Abstract
我们描述了一种最近开发的方法来测量植物组织的表面的机械特性使用原子力显微镜（AFM）的微/纳米压痕，要JPK原子力显微镜。具体来说，在这个协议中，我们测量视杨氏模量的细胞壁在跨区域的亚细胞分辨率可达100 微米 ×100微米花分生组织，下胚轴和根。这需要精心准备的样品，正确选用微压头和压痕深度。只占，测量在甘露醇的高度浓缩的溶液以质壁分离的细胞中，从而除去细胞膨压的贡献进行细胞壁的属性。
相对于其他现存的技术，通过使用不同的压头和压痕深度，该方法允许同时多尺度测量 然而，一些局限性依然存在：该方法只能用于在相当小的样品（大约100μm直径），并且只在外部组织;该方法是将组织形貌敏感;它测量的组织复杂的机械特性只有某些方面。该技术正在迅速发展，很可能大多数的这些限制将在不久的将来得到解决。
Introduction
在植物生长受周围的生物体的每一个细胞的刚性细胞壁的协调扩张来实现。越来越多的证据表明它是通过细胞壁化学修饰的植物局部控制这种膨胀。膨胀被认为是主要受应变的细胞壁，引起细胞的高膨压上;此应变响应膨压是由细胞壁1的机械性能约束。鲜为人知的是，这些机械性能和他们在开发过程中如何变化。而且很少有人知道如何将这些机械性能的控制和反馈是否有助于改变细胞壁化学在显然是跨组织协调的方式。如果我们要了解发育过程中植物细胞壁的化学和机械变化，最终如何将这些微观相互作用支配植物之间的连接的宏观增长，一个是可以监控的细胞壁中，在细胞或组织规模发展器官的机械性能的方法是必需的。
这里的原子力显微镜（AFM）所描述的方法，它是基于微米或纳米级组织的压缩或压痕，开发了精确测量的细胞壁中的亚细胞分辨率同时显影机构和跨组织的整个区域的机械性能。其他的方法有两种，分辨率太低或太高：引伸计仅能够在毫米尺度2-4，其规模是例如过大而无法 测量中的早期事件，以测量整个组织的平均机械性能器官;该microindenter可以进行测量以在纳米尺度的亚细胞的分辨率，但它被限制在测定分离的细胞，而不是细胞或器官5-7的基团。用原子力显微镜的要求三维组织，细胞，亚细胞分辨率可达到8-10。最近几个协议已被开发专门用于测量植物组织中，可能也可用于11，12的结构。
我们将在这里介绍了如何通过表观杨氏模13的测量评估组织的弹性。
杨氏模量通常是用来描述材料的刚度。在小变形而变形的材料所需要的力是正比于压痕的面积。杨氏模量是该系数。在一个连续的均匀的材料的情况下相同的系数将被考虑的缩进类型（大小和形状）的测定，但将与所述测量的速度发生变化。在植物组织中的复杂结构的情况下，我们观察到，到目前为止，该力正比于该变形容许的确定比例系数，我们命名为“表观杨氏模量”。在从连续媒体中的植物相比，这明显的杨氏模量是压痕的大小敏感。它不对应于一个纯细胞壁的年轻模量。它最能说明细胞壁组织的脚手架的弹性。
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Protocol
1，准备玻璃幻灯片的安装示例
- 准备嵌入琼脂糖介质：10％甘露糖醇（在水中）0.7％低熔点琼脂糖。
- 使用强金属工具（ 如钻头尖，酸橙），蚀刻出一0.5×0.5厘米面积在显微镜载玻片上的中心位置。或者相反，粘上一小块玻璃薄片（约20×200微米），以使用爱牢达胶水的载玻片上。注：此变粗糙的表面，以便于琼脂糖的附着力，以确保琼脂糖介质棒或修复的幻灯片。该滑动可重复使用。
- 放置约20微升嵌入琼脂糖介质到玻璃载片的蚀刻区域的液滴。这使琼脂糖的薄膜。
- 储存在潮湿箱中的载玻片，并等待琼脂糖介质固化。
2，解剖和安装分生组织样品
- Microdissect分生组织的共聚焦想象力吴：从干拉下来了超精细镊子取出花芽一个接一个。重要的是要消除所有的花蕾最多时不显示（ 即 P1原基14）萼片的味蕾是很重要的。
- 用刀片或镊子的尖端，切分生组织离干。切口应平行于分生组织表面的将要被使用的原子力显微镜测得的区域。得到的顶点应该是300微米，600微米高，以适应针尖下的。
- 推顶到在步骤1.1.4制备琼脂糖介质的膜。选择在载玻片/琼脂糖的位置并轻推，这样的分生组织，既是直接与载玻片接触，并从琼脂糖伸出。关键是要遵循从它的茎切了几秒钟之内定位在琼脂糖的分生组织。注意：这是为了防止从分生组织的干燥。在这个阶段，分生组织将站在一个CRACķ因为琼脂糖时施加压力破碎。
- 准备几个分生组织这种方式为批处理成像，只要它们都具有相同的高度并彼此上滑动定位小于500微米。保持分生组织准备在潮湿的盒子，同时进一步解剖标本。
注意：它限制了变化，从校准到来。理想的情况是2个样本的每个条件的可能做好准备，并随机测量。到目前为止，有一批成像对测量（应力诱导反应）没有观察到的效果。这可能是由于应激信号传导分子中的琼脂和/或所述安装的溶液稀释。备选的应激反应是一样的，不管对样品的制备量。 - 之前移动到下一个步骤，确保分生组织和花芽之间的边界是干的。如果没有，用滤纸轻轻去除多余水分。这应防止在接下来的阶段，该熔融琼脂糖洪水样品由于毛细作用的力量。
- 用20微升移液器，补充足够的安装融化琼脂糖填写步骤1.2.3创建裂纹。和以包围各分生组织。琼脂糖应达到除去花芽（原基）的伤痕的程度。为了实现这一目标，它可能有必要在裂纹的每一端加琼脂糖。
- 当琼脂糖被添加，它会迅速涌入裂缝;使用吸管，吸脱熔安装琼脂糖，以确保分生组织是幻灯片上的最高点的一部分。这解决了分生组织，使其不能成像过程中移动。
3，安装根或胚轴样品
- 对于根和下胚轴，没有剥离是必要的。在琼脂糖上制备的玻璃载片的薄膜，使一个槽是直接在上面的玻璃蚀刻或沿着一个玻璃薄片。放置在该槽中根或胚轴确保它是与接触玻璃沿其整个长度。
- 之前移动到下一个步骤，确保样品是干在其表面。如果没有，用滤纸轻轻去除多余的水。
- 加入融化的样品周围琼脂糖作为安装步骤1.2.6。
4，原子力显微镜制备及灵敏度校准（一JPK Nanowizard AFM）
- 安装在原子力显微镜的悬臂。悬臂的安装应与圆形压头。半径将决定在x，y和z的分辨率和压痕深度在哪个精确的测量可被存档。
- 采取细观纳米级测量在表皮表面，使用50纳米半径圆压头;采取尺度测量，使用一个0.5微米的半径圆压头;采取微尺度测量（横跨2-3个细胞），使用2.5微米半径的圆压头。
- 定位激光在悬臂的尖端。激光对准中间使用镜像的俘虏的。
- 放置干净的玻璃的原子力显微镜下。
注意：以下设置变换的原子力显微镜受体的激光位置的信号转换成悬臂的变形，并通过评估悬臂的弹簧常数，把它翻译成一种力量。 - 与1 V的目标部队“设定点”的方法
- 选择“力谱”。由最大的“相对集中点”设置为2 V做一个压痕，在“扩展速度”到40微米/秒，而“Z长”到5微米。
- 从“校准管理”菜单中，选择适合使用“选择合适的范围”按钮灵敏度的远期曲线的线性部分。 “相对集中点”应该从“伏”转化为“米”。
- 从“校准管理”菜单，选择“弹性系数”来评价的ELasticity利用热波动的悬臂。按“运行”，以获得悬臂的频谱密度图。找到具有最低频率的共振峰。使用“选择合适的范围”按钮适应它。
注1：关于热波动调整的更多细节，请阅读库克等人15。
注2：这是优选使用的直接方法使用参考悬臂（或材料与已知的刚度），以评估在悬臂的弹性。这里使用一个是好心阿提夫Asnacios 16捐赠。 - 加入200μl的悬臂尖端下10％甘露醇溶液。重新对准激光来使用镜子的捕捉体的中间。
- 重新校准灵敏度：从“校准管理”菜单中，单击“未知”按钮;重复步骤2.3至2.5。
5，数据采集：表观杨氏模量制图
6，数据分析：表观杨氏模量的计算
- 在数据分析软件打开数据文件。
- 选择“批量处理”，以同样的分析适用于单个地图中的所有曲线。
- 选择“正确的高度为悬臂的弯曲”，所以提取压痕深度。
- 选择“杨氏模量的拟合函数”，将假定该力正比于压痕的面积。将“笔尖形状”，以抛物线假设压痕形状是抛物线。
- 表明尖的半径。
- 优先选择的“回退”曲线的分析，因为它是地形较不敏感比“扩展”曲线。然而，如果有探针的显著粘固在“回退”，用“扩展”曲线，这是不敏感的粘附。
- 集泊松比为0.5。按分析和保存输出。
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Representative Results
在图1中，我们提出花分生组织（ 图1A和1B），年轻人和老年人的下胚轴（ 图1C-F）和根分生组织（ 图1G和1H）典型的年轻模量地图。在所有实验中压头是半球形的，但它的半径不同，使不同空间分辨率可以达到图1C和1D显示了中观纳米压头（50纳米半径）与介观纳米压痕（50 nm的深度）的典型结果。所cartographs揭示胚轴表皮细胞的表面细胞壁微观非均质性图1A，1E，和1G显示了中尺度压头（500 nm的半径）与中尺度压痕（500纳米的深度）为花分生组织，下胚轴和根的典型结果;注意，因为压头半径超过细胞壁的直径这消旋 - 缩进的计算结果垂周壁细胞“明显的”杨模量（见Peaucelle 等。9,17和Braybrook 等 10节）。最后， 图1B示出一个cartograph对于微尺度压头（2.5微米的半径）与尺度凹部（500 nm的深度）;有趣的是，成像于本决议案器官萌生了之前任何可见增长9时透露组织软化。
现在，我们强调并提出部分解决方案，使用原子力显微镜来衡量开发植物器官的属性时，通常出现四个技术困难。首先，样品可能被不恰当地嵌入在琼脂糖：即覆盖有琼脂糖的区域不能被正确测量（ 见图1E箭头的边缘）。要解决这个问题，尝试重复步骤1.2.6。第二，被不正当地固定在玻璃载玻片上的试样可在实验过程中移动;那么异常的条纹出现在影像所拖欠左和右行进扫描（ 图1F）之间去相关。要解决这个问题，尝试仔细反复的样品制备。第三，该z轴范围的样品的高度必须低于一定的阈值。对所用样品的平均高度在垂直的z方向上没有限制，但在高度在Z方向（在最高点和最低点之间的距离）的范围必须小于15微米，否则在扫描将被中止（见图1B;设置在原子力显微镜nanowizard）。这是因为，在扫描过程中，在原子力显微镜自动调整悬臂的高度相匹配的样品的高度，但是在一次扫描中的悬臂的高度可以通过仅15μm的不同而不同。要解决此问题，请使用JPK cellHesion模块，从而增加了Z-〜100微米，这表现在图1E-G。第四，该方法是对表面形貌敏感：越是在样品表面是奥连平行于压痕的方向d时，较不可靠的测量结果。在图1G-H呈现的根样品，孔壁平行于根部的长轴是不可见的在扫描的顶部和底部边缘：这里的根表面是远离垂直于所述凹部。在分生组织中，类似地，在花蕾的边缘细胞壁未正确测量（ 图1A）。为内消旋-纳米压痕（ 图1C），这同样地形效应观察：细胞的边缘被不正确地测量为软正是其中所述细胞曲线远离悬臂的平面。数据分析工具，能够考虑到这些地形效应可以解决这件神器在未来，但这样的工具尚不可用。
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Discussion
在植物中，改变机械性能起到引导生长和形态发生了重大作用。到目前为止，已经在解开控制植物生长的遗传和化学网络很大的进步，但我们对这些网络如何促进并受到改变机械性能知识是最基本的。这个方法应该使我们能够填补这一空白，所以它应该是浓厚的兴趣，科学家研究植物生长或形态发生的任何方面的。现在我们总结了该方法的挑战和局限，以及未来展望。
在协议中最具挑战性的步骤是样品制备。样品必须被牢固地固定在琼脂糖载玻片但这琼脂糖不能覆盖的样品要被测量的任何区域。此外，该制剂具有可完成足够快（几分钟内），以防止干燥和微妙，从而防止组织损伤：伤人第二干旱预计将导致在细胞中壁18的机械性能的不可逆变化。另一个具有挑战性的一步是选择正确的原子力显微镜微缩进设置：依赖于科学问题，组织，细胞，亚细胞或分辨率可以与不同的压头和压痕深度来实现。欲了解更多信息，请参见9,10。
该方法有一些局限性。首先，该方法仅限于在器官的表面测量的机械性能;试图制定一个协议，用于测量切除器官的内陆地区正在进行在我们的实验室。第二，分化组织具有高度可变的地形是非常难以测量;例如，毛状体阻挡针尖的访问叶表皮和茎，同样，根毛阻止针尖的访问根表皮。第三，该方法最好适用于长度为100μm或勒的样本SS;它可以在较大的样品用于可达1毫米，但是这需要耗费时间顺序制图测量（ 如图1D和1E）。最后，在原子力显微镜的措施仅部分细胞壁的机械复杂性：它是有限的压缩压痕实验，而细胞壁是复杂的凝胶，可能表现出不同的机械性能取决于变形的类型（ 例如，张力比压缩）。起初，这种方法仅限于压缩似乎是不可或远程能通知上生长，这是一个膨衍生细胞壁拉伸处理。然而，我们在分生组织9，19或上胚轴（未发表数据）的超大测量表明，通过表观杨氏模量和生长测量的弹性之间的惊人关系。我们希望在未来，这项技术的发展将有助于理解这个谜。
该这里提出的方法只测定的植物组织中的弹性力学性能的某些方面，如上面所解释的。但活组织也表现粘滞，合并的粘弹性行为的预测是增长和发展的16,20重要。迄今为止未尽，我们观察到细胞壁反应AFM微压痕的是时间依赖性过几十秒 - 这种反应被定性为粘弹性。在我们以前的工作中，我们给出的一个原子力显微镜的方法来评估此粘弹性响应9。一个组织的另一个重要的生长介导特性是电池的局部膨压。用于测量膨压，我们面临着相似的挑战：测量在整个组织中尺度分辨率的技术还不存在。在植物中使用的压力微探针是，直到最近，限制了玻璃尖端半径，这是分生组织细胞的大小（5微米）12，21通过。另一的研究非常有希望的途径是开发这种原子力显微镜方法，对非plasmolyzed组织使用;我们希望，通过这种方式，揭示单细胞膨压和组织生长之间的关系。 24 -使用其它设备和单个细胞22用这种方法基本上都会通过缩进适用于已经开发的AFM膨压的测量。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
我们特别感谢伊夫Couder许多有益的讨论。我们感谢阿提夫Asnacios的悬臂和讨论的校准。我们感谢丽莎·威利斯，艾略特迈耶罗维茨，和奥利弗Hamant批判性的阅读。这项工作被资助了一部分由人类前沿科学计划授出RGP0062/2005-C;在法新社国立德拉RECHERCHE项目'' Growpec，''和'''' Mechastem。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM | JPK | NanoWizard | All the 3-generation are able to do the work with the same preferment. |
| AFM stage | JPK | CellHesion | Required for sample with low topography (less than 11 µm between the lowest and the highest point in the area of force scanning). |
| AFM optics | JPK | Top View Optics | Very important in order to position the sample. Could be replaced by long range binoculars or a microscope. |
| Stereo microscope | Leica | M125 | Any type of stereo microscope could do. |
| 150 nm mounted cantilever | Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland | R150-NCL-10 | To measure only the cell wall at the surface of the epidermis use. |
| 1 µm mounted cantilever | Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland | SD-Sphere-NCH-S-10 | To measure the mechanics of the cell wall orthogonal to the surface of the epidermis. |
| Tipless cantilever | Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland | TL-NCH-20 | To measure the local mechanics of the tissue (2-3 cell wide) use a 5 µm mounted cantilever. We attached a 5 µm borosilicate bead to a tipless cantilever. |
| 5 µm silicon microspheres | Corpuscular | C-SIO-5 | |
| Araldite | Bartik S.A. 77170 Coubet, France | Araldite for fixing the bead to the tipless cantilever. | |
| Low melting agarose | Fisher Scientific Fair Lawn, New Jersey 07410 | BP160-100 | 34-45 °C gelation temperature |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 USA | M4125-500G | |
| 2 Stainless Steel No. 5 Tweezers | Ideal-Tek 6828 Balerna, Switzerland | 951199 |
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