Abstract
Biz bir JPK AFM için, atomik kuvvet mikroskobu (AFM) mikro / nano-çentikler kullanılarak bitki dokularının yüzeylerinin mekanik özelliklerini ölçmek için yeni geliştirilmiş bir yöntem açıklanmaktadır. Özellikle, bu protokolde, çiçek meristemler, hipokotiller, ve köklerde x 100 um kadar 100 um'lik bölgeler arasında hücre içi çözünürlüklerde hücre duvarlarının belirgin Young modülüne ölçün. Bu numunenin dikkatli hazırlanması, mikro-indenters ve girinti derinliklerinde doğru seçimi gerektirir. Sadece, ölçümler hücreleri plazmolize ve böylece hücre turgor basınç katkı çıkarmak için manitol yüksek ölçüde konsantre çözeltiler içinde gerçekleştirilen hücre duvarı özellikleri hesaba katılması için.
Diğer kaybolmamış tekniklerin aksine, farklı çentikleri ve girinti derinliği kullanılarak, bu yöntem, aynı anda çok ölçekli ölçümleri sağlar: Ancak, bazı sınırlamalar kalır: bu yöntem sadece (100 çapı um civarında) ve bu dış dokularda oldukça küçük numuneler üzerinde kullanılabilir; yöntem, doku topografya duyarlıdır; bu dokusunun karmaşık mekanik özelliklerinin sadece bazı yönlerini ölçer. Teknik hızla geliştirilmektedir ve bu sınırlamalar çoğu yakın gelecekte çözüleceğini olasıdır.
Introduction
Bitkilerde büyüme organizmanın her hücre çevreleyen sert hücre duvarlarının koordineli genişlemesi ile elde edilir. Giderek artan kanıtlar bu bitkiler, yerel olarak, bu genişleme kontrol eden hücre duvarı kimyanın tadilatı yoluyla olduğunu gösterir. Genişleme hücrenin yüksek turgor basıncının neden olduğu hücre duvarları, üzerinde yük öncelikle tahrik olması düşünülmektedir; turgor basıncına bu gerginlik tepkisi hücre duvarlarının 1'in mekanik özellikleri tarafından yönetilir. Küçük bu mekanik özellikleri bilinen ve geliştirme sırasında nasıl değiştiğini. Ayrıca biraz bu mekanik özellikleri geribildirimler görünüşte bir doku boyunca koordineli bir şekilde hücre duvarı kimyasını değiştirmeye katkısı olup olmadığını kontrol edilir ve nasıl bilinir. Biz kimyasal ve mekanik gelişimi sırasında bitki hücre duvarlarında değişiklikler ve sonuçta nasıl bu mikroskobik etkileşimlerin bir bitkiyi yöneten arasındaki bağlantıyı anlamak için ise'In makroskopik büyümesi, hücre ya da doku ölçeğinde organları geliştirilmesinde hücre çeperlerinin mekanik özelliklerini izlemek için bir yöntem gereklidir.
Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) yöntemi mikrometre veya nanometre doku sıkıştırmasından ya da çentikler dayandığı, burada anlatılan, subselüler çözünürlüklerde aynı anda organları gelişmekte ve doku tüm bölgeler arasında hücre duvarlarının mekanik özelliklerini ölçmek için tam geliştirilmiştir. Diğer yöntemler var ya çok düşük ya da çok yüksek bir çözünürlük: Ekstansometrelerin milimetre ölçeğinde 2-4, erken olayları ölçmek için çok büyük örneğin bir ölçekte tüm doku ortalama mekanik özelliklerini ölçmek için sadece yapabiliyor Organogenezis; microindenter nanometre ölçeğinde hücre içi çözünürlükte ölçümlerini, ancak izole edilmiş hücreler olup hücre ya da organların 5-7 gruplarının ölçümü ile sınırlandırılmıştır. AFM ile, ihtiyaçd doku, hücre ve hücre içi çözünürlükleri 8-10 elde edilebilir. Son zamanlarda çok sayıda protokolleri de 11, 12, kullanılabilecek bitki doku mekanik ölçmek için özel olarak geliştirilmiştir.
Biz, belirgin Young modülü 13 ölçü dokuya elastikiyetini değerlendirmek nasıl burada sunacaktır.
Young modülü, genellikle bir malzemenin sertliğini tarif etmek için kullanılır. Küçük deformasyon esnasında bir malzemenin deforme edilmesi için gerekli kuvvet girinti alanı ile orantılıdır. Young modülü, bu katsayısıdır. Sürekli bir homojen madde durumunda, aynı katsayısı ne olursa olsun girinti tipi (boyut ve şekil) içinde ölçülür, ancak ölçüm hızı ile değişecektir. Bitki dokusunun bir kompleks yapının durumunda, şimdiye kadar kuvvet belirlenmesini sağlayan bir deformasyon orantılı olduğunu gözlemledikbiz "belirgin genç modülü" adını bir orantılılık katsayısı. Bitkilerde sürekli akışkanda ikinci Bunun aksine, bu bariz genç modülü girinti boyutuna duyarlıdır. Bu saf hücre duvarının genç modülünün karşılık gelmez. Bu, en iyi doku hücre duvarının iskele elastikiyetini açıklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Örnek Montaj için cam slaytlar hazırlayın
- Agaroz ortam gömülmesinin hazırlanması:% 10 manitol (su içinde) içinde% 0.7 düşük erime noktalı agaroz.
- Güçlü bir metal alet (örneğin matkap ucu, kireç) kullanılarak, bir mikroskop cam slayt merkezinde 0.5 x 0.5 cm bölgeyi etch. Veya bunun yerine, Araldite yapıştırıcı kullanarak cam slayt cam yapraklardan (yaklaşık 20 x 200 mm) küçük bir parça tutkal. Not: Bu sağlamak için agaroz yapışmasını kolaylaştırmak amacıyla yüzeyi pürüzlü olduğu slayt agaroz ortam çubukları ya da giderir. Bu slayt yeniden kullanılabilir.
- Cam slayt kazınmış bölge üzerine agaroz ortam gömülmesinin yaklaşık 20 | il bir damlacık yerleştirin. Bu agaroz ince bir film oluşturur.
- Nemli bir kutu içinde cam slayt saklayın ve agaroz medya katılaşması için bekleyin.
2.. Meristem Örnekleri Diseksiyon ve Montaj
- Konfokal IMAGI için Microdissect meristemlering: ultra ince cımbız ile onları aşağı çekerek sapından çiçek tomurcukları tek tek kaldırın. Bu (P1 primordia 14 yani) sepals ememeyen tomurcukları tüm çiçek tomurcukları kadar kaldırmak için önemlidir.
- Bir jilet veya cımbız ucu kullanarak, uzak sapından meristemi kesti. Kesilen AFM ile ölçülecek olan meristem yüzeyinin bölgesine paralel olmalıdır. Elde edilen apeks 300 um ve AFM ucu altında uygun yüksek 600 mm arasında olmalıdır.
- Aşama 1.1.4 hazırlanan agaroz ortam filmin içine tepe itin. Cam slayt / agaroz bir pozisyon seçin ve meristem cam slayt ile temas hem de doğrudan ve agarozdan dışarı çıkıntı nazikçe böyle itin. Bu kök onun kesim takip birkaç saniye içinde agaroz meristemi konumlandırmak için çok önemlidir. Not: Bu kurutma gelen meristemi önlemek için olan. Bu aşamada, bir meristem CRAC ayakta edilecektirAgaroz basınç uygulanması üzerine kırık nedeniyle k.
- Onlar aynı yükseklikte ve tek slaytta diğerinden az 500 mikron konumlandırılmış şartıyla, birkaç meristemleri toplu görüntüleme için bu şekilde hazırlayın. Bundan başka örnekleri kesme sırasında nemli kutu içinde hazırlanan meristemleri tutun.
NOT: Bu kalibrasyon gelen değişimi sınırlayan. Her durumda, ideal olarak 2 örnekler hazırlanmış ve rasgele ölçülebilir. Şimdiye kadar ölçüm (stres kaynaklı cevap) toplu görüntüleme gözlenen herhangi bir etkisi yoktur. Bu agar ve / veya montaj çözelti içinde stres sinyal molekülleri seyreltme sayesinde olabilir. Alternatif olarak, stres tepkisi ne olursa olsun, hazırlanmış bir numune miktarı aynıdır. - Bir sonraki adıma geçmeden önce, meristem ve çiçek tomurcukları arasındaki sınır kuru olduğundan emin olun. Değilse, hafifçe filtre kağıdı kullanılarak fazla su çıkarmak. Bu erimiş bir sonraki aşamada engellemelidiragaroz nedeniyle kapillarite kuvvetlere örnek sel.
- 20 ul pipet ile, eklemek yeterli adım 1.2.3 oluşturulan çatlak doldurmak için agaroz montaj eridi. ve her bir meristemi çevreleyen. Agaroz kaldırılan çiçek tomurcuğu (primordium) ve skar seviyesine ulaşmak gerekir. Bu amaca ulaşmak için, bu çatlak her iki ucunda da agaroz eklemek için gerekli olabilir.
- Agaroz ilave edildiğinde, hızla çatlak içine sel olacak; pipet kullanarak, meristem slaytta en yüksek noktası olmasını sağlamak için agaroz montaj erimiş kısmını emmek. Bu görüntüleme sırasında hareket edemez, böylece bu meristemi giderir.
3.. Montaj Kök veya Hipokotil Örnekleri
- Kökler ve hipokotiller, hiç diseksiyon gereklidir. Hazırlanan cam slayt üzerinde agaroz ince bir film olarak, doğrudan cam üzerinde olan asit ya da bir cam lamel üzerinde ya da bir oluk yapmak. Bu temas halinde olduğu bu sağlanan bir oluk içinde kök veya hipokotil yerleştirinonun bütün uzunluğu boyunca cam.
- Bir sonraki adıma geçmeden önce, numune yüzeyinde kuru olduğundan emin olun. Eğer değilse, hafifçe filtre kağıdı kullanılarak suyun fazlası uzaklaştırıldı.
- 1.2.6 ekleme aşamasında olduğu gibi, numune etrafında monte agaroz eritilir.
4. AFM Hazırlama ve Hassasiyet Kalibrasyon (bir JPK Nanowizard AFM için)
- AFM üzerinde bir dirsek monte edin. Konsol yuvarlak indenter ile monte edilmelidir. Yarıçapı x, y, z çözünürlük ve hassas ölçüm arşivlenmiş olabilir hangi girinti derinliği belirleyecek.
- Epidermisteki yüzeyindeki mezo-nano ölçümler almak için, bir 50 nm yarıçaplı yuvarlak dişinin kullanın; , orta ölçek ölçümleri almak 0.5 mikron yarıçaplı yuvarlak dişinin kullanmak için; (2-3 hücreleri arasında) mikro ölçümler almak için, 2.5 mikron yarıçaplı yuvarlak dişinin kullanın.
- Konsol ucundaki lazer yerleştirin. Orta lazer hizalamaayna kullanarak captor.
- AFM altında temiz bir bardak yerleştirin.
NOT: Aşağıdaki konsol bir deformasyon içine AFM reseptörü üzerindeki lazer pozisyonun sinyalini dönüştürmek için ayarlanır ve bir güç haline çevirmek için, konsolun yay sabiti değerlendirerek edilir. - 1 V. hedef kuvvet "set point" ile yaklaşım
- "Force spektroskopi" seçeneğini seçin. 2 V maksimal "göreli noktası" ayarlayarak bir girinti yapmak, 40 mikron / sn "hız genişletmek", ve 5 um için "z uzunluk".
- "Kalibrasyon Yöneticisi" menüsünden "fit aralığını seçin" düğmesini kullanarak hassasiyeti sığdırmak için öne eğrisinin doğrusal bölümünü seçin. "Göreli set point" "metre" ile "volt" dönüştürülmüş olmalıdır.
- "Kalibrasyon Yöneticisi" menüsünden EL değerlendirmek için "yay sabiti" seçiniztermal dalgalanmalar kullanarak Konsolun asticity. Konsolun spektral yoğunluk arsa almak için Basın "run". Düşük frekans ile rezonans pik bulun. "Fit aralığını seçin" düğmesini kullanarak takınız.
NOT 1:. Termal dalgalanmalar ayarlama hakkında daha fazla bilgi için, Cook ve ark 15 okundu
Not 2: (bilinen sertlik ya da malzeme), bir referans konsol ile konsol elastikiyetini değerlendirmek için doğrudan bir yöntemi kullanmak için tercih edilir. Burada kullanılan nazik birini Atef Asnacios 16 tarafından bağışlanmıştır. - Konsol ucu altında% 10 mannitol çözeltisi 200 ul ekleyin. Ayna kullanarak captor ortasına lazer hizalayın.
- Hassasiyetini yeniden kalibre: "kalibrasyon Yöneticisi" menüsünden, "bilinmeyen" butonuna tıklayın; tekrar 2.5 ile 2.3 adım.
. 5 Veri Toplama: Görünen Young Modülü Haritacılık
. 6. Veri Analizi: Görünen Young Modülü Hesaplamalar
- Veri analiz yazılımı veri dosyasını açın.
- Tek bir harita tüm eğrileri aynı analizi uygulamak için "toplu işlem" seçeneğini seçin.
- Böylece girinti derinliği ayıklamak için "konsolun bükme için yüksekliği düzeltmek" seçeneğini seçin.
- Kuvvet girinti alanı ile orantılıdır üstlenecek "Young modülü uyum fonksiyonunu" seçeneğini seçin. Girinti şekli parabolik olduğunu varsaymak için parabolik "ucu şekli" olarak ayarlayın.
- Uç yarıçapını gösterir.
- O "genişletmek" eğri daha topografya daha az duyarlı olduğu için tercihen analizi için "geri çekme" eğrisi seçin. Prob önemli yapışma sırasında Ancak, eğer "geri çekme," yapıştırma duyarsız "genişletmek" eğrisi, kullanın.
- Set0,5 Poisson oranıdır. Basın üzerinde analiz ve çıkış kaydedin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1 de çiçek Meristemlere tipik Genç modülleri haritalar (Şekil 1A ve 1B), genç ve yaşlı hipokotilleri (Şekil 1C-F) ve kök meristem (Şekil 1G ve 1H) sunuyoruz. Tüm deneylerde delici yarı-küresel, ancak farklı uzamsal çözünürlük elde edilebilir, böylece bunun radius farklıdır 1C ve 1D meso-nano girinti (50 nm derinlik) meso-nano indenters (50 nm çapında) için tipik sonuçlar göstermektedir.; . cartographs hipokotil epidermal hücrelerin yüzey hücre duvarlarında microscale heterojenliklerin ortaya 1A, 1E ve 1G Rakamlar çiçek meristem, hipokotil ve kök için orta ölçek girintilerinden (500 nm derinlik) ile orta ölçek indenters (500 nm yarıçap) için tipik sonuçlar göstermektedir; indenter yarıçapı bu mezo-girinti değerlendirir hücre duvarının çapını aştığından unutmayınAnticlinal hücre duvarlarının 'açık' Young modülleri (Peaucelle et al. 9,17 ve detaylar için Braybrook et al. 10). Son olarak, Şekil 1B orta ölçek girintilerinden (500 nm derinlik) ile mikro indenters (2.5 mikron yarıçap) için bir haritacılık göstermektedir; İlginçtir, bu çözünürlükte görüntüleme 9 herhangi bir görünür büyüme öncesinde organ gelişimi sırasında doku yumuşama gösterdi.
Biz şimdi vurgulamak ve bitki organları gelişmekte özelliklerini ölçmek için AFM kullanırken sık ortaya dört teknik zorluklar kısmi çözümler önermek. İlk olarak, Örnekler yanlış agaroz ankastre edilebilir: agaroz ile kaplanmıştır bölgeleri doğru (Şekil 1E ok kenarları bakınız) ölçülemez. Bu sorunu çözmek için, adım 1.2.6 tekrarlayarak deneyin. İkincisi, yanlış cam slayt sabitlenir numuneler deney sırasında hareket edebilir; sonra anormal çizgili görüntülerde borçlusol ve sağ ilerleyen taramaları (Şekil 1F) arasında Decorrelation için. Bu sorunu çözmek için, Numune Hazırlama tekrarlayarak dikkatlice deneyin. Üçüncü olarak, numune yüksekliği z aralığı, belirli bir eşiğin altında olmalıdır. Orada dikey z-yönünde, örneğin ortalama yüksekliği üzerinde bir sınırlama yoktur, fakat z-yönünde (en yüksek ve en düşük noktası arasındaki uzaklık) yüksekliğinde aralık en az 15 um olması gerekir, aksi halde tarama iptal edilecektir (bakınız Şekil 1B, ayarları) AFM nanowizard vardır. Tarama sırasında, AFM otomatik numune yüksekliğini maç için konsol yüksekliğini ayarlar, ancak tek bir tarama konsol yüksekliği sadece 15 mikron göre değişebilir, çünkü bu. Bu sorunu çözmek için, Şekil 1E-G'de gösterildiği gibi, 100 um z-aralığı artırır JPK cellHesion modülünü kullanmaktadır. Dördüncü olarak, yöntem, yüzey topografyasının duyarlıdır: Numune yüzeyi, daha oriente olduğugirinti yönüne paralel d, ölçümler daha az güvenilirdir. Şekil 1G-H sunulan kök örnek olarak, hücre duvarları kök uzun eksenine paralel tarama üst ve alt kenarlarında görünür değildir: burada kök yüzeyi çok girinti dik olmaktan uzaktır. Meristem de, benzer şekilde, çiçek tomurcukları kenarlarında hücre duvarları doğru (Şekil 1A) ölçülmemiştir. Mezo-nano ölçekli girinti çıkıntılar (Şekil 1C) için, yine bu topografik etki görülmektedir: hücrelerin kenarları yanlış yumuşak tam olarak ölçülür nerede uzak konsolun düzleminden hücreler eğri. Bu topoğrafik etkilerin hesaba mümkün olan bir veri analizi aracı ileride Bu yapıyı çözmek olabilir, ancak böyle bir araç henüz mevcut değildir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bitkilerde, değişen mekanik özellikler büyüme ve morfolojilerinden yönlendirilmesinde önemli bir rol oynamaktadır. Bugüne kadar orada bitki gelişimini kontrol genetik ve kimyasal ağları çözülüyor büyük ilerlemeler kaydedilmiş, ancak bu ağlar katkı ve mekanik özelliklerindeki değişikliklerden nasıl etkilendiğini bilgimiz ilkel gelmiştir. Bu yöntem, bu boşluğu doldurmak için bize imkan vermelidir, ve bu yüzden bitki büyümesi veya morfojenesis'in herhangi bir yönünü inceleyen bilimciler için güçlü bir ilgi olmalıdır. Biz şimdi zorlukları ve sınırlamaları yöntemi ve gelecekteki görünüm özetler.
Protokolünde en zorlu adım örnek bir hazırlıktır. Numune sıkıca agaroz ile cam slayt sabit olmalı, ancak agaroz ölçülecek olan örnek bir alanda kapak olmamalıdır. Ince kurumasını önlemek ve böylece doku hasarını önlemek için ayrıca, preparat (birkaç dakika içinde) yeterince hızlı bir şekilde tamamlanması için var yaralama and kuraklık hücre duvarının 18 mekanik özelliklerinde geri dönüşü olmayan değişimlere yol açtığı tahmin edilmektedir. Bir başka zorlu adım doğru AFM mikro girinti ayarları seçmek için: bilimsel soruya bağlı olarak, doku, hücre ya da hücre altı çözünürlüğü farklı indenters ve girinti derinlikleri ile elde edilebilir. Daha fazla bilgi için, bkz: 9,10.
Yöntem, çeşitli sınırlamalar vardır. İlk olarak, yöntem organların yüzeylerinde mekanik özelliklerinin ölçümü ile sınırlıdır; rezeke organların iç bölgelerini ölçmek için bir protokol geliştirme çabası bizim laboratuvarda devam etmektedir. İkincisi, son derece değişken bir topografya ile farklılaşmış dokuların ölçmek çok zordur; Örneğin, trikomlar yaprakların epidermis AFM ucun erişimi engellemek ve sapları, ve benzer, kök tüyleri kök epidermis AFM ucun erişimini engellemek. Üçüncü olarak, bu yöntem en iyi uzunluğu 100 um veya le örnekleri uygulanırss; o kadar 1 mm daha geniş örneklem üzerinde kullanılabilir, ancak (Şekil 1D ve 1E'de gösterildiği gibi), bu zaman alıcı sıralı kartografik ölçümler gerektirir. Son olarak, AFM önlemler hücre duvarının mekanik karmaşıklığı sadece bir bölümü: hücre duvarları deformasyon türüne göre (örn. gerilim sıkıştırma vs) bağlı olarak, farklı mekanik özelliklere gösterebilir kompleks jeller ise bu basınç girinti deneyler ile sınırlıdır. İlk olarak, sıkıştırma sınırlayıcı bu yöntem, işlem uzanan bir turgor kaynaklı hücre duvarı olan, büyüme üzerindeki bilgi olmayan ya da uzaktan sahip olduğu görülmektedir. Oysa meristemden 9, 19 veya hipokotil (yayınlanmamış veri) bizim kendi supersize ölçüm belirgin genç modüllü ve büyüme ile ölçülen esneklik arasında inanılmaz bir korelasyon gösterir. Biz gelecekte, bu tekniğin gelişimi bu bilmece anlamada yardımcı olacağını umuyoruz.
yöntem, yukarıda açıklandığı gibi, sadece, bitki dokularının mekanik elastik özelliklerin bazı yönlerini ölçüldü burada açıklanmıştır. Ancak, canlı dokular viscously davranır ve birleştirilen visko-elastik davranış ve büyüme ve gelişme 16,20 için önemli olduğu tahmin edilmektedir. Şimdiye kadar bahsedilmemiş, biz zamana bağımlı saniye onlarca üzerinde olduğunu mikro çentikler AFM hücre duvarlarının yanıtları gözlenen - Bu tepki viskoelastik olarak karakterize edildi. Daha önceki çalışmada bu viskoelastik yanıtı 9 değerlendirmek için bir AFM yöntem sundu. Bir doku bir diğer önemli büyüme aracılık özelliği hücrelerin lokal turgor basınçtır. Turgor basıncını ölçmek için, biz de benzer sorunlarla karşı karşıya: dokular arasında orta ölçek çözünürlüğünde ölçen bir teknik henüz yok. Bitkilerde kullanılan basınç mikropiliye merizmatik hücrelerin boyutu (5 mikron) 12, 21 olan cam ucu yarıçapı, sınırlı, yakın zamana kadar vardı. BaşkaAraştırmanın çok umut verici avenue olmayan plasmolyzed doku kullanım için bu AFM yöntemi geliştirmektir; Biz, tek bir hücre turgor basınç ve doku büyümesi arasındaki ilişkiyi ortaya çıkarmak için, bu şekilde olur. 24 - Bu yöntem temelde diğer cihazlar kullanılarak ve bireysel hücrelerin 22 kullanılan girinti ile zaten gelişmiş AFM turgor ölçümü için geçerli olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz birçok yararlı tartışmalar için Yves Couder özel şükrediyoruz. Biz dirseklerin ve tartışma kalibrasyonu için Aymen Asnacios teşekkür ederim. Biz eleştirel okuma Lisa Willis, Elliot Meyerowitz ve Oliver Hamant teşekkür ederim. Bu çalışma İnsan Frontier Bilim Programı hibe RGP0062/2005-C tarafından kısmen finanse edildi; Agence Nationale de la Recherche'''' Growpec'' ve'' Mechastem projeler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM | JPK | NanoWizard | All the 3-generation are able to do the work with the same preferment. |
| AFM stage | JPK | CellHesion | Required for sample with low topography (less than 11 µm between the lowest and the highest point in the area of force scanning). |
| AFM optics | JPK | Top View Optics | Very important in order to position the sample. Could be replaced by long range binoculars or a microscope. |
| Stereo microscope | Leica | M125 | Any type of stereo microscope could do. |
| 150 nm mounted cantilever | Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland | R150-NCL-10 | To measure only the cell wall at the surface of the epidermis use. |
| 1 µm mounted cantilever | Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland | SD-Sphere-NCH-S-10 | To measure the mechanics of the cell wall orthogonal to the surface of the epidermis. |
| Tipless cantilever | Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland | TL-NCH-20 | To measure the local mechanics of the tissue (2-3 cell wide) use a 5 µm mounted cantilever. We attached a 5 µm borosilicate bead to a tipless cantilever. |
| 5 µm silicon microspheres | Corpuscular | C-SIO-5 | |
| Araldite | Bartik S.A. 77170 Coubet, France | Araldite for fixing the bead to the tipless cantilever. | |
| Low melting agarose | Fisher Scientific Fair Lawn, New Jersey 07410 | BP160-100 | 34-45 °C gelation temperature |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 USA | M4125-500G | |
| 2 Stainless Steel No. 5 Tweezers | Ideal-Tek 6828 Balerna, Switzerland | 951199 |
References
- Cosgrove, D. J. Measuring in vitro extensibility of growing plant cell walls. Methods in molecular biology. 715, 291-303 (2011).
- Durachko, D. M., Cosgrove, D. J. Measuring plant cell wall extension (creep) induced by acidic pH and by alpha-expansin. Journal of visualized experiments : JoVE. , 1263 (2009).
- Durachko, D. anielM., C, D. J. Measuring Plant Cell Wall Extension (Creep) Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin. J. Vis. Exp.. , 25 (2009).
- Suslov, D., Verbelen, J. P., Vissenberg, K. Onion epidermis as a new model to study the control of growth anisotropy in higher plants. Journal of experimental botany. 60, 4175-4187 (2009).
- Parre, E., Geitmann, A. Pectin and the role of the physical properties of the cell wall in pollen tube growth of Solanum chacoense. Planta. 220, 582-592 (2005).
- Zerzour, R., Kroeger, J., Geitmann, A. Polar growth in pollen tubes is associated with spatially confined dynamic changes in cell mechanical properties. Developmental biology. 334, 437-446 (2009).
- Radotic, K., et al. Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth. Biophysical journal. 103, 386-394 (2012).
- Milani, P., et al. In vivo analysis of local wall stiffness at the shoot apical meristem in Arabidopsis using atomic force microscopy. The Plant journal : for cell and molecular biology. 67, 1116-1123 (2011).
- Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current biology : CB. 21, 1720-1726 (2011).
- Braybrook, S. A., Hofte, H., Peaucelle, A. Probing the mechanical contributions of the pectin matrix: Insights for cell growth. Plant signaling & behavior. 7, 1037-1041 (2012).
- Routier-Kierzkowska, A. L., et al. Cellular force microscopy for in vivo measurements of plant tissue mechanics. Plant physiology. 158, 1514-1522 (2012).
- Agudelo, C. G., et al. TipChip: a modular, MEMS-based platform for experimentation and phenotyping of tip-growing cells. The Plant journal : for cell and molecular biology. 73, 1057-1068 (2013).
- Miedes, E., et al. Xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase (XTH) overexpression affects growth and cell wall mechanics in etiolated Arabidopsis hypocotyls. Journal of experimental botany. 64, 2481-2497 (2013).
- Byrne, M. E., et al. Asymmetric leaves1 mediates leaf patterning and stem cell function in Arabidopsis. Nature. 408, 967-971 (2000).
- Cook, S. M., et al. Practical implementation of dynamic methods for measuring atomic force microscope cantilever spring constants. Nanotechnology. 17, 20135-22145 (2006).
- Desprat, N., Richert, A., Simeon, J., Asnacios, A. Creep function of a single living cell. Biophysical journal. 88, 2224-2233 (2005).
- Peaucelle, A., Braybrook, S., Hofte, H. Cell wall mechanics and growth control in plants: the role of pectins revisited. Frontiers in plant science. 3, 121 (2012).
- Mittler, R., et al. ROS signaling: the new wave. Trends in plant science. 16, 300-309 (2011).
- Braybrook, S. A., Peaucelle, A. Mechano-chemical aspects of organ formation in Arabidopsis thaliana: the relationship between auxin and pectin. PLoS. 8, e57813 (2013).
- Asnacios, A., Hamant, O. The mechanics behind cell polarity. Trends in cell biology. 22, 584-591 (2012).
- Meister, A., et al. FluidFM: combining atomic force microscopy and nanofluidics in a universal liquid delivery system for single cell applications and beyond. Nano letters. 9, 2501-2507 (2009).
- Lintilhac, P. M., Wei, C., Tanguay, J. J., Outwater, J. O. Ball tonometry: a rapid, nondestructive method for measuring cell turgor pressure in thin-walled plant cells. Journal of plant growth regulation. 19, 90-97 (2000).
- Kroeger, J. H., Zerzour, R., Geitmann, A. Regulator or driving force? The role of turgor pressure in oscillatory plant cell growth. PloS one. 6, e18549 (2011).
- Forouzesh, E., Goel, A., Mackenzie, S. A., Turner, J. A. In vivo extraction of Arabidopsis cell turgor pressure using nanoindentation in conjunction with finite element modeling. The Plant journal : for cell and molecular biology. 73, 509-520 (2013).
