналов от внеклеточного матрикса, потеряны или их актуальность недостаточно изучена, когда клетки выращивают в культуре двумерной (2D) в виде монослоя. В последние годы трехмерная (3D) культура на восстановленного базальной мембраны возник как метод выбора резюмировать тканевое архитектуру доброкачественных и злокачественных клеток молочной железы. Клетки, выращенные в 3D сохранить важные сигналы от внеклеточного матрикса и обеспечить физиологически соответствующую Экс Vivo системы 2,3. Следует отметить, что появляется все больше доказательств предполагая, что клетки ведут себя по-разному при выращивании в 3D по сравнению с 2D 4. 3D культурамогут быть эффективно использованы в качестве средства различения злокачественного фенотипа с фенотипом доброкачественной молочной и лежащие в основе клеточных и молекулярных сигналов участвуют 3. Одной из отличительных характеристик доброкачественных эпителиальных клеток является то, что они поляризованы так, чтобы верхушечная цитоплазма к полости, а базальная цитоплазма лежит на базальной мембране. Это апикально-базальной полярности теряется в инвазивным раком молочной железы, которые характеризуются клеточной дезорганизации и формирования анастомоз и ветвление канальцы, что случайно проникает в окружающий стромы. Эти гистологические различия между доброкачественной железы и инвазивным раком могут быть воспроизведены в 3D 6,7. Используя соответствующие выходы для чтения как количественного один раунд ацинарных структур или дифференциальной экспрессии проверенных молекулярных маркеров для клеточной пролиферации, полярности и апоптоза в сочетании с другими молекулярных и клеточных методов биологии, 3D культурное может служить важным инструментом для лучшего понимания клеточных изменений во злокачественной трансформации и для очерчивания ответственного сигнализации.
Introduction
Трехмерная культура (3D) молочной эпителиальных клеток на восстановленного базальной мембраны является важным модельной системой для изучения сложного фенотипа и связанного сигнализацию нормальной молочной железы и рака молочной железы 2,3. Функциональная единица груди является выводной проток очаговая блок (TDLU), который состоит из небольшой канал, который разветвляется на ацинусов. В ацинусы очень организованные структуры, состоящие из двух слоев клеток, эпителиальных и миоэпителиальных клеток, которые окружены базальной мембраной 5. Наиболее отличительные черты нормальных ацинусов являются клеточными поляризация, привязанность к подлежащей базальной мембраны и специализированные контакты межклеточные. Это сложная организация нарушается в инвазивным раком. Широко используемые 2D культур, где клетки выращивают в виде монослоев, не позволяют для формирования ацинусов. Таким образом, монослой культуры недостает обеспечение системы для захвата сложную взаимосвязь между эпителиальными клеткамив нормальном груди и их дерегулирования при раке молочной железы. Функциональные монотипический эпителиальные культуры клеток молочной железы были разработаны в нескольких лабораториях 2,3. 3D культура включает рост клеток молочной железы на Матригель, который является солюбилизированного экстракта получают из Engelbreth-Холм-Swarm клеток саркомы мыши и коммерчески доступен. Другие 3D субстраты, как коллаген Я также используются. Груди клетки можно культивировать в 3D на 3D встроенного анализа, где культивируют клетки встроены в Матригель 2. Кроме того, клетки можно культивировать на 3D на верхнем анализа, которая также называется 3D наложения Пробирной, который является экономически эффективным, так как требует меньшего объема Матригель, и облегчает времени мониторинг прошествии образования колоний контрастной томографии фазы и идеально подходит для на месте визуализации 2 -3. 3D сверху анализа был использован для определения корреляции между ацинозной фенотипа и профиля экспрессии генов 7.
3D культура может быть effectivелы используется, чтобы различать нормальные и доброкачественных клеток от инвазивной карциномы. Нормальные и доброкачественные клетки груди образуют рост арестован поляризованных структур с четко определенными просвет в центре на Матригель тогда инвазивные клетки карциномы растут в изобилии и бессистемно, без очистки просвета. Е6/Е7 увековечены человека эпителиальные клетки молочной железы и клеточной линии MCF10A, который является спонтанно увековечены клеточная линия, выделенный из 36-летнего пациента с фиброзно-кистозной изменений, были успешно использованы, чтобы вернуть фенотип доброкачественной молочной железы в 3D 3,8 и послужили модельная система для изучения онкогенных и супрессоров опухолей функцию нескольких молекул 8,9. Эти доброкачественные клетки могут быть спроектированы, чтобы манипулировать ген (ы) из интереса путем введения лентивирусов / ретровируса. Если ген (ы) интерес представляет собой супрессор опухоли, shRNA обусловленный нокдаун приведет к злокачественной трансформации, тогда как, если интересующий ген является избыточная экспрессия онкогена в клетки доброкачественныхдолжен показать злокачественного фенотипа. В обоих случаях ацинарные структуры, образованные в 3D может захватить злокачественной трансформации.
Доброкачественные одиночные клетки высевали в 3D начинают размножаться и образуют вокруг сферические структуры. Днем 5-8 этот сферический агрегат клеток будет дифференцироваться в окружающей поляризованного слоя клеток, который находится в контакте с Матригель и внутренней массой менее поляризованных клетках, в которых отсутствует контакт с Матригель. В ближайшие 10-15 дней внутренние клетки начинают умирать от апоптоза формирования четкого просвет. Злокачественные клетки будут расти случайно теряют свою полярность. Высоко злокачественные клетки обычно образуют ветвящиеся структуры. Эти различия в фенотипа могут быть захвачены времени контрастности изображений промежуток фазы и на месте иммуноокрашивания с соответствующими молекулярных маркеров. Наиболее часто используемые маркеры альфа 6-интегрин, базальный полярность маркер, в сочетании с распространением маркера фосфо-гистон 3 и apoptotМикросхема маркер расщепляется каспазы-3. Последнее важно, чтобы определить, есть ли просвет формирование в центре ацинусов, особенность нормальных и злокачественных клеток молочной железы. Другие полярности и межклеточного контакта маркеры включают GM130, ламинин, ERM, E-кадгерина. В качестве альтернативы линии клеток рака молочной железы может быть спроектирован для управления представляющий интерес ген. В этом случае возврат к более роста доброкачественных задержанного фенотип может быть использован как считывать отличить от фенотипа рака.
3D культура также может использовать осторожно, чтобы очертить сигнальные пути, участвующие в злокачественной трансформации 10-11. Использование указанное выше индикаторы, устройства фармакологические ингибиторы, блокирующие антитела или рекомбинантные белки могут быть использованы быть точно на молекулярном сигнализации, ведущие к злокачественной трансформации. С неустанные усилия различных лабораториях можно извлечь клетки от 3D изолировать РНК, а также подготовить лизатов для иммуноблотинга и IMMUnoprecipitation. Эти стратегии описаны в поэтапной и подробным образом в протоколе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка материалов и культура СМИ
- Оттепель фактор роста снижается (СКФ) Матригель при 4 ° СО / Н.
- Разминка полные носители для требуемой клеточной линии при 37 ° С MCF10A-АТСС указано СМИ; F-12 средний HME-Хэма с добавлением 5% фетальной бычьей сыворотки, 1 мкг / мл гидрокортизона, 5 мкг / мл инсулина, 10 нг / мл эпидермального фактора роста и 100 нг / мл холерного токсина; F-12 медиа-SUM149 Хама с добавлением 5% FBS, 2 мкг / мл гидрокортизона и 5 мкг / мл инсулина; и MDA-MB-231-10% FBS-DMEM
- Предварительного охлаждения в камере слайд 8-а на льду.
- Подготовка капот культуры ткани и материалы.
2. Трехмерная Культура в 8-а палаты Slide
- Пальто каждую лунку 8-а слайд с 40 мкл СКФ Матригель. Добавьте Матригель в центре слайда, а затем распространилась с помощью пипетки P200. Попробуйте распространяться как можно более равномерно, избегая пузырьков и крыле, которые могут привести кформирование мениска.
- Выдержите слайды при 37 ° С в атмосфере 5% CO 2. В то время как Матригель является укрепляя, Trypsinize клетки, собирать и вращаются на 150 мкг в культуре ткани центрифуги в течение 4 мин.
- Граф клеток и разбавляют до 12 500 клеток / мл в полной среды соответствующего клеточной линии. Добавить СКФ Матригель до 2% и добавить 400 мкл на каждую лунку Матригель предварительно покрытый камеры слайда.
- Инкубируйте слайды в СО 2-инкубаторе. Не давать свежие полные изменения медиа каждый 4-й день, пока 15 дней.
- Лечение с помощью фармакологических ингибиторов: Для исследования ингибитор добавляют низкомолекулярные ингибиторы к полной среде в момент посева с последующим свежих изменений среде с ингибиторами каждые три дня при выращивании клеток на СКФ Матригель.
- Лечение очищенного белка:
- Пластина клетки следующие шаги 2.1-2.3. Разрешить культуры расти в течение 4 дней, после чего в сыворотке starvatiв течение 16 часов.
- В 5-й день, лечить клетки с соответствующей концентрации очищенного белка в 0,1% FBS дополненной СМИ к голодающих клеток в сыворотке крови. Дайте свежую изменение медиа с очищенного белка через 2 дня.
- В 10-й день заменить кондиционированной среды с полным HME СМИ. Разрешить культуры расти в течение еще 5 дней.
- Иммунофлуоресцентное окрашивание ацинарных структур, выращенных на Матригель:
- Подготовка 2% параформальдегида, 0,5% Тритон Х-100 и 100 мМ глицина в 1X PBS, рН 7,4. Подготовка иммунофлюоресценции буфера (если буфер), который состоит из 1x PBS, содержащим 0,1% бычьего сывороточного альбумина, 0,2% Тритон Х-100, 0,05% Tween-20.
- Используйте пипетки P200 тщательно аспирации кондиционированной среды.
- Закрепить ацинарных структуры с 2% свежеприготовленного параформальдегида при комнатной температуре (RT) в течение 20 мин.
- Клетки проницаемыми с 0,5% Triton X-100 в течение 10 мин при 4 ° С.
- Вымойте культурысек три раза 100 мМ глицина, 10-15 мин для каждой стирки.
- Блок клеток с 10% козьей сывороткой, если буфер, называемый первичный блок, в течение 1 часа при комнатной температуре.
- Инкубируют культуры с 20 мкг / мл козьего анти мыши F (аb ') 2-фрагмент в первичном буфере блока течение 30 мин. Этот шаг важен для блокирования иммунореактивные мыши видов IgG в Матригель.
- Инкубировать с первичным антителом во втором блокирующего раствора (Первичный блок +20 мкг / мл козьего антитела мыши F (аb ') 2-фрагмент) O / N при 4 ° С.
- Вымойте три раза IF буфер в течение 10-15 мин каждого с нежным покачиванием.
- Инкубировать с флуоресцентными сопряженных вторичными антителами, если буфере в течение 45 мин.
- Вымойте 3x в течение 10 мин каждый с IF буфер с нежным покачиванием.
- Установите слайды с анти-выцветанию реагентом, содержащим DAPI визуализировать ядра.
- Разрешить слайды высохнуть O / N при комнатной температуре.
- Получение изображений: Приобретать конфокальных изображений в колонии миdsection из клеток, выращенных в верхней части Матригель. Для получения дополнительной информации приобретать серию оптических срезов по всей длине конструкции ацинозной по Z укладки.
3. Трехмерная Культура в 2-а палаты Слайды для Иммуноблоттинг
- Предварительного охлаждения камерный слайд 2-а на льду. Выполните шаги 2.1-2.4 расширения реагенты для 2-а камеры слайд например пальто с 160 мкл Матригель и добавить 1,6 мл клеточной / Матригель смешивать в каждую лунку слайде 2-а.
- Урожай ацинарные структуры от Матригель помощью коммерчески доступного набора уборки 3D клеточная культура в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Развести мытья клеток и клеток от буферов 1x и предварительного охлаждения до 4 ° С Стиральная и оплывание Матригель следует проводить на льду.
- Вымойте ацинарные структуры 3x с помощью буфера для промывки ячеек.
- Соберите ацинусы на 15 мл центрифужные пробирки с помощью сбора клеток буffer затем 30 мин инкубации на качалке при 4 ° С. Смешайте подвеска хорошо с 1 мл пипетки. Это сломает Матригель на мелкие кусочки и отпустите большинство клеток в буфере уборки клеток.
- Гранул клеток при 200g в питательной центрифуге. Снимите с плавающей слой гидрогеля из осажденной клеток с кончика пипетки P200.
- Ресуспендируют лизатов в SDS буфера для образца, входящие в комплект. РИПА лизис буфера также может быть использован.
4. Количественная оценка Злокачественная против доброкачественной молочной фенотипа
- Рост клеток в трех экземплярах для каждого набора лечения следующие шаги 2.1-2.4.
- Возьмите контрастные изображения Фаза ацинарных структур из каждой лунки на 5X или разрешения 10X с использованием контрастного микроскопа фаз, прикрепленный к слайд переключения передач и компьютером. Возьмем изображения путем перемещения слайд из одного кадра к другому, и, таким образом, охватывает весь лунку патрон слайда.
- Подсчитать общее количество ацинарных структур,количество одной плоской круглой ацинусов и количества multiacinar структур или случайно растущих структур, не имеющих организацию и с ветвления процессов, вытекающих из нее.
- Рассчитать процент одиноких круглых структур плоским ацинарных против злокачественных структур и сюжет как колонки графике. Вычислить значение Т-критерия Стьюдента.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
3D культура может быть эффективно использован для дифференциации злокачественной фенотип эпителиальных клеток молочной железы человека от доброкачественной груди. Одиночные доброкачественные клетки высевали на Матригель расти как организованных сферических структур, которые могут быть легко отображаемого в качестве одной плоской круглой ацинусов в одной плоскости с помощью контрастности изображений фаз. Отдельные злокачественные клетки высевают на Матригель расти хаотично, показывают очень высокий показатель преломления, и их трудно изображение в одной плоскости. Как показано на рисунке 1, доброкачественная ЖКХ и MCF10A клетки образуют сферические выглядящие ацинусы тогда высоко метастатических молочной клеточные линии SUM149 и MDA-MB-231 растут как ветвление трубчатых структур с процессами, вытекающих из них. Такое отклонение от доброкачественной фенотипа может быть использован как считывать, чтобы подтвердить злокачественной трансформации и может быть использован для определения функции молекулы как супрессор опухоли или в качестве промотора опухоли. Как показано на рисунке 2, нокдаун (KD) гена супрессора опухоли CCN6 тмонтажники злокачественную трансформацию. HME клетки инженерии, что вниз регулируется уровень CCN6 по лентивирусом опосредованной трансфекции потерять свою организацию от очень рано. В 5-й день доброкачественные клетки контроля росли как идеальную сферическую структуры тогда как клетки CCN6 KD показать дезорганизованы фенотип. К 15 день доброкачественные клетки контроля стать рост арестован и показать поляризованный слой клеток, окружающих четко определенную центральный канал в то время как клетки KD расти в изобилии, чтобы сформировать дезорганизованные большие трубчатые структуры, которые продолжают расти, если разрешено (рис. 2).
Несколько молекулярные маркеры могут быть использованы с выгодой, чтобы различать доброкачественные против злокачественной фенотипа молочной железы. Доброкачественные молочной показывает дифференцированный рост арестован фенотип на 15 день в 3D культуры. Ацинусов у отложение базальной мембраны, которые могут быть визуализированы иммунного окрашивания с ламинина V как это четко показано на контрольных клеток на фиг.3 (рис. 3).
Сигнальных путей, участвующих в злокачественной трансформации могут быть выделены с использованием комбинации фармакологических ингибиторов и очищенный рекомбинантный человека (RH) белков. Как показано на рисунке 4 malignanт фенотип CCN6 KD HME клеток можно вернуть к отдельным круглых ацинарных структур экзогенной терапии rhCCN6 белка. Конфокальной изображений в средней части из DAPI окрашенных ацинарных структур ясно показывают, поляризованный ацинусов с центральным каналом в CCN6 KD клетках, обработанных rhCCN6. Аналогично инвазивной SUM149 и MDA-MB-231 клетки, обработанные ингибитора р38 МАР-киназы показано уменьшение злокачественного фенотипа (фиг.5А). Возвращение к доброкачественной как фенотип может быть определена количественно путем расчета процента один раунд ацинарных структур по сравнению с злокачественных структур. Специфичность ингибиторов могут быть оценены на то, что ингибиторы AKT не показывают никакого эффекта на КД CCN6 клеток, тогда как лечение ингибитором МАР-киназы PD98059 показывает замечательную возврат к один раунд ацинарных структур (фиг.5В).
Рисунок 1. Контрастные изображения Фазовые доброкачественная против злокачественных клеток молочной железы, выращенных на Матригель в течение 10 дней. Доброкачественные иммортализованные человеческие эпителиальные клетки молочной железы (HME) и спонтанно иммортализованные MCF10A клетки растут как один плоской круглой ацинусов лишены каких-либо выступа. В то время как злокачественные молочной человеческие клеточные линии SUM149 и MDA-MB-231 расти как высоко дезорганизованные структуры. Шкала бар представляет 100 мкм. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 2. Конфокальной визуализации HME-контроля и CCN6 KD клеток, выращенных на Матригель
Томография Рисунок 3. Конфокальной показывает дифференциальную экспрессию молекулярных маркеров в Бенидп против злокачественных клеток молочной железы. CCN6 KD HME клетки показывают потерю ламинином V, представляющий нарушение базальной мембраны, потеря базальной полярности маркера альфа-6-интегрина, указывая потерю полярности и потери межклеточных контактов маркера Е-кадгерина . Однако контрольные клетки показывают отложение базальной мембраны (нетронутыми ламинином слоя вокруг ацинусов), базальную экспрессию альфа 6 интегрина, верхушечный выражение GM130 и наличие Е-кадгерина в межклеточной перехода. Шкала бар составляет 50 мкм. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 4. Восстановление злокачественного фенотипа CCN6 KD HME клеток путем экзогенного лечения очищенного рекомбинантного человеческого CCN6 протЭйн. CCN6 KD клетки растут как случайным, инвазивные Acinar структуры в 3D культуры. Тем не менее, CCN6 KD клетки обрабатывали 500 нг / мл rhCCN6 шоу реверсии к одной фенотипа круглого ацинозной с очистки просвета, что указывает на более доброкачественные как фенотип. Черный масштабная линейка представляет 100 мкм и желтый масштабная линейка представляет 50 мкм. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 5. Лечение низкомолекулярные ингибиторы вернуться злокачественного фенотипа менее злокачественной или доброкачественной фенотип. А. Лечение 2 высоко метастатических клеточных линий рака молочной SUM149 и MDA-MB-231 с P38 ингибиторов киназы MAP SB203850 (5 мкм) и SB202190 (10 мкМ) снижает ихзлокачественная поведение как отражается в один раунд ацинозной фенотипа на 3D. Б. CCN6 KD HME клетки, обработанные с ингибиторами AKT LY294002 (7,5 мкм), Wortamannin (2 нМ) не проявляют никакой реакции, но лечение ингибитором МАР-киназы PD98059 (10 мкм) возвращается фенотип, чтобы один раунд организован Acinar структур. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы описали здесь трехмерную культуру эпителиальных клеток молочной железы на восстановленного базальной мембраны и полезность этой системы различать фенотипа доброкачественной молочной злокачественная против. Эта система также может быть использован для культуры различных типов клеток из других железистой ткани и, как сообщается, были успешно использованы в эпителиальных культура простаты, бронхиальной эпителиальной и щитовидной железы эпителиальных клеток, чтобы назвать несколько 12-14. Важность 3D культуры заключается в том, что он является физиологически релевантных модель. 3D культура предоставляет средства, чтобы получить понимание молекулярных механизмов, что приводит к нарушению железистой архитектуры в злокачественной трансформации. Она также обеспечивает рабочую систему модели, которые могут быть полезны в скрининге новых терапевтических целей для лечения раковых заболеваний. Многие препараты, которые оказались эффективными в 2D культуре часто имеют небольшой эффект в экспериментальной и клинической applictaiДополнения 15. В качестве такого 3D культуры может служить важным доклинические инструмент для прогнозирования влияния соединений в естественных условиях.
3D культура является сложной техникой и должна быть выполнена тщательно. СКФ Матригель является наиболее часто используемым субстраты для культивирования клеток в 3D. Он может быть оттаивали при 4 ° CO / N, на аликвоты и замораживали при -20 ° С для последующего использования. Повторное замораживание оттаивания следует избегать. СКФ Матригель является жидким при температуре 4 ° С, но затвердевает при 37 ° С и может быть чрезвычайно трудно обрабатывать при изменении кондиционированной среды свежей средой или при обработке клеток в течение иммуноцитохимии. Пожалуйста, не используйте вакуумный аспиратор для удаления кондиционированной среды, как это неизменно ведет к потере целых культур ацинарных вместе с Матригель. Он отметил, что в случае некоторых агрессивных линий раковых клеток, как MDA-MB-231 клеток, которые образуют очень разветвленную сеть структур Матригель может оторваться от сюрлицо и часто раз плавающие. Следует проявлять осторожность, чтобы сосать СМИ из этих культур в противном случае они будут потеряны при удалении СМИ.
Не менее важным является уход и прохождение клеток, растущих как однослойных культур, особенно для доброкачественных клеток, как ЖКХ и MCF10A. За слияния или отклонения от предписанной СМИ могут влиять на формирование Acinar в 3D.
Можно выделить клетки от 3D культур для обработки для РНК или белка изоляции с использованием коммерчески доступного набора уборки 3D культуры клеток. Переменный трехмерные культуры могут быть непосредственно лизируют с использованием моющей основе-лизирующего буфера, такие как RIPA буфере (1% Nonidet Р-40, 0,2% SDS, 0,5% дезоксихолат натрия, 150 мМ хлорида натрия, 50 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 10 мМ фторида натрия, 1 мМ ортованадата натри, 10 мМ B-глицерофосфата, 5 мкг / мл apoprotinin, 5 мкг / мл лейпептина и 100 мкМ фенилметилсульфонилфторида). Однако белок quantifiкатион не возможно в данном случае, потому что белка изобилии в Матригель. Таким образом, белковые лизаты должны быть нормализованы с колориметрические анализы, используемые для измерения активности стабильных цитозольных ферментов, таких как лактоза (ЛДГ) и пятнами должны быть повторно зондировали для гена домашнего хозяйства, как актина или GAPDH тубулина или 3.
Однако уборка клеток из процесса Matrigel требуется большая продолжительность инкубации при 4 ° С. Это может повлиять на профиль экспрессии поверхностных белков клеточной и как таковой на месте иммунным окрашиванием является более подходящим способом анализа экспрессии белков клеточной поверхности. Для иммуноокрашивания антител инкубации на пологом рокер является полезным в равномерно окрашивания ацинусы но оптимальную скорость и рокер вид имеет решающее значение, поскольку это может также привести к оплывание в Матригель. Концентрацию антител, возможно, потребуется оптимизации, но большинство антител были найдены, чтобы быть эффективным в концентрации 1:100. Море Конкретный перечень антител приведены в таблице. Подробный список антител с их характеристики могут быть найдены в Debnath соавт. 2 одновременной инкубацией с более чем одним первичным антителом, полученной из различных животных, таких как крысы, кролика и мыши может быть осуществлена, но должны быть оптимизированы первоначально исключить любую перекрестную реактивность .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют каких конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NIH гранты R01 CA107469, R01 CA125577 и U01CA154224 к CG Kleer, Университета онкологический центр поддержки Мичигана.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth Factor Reduced Matrigel | BD Biosciences | 354230 | Avoid repeat freeze thaw |
| Lab-Tek glass hamber slides 8-well | Thermo Fisher Scientific | 177402 | Precool on ice |
| Lab-Tek glass chamber slides 2-well | Thermo Fisher Scientific | 177380 | Precool on ice |
| Goat anti mouse F(ab´)2 fragment | Jackson Immunoresearch | 115-006-006 | |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| Fluorescent conjugated Alexa antibodies | Molecular Probes | Please look at molecular probes website | |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Molecular Probes | P36935 | |
| 3D Culture Cell Harvesting kit | Trevigen | 3448-020-k | |
| Anti-Apha-6-integrin | Fisher Scientific | MAB1378 | 1:100 dilution for IF |
| Anti-GM130 | BD Biosciences | 610822 | 1:100 dilution for IF |
| Anti-phospho-histone 3 (Ser10)FITC Conjugated | Fisher Scientific | 16-222 | 1:100 dilution for IF |
| Anti-Cleaved caspase 3 (Asp 175) | Cell Signaling | 9661s | 1:50 dilution for IF |
| Anti-E-cadherin | BD Biosciences | 610181 | 1:200 dilution for IF |
References
- Arendt, L. M., Rudnick, J. A., Keller, P. J., Kuperwasser, C. Stroma in breast development and disease. Semin. Cell Dev. Biol. 21, 11-18 (2009).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30, 256-268 (2003).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nat. Methods. 4, 359-365 (2007).
- Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 332, 821-828 (2010).
- Rosen, P. P. Rosen's breast pathology. Rosen, P. , 3rd edition, Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia, PA. (2008).
- Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay. Biochem. Cell Biol. 74, 833-851 (1996).
- Kenny, P. A., et al. The morphologies of breast cancer cell lines in three-dimensional assays correlate with their profiles of gene expression. Mol. Oncol. 1, 84-96 (2007).
- Pal, A., Huang, W., Li, X., Toy, K. A., Nikolovska-Coleska, Z., Kleer, C. G. CCN6 modulates BMP signaling via the Smad-independent TAK1/p38 pathway, acting to suppress metastasis of breast cancer. Cancer Res. 15, 4818-4828 (2012).
- Pal, A., Huang, W., Toy, K. A., Kleer, C. G. CCN6 knockdown disrupts acinar organization of breast cells in three-dimensional cultures through up-regulation of type III TGF-β receptor. Neoplasia. 14, 1067-1074 (2012).
- Wang, F., et al. Phenotypic reversion or death of cancer cells by altering signaling pathways in three-dimensional contexts. J. Natl. Cancer Inst. 94, 1494-1503 (2002).
- Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).
- Wang, R., et al. Three-dimensional co-culture models to study prostate cancer growth, progression, and metastasis to bone. Semin. Cancer Biol. 15, 353-364 (2005).
- Vaughan, M. B., Ramirez, R. D., Wright, W. E., Minna, J. D., Shay, J. W. A three-dimensional model of differentiation of immortalized human bronchial epithelial cells. Differentiation. 74, 141-148 (2006).
- Fata, J. E., Werb, Z., Bissell, M. J. Regulation of mammary gland branching morphogenesis by the extracellular matrix and its remodeling enzymes. Breast Cancer Res. 6, 1-11 (2004).
- Luca, A. C., et al. Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines. PLoS One. 8, 1-11 (2013).
