Abstract
Wir beschreiben eine kürzlich entwickelte Methode, um die mechanischen Eigenschaften der Oberflächen von Pflanzengeweben für ein JPK AFM-Messung mit Hilfe der Rasterkraftmikroskopie (AFM) Mikro / Nano-Vertiefungen. Insbesondere wird in diesem Protokoll wir das scheinbare Elastizitätsmodul der Zellwände zu messen subzellulären Auflösungen in den Regionen von bis zu 100 &mgr; m × 100 &mgr; m in Blütenmeristemen, Hypokotylen und Wurzeln. Dies erfordert eine sorgfältige Vorbereitung der Probe, die richtige Auswahl der Mikro-Eindringkörper und Eindringtiefen. Um die Zellwand nur Eigenschaften werden Messungen in hochkonzentrierten Lösungen von Mannitol, um die Zellen plasmolysieren beseitigen und damit den Beitrag der Zelle Turgor geführt ausmachen.
Im Gegensatz zu anderen vorhandenen Techniken, durch die Verwendung unterschiedlicher Eindringkörpern und Eindringtiefen ermöglicht dieses Verfahren die gleichzeitige Multiskalen-Messungen Es bleiben jedoch mehrere Einschränkungen: Das Verfahren kann nur für relativ kleine Proben (etwa 100 um Durchmesser) und nur an äußeren Gewebe verwendet werden; die Methode ist empfindlich, um Gewebe Topographie; sie misst nur bestimmte Aspekte des Gewebes komplexen mechanischen Eigenschaften. Die Technik wird schnell entwickelt, und es ist wahrscheinlich, dass die meisten dieser Beschränkungen werden in naher Zukunft gelöst werden.
Introduction
Wachstum der Pflanzen wird durch die koordinierte Ausdehnung der starren Zellwänden, die jede einzelne Zelle des Organismus umgibt erreicht. Zunehmend Hinweise darauf, zeigt, dass es durch die Modifikation der Zellwand der Chemie, dass Pflanzen lokal diese Expansion zu steuern. Die Expansion wird angenommen, dass in erster Linie durch Druck auf den Zellwänden von hohen Turgor der Zelle verursacht angetrieben zu werden; Dieser Stamm Reaktion auf Turgor wird durch die mechanischen Eigenschaften der Zellwände 1 geregelt. Wenig ist von dieser mechanischen Eigenschaften bekannt und wie sie während der Entwicklung ändern. Weiterhin ist wenig wie diese mechanischen Eigenschaften gesteuert werden, und ob erteilen tragen zur Zellwandchemie in einer Weise, die offensichtlich in einer Gewebe koordiniert verändern bekannt. Wenn wir die Verbindung zwischen chemischen und mechanischen Veränderungen in der Pflanzenzellwände während der Entwicklung, und schließlich, wie diese mikroskopischen Wechselwirkungen regieren ein Werk verstehen'S makroskopischen Wachstums, eine Methode, die die mechanischen Eigenschaften der Zellwände bei der Entwicklung von Organen an der Zell-oder Gewebe Maßstab überwachen erforderlich.
Die Rasterkraftmikroskopie (AFM)-Methode hier beschrieben, die auf Mikrometer-oder Nanometergewebekompressionen oder Vertiefungen basiert, wurde entwickelt, um genau die mechanischen Eigenschaften der Zellwände in der Entwicklung gleichzeitig Organe auf subzellulärer Auflösungen und über ganze Regionen des Gewebes zu messen. Andere Methoden entweder eine Auflösung, die zu niedrig oder zu hoch ist: das Extensometer ist nur in der Lage, die durchschnittlichen mechanischen Eigenschaften eines ganzen Gewebes an der Millimeter-Skala 2-4, einer Skala, die beispielsweise zu groß, um in frühen Ereignisse zu messen, ist zu messen Organogenese; die Mikroindenter können Messungen an subzellulärer Auflösung im Nanometerbereich, aber es wird in den Messzellen isoliert und nicht Gruppen von Zellen oder Organen 5-7 beschränkt. Mit der AFM, die erforderlichd Gewebe, Zell und subzellulärer Auflösungen 8-10 erreicht werden. Kürzlich mehrere Protokolle wurden speziell entwickelt, um Mechanismen der Gewebe Pflanzen, die auch verwendet werden könnte, 11, 12 zu messen.
Wir werden hier präsentiert, wie die Elastizität des Gewebes durch Messung der scheinbaren Elastizitätsmodul 13 zu beurteilen.
Der Elastizitätsmodul wird häufig verwendet, um die Steifigkeit eines Materials zu beschreiben. Während kleine Verformung der erforderlich ist, um ein Material zu verformen Kraft ist proportional zur Fläche des Eindrucks. Der E-Modul ist dieser Koeffizient. Im Fall einer kontinuierlichen homogenen Material die gleichen Koeffizienten unabhängig von der Einrückung Typ (Größe und Form) gemessen werden, jedoch wird mit der Geschwindigkeit der Messung verändern. Im Falle der komplexen Struktur von Pflanzen Gewebe haben wir so weit, dass die Kraft proportional zu der Deformation, die die Bestimmung der beobachtetenein Koeffizient der Verhältnismäßigkeit, die wir nennen "scheinbare Elastizitätsmodul". Im Gegensatz von kontinuierlichen Medien in den Pflanzen ist diese scheinbare Elastizitätsmodul empfindlich auf die Größe der Vertiefung. Es muss nicht auf die jungen Moduli eines reinen Zellwand entsprechen. Es beschreibt die beste Elastizität des Gerüsts der Zellwand des Gewebes.
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Protocol
1. Bereiten Glasobjektträger für die Montage Proben
- Bereiten Einbettung Agarose Mittel: 0,7% niedrig schmelzender Agarose in 10% Mannit (in Wasser).
- Mit einem starken Metallinstrument (zB Bohrerspitze, Kalk), ätzen ein 0,5 x 0,5 cm-Bereich in der Mitte eines Mikroskopie Glasträger. Oder statt, kleben Sie ein kleines Stück der Glaslamelle (ca. 20 x 200 um) auf die Glasobjektträger mit Araldite Leim. ANMERKUNG: Diese raut die Oberfläche, um die Haftung der Agarose zu erleichtern, damit die Agarose Medien Sticks oder Korrekturen an der Folie. Diese Folie kann wiederverwendet werden.
- Positionieren eines Tröpfchens von 20 &mgr; l Agarose-Einbettungsmedium auf dem geätzten Bereich des Objektträgers. Dies ergibt eine Dünnschicht aus Agarose.
- Bewahren Sie die Glasobjektträger in einer feuchten Box und warten, bis die Agarose-Medien zu verfestigen.
2. Zergliedern und Montage Meristem Proben
- Microdissect Meristemen für konfokale Phantasieng: Entfernen Sie die Blütenknospen eines nach dem anderen aus dem Stamm, indem Sie sie mit ultra feinen Pinzette nach unten. Es ist wichtig, alle Blütenknospen an den Knospen, die nicht Kelchblätter nicht aufweisen (dh der P1 Primordia 14) entfernen sich.
- Mit einer Rasierklinge oder die Spitze der Pinzette, schneiden Sie den Meristem vom Stamm. Der Schnitt sollte parallel zu dem Bereich der Meristem Oberfläche, die mit dem AFM gemessen werden soll. Das erhaltene Spitze sollte zwischen 300 &mgr; m und 600 &mgr; m hoch, unter der AFM-Spitze zu passen.
- Drücken Sie die Spitze in den Film der in Schritt 1.1.4 vorbereitet Agarose-Medien. Wählen Sie eine Position auf dem Objektträger / Agarose und drücken Sie vorsichtig, so dass das Meristem ist sowohl direkt in Kontakt mit dem Objektträger aus Glas und ragt aus dem Agarose. Es ist entscheidend, die Meristem in der Agarose in den wenigen Sekunden, die seinen Schnitt von dem Schaft folgen positionieren. Hinweis: Dies ist, um das Austrocknen zu verhindern Meristem aus. In dieser Phase wird das Meristem in einem crac zu stehenk, weil die Agarose bei Anwendung von Druck zerbrochen.
- Bereiten mehrere Meristeme diese Weise für Batch-Bildgebung, vorausgesetzt, sie haben die gleiche Höhe aufweisen und weniger als 500 um voneinander auf der Folie angeordnet ist. Halten Sie die vorbereitet Meristeme in der feuchten Feld während Sezieren weitere Proben.
HINWEIS: Es begrenzt die Änderung, die von der Kalibrierung. Idealer 2 Proben jeder Bedingung könnte vorbereitet und zufällig gemessen werden. Bisher gibt es keine Wirkung beobachtet von Batch-Bildgebung auf der Messung (Stress-induzierten Antwort). Dies dank der Verdünnung des Spannungssignalmoleküle in den Agar und / oder der Montage Lösung. Alternativ kann die Spannung ist die gleiche, unabhängig auf die Menge der Probe hergestellt. - Bevor wir zum nächsten Schritt, um sicherzustellen, dass die Grenze zwischen dem Meristem und die Blütenknospen trocken ist. Wenn nicht, entfernen Sie vorsichtig das überschüssige Wasser mit Filterpapier. Dies sollte in der nächsten Stufe zu verhindern, daß das geschmolzeneAgarose flutet die Probe aufgrund der Kapillarwirkung Kräfte.
- Mit einem 20 ul Pipette genug geschmolzen Montage Agarose in den Riss im Schritt 1.2.3 erstellt zu füllen. und jede Meristem zu umgeben. Die Agarose sollte das Niveau der Narbe des entfernten Blütenknospe (Primordium) zu erreichen. Um dies zu erreichen, kann es notwendig sein, Agarose an jedem Ende des Risses hinzuzufügen.
- Wenn die Agarose hinzugefügt wird, wird es schnell in den Riss überfluten; mit der Pipette absaugen Teil der geschmolzenen Agarose-Montage, um sicherzustellen, dass das Meristem ist der höchste Punkt auf der Folie. Dieser behebt das Meristem, so dass es nicht während der Bildgebung zu bewegen.
3. Montage Root-oder Hypokotyl Proben
- Für Wurzeln und Keimstengel, keine Präparation erforderlich. In dem dünnen Film aus Agarose auf die vorbereitete Objektträger, einen Nut direkt oberhalb einer Ätzung in dem Glas oder auf einer Glaslamelle. Positionieren Sie die Wurzel oder Hypokotyl in dieser Nut sicherzustellen, dass sie in Kontakt mit der istGlas in seiner ganzen Länge.
- Bevor wir zum nächsten Schritt, um sicherzustellen, dass die Probe trocken ist, an seiner Oberfläche. Wenn nicht, entfernen Sie vorsichtig das überschüssige Wasser mit Filterpapier.
- Montage Agarose geschmolzen um die Probe, wie in Schritt 1.2.6 hinzufügen.
4. AFM Vorbereitung und Empfindlichkeitskalibrierung (JPK Nanowizard für eine AFM)
- Montieren Sie einen Ausleger auf der AFM. Der Ausleger sollte mit runder Eindringkörper montiert werden. Der Radius wird die x, y, z-Auflösung und die Eindringtiefe in dem eine genaue Messung archiviert werden konnten bestimmen.
- Um meso-nanoskalige Messungen an der Epidermis der Oberfläche nehmen, verwenden Sie eine 50 nm Radius runden Stempels; zu mesoskaligen Messungen, verwenden Sie eine 0,5 um Radius rund Eindringkörper; zu Mikro Messungen (über 2-3 Zellen), verwenden Sie eine 2,5 um Radius rund Eindringkörper.
- Positionieren Sie den Laser an der Spitze des Auslegers. Ausrichten des Lasers auf die Mittelder Entführer mit dem Spiegel.
- Positionieren Sie ein sauberes Glas unter den AFM.
HINWEIS: Das folgende ist eingestellt, um das Signal der Laserposition auf der AFM-Rezeptor in einer Verformung des Auslegers zu verändern und, durch Auswertung der Federkonstante des Cantilevers, um es in eine Kraft umzusetzen. - Anfahren mit einem Zielkraft "Sollwert" von 1 V.
- Wählen Sie "Kraftspektroskopie". Tun eine Vertiefung durch Einstellen der maximalen "relative Sollwert" auf 2 V, die "erstrecken Geschwindigkeit" auf 40 um / s, und die "Länge z" bis 5 um.
- Wählen Sie im Menü "Calibration Manager", wählen Sie den linearen Teil der Terminkurve, um die Empfindlichkeit mit dem "fit Bereich wählen"-Button passen. Die "relative Sollwert" vom "Volt" auf "Meter" umgewandelt werden.
- Wählen Sie im Menü "Calibration Manager", wählen Sie "Federkonstante", um die el bewertenasticity des Auslegers mit thermischen Fluktuationen. Drücken Sie auf "Ausführen", um die spektrale Dichte Grundstück des Auslegers zu erhalten. Finden Sie die Resonanzspitze mit der niedrigsten Frequenz. Setzen Sie es mit dem "fit Bereich auswählen" klicken.
Hinweis 1: Für weitere Informationen über die thermischen Fluktuationen Tuning, lesen Koch et al 15.
Hinweis 2: Es ist besser, eine direkte Methode verwenden, um die Elastizität des Auslegers bewerten mit Hilfe eines Referenzbiegebalken (oder Material mit bekannten Steifigkeit). Der hier verwendete wurde freundlicherweise von Atef Asnacios 16 gespendet. - Geben Sie 200 ul 10% Mannit-Lösung unter der Auslegerspitze. Richten des Lasers, um die Mitte der Fänger mit dem Spiegel.
- Kalibrieren Sie die Empfindlichkeit: aus dem Menü "Calibration Manager", klicken Sie auf den "unbekannten"-Taste; wiederholen Sie die Schritte 2.3 bis zum 2.5.
. 5 Datenerfassung: Scheinbarer Elastizitätsmodul Kartographie
. 6 Datenanalyse: Scheinbarer Elastizitätsmodul Berechnungen
- Öffnen Sie die Datei in der Datenanalyse-Software.
- Wählen Sie "Stapelverarbeitung", um die gleiche Analyse für alle Kurven einer einzigen Karte beantragen.
- "Korrigieren der Höhe der Biegung des Auslegers", damit die Eindringtiefe zu extrahieren.
- Option "Elastizitätsmodul fit-Funktion", die annehmen, wird die Kraft ist proportional zu der Fläche der Einbuchtung. Stellen Sie die "Spitzenform" parabolischer anzunehmen, dass die Vertiefung Form ist ein parabolisch.
- Geben Sie den Radius der Spitze.
- Vorzugsweise Wählen Sie die "Rückzugs"-Kurve für die Analyse, weil sie weniger empfindlich auf Topographie als die "extend"-Kurve. Allerdings, wenn es erhebliche Verkleben der Sonde während des "Rückzugs", benutzen Sie die "verlängern"-Kurve, die unempfindlich gegenüber kleben ist.
- Setdas Poisson-Verhältnis von 0,5. Drücken Sie auf zu analysieren und speichern Sie die Ausgabe.
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Representative Results
In Abbildung 1 stellen wir typische Junge Module Karten Blütenmeristemen (1A und 1B), jung und alt Hypokotylen (1C-F) und Wurzelspitzen (1G und 1H). Bei allen Versuchen der Eindringkörper ist halbkugelförmig, aber seinen Radius unterscheidet, so dass verschiedene räumliche Auflösungen erreicht werden kann 1C und 1D zeigen typische Ergebnisse für meso-nanoskaligen Eindringkörper (50 nm Radius) mit meso-nanoskaligen Vertiefungen (50 nm Tiefe). . cartographs zeigen die Mikro Heterogenitäten in Oberflächenzellwände von Hypokotyl epidermalen Zellen 1A, 1E und 1G zeigen typische Ergebnisse für mesoskalige Eindringkörpern (500 nm Radius) mit mesoskaligen Vertiefungen (500 nm Tiefe) für Blumen Meristem, Hypokotyl und Wurzel; beachten, dass sich der Eindringkörper Radius größer als der Durchmesser der Zellwand dieser Vertiefung meso-wertet'Scheinbare' Young Module der Antiklinale Zellwände (siehe Peaucelle et al. 9,17 und Braybrook et al. 10 für Details). Schließlich zeigt 1B eine cartograph für Mikro Eindringkörpern (2,5 um Radius) mit mesoskaligen Vertiefungen (500 nm Tiefe); interessanterweise Bildgebung bei dieser Auflösung enthüllt Gewebe Erweichung während der Organ Initiation, die keine sichtbaren Wachstums 9 voraus.
Wir zeigen nun, und Teillösungen zu vier technischen Schwierigkeiten, die häufig auftreten, wenn Sie die AFM, um die Eigenschaften der Entwicklung von Pflanzenorganen messen vorschlagen. Erstens kann Proben nicht ordnungsgemäß in der Agarose eingebettet sein: Regionen, die mit Agarose abgedeckt werden, können nicht richtig gemessen werden (siehe Kanten 1E Pfeil). Um dies zu beheben, versuchen Sie Schritt 1.2.6. Zweitens können Proben, die nicht ordnungsgemäß auf die Glasobjektträger fixiert werden während des Experiments zu bewegen; dann abweichende Streifen erscheinen in den Bildern geschuldetzwischen der linken und rechten Vorschub Scans (1F) Dekorrelation. Um dies zu beheben, versuchen Sie sorgfältig Wiederholung der Probenvorbereitung. Drittens muss die z-Höhenbereich der Probe unter einem bestimmten Schwellenwert liegt. Es gibt keine Beschränkung auf mittlerer Höhe der Probe in der vertikalen z-Richtung, aber der Bereich in der Höhe in der z-Richtung (Abstand zwischen den höchsten und niedrigsten Punkt) kleiner als 15 &mgr; m sein, da sonst die Abtastung abgebrochen werden (siehe 1B; Einstellungen sind in der Nanowizard AFM). Dies liegt daran, dass während der Abtastung die AFM automatisch die Auslegerhöhe, um die Höhe der Probe entsprechen, aber in einer einzigen Abtastung der Ausleger in der Höhe durch lediglich 15 &mgr; m variieren. Um dies zu beheben, die JPK CellHesion Modul, das die z-Bereich bis 100 um erhöht, wie in Abbildung 1E-G gezeigt. Viertens ist das Verfahren empfindlich gegenüber Oberflächentopographien: je mehr der Probenoberfläche ist oriented parallel zu der Richtung der Vertiefung, die weniger zuverlässige Messungen. In der Stammprobe in Figur 1G-H dargestellt, die Zellwände parallel zu der langen Achse der Wurzel nicht sichtbar sind an den oberen und unteren Kanten der Abtastung: Hier wird die Wurzeloberfläche ist weit davon entfernt, die senkrecht zu der Vertiefung. Im Meristem, ähnlich, Zellwände an den Rändern der Blütenknospen nicht korrekt gemessen (Fig. 1A). Meso-nanoskaligen Vertiefungen (Fig. 1C), auch in diesem topographischen Effekt beobachtet: Zellen Kanten fälschlicherweise als weiche genau gemessen, wo die Zellen-Kurve von der Ebene des Auslegers. Eine Datenanalyse-Tool, das in der Lage, für diese topografischen Effekte zu berücksichtigen ist, könnte dieses Artefakt in der Zukunft zu lösen, aber so ein Tool ist noch nicht verfügbar.
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Discussion
In Pflanzen spielen wechselnden mechanischen Eigenschaften eine wichtige Rolle bei der Leitung Wachstum und Morphogenese. Bis heute hat es große Fortschritte in der Entschlüsselung der genetischen und chemischen Netzwerke, die das Pflanzenwachstum zu kontrollieren, aber unser Wissen, wie diese Netzwerke beitragen, und sind durch Veränderungen der mechanischen Eigenschaften betroffen ist rudimentär. Diese Methode sollte es uns ermöglichen, diese Lücke zu füllen, und so sollte es ein starkes Interesse an Wissenschaftler, die jeden Aspekt des Pflanzenwachstums oder Morphogenese sein. Wir haben jetzt einen Überblick über die Herausforderungen und Grenzen der Methode und die Zukunftsaussichten.
Der schwierigste Schritt im Protokoll ist die Probenvorbereitung. Die Probe muss fest an der Glasplatte mit Agarose befestigt werden, aber dies Agarose dürfen keine Bereiche der Probe, die gemessen werden sollen, abdecken. Ferner weist die Herstellung schnell genug (in Minuten) abgeschlossen werden, um ein Austrocknen zu verhindern und so zart wie Gewebeschädigung zu verhindern: Verwundung einnd Dürre vorausgesagt, um zu irreversiblen Veränderungen der mechanischen Eigenschaften der Zellwand 18 führen. Ein weiterer Schritt ist eine Herausforderung, die richtigen AFM Mikroeindruck Einstellungen wählen: abhängig von der wissenschaftlichen Frage, können Gewebe, zellulären oder subzellulären Auflösung mit unterschiedlichen Eindringkörpern und Eindringtiefen erreicht werden. Für weitere Informationen, siehe 9,10.
Das Verfahren hat mehrere Einschränkungen. Erstens ist das Verfahren begrenzt auf die Messung der mechanischen Eigenschaften an den Oberflächen von Organen; ein Versuch, ein Protokoll für die Messung von Innenbereichen reseziert Organe zu entwickeln, ist in unserem Labor im Gange. Zweitens sind differenzierte Gewebe mit einem hochvariablen Topographie sehr schwierig zu messen; zB Trichome blockieren den Zugang der AFM-Spitze ist auf die Epidermis von Blättern und Stängeln, und ähnlich, Wurzelhaare Zugang des AFM-Spitze auf root Epidermis zu blockieren. Drittens ist die beste Methode, um Proben mit einer Länge von 100 um oder le angewendetss; es kann an größeren Proben bis zu 1 mm verwendet werden, aber dies erfordert zeitaufwendige sequentielle kartographische Messungen (wie in Fig. 1D und 1E dargestellt). Schließlich werden die AFM Maßnahmen nur ein Teil der mechanischen Komplexität der Zellwand: Es ist auf Druckeindruckversuchen, während die Zellwände sind komplexe Gele, die unterschiedliche mechanische Eigenschaften in Abhängigkeit von der Art der Verformung (z. B. Spannung vs Kompression) zeigen kann. Zunächst scheint diese Methode zur Kompression beschränkt zu sein, nicht in der Lage oder remote auf Wachstum zu informieren, welche ein Turgor abgeleiteten Zellwandstreckprozesses ist. Doch unsere eigenen Supersize-Messung auf dem Meristem 9, 19 oder auf der Hypokotyl (unveröffentlichte Daten) zeigt eine erstaunliche Korrelation zwischen der Elastizität durch die scheinbare Elastizitätsmodul und Wachstum gemessen. Wir hoffen, dass in der Zukunft, die Entwicklung dieser Technik wird dazu beitragen, das Verständnis dieses Rätsel.
DieMethode stellt nur bestimmte Aspekte der elastischen mechanischen Eigenschaften von Pflanzen, Geweben gemessen, wie oben erläutert. Sondern auch lebende Gewebe zähflüssig verhält, und die kombinierte visko-elastische Verhalten und vorhergesagt wird, die für Wachstum und Entwicklung 16,20 sein. Bisher nicht erwähnte, beobachteten wir Antworten der Zellwände von Mikrovertiefungen, die zeitabhängig über zehn Sekunden waren AFM - diese Reaktion wurde als viskoelastische gekennzeichnet. In unserer bisherigen Arbeit präsentierten wir ein AFM-Methode, um diese viskoelastischen Reaktion 9 beurteilen. Ein weiterer wichtiger Wachstumsvermittelnde Eigenschaft eines Gewebes ist die lokale Turgor der Zellen. Zur Messung Turgor stehen wir vor ähnlichen Herausforderungen: eine Technik, die bei mesoskaligen Auflösung über Gewebe misst noch nicht existiert. Mikrosonden in die Druckwerke eingesetzt wurden, bis vor kurzem durch die Glasspitzenradius, der die Größe des meristematischen Zellen (5 &mgr; m) 12, 21 begrenzt ist. Ein anderervielversprechende Weg der Forschung ist es, diese AFM Verfahren für den Einsatz auf nicht-plasmolysierten Gewebe zu entwickeln; wir hoffen, auf diese Weise, um die Beziehung zwischen einzelnen Zelle Turgor und Gewebewachstum zu offenbaren. Diese Methode wird im Wesentlichen auf die bereits entwickelten AFM-Messung gelten Turgor durch Vertiefung mit anderen Geräten und auf einzelne Zellen verwendet 22 - 24.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir geben besonderen Dank an Yves Couder für viele hilfreiche Diskussionen. Wir danken Atef Asnacios zur Kalibrierung der Ausleger und Diskussion. Wir danken Lisa Willis, Elliot Meyerowitz und Oliver Hamant für das kritische Lesen. Diese Arbeit wurde zum Teil von Human Frontier Science Program RGP0062/2005-C Zuschuss finanziert werden; der Agence Nationale de la Recherche-Projekte Growpec'','' und'''' Mechastem.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM | JPK | NanoWizard | All the 3-generation are able to do the work with the same preferment. |
| AFM stage | JPK | CellHesion | Required for sample with low topography (less than 11 µm between the lowest and the highest point in the area of force scanning). |
| AFM optics | JPK | Top View Optics | Very important in order to position the sample. Could be replaced by long range binoculars or a microscope. |
| Stereo microscope | Leica | M125 | Any type of stereo microscope could do. |
| 150 nm mounted cantilever | Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland | R150-NCL-10 | To measure only the cell wall at the surface of the epidermis use. |
| 1 µm mounted cantilever | Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland | SD-Sphere-NCH-S-10 | To measure the mechanics of the cell wall orthogonal to the surface of the epidermis. |
| Tipless cantilever | Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland | TL-NCH-20 | To measure the local mechanics of the tissue (2-3 cell wide) use a 5 µm mounted cantilever. We attached a 5 µm borosilicate bead to a tipless cantilever. |
| 5 µm silicon microspheres | Corpuscular | C-SIO-5 | |
| Araldite | Bartik S.A. 77170 Coubet, France | Araldite for fixing the bead to the tipless cantilever. | |
| Low melting agarose | Fisher Scientific Fair Lawn, New Jersey 07410 | BP160-100 | 34-45 °C gelation temperature |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 USA | M4125-500G | |
| 2 Stainless Steel No. 5 Tweezers | Ideal-Tek 6828 Balerna, Switzerland | 951199 |
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