Abstract
نحن تصف طريقة تم تطويرها مؤخرا لقياس الخواص الميكانيكية للأسطح الأنسجة النباتية باستخدام القوة الذرية المجهري (AFM) الصغيرة / نانو المسافات البادئة، لJPK فؤاد. على وجه التحديد، في هذا البروتوكول نقيس معامل يونغ واضحة من جدران الخلايا في قرارات التحت خلوية عبر المناطق تصل إلى 100 × 100 ميكرومتر ميكرومتر في الخلايا الإنشائية الأزهار، hypocotyls، والجذور. هذا يتطلب إعدادا دقيقا من العينة، واختيار الصحيح من indenters الصغيرة وأعماق المسافة البادئة. لحساب خصائص جدار الخلية فقط، يتم تنفيذ القياسات في حلول مركزة للغاية من مانيتول ليحل الجبلة الخلايا، وبالتالي إزالة مساهمة ضغط تورم الخلية.
وعلى النقيض من تقنيات موجودة الأخرى، وذلك باستخدام indenters مختلفة وأعماق المسافة البادئة، وهذه الطريقة تسمح قياسات متعددة النطاقات في وقت واحد، ومع ذلك، لا تزال هناك العديد من القيود: لا يمكن إلا أن طريقة استخدامها على عينات صغيرة نسبيا (حوالي 100 ميكرون في القطر) وفقط على الأنسجة الخارجية؛ طريقة حساسة للتضاريس الأنسجة؛ فهو يقيس جوانب معينة فقط من الخواص الميكانيكية المعقدة الأنسجة و. ويجري تطوير هذه التقنية بسرعة وأنه من المرجح أن معظم هذه القيود سيتم حلها في المستقبل القريب.
Introduction
ويتحقق النمو في النباتات عن طريق التوسع المنسق لجدران الخلايا الجامدة التي تحيط كل خلية من خلايا الكائن الحي. تراكم الأدلة تشير إلى أنه من خلال تعديل الكيمياء جدار الخلية أن النباتات السيطرة محليا هذا التوسع. ويعتقد أن توسع لتكون مدفوعة أساسا عن طريق الضغط على جدران الخلايا، والناجمة عن ارتفاع ضغط تورم الخلية؛ ويخضع هذا الرد سلالة لضغوط تورم من قبل الخواص الميكانيكية للجدران الخلايا 1. لا يعرف الا القليل من هذه الخصائص الميكانيكية وكيف تتغير خلال التنمية. وعلاوة على ذلك والقليل المعروف عن كيفية التحكم في هذه الخصائص الميكانيكية وعما إذا كانت الاصداء يسهم في تغيير كيمياء جدار الخلية بطريقة ما يبدو أن يتم تنسيق عبر الأنسجة. إذا أردنا أن نفهم العلاقة بين التغيرات الكيميائية والميكانيكية في جدران الخلايا النباتية خلال التنمية، وفي نهاية المطاف كيف تحكم هذه التفاعلات المجهرية مصنعمطلوب النمو 'ق العيانية، وهو الأسلوب الذي يمكن رصد الخصائص الميكانيكية للجدران الخلايا في تطوير الأجهزة على المستوى الخلوي أو الأنسجة.
أسلوب القوة الذرية المجهري (فؤاد) وصفها هنا، والتي تقوم على ميكرومتر أو نانومتر الضغط على الأنسجة أو المسافات البادئة، وقد وضعت على وجه التحديد لقياس الخواص الميكانيكية للجدران الخلايا في تطوير أجهزة في وقت واحد في قرارات التحت خلوية وعبر مناطق بأكملها من الأنسجة. أساليب أخرى إما قرارا منخفضة جدا أو مرتفعة جدا: على التمدد هو فقط قادرة على قياس متوسط الخواص الميكانيكية للأنسجة كلها في نطاق ملليمتر 2-4، وهو النطاق الذي هو على سبيل المثال كبيرة جدا لقياس الأحداث في وقت مبكر من توالد؛ وmicroindenter يمكن أخذ القياسات في قرار التحت خلوية على مقياس متناهي الصغر، لكنه يقتصر على قياس خلايا معزولة وليس مجموعات من الخلايا أو الأجهزة 5-7. مع فؤاد، وتتطلبد الأنسجة الخلوية، وقرارات التحت خلوية ويمكن تحقيق 8-10. في الآونة الأخيرة تم تطوير العديد من البروتوكولات خصيصا لقياس اليات الأنسجة النباتات التي يمكن أن تستخدم أيضا 11 و 12.
سنستعرض هنا كيفية تقييم مرونة الأنسجة من خلال قياس معامل الظاهر يونغ 13.
يتم استخدام معامل يونغ عادة لوصف صلابة من المواد. خلال تشويه صغيرة القوة المطلوبة لتشوه مادة يتناسب مع مجال المسافة البادئة. معامل يونج هو هذا معامل. في حالة وجود مواد متجانسة المستمر سيتم قياس معامل نفسه بغض النظر عن نوع المسافة البادئة (الحجم والشكل) ولكن سوف يتغير مع سرعة القياس. في حالة من بنية معقدة من أنسجة النباتات، وقد لاحظنا حتى الآن أن القوة تتناسب مع تشوه السماح تحديدمعامل التناسب أننا اسم "معامل الشباب على ما يبدو". في المقابل من وسائط الإعلام المستمر في النباتات، وهذا واضح معامل الشباب حساس لحجم المسافة البادئة. أنها لا تتوافق مع معاملات الرجوعية الشباب من جدار الخلية نقية. فهو يصف أفضل مرونة من السقالات من خلايا جدار الأنسجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد الشرائح الزجاجية لتركيب عينة
- إعداد الطمر وسائل الإعلام الاغاروز: 0.7٪ انخفاض ذوبان الاغاروز في 10٪ مانيتول (في الماء).
- باستخدام أداة معدنية قوية (مثل الحفر طرف، والجير)، حفر خارج المنطقة 0.5 سم × 0.5 في وسط شريحة زجاجية مجهرية. أو بدلا من ذلك، الغراء قطعة صغيرة من الزجاج لاميلا (حوالي 20 × 200 ميكرون) إلى شريحة زجاجية باستخدام الغراء Araldite. ملاحظة: هذا roughens السطح من أجل تسهيل التصاق الاغاروز لضمان أن العصي وسائل الإعلام الاغاروز أو الإصلاحات إلى الشريحة. يمكن إعادة استخدامها هذه الشريحة.
- وضع قطرات من حوالي 20 ميكرولتر من وسائل الإعلام الطمر الاغاروز على المنطقة محفورا من شريحة زجاجية. وهذا يعطي طبقة رقيقة من الاغاروز.
- تخزين شريحة زجاجية في مربع الرطبة وانتظر الإعلام لترسيخ الاغاروز.
2. تشريح وتركيب عينات النسيج الإنشائي
- Microdissect الخلايا الإنشائية لimagi متحد البؤرنانوغرام: إزالة البراعم الزهرية واحدا تلو الآخر من جذع عن طريق سحب عليهم مع ملاقط غرامة فائقة. فمن المهم لإزالة جميع البراعم الزهرية حتى البراعم التي لا تظهر كأسية (أي براعم P1 14).
- باستخدام شفرة حلاقة أو غيض من ملاقط، وقطع النسيج الإنشائي بعيدا عن الجذع. وينبغي أن يكون خفض مواز للمنطقة من سطح النسيج الإنشائي الذي سيتم قياس مع فؤاد. وينبغي أن تكون قمة حصل بين 300 ميكرون و 600 ميكرون عالية لتناسب تحت غيض فؤاد.
- دفع قمة في الفيلم من وسائل الإعلام الاغاروز أعدت في الخطوة 1.1.4. اختيار الموقف على شريحة زجاجية / الاغاروز ودفع مثل هذه بلطف أن النسيج الإنشائي على حد سواء على اتصال مباشر مع شريحة زجاجية ويبرز الخروج من الاغاروز. فمن الأهمية بمكان لوضع النسيج الإنشائي في الاغاروز في غضون بضع ثوان التي تتبع خفض من الجذع. ملاحظة: هذا هو من أجل منع النسيج الإنشائي من التجفيف. في هذه المرحلة، سيتم النسيج الإنشائي واقفا في CRACك لأن الاغاروز بكسر على تطبيق الضغط.
- إعداد العديد من الخلايا الإنشائية لهذا الطريق لدفعة التصوير، وتوفير أنهم من نفس الارتفاع ويتم وضع أقل من 500 ميكرون من بعضها البعض على الشريحة. الحفاظ على الخلايا الإنشائية أعدت في مربع الرطبة بينما تشريح عينات أخرى.
ملاحظة: إنه يحد من الاختلاف يأتي من المعايرة. من الناحية المثالية 2 عينات من كل شرط يمكن إعداد وقياس عشوائيا. حتى الآن ليس هناك أي تأثير لوحظ من التصوير دفعة على القياس (الاجهاد الناجم الاستجابة). هذا يمكن أن يكون ذلك بفضل التخفيف من الإجهاد يشير الجزيئات في أجار و / أو الحل في تصاعد مستمر. بدلا من الاستجابة للضغط النفسي هو نفسه بغض النظر عن كمية من العينة مستعدة. - قبل الانتقال إلى الخطوة التالية، تأكد من أن الحدود بين النسيج الإنشائي وبراعم الأزهار جافة. إن لم يكن، وإزالة الماء الزائد بلطف باستخدام ورق الترشيح. هذا ينبغي أن يمنع في المرحلة المقبلة أن ذابتالاغاروز الفيضانات العينة بسبب القوى الشعرية.
- مع ماصة 20 ميكرولتر، إضافة ما يكفي من ذاب تصاعد الاغاروز لملء في صدع إنشاؤها في الخطوة 1.2.3. وتحيط بكل النسيج الإنشائي. الاغاروز ينبغي أن تصل إلى مستوى ندبة من برعم زهرة إزالتها (منشم). لتحقيق هذا، قد يكون من الضروري إضافة الاغاروز في نهاية كل من الكراك.
- عند إضافة الاغاروز، وسوف تغرق بسرعة في صدع؛ باستخدام ماصة، تمتص قبالة جزء من ذاب تصاعد الاغاروز لضمان أن النسيج الإنشائي هو أعلى نقطة على الشريحة. هذا على إصلاح النسيج الإنشائي بحيث لا يمكن أن تتحرك خلال التصوير.
3. تركيب الجذر أو عينات التحتفلقي
- لجذور وhypocotyls، لا تشريح ضروري. في الفيلم رقيقة من الاغاروز على شريحة زجاجية استعداد، وجعل أخدود إما مباشرة فوق لحفر في الزجاج أو على طول الصفيحة الزجاجية. ضع الجذر أو التحتفلقي في هذا الأخدود ضمان أنه في اتصال معالزجاج على طوله كله.
- قبل الانتقال إلى الخطوة التالية، تأكد من أن العينة الجافة في سطحه. إن لم يكن، وإزالة بلطف وفائض من المياه باستخدام ورق الترشيح.
- إضافة ذاب تصاعد الاغاروز حول عينة كما في الخطوة 1.2.6.
4. إعداد فؤاد وحساسية معايرة (لو NanoWizard JPK فؤاد)
- جبل ناتئ على فؤاد. يجب أن يتم تنظيمها ناتئ مع إندينتر على شكل مستدير. فإن نصف قطرها تحديد س، ص، ض القرار وعمق المسافة البادئة في القياس الدقيق الذي يمكن أرشفة.
- لأخذ القياسات ميزو النانوية على سطح البشرة، واستخدام إندينتر الجولة 50 نانومتر نصف قطرها؛ لأخذ القياسات المتوسطة المدى، واستخدام 0.5 ميكرومتر إندينتر الجولة دائرة نصف قطرها؛ لأخذ القياسات الميكروسكيل (2-3 عبر الخلايا)، واستخدام إندينتر الجولة دائرة نصف قطرها 2.5 ميكرومتر.
- وضع الليزر على طرف ناتئ. محاذاة الليزر إلى منتصفمن الآسر باستخدام مرآة.
- وضع كوب نظيف تحت فؤاد.
ملاحظة: يتم تعيين التالية لتحويل إشارة لموقف الليزر على مستقبلات فؤاد إلى تشوه ناتئ، وتقييم مستمر ربيع ناتئ، لترجمته إلى قوة. - النهج مع قوة الهدف "نقطة مجموعة" من 1 V.
- حدد "التحليل الطيفي القوة". القيام المسافة البادئة من خلال تحديد الحد الأقصى "نقطة مجموعة النسبية" ل2 V، و "تمديد السرعة" إلى 40 ميكرون / ثانية، و "طول ض" إلى 5 ميكرون.
- من القائمة "المعايرة مدير"، حدد الخطية جزء من منحنى إلى الأمام لتناسب حساسية باستخدام زر "اختيار مجموعة مناسبة". "نقطة مجموعة النسبية" يجب أن تتحول من "فولت" إلى "متر".
- من القائمة "مدير المعايرة"، حدد "ربيع دائم" لتقييم ايلasticity من ناتئ باستخدام التقلبات الحرارية. اضغط على "تشغيل" للحصول على المؤامرة الكثافة الطيفية للناتئ. العثور على ذروة صدى مع أدنى تردد. أنها تناسب باستخدام زر "اختيار مجموعة مناسبة".
ملاحظة 1: للحصول على مزيد من التفاصيل على ضبط التقلبات الحرارية، وقراءة كوك 15 آخرون.
ملاحظة 2: يفضل استخدام الطريقة المباشرة لتقييم مرونة ناتئ باستخدام ناتئ المرجعية (أو المواد مع صلابة المعروفة). وقد تبرعت تلك المستخدمة هنا تفضلت عاطف Asnacios 16. - إضافة 200 ميكرولتر من 10٪ محلول مانيتول تحت طرف ناتئ. إعادة تنظيم الليزر لمنتصف الآسر باستخدام مرآة.
- إعادة ضبط حساسية: من القائمة "المعايرة مدير"، انقر على زر "غير معروف"؛ كرر الخطوات من 2.3 إلى 2.5 خلال.
5 الحصول على البيانات: ولي يونغ معامل رسم الخرائط
6 تحليل البيانات: حسابات معامل ولي يونغ
- فتح ملف البيانات في البرنامج وتحليل البيانات.
- حدد "تجهيز الدفعات" لتطبيق نفس التحليل لجميع منحنيات خريطة واحدة.
- حدد "تصحيح الارتفاع لالانحناء للناتئ" لذلك لاستخراج عمق المسافة البادئة.
- حدد "معامل تناسب وظيفة يونغ" التي ستتولى القوة يتناسب مع مجال المسافة البادئة. تعيين "شكل نصيحة" إلى مكافئ لنفترض أن المسافة البادئة هو شكل قطع مكافئ.
- وتشير دائرة نصف قطرها من الحافة.
- حدد تفضيلي "التراجع" منحنى لتحليل لأنها أقل حساسية للتضاريس من منحنى "تمديد". ومع ذلك، إذا كان هناك خلاف كبير من التحقيق خلال "التراجع"، استخدم منحنى "تمديد"، والتي هي حساسة للالتصاق.
- مجموعةنسبة بواسون إلى 0.5. الصحافة على تحليل وحفظ الإخراج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في الشكل 1 نقدم نموذجية معاملات الرجوعية الخرائط الشباب من الخلايا الإنشائية الأزهار (أرقام 1A و 1B)، hypocotyls الصغار والكبار (أرقام 1C-F)، والنسيج الإنشائي الجذر (الشكل 1G و1H). في جميع التجارب إندينتر هو نصف كروية، ولكن نصف قطرها يختلف بحيث يمكن تحقيق دقة مكانية مختلفة الأشكال و1C 1D تظهر نتائج نموذجية لindenters-ميزو النانوية (50 نانومتر نصف قطرها) مع الانبعاجات-النانو المتوسط (50 العمق نانومتر).؛ . وcartographs تكشف التغاير الميكروسكيل في جدران الخلايا السطحية من خلايا البشرة التحتفلقي أرقام 1A، 1E، 1G وتظهر نتائج نموذجية لindenters المتوسطة المدى (500 نانومتر نصف قطرها) مع الانبعاجات المتوسطة المدى (500 عمق نانومتر) لالنسيج الإنشائي الأزهار، التحتفلقي، والجذر؛ لاحظ أن لأن دائرة نصف قطرها إندينتر يتجاوز قطرها من جدار الخلية هذا ميزو المسافة البادئة يقيم'واضح' معاملات الرجوعية الشباب من جدران الخلايا احديدابي (انظر Peaucelle وآخرون. 9،17 وBraybrook آخرون 10 لمزيد من التفاصيل). أخيرا، ويبين الشكل 1B لcartograph لindenters الميكروسكيل (2.5 ميكرومتر نصف قطرها) مع الانبعاجات النطاق المتوسط (500 عمق نانومتر)؛ ومن المثير للاهتمام، والتصوير في هذا القرار كشف تليين الأنسجة أثناء بدء الجهاز الذي يسبق أي نمو مرئية 9.
نحن الآن تسليط الضوء واقتراح الحلول الجزئية إلى أربعة الصعوبات التقنية التي تنشأ عادة عند استخدام فؤاد لقياس خصائص تطوير أجهزة النبات. الأولى، عينات يمكن جعلهما غير صحيح في الاغاروز: المناطق التي يتم تغطيتها مع الاغاروز لا يمكن قياسها بشكل صحيح (انظر الشكل 1E حواف السهم). لحل هذه المشكلة، حاول تكرار الخطوة 1.2.6. الثانية، قد العينات التي يتم إصلاحها بشكل غير صحيح إلى الشريحة الزجاجية التحرك خلال التجربة؛ ثم تظهر المشارب الشاذة في الصور مديونلdecorrelation بين اليسار واليمين يتقدم بالاشعة (الشكل 1F). لحل هذه المشكلة، حاول بعناية تكرار إعداد نموذج. ثالثا، يجب أن يكون المدى ض ارتفاع العينة أقل من عتبة معينة. لا يوجد أي قيود على ارتفاع متوسط العينة في رأسي اتجاه زي، ولكن يجب أن يكون النطاق في الارتفاع في اتجاه زي (المسافة بين أعلى وأدنى نقطة) أقل من 15 ميكرون، وإلا سيتم إحباط الفحص (انظر الرقم 1B؛ الإعدادات في nanowizard AFM). هذا هو لأنه، أثناء الفحص، فؤاد تلقائيا بضبط ارتفاع ناتئ لتتناسب مع ارتفاع العينة، ولكن في مسح واحد ارتفاع ناتئ يمكن أن تختلف وفقا ل15 ميكرون فقط. لحل هذه المشكلة، استخدم وحدة cellHesion JPK، مما يزيد من ض المدى إلى 100 ميكرون، كما هو موضح في الشكل 1E-G. الرابعة، وطريقة حساسة للتصاميم السطح: كلما سطح العينة هي اورينتيد موازية لاتجاه المسافة البادئة، وأقل موثوقية القياسات. في العينة الجذرية الواردة في الشكل 1G-H، جدران الخلايا موازية لمحور طويل من الجذر تكون غير مرئية عند الحواف العلوية والسفلية من الفحص: هنا سطح الجذر هو أبعد من أن يكون عمودي على المسافة البادئة. في النسيج الإنشائي، وبالمثل، جدران الخلايا على حواف البراعم الزهرية لم تقاس بشكل صحيح (الشكل 1A). لالانبعاجات ميزو النانوية (الشكل 1C)، ومرة أخرى لوحظ هذا التأثير الطبوغرافية: تقاس حواف الخلايا بشكل غير صحيح بأنها لينة على وجه التحديد حيث منحنى الخلايا بعيدا عن الطائرة من ناتئ. ويمكن لأداة تحليل البيانات التي هي قادرة على تمثل هذه الآثار الطبوغرافية لحل هذه الأداة في المستقبل، ولكن هذه الأداة غير متوفرة حتى الآن.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في النباتات، وتغيير الخواص الميكانيكية تلعب دورا رئيسيا في توجيه النمو والتشكل. حتى الآن لم يكن هناك تقدم كبير في كشف شبكات الوراثية والكيميائية التي تتحكم في نمو النبات، ولكن معرفتنا لكيفية مساهمة هذه الشبكات إلى وتتأثر التغيرات في الخواص الميكانيكية بدائية. يجب أن هذا الأسلوب تمكننا من ملء هذه الفجوة، وهكذا ينبغي أن يكون من مصلحة قوية للعلماء دراسة أي جانب من جوانب نمو النبات أو التشكل. نحن الآن تلخيص التحديات والقيود المفروضة على الأسلوب، والنظرة المستقبلية.
الخطوة الأكثر تحديا في البروتوكول هو إعداد العينات. يجب أن تكون ثابتة العينة بقوة إلى شريحة زجاجية مع الاغاروز ولكن هذا يجب ألا الاغاروز تغطية أي مناطق من العينة التي سيتم قياسها. وعلاوة على ذلك، وإعداد لابد من الانتهاء بسرعة كافية (في غضون دقائق) وذلك لمنع جفاف وبدقة وذلك لمنع تلف الأنسجة: جرحالثانية ومن المتوقع أن يؤدي الجفاف إلى تغيرات لا رجعة فيها في الخواص الميكانيكية للجدار الخلية 18. الخطوة تحديا آخر هو لتحديد إعدادات المسافة البادئة الدقيقة الصحيح فؤاد: اعتمادا على مسألة علمية، والأنسجة الخلوية أو التحت خلوية القرار لا يمكن أن يتحقق مع indenters مختلفة وأعماق المسافة البادئة. لمزيد من المعلومات، راجع 9،10.
طريقة لديها العديد من القيود. الأولى، فإن هذه الطريقة محدودة لقياس الخواص الميكانيكية في أسطح الأجهزة؛ هو محاولة لوضع بروتوكول لقياس المناطق الداخلية من أجهزة مقطوعة الجارية في مختبرنا. الثانية، أنسجة متباينة مع تضاريس شديدة التباين من الصعب جدا قياس؛ على سبيل المثال، التريكوم منع الوصول تلميح فؤاد على البشرة من الأوراق والسيقان، وبالمثل، جذور الشعر منع الوصول تلميح فؤاد على البشرة الجذرية. الثالث، هو أفضل طريقة لتطبيق عينات من طول 100 ميكرون أو لوق ق؛ يمكن استخدامه على عينات أكبر تصل إلى 1 ملم، ولكن هذا يتطلب قياسات الخرائط متتابعة تستغرق وقتا طويلا (كما هو موضح في الشكل 1D و1E). وأخيرا، فإن التدابير فؤاد سوى جزء من التعقيد الميكانيكي للجدار الخلية: أنه يقتصر على التجارب المسافة البادئة الضغط، في حين أن جدران الخلايا هي المواد الهلامية المعقدة التي قد تظهر الخواص الميكانيكية مختلفة اعتمادا على نوع من التشوه (مثل التوتر مقابل ضغط). في البداية، ويبدو أن هذا الأسلوب يقتصر على الضغط إلى أن تكون غير قادرة أو عن بعد للإبلاغ عن النمو، وهو تورم المستمدة جدار الخلية عملية التمدد. حتى الآن لدينا قياس يزيدوا الخاصة على النسيج الإنشائي 9، 19 أو على التحتفلقي (بيانات غير منشورة) يدل على وجود علاقة مذهلة بين مرونة من خلال قياس معامل الشباب واضحة والنمو. نأمل أن يتم في المستقبل، وتطوير هذه التقنية ستساعد فهم هذا اللغز.
الالطريقة المعروضة هنا قياس جوانب معينة فقط من الخواص الميكانيكية المرنة للأنسجة النباتات، كما هو موضح أعلاه. ولكن الأنسجة الحية أيضا تتصرف viscously، ومن المتوقع مجتمعة فيسكو ومرونة السلوك إلى أن تكون مهمة للنمو والتنمية 16،20. غير مذكورة حتى الآن، لاحظنا ردود جدران الخلايا لفؤاد الفجوات الصغيرة التي كانت على مدى عشرات الثواني التي تعتمد على الوقت - وقد تميزت هذه الاستجابة كما اللزجة. في عملنا السابق قدمنا طريقة فؤاد واحد لتقييم هذه الاستجابة اللزجة 9. آخر خاصية التوسط النمو مهم من النسيج هو الضغط تورم المحلية من الخلايا. للقياس الضغط تورم، فإننا نواجه تحديات مماثلة: عدم وجود الاسلوب الذي يقيس بدقة متوسطة المدى عبر الأنسجة حتى الآن. كانت مجهرية الضغط المستخدمة في النباتات، وحتى وقت قريب، تقتصر من قبل دائرة نصف قطرها طرف الزجاج، الذي هو حجم الخلايا الإنشائية (5 ميكرون) 12، 21. آخرسيلة واعدة جدا من البحوث لتطوير هذا الأسلوب فؤاد للاستخدام على الأنسجة غير plasmolyzed؛ نأمل، في هذا السبيل، لتكشف عن العلاقة بين ضغط واحد تورم الخلية ونمو الأنسجة. وسوف تطبق هذه الطريقة في الأساس إلى ضعت بالفعل فؤاد قياس المسافة البادئة باستخدام تورم من خلال الأجهزة الأخرى واستخدامها على الخلايا الفردية 22-24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
نحن نقدم شكر خاص لإيف Couder لكثير من المناقشات المفيدة. نشكر عاطف Asnacios لمعايرة الكابولي والمناقشة. نشكر ليزا ويليس، إليوت Meyerowitz، وأوليفر Hamant لقراءة نقدية. وقد تم تمويل هذا العمل في جزء من منحة RGP0062/2005-C برنامج العلوم الحدودي الإنسان؛ الوكالة الوطنية للبحوث دي لا تتوقع'' Growpec،'''' وMechastem''.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM | JPK | NanoWizard | All the 3-generation are able to do the work with the same preferment. |
| AFM stage | JPK | CellHesion | Required for sample with low topography (less than 11 µm between the lowest and the highest point in the area of force scanning). |
| AFM optics | JPK | Top View Optics | Very important in order to position the sample. Could be replaced by long range binoculars or a microscope. |
| Stereo microscope | Leica | M125 | Any type of stereo microscope could do. |
| 150 nm mounted cantilever | Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland | R150-NCL-10 | To measure only the cell wall at the surface of the epidermis use. |
| 1 µm mounted cantilever | Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland | SD-Sphere-NCH-S-10 | To measure the mechanics of the cell wall orthogonal to the surface of the epidermis. |
| Tipless cantilever | Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland | TL-NCH-20 | To measure the local mechanics of the tissue (2-3 cell wide) use a 5 µm mounted cantilever. We attached a 5 µm borosilicate bead to a tipless cantilever. |
| 5 µm silicon microspheres | Corpuscular | C-SIO-5 | |
| Araldite | Bartik S.A. 77170 Coubet, France | Araldite for fixing the bead to the tipless cantilever. | |
| Low melting agarose | Fisher Scientific Fair Lawn, New Jersey 07410 | BP160-100 | 34-45 °C gelation temperature |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 USA | M4125-500G | |
| 2 Stainless Steel No. 5 Tweezers | Ideal-Tek 6828 Balerna, Switzerland | 951199 |
References
- Cosgrove, D. J. Measuring in vitro extensibility of growing plant cell walls. Methods in molecular biology. 715, 291-303 (2011).
- Durachko, D. M., Cosgrove, D. J. Measuring plant cell wall extension (creep) induced by acidic pH and by alpha-expansin. Journal of visualized experiments : JoVE. , 1263 (2009).
- Durachko, D. anielM., C, D. J. Measuring Plant Cell Wall Extension (Creep) Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin. J. Vis. Exp.. , 25 (2009).
- Suslov, D., Verbelen, J. P., Vissenberg, K. Onion epidermis as a new model to study the control of growth anisotropy in higher plants. Journal of experimental botany. 60, 4175-4187 (2009).
- Parre, E., Geitmann, A. Pectin and the role of the physical properties of the cell wall in pollen tube growth of Solanum chacoense. Planta. 220, 582-592 (2005).
- Zerzour, R., Kroeger, J., Geitmann, A. Polar growth in pollen tubes is associated with spatially confined dynamic changes in cell mechanical properties. Developmental biology. 334, 437-446 (2009).
- Radotic, K., et al. Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth. Biophysical journal. 103, 386-394 (2012).
- Milani, P., et al. In vivo analysis of local wall stiffness at the shoot apical meristem in Arabidopsis using atomic force microscopy. The Plant journal : for cell and molecular biology. 67, 1116-1123 (2011).
- Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current biology : CB. 21, 1720-1726 (2011).
- Braybrook, S. A., Hofte, H., Peaucelle, A. Probing the mechanical contributions of the pectin matrix: Insights for cell growth. Plant signaling & behavior. 7, 1037-1041 (2012).
- Routier-Kierzkowska, A. L., et al. Cellular force microscopy for in vivo measurements of plant tissue mechanics. Plant physiology. 158, 1514-1522 (2012).
- Agudelo, C. G., et al. TipChip: a modular, MEMS-based platform for experimentation and phenotyping of tip-growing cells. The Plant journal : for cell and molecular biology. 73, 1057-1068 (2013).
- Miedes, E., et al. Xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase (XTH) overexpression affects growth and cell wall mechanics in etiolated Arabidopsis hypocotyls. Journal of experimental botany. 64, 2481-2497 (2013).
- Byrne, M. E., et al. Asymmetric leaves1 mediates leaf patterning and stem cell function in Arabidopsis. Nature. 408, 967-971 (2000).
- Cook, S. M., et al. Practical implementation of dynamic methods for measuring atomic force microscope cantilever spring constants. Nanotechnology. 17, 20135-22145 (2006).
- Desprat, N., Richert, A., Simeon, J., Asnacios, A. Creep function of a single living cell. Biophysical journal. 88, 2224-2233 (2005).
- Peaucelle, A., Braybrook, S., Hofte, H. Cell wall mechanics and growth control in plants: the role of pectins revisited. Frontiers in plant science. 3, 121 (2012).
- Mittler, R., et al. ROS signaling: the new wave. Trends in plant science. 16, 300-309 (2011).
- Braybrook, S. A., Peaucelle, A. Mechano-chemical aspects of organ formation in Arabidopsis thaliana: the relationship between auxin and pectin. PLoS. 8, e57813 (2013).
- Asnacios, A., Hamant, O. The mechanics behind cell polarity. Trends in cell biology. 22, 584-591 (2012).
- Meister, A., et al. FluidFM: combining atomic force microscopy and nanofluidics in a universal liquid delivery system for single cell applications and beyond. Nano letters. 9, 2501-2507 (2009).
- Lintilhac, P. M., Wei, C., Tanguay, J. J., Outwater, J. O. Ball tonometry: a rapid, nondestructive method for measuring cell turgor pressure in thin-walled plant cells. Journal of plant growth regulation. 19, 90-97 (2000).
- Kroeger, J. H., Zerzour, R., Geitmann, A. Regulator or driving force? The role of turgor pressure in oscillatory plant cell growth. PloS one. 6, e18549 (2011).
- Forouzesh, E., Goel, A., Mackenzie, S. A., Turner, J. A. In vivo extraction of Arabidopsis cell turgor pressure using nanoindentation in conjunction with finite element modeling. The Plant journal : for cell and molecular biology. 73, 509-520 (2013).
