Abstract
हम एक JPK AFM के लिए, परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) माइक्रो / नैनो indentations का उपयोग संयंत्र के ऊतकों की सतहों के यांत्रिक गुणों को मापने के लिए एक हाल ही में विकसित विधि का वर्णन. विशेष रूप से, इस प्रोटोकॉल में हम फूलों मेरिस्टेमों, hypocotyls, और जड़ों में एक्स 100 माइक्रोन तक के लिए 100 माइक्रोन के क्षेत्रों में subcellular प्रस्तावों पर सेल दीवारों का स्पष्ट यंग मापांक उपाय. इस नमूने की सावधान तैयारी, सूक्ष्म Indenters और खरोज गहराई का सही चयन की आवश्यकता है. केवल, माप कोशिकाओं plasmolyze और इस तरह सेल टर्गर दबाव के योगदान को दूर करने के क्रम में mannitol की अत्यधिक ध्यान केंद्रित समाधान में प्रदर्शन कर रहे हैं सेल दीवार गुणों के लिए खाते.
अन्य मौजूदा तकनीक के विपरीत, अलग Indenters और खरोज गहराई का उपयोग करके, इस विधि, एक साथ multiscale माप की अनुमति देता है हालांकि, कई सीमाएं रह: विधि केवल (100 व्यास में माइक्रोन के आसपास) और केवल बाहरी ऊतकों पर काफी छोटे नमूनों पर इस्तेमाल किया जा सकता है; विधि ऊतक स्थलाकृति के प्रति संवेदनशील है; यह ऊतक की जटिल यांत्रिक गुणों की ही कुछ पहलुओं के उपाय. तकनीक तेजी से विकसित किया जा रहा है और यह इन सीमाओं के सबसे निकट भविष्य में हल हो जाएगा संभावना है.
Introduction
पौधों में विकास जीव के हर कोशिका है कि चारों ओर कठोर सेल दीवारों के समन्वित विस्तार से हासिल की है. सबूत जमा यह पौधों स्थानीय स्तर पर इस विस्तार है कि नियंत्रण सेल दीवार रसायन शास्त्र के संशोधन के माध्यम से इंगित करता है. विस्तार सेल के उच्च टर्गर दबाव की वजह से सेल दीवारों, पर तनाव द्वारा मुख्य रूप से संचालित होने लगा है; टर्गर दबाव को इस तनाव प्रतिक्रिया सेल दीवारों 1 के यांत्रिक गुणों से नियंत्रित होता है. लिटिल इन यांत्रिक गुणों के लिए जाना जाता है और वे विकास के दौरान बदल कैसे. इसके अलावा छोटे इन यांत्रिक गुणों प्रतिपुष्टि जाहिरा तौर पर एक ऊतक भर में समन्वित है कि एक तरह से कोशिका दीवार रसायन शास्त्र में परिवर्तन करने के लिए योगदान है कि क्या नियंत्रित कर रहे हैं और कैसे के नाम से जाना जाता है. हम रासायनिक और यांत्रिक विकास के दौरान संयंत्र सेल दीवारों में परिवर्तन, और अंततः कैसे इन सूक्ष्म बातचीत एक संयंत्र को नियंत्रित के बीच संबंध को समझने के लिए कर रहे हैंके macroscopic विकास, सेलुलर या ऊतक पैमाने पर अंगों के विकास में सेल दीवारों के यांत्रिक गुणों की निगरानी कर सकते हैं कि एक विधि की आवश्यकता है.
परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) विधि माइक्रोमीटर या नैनोमीटर ऊतक compressions या indentations पर आधारित है, जो यहाँ वर्णित, subcellular प्रस्तावों पर एक साथ अंगों के विकास में और ऊतकों की संपूर्ण क्षेत्रों में सेल दीवारों के यांत्रिक गुणों को मापने के लिए ठीक से विकसित किया गया था. अन्य तरीके हैं या तो बहुत कम या बहुत अधिक है कि एक संकल्प: एक्सटेन्सोमीटर मिलीमीटर पैमाने 2-4, में प्रारंभिक घटनाओं को मापने के लिए बहुत बड़ा उदाहरण के लिए है कि एक पैमाने पर एक पूरे ऊतक की औसत यांत्रिक गुणों को मापने के लिए केवल सक्षम है जीवोत्पत्ति; microindenter नैनोमीटर पैमाने पर subcellular संकल्प पर माप ले जा सकते हैं, लेकिन यह अलग कक्षों और नहीं कोशिकाओं और अंगों 5-7 के समूहों को मापने के लिए प्रतिबंधित है. AFM के साथ, की आवश्यकताडी ऊतक, सेलुलर, और subcellular प्रस्तावों 8-10 प्राप्त किया जा सकता है. हाल ही में कई प्रोटोकॉल भी 11, 12 इस्तेमाल किया जा सकता है कि पौधों के ऊतकों की यांत्रिकी को मापने के लिए विशेष रूप से विकसित किया गया है.
हम स्पष्ट यंग मापांक 13 की माप के माध्यम से ऊतक की लोच का मूल्यांकन करने के लिए कैसे यहाँ पेश करेंगे.
यंग मापांक सामान्यतः एक सामग्री की कठोरता का वर्णन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. छोटे विरूपण के दौरान एक सामग्री ख़राब करने के लिए आवश्यक बल खरोज के क्षेत्र के लिए आनुपातिक है. यंग मापांक इस गुणांक है. एक निरंतर समरूप सामग्री के मामले में एक ही गुणांक की परवाह किए बिना खरोज प्रकार (आकार और आकार) के मापा जाएगा लेकिन माप की गति के साथ बदल जाएगा. पौधों के ऊतकों की जटिल संरचना के मामले में, हम अब तक शक्ति दृढ़ संकल्प की अनुमति देने के विरूपण के लिए आनुपातिक है कि मनायाहम "स्पष्ट युवा मापांक" नाम देते हैं समानता का एक गुणांक. पौधों में निरंतर medias से विपरीत, यह स्पष्ट युवा मापांक खरोज के आकार के प्रति संवेदनशील है. यह एक शुद्ध सेल की दीवार के युवा moduli के अनुरूप नहीं है. यह सबसे अच्छा ऊतकों की कोशिका दीवार के मचान की लोच का वर्णन करता है.
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Protocol
1. नमूना बढ़ते के लिए गिलास स्लाइड तैयार करें
- Agarose मीडिया imbedding तैयार: 10% mannitol (पानी में) में 0.7% कम पिघलने agarose.
- एक मजबूत धातु (जैसे ड्रिल टिप, चूना) का उपयोग करना, एक माइक्रोस्कोपी गिलास स्लाइड के केंद्र में एक 0.5 x 0.5 सेमी क्षेत्र से बाहर खोदना. या बजाय, Araldite गोंद का उपयोग गिलास स्लाइड पर कांच लामेल्ला (लगभग 20 एक्स 200 माइक्रोन) का एक छोटा सा टुकड़ा गोंद. नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए agarose के आसंजन को सुविधाजनक बनाने के क्रम में सतह roughens कि स्लाइड को agarose मीडिया की छड़ें या सुधारों. इस स्लाइड पुनः उपयोग किया जा सकता है.
- कांच स्लाइड की etched क्षेत्र पर agarose मीडिया imbedding के बारे में 20 μl की एक छोटी बूंद रखें. इस agarose की एक पतली फिल्म देता है.
- एक नम बॉक्स में कांच स्लाइड स्टोर और agarose मीडिया जमना करने के लिए प्रतीक्षा करें.
2. Meristem नमूने विदारक और बढ़ते
- Confocal imagi के लिए Microdissect मेरिस्टेमोंएनजी: अल्ट्रा ठीक चिमटी के साथ उन्हें नीचे खींच कर स्टेम से पुष्प कलियों एक एक करके हटा दें. यह (P1 primordia 14) अर्थात् sepals प्रदर्शन नहीं करते हैं कि कलियों के सभी फूलों की कलियों को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है.
- एक रेजर ब्लेड या चिमटी की नोक का प्रयोग, दूर स्टेम से meristem काटा. कटौती AFM से मापा जा रहा है कि meristem सतह के क्षेत्र के समानांतर होना चाहिए. प्राप्त शीर्ष 300 माइक्रोन और AFM टिप के नीचे फिट करने के लिए उच्च 600 माइक्रोन के बीच होना चाहिए.
- कदम 1.1.4 पर तैयार agarose मीडिया की फिल्म में शीर्ष पुश. कांच स्लाइड / agarose पर एक स्थान चुनें और meristem गिलास स्लाइड के साथ संपर्क में दोनों सीधे और agarose से बाहर protrudes कि धीरे ऐसे धक्का. यह स्टेम से इसकी कटौती का पालन करें कि कुछ सेकंड के भीतर agarose में meristem की स्थिति के लिए महत्वपूर्ण है. नोट: इस सूखने से meristem को रोकने के क्रम में है. इस स्तर पर, meristem एक CRAC में खड़ा किया जाएगाagarose दबाव के आवेदन पर खंडित क्योंकि कश्मीर.
- वे एक ही ऊंचाई के हैं और एक स्लाइड पर दूसरे से कम से कम 500 माइक्रोन तैनात कर रहे हैं कि उपलब्ध कराने, कई मेरिस्टेमों बैच इमेजिंग के लिए इस तरह तैयार करें. आगे नमूने विदारक जबकि नम बॉक्स में तैयार मेरिस्टेमों रखें.
नोट: यह अंशांकन से आ भिन्नता की सीमा. प्रत्येक शर्त के आदर्श रूप में 2 नमूने तैयार और बेतरतीब ढंग से मापा जा सकता है. अब तक माप (तनाव प्रेरित प्रतिक्रिया) पर बैच इमेजिंग का कोई मनाया प्रभाव है. यह अगर और / या बढ़ते समाधान में तनाव संकेतन अणुओं के कमजोर पड़ने के लिए धन्यवाद किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से तनाव प्रतिक्रिया की परवाह किए बिना तैयार नमूना की राशि के लिए एक ही है. - अगले चरण पर जाने से पहले, meristem और फूलों की कलियों के बीच सीमा सूखी है कि सुनिश्चित करें. यदि नहीं, तो धीरे फिल्टर पेपर का उपयोग कर अतिरिक्त पानी निकाल दें. इस पिघल कि अगले चरण में रोकने चाहिएagarose कारण कैशिकता बलों के लिए नमूना बाढ़.
- एक 20 μl विंदुक के साथ, पर्याप्त जोड़ने कदम 1.2.3 में बनाया दरार को भरने के लिए agarose बढ़ते पिघल गए. और प्रत्येक meristem घेर. agarose हटाया फूल कली (उत्स) के निशान के स्तर तक पहुंच जाना चाहिए. इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, यह दरार के अंत में प्रत्येक agarose जोड़ने के लिए आवश्यक हो सकता है.
- Agarose जोड़ा जाता है, इसे जल्दी दरार में बाढ़ की जाएगी पिपेट का उपयोग, meristem स्लाइड पर उच्चतम बिंदु है कि यह सुनिश्चित करने के लिए agarose बढ़ते पिघल का हिस्सा चूसना बंद. यह इमेजिंग के दौरान ले जाया जा सकता है, ताकि यह meristem को हल करता है.
3. बढ़ते जड़ या Hypocotyl नमूने
- जड़ों और hypocotyls के लिए, कोई विच्छेदन आवश्यक है. तैयार गिलास स्लाइड पर agarose की पतली फिल्म में, सीधे गिलास में एक खोदना ऊपर या एक गिलास लामेल्ला के साथ या तो एक नाली बनाने. इसके साथ संपर्क में है यह सुनिश्चित करना कि इस नाली में जड़ या hypocotyl स्थित करेंअपनी पूरी लंबाई के साथ कांच.
- अगले चरण पर जाने से पहले, नमूना इसकी सतह पर शुष्क है कि सुनिश्चित करें. यदि नहीं, तो धीरे फिल्टर पेपर का उपयोग पानी के अतिरिक्त हटा दें.
- जोड़ें कदम 1.2.6 में के रूप में नमूना के आसपास agarose बढ़ते पिघल गए.
4. AFM तैयार करना और संवेदनशीलता अंशांकन (एक JPK Nanowizard AFM के लिए)
- AFM पर एक ब्रैकट माउंट. ब्रैकट गोल आकार का इंडेंट के साथ रखा जाना चाहिए. त्रिज्या एक्स, वाई, जेड संकल्प और सटीक माप संग्रहीत किया जा सकता है, जिस पर खरोज गहराई का निर्धारण करेगा.
- एपिडर्मिस की सतह पर Meso-nanoscale माप लेने के लिए, एक 50 एनएम त्रिज्या दौर इंडेंट का उपयोग करें; , mesoscale माप लेने के एक 0.5 माइक्रोन त्रिज्या दौर इंडेंट उपयोग करने के लिए; (2-3 कोशिकाओं के पार) microscale माप लेने के लिए, एक 2.5 माइक्रोन त्रिज्या दौर इंडेंट का उपयोग करें.
- ब्रैकट की नोक पर लेजर स्थिति. बीच करने के लिए लेजर संरेखितदर्पण का उपयोग कर अपहरणकर्ता की.
- AFM के तहत एक साफ ग्लास स्थिति.
नोट: निम्न ब्रैकट की एक विकृति में AFM रिसेप्टर पर लेजर स्थिति का संकेत परिणत करने के लिए सेट और, एक बल में यह अनुवाद करने के लिए, ब्रैकट वसंत निरंतर मूल्यांकन के द्वारा किया जाता है. - 1 वी. के लक्ष्य के बल "सेट बिंदु" के साथ दृष्टिकोण
- "बल स्पेक्ट्रोस्कोपी" का चयन करें. 2 वी करने के लिए अधिक से अधिक "सापेक्ष सेट बिंदु" सेटिंग से एक खरोज है, 40 माइक्रोन / सेक करने के लिए "गति का विस्तार", और 5 माइक्रोन "z लंबाई".
- "अंशांकन प्रबंधक" मेनू से, "फिट श्रेणी का चयन करें" बटन का उपयोग संवेदनशीलता फिट करने के लिए आगे की अवस्था के रैखिक भाग का चयन करें. "सापेक्ष सेट बिंदु" "मीटर" के लिए "वाल्ट" से बदल दिया जाना चाहिए.
- "अंशांकन प्रबंधक" मेनू से, एल का मूल्यांकन करने के लिए "निरंतर वसंत" का चयनथर्मल उतार चढ़ाव का उपयोग ब्रैकट की asticity. ब्रैकट के वर्णक्रमीय घनत्व की साजिश प्राप्त करने के लिए प्रेस "रन". सबसे कम आवृत्ति के साथ गूंज शिखर प्राप्त करें. "फिट श्रेणी का चयन करें" बटन का उपयोग कर इसे फिट.
नोट 1:. थर्मल उतार चढ़ाव ट्यूनिंग के बारे में अधिक जानकारी के लिए, कुक एट अल 15 पढ़ा
नोट 2: यह (ज्ञात कठोरता के साथ या सामग्री) एक संदर्भ ब्रैकट का उपयोग ब्रैकट की लोच का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रत्यक्ष पद्धति का उपयोग करने के लिए बेहतर है. यहां इस्तेमाल एक कृपया अतेफ Asnacios 16 द्वारा दान में दिया था. - ब्रैकट टिप के तहत 10% mannitol समाधान के 200 μl जोड़ें. दर्पण का उपयोग कर अपहरणकर्ता के बीच करने के लिए लेजर फिर से संगठित करना.
- संवेदनशीलता recalibrate: "अंशांकन प्रबंधक" मेनू से, "अज्ञात" बटन पर क्लिक करें; दोहराने से 2.5 के माध्यम से 2.3 कदम.
5. डाटा अधिग्रहण: स्पष्ट यंग मापांक नक्शानवीसी
. 6 डाटा विश्लेषण: स्पष्ट यंग मापांक गणना
- डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर में डेटा फ़ाइल खोलें.
- एक भी नक्शा सब घटता के लिए एक ही विश्लेषण लागू करने के लिए "बैच संसाधन" का चयन करें.
- इसलिए खरोज गहराई को निकालने के लिए 'ब्रैकट के झुकने के लिए ऊंचाई को सही "का चयन करें.
- बल खरोज के क्षेत्र के लिए आनुपातिक है मान जाएगा कि "यंग मापांक फिट समारोह" का चयन करें. खरोज आकार एक परवलयिक लगता है कि पैराबोलिक को "टिप आकार" सेट.
- टिप की त्रिज्या से संकेत मिलता है.
- यह "विस्तार" वक्र से स्थलाकृति के प्रति संवेदनशील है क्योंकि preferentially विश्लेषण के लिए "वापस लेना" वक्र का चयन करें. जांच के महत्वपूर्ण चिपके दौरान अगर वहाँ हालांकि, "वापस लेना है," चिपके के प्रति असंवेदनशील है जो "विस्तार" वक्र, का उपयोग करें.
- समूह0.5 पॉसों अनुपात. प्रेस पर विश्लेषण और उत्पादन को बचाने के.
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Representative Results
चित्रा 1 में हम पुष्प मेरिस्टेमों की ठेठ युवा moduli नक्शे (आंकड़े 1 ए और 1 बी), जवान और बूढ़े hypocotyls (आंकड़े 1 सी एफ), और जड़ meristem (चित्रा 1G और 1H) उपस्थित थे. सभी प्रयोगों में इंडेंट अर्धगोल है, लेकिन अलग स्थानिक प्रस्तावों प्राप्त किया जा सकता है, ताकि इसकी त्रिज्या अलग -1 सी और 1 डी Meso-nanoscale indentations (50 एनएम गहराई) के साथ Meso-nanoscale indenters (50 एनएम त्रिज्या) के लिए विशिष्ट परिणाम दिखाने के आंकड़े.; . cartographs hypocotyl एपिडर्मल कोशिकाओं की सतह सेल दीवारों में microscale विषमताओं प्रकट 1 ए, 1E, और 1G आंकड़े पुष्प meristem, hypocotyl, और रूट के लिए mesoscale indentations (500 एनएम गहराई) के साथ mesoscale indenters (500 एनएम त्रिज्या) के लिए विशिष्ट परिणाम दिखाने; इंडेंट त्रिज्या इस मेसो खरोज मूल्यांकन कोशिका दीवार के व्यास से अधिक है क्योंकि ध्यान दें किअपनत सेल दीवारों का 'स्पष्ट' युवा moduli (Peaucelle एट अल. 9,17 और जानकारी के लिए Braybrook एट अल. 10 देखें). अन्त में, चित्रा 1 बी mesoscale indentations (500 एनएम गहराई) के साथ microscale indenters (2.5 माइक्रोन त्रिज्या) के लिए एक cartograph से पता चलता है; दिलचस्प है, इस प्रस्ताव पर इमेजिंग 9 किसी भी दिखाई विकास पहले कि अंग दीक्षा के दौरान ऊतक नरमी का पता चला.
अब हम पर प्रकाश डाला और संयंत्र अंगों के विकास के गुणों को मापने के लिए AFM का उपयोग करते समय आमतौर पर उठता है कि चार तकनीकी कठिनाइयों को आंशिक समाधान का प्रस्ताव. सबसे पहले, नमूने अनुचित तरीके से agarose में imbedded किया जा सकता है: agarose के साथ कवर कर रहे हैं क्षेत्रों है कि ठीक से (चित्रा 1E तीर के किनारों देखें) मापा नहीं जा सकता. इस को हल करने के कदम 1.2.6 दोहरा प्रयास करें. दूसरा, अनुचित तरीके से गिलास स्लाइड के लिए तय कर रहे हैं कि नमूनों प्रयोग के दौरान स्थानांतरित कर सकते हैं; फिर न्यायपालिका धारियों छवियों में प्रकट हेतु सेबाएँ और दाएँ आगे बढ़ाने स्कैन (चित्रा 1F) के बीच decorrelation लिए. इसके समाधान के लिए, नमूना तैयार दोहरा ध्यान से प्रयास करें. तीसरा, नमूना की ऊंचाई के z-श्रृंखला एक निश्चित सीमा से नीचे होना चाहिए. वहाँ खड़ी z-दिशा में नमूना की औसत ऊंचाई पर कोई प्रतिबंध नहीं है, लेकिन z-दिशा (उच्चतम और निम्नतम अंक के बीच की दूरी) में ऊंचाई में सीमा कम से कम 15 माइक्रोन होना चाहिए, अन्यथा स्कैन खत्म कर दिया जायेगा (देखें चित्रा 1 बी; सेटिंग्स) AFM NanoWizard में हैं. स्कैन के दौरान, AFM स्वतः नमूना की ऊंचाई मैच के लिए ब्रैकट की ऊंचाई को समायोजित कर देता है, लेकिन एक भी स्कैन में ब्रैकट की ऊंचाई केवल 15 माइक्रोन से भिन्न हो सकते हैं, इसका कारण यह है. इसके समाधान के लिए, चित्रा 1E जी में प्रदर्शन के रूप में, 100 माइक्रोन से Z दूरी बढ़ जाती है जो JPK cellHesion मॉड्यूल, का उपयोग करें. चौथा, विधि सतह topographies के प्रति संवेदनशील है: नमूना सतह अधिक Oriente हैखरोज की दिशा को डी समानांतर, माप कम विश्वसनीय. चित्रा 1G-एच में प्रस्तुत जड़ नमूने में, सेल दीवारों रूट की लंबी अक्ष के समानांतर स्कैन के ऊपर और नीचे किनारों पर दिखाई नहीं देते हैं: यहाँ जड़ सतह दूर खरोज सीधा करने के लिए किया जा रहा से है. Meristem में, इसी तरह, फूल कलियों के किनारों पर सेल दीवारों को ठीक से (चित्रा 1 ए) मापा नहीं थे. Meso-nanoscale indentations (चित्रा 1C) के लिए, फिर से इस स्थलाकृतिक प्रभाव देखा जाता है: 'कोशिकाओं किनारों को गलत ढंग से मुलायम ठीक होने के रूप में मापा जाता है, जहां दूर ब्रैकट के विमान से कोशिकाओं की अवस्था. इन स्थलाकृतिक प्रभाव के लिए खाते में सक्षम है जो डेटा विश्लेषण उपकरण भविष्य में इस विरूपण साक्ष्य को हल कर सकता है, लेकिन इस तरह के एक उपकरण अभी तक उपलब्ध नहीं है.
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Discussion
पौधों में, बदलते यांत्रिक गुणों के विकास और morphogenesis निर्देशन में एक प्रमुख भूमिका निभाते हैं. तिथि करने के लिए वहाँ पौधों की वृद्धि को नियंत्रित कि आनुवंशिक और रासायनिक नेटवर्क unraveling में काफी प्रगति कर दिया गया, लेकिन इन नेटवर्कों के लिए योगदान और यांत्रिक गुणों में परिवर्तन से प्रभावित कर रहे हैं कि कैसे हमारे ज्ञान अल्पविकसित है. इस विधि इस अंतर को भरने के लिए सक्षम होना चाहिए, और इसलिए यह संयंत्र विकास या morphogenesis के किसी भी पहलू का अध्ययन वैज्ञानिकों को मजबूत ब्याज की होनी चाहिए. अब हम चुनौतियों और सीमाओं विधि की, और भविष्य के दृष्टिकोण संक्षेप.
प्रोटोकॉल में सबसे चुनौतीपूर्ण कदम नमूना तैयार है. नमूना मजबूती से agarose के साथ कांच स्लाइड करने के लिए तय की जानी चाहिए, लेकिन इस agarose मापा जा रहे हैं कि नमूने के किसी भी क्षेत्र को कवर नहीं करना चाहिए. नाजुक सुखाने को रोकने और इतनी के रूप में ऊतकों को नुकसान को रोकने के लिए इसके अलावा, तैयारी (मिनट के भीतर) जल्दी पर्याप्त पूरा हो गया है: लोग घायल हो गए एकएन डी सूखे सेल की दीवार 18 के यांत्रिक गुणों में अपरिवर्तनीय परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व करने के लिए भविष्यवाणी कर रहे हैं. एक और चुनौतीपूर्ण कदम सही AFM सूक्ष्म खरोज सेटिंग्स का चयन करने के लिए है: वैज्ञानिक सवाल पर निर्भर करता है, ऊतक, सेलुलर, या subcellular संकल्प अलग Indenters और खरोज गहराई के साथ प्राप्त किया जा सकता है. अधिक जानकारी के लिए, 9,10 देखते हैं.
विधि कई सीमाएं हैं. सबसे पहले, विधि अंगों की सतहों पर यांत्रिक गुणों को मापने के लिए सीमित है; resected अंगों की आंतरिक क्षेत्रों को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित करने के प्रयास हमारी प्रयोगशाला में चल रहा है. दूसरा, एक उच्च चर स्थलाकृति के साथ भेदभाव ऊतकों को मापने के लिए बहुत मुश्किल हो जाता है; उदाहरण के लिए, ट्राईकोम्स पत्तों की एपिडर्मिस को AFM टिप का उपयोग ब्लॉक और उपजा, और इसी तरह, जड़ बाल जड़ एपिडर्मिस को AFM टिप का उपयोग ब्लॉक. तीसरा, विधि सबसे अच्छा लंबाई 100 माइक्रोन या ले के नमूने के लिए लागू किया जाता हैएस एस; यह 1 मिमी तक बड़े नमूनों पर इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन (चित्रा -1 और 1E में दिखाया गया है) इस समय लेने वाली अनुक्रमिक कार्टोग्राफिक माप की आवश्यकता है. अंत में, AFM उपायों कोशिका दीवार के यांत्रिक जटिलता का ही हिस्सा: सेल दीवारों विरूपण के प्रकार (संपीड़न बनाम जैसे तनाव) के आधार पर विभिन्न यांत्रिक गुणों दिखा सकता है कि जटिल जैल रहे हैं, जबकि यह compressive खरोज प्रयोगों के लिए सीमित है. सबसे पहले, संपीड़न तक सीमित इस विधि प्रक्रिया खींच एक टर्गर निकाली गई कोशिका दीवार है, जो विकास पर सूचित करने के लिए गैर या दूर करने में सक्षम हो रहा है. अभी तक meristem 9, 19 या hypocotyl (अप्रकाशित डेटा) पर हमारे अपने supersize माप को स्पष्ट युवा मापांक और विकास के माध्यम से मापा लोच के बीच एक अद्भुत सह - संबंध को दर्शाता है. हम भविष्य में, इस तकनीक के विकास के लिए इस पहेली को समझने में मदद मिलेगी.
विधि जैसा कि ऊपर बताया ही, पौधों के ऊतकों की लोचदार यांत्रिक गुणों के कुछ पहलुओं को मापा यहां प्रस्तुत किया. लेकिन जीवित ऊतकों भी viscously व्यवहार करते हैं, और संयुक्त visco और लोचदार व्यवहार वृद्धि और विकास 16,20 के लिए महत्वपूर्ण होने की भविष्यवाणी की है. अब तक अवर्णित, हम समय पर निर्भर सेकंड के दसियों से अधिक थे कि सूक्ष्म indentations AFM के लिए सेल दीवारों की प्रतिक्रियाओं मनाया - इस प्रतिक्रिया viscoelastic के रूप में होती थी. हमारे पिछले काम में हम इस viscoelastic प्रतिक्रिया 9 मूल्यांकन करने के लिए एक AFM विधि प्रस्तुत किया. एक ऊतक का एक अन्य महत्वपूर्ण विकास मध्यस्थता संपत्ति कोशिकाओं की स्थानीय टर्गर दबाव है. टर्गर दबाव मापने के लिए, हम इसी तरह की चुनौतियों का सामना: ऊतकों भर mesoscale प्रस्ताव पर उपाय है कि एक तकनीक अभी तक मौजूद नहीं है. संयंत्रों में इस्तेमाल के दबाव microprobes मेरिस्टेमेटिक कोशिकाओं के आकार (5 माइक्रोन) 12, 21 है जो कांच टिप त्रिज्या, द्वारा सीमित है, हाल ही में जब तक ऊपर, थे. एक औरअनुसंधान के बहुत आशाजनक अवसर गैर plasmolyzed ऊतक पर इस्तेमाल के लिए इस AFM विधि विकसित करने का है; हम एकल कक्ष टर्गर दबाव और ऊतकों के विकास के बीच संबंध उजागर करने के लिए, इस तरह, आशा है. 24 - इस विधि मूल रूप से अन्य उपकरणों का उपयोग कर और व्यक्तिगत कोशिकाओं 22 पर इस्तेमाल किया खरोज के माध्यम से पहले से ही विकसित AFM टर्गर माप के लिए लागू होगी.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
हम कई उपयोगी विचार विमर्श के लिए यवेस Couder को विशेष धन्यवाद देना. हम cantilevers और चर्चा की जांच के लिए अतेफ Asnacios धन्यवाद. हम महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए लिसा विलिस, इलियट Meyerowitz, और ओलिवर Hamant धन्यवाद. इस काम मानव फ्रंटियर विज्ञान कार्यक्रम अनुदान RGP0062/2005-C हिस्से में वित्त पोषित किया गया था; एजेंस Nationale डे ला Recherche'''' Growpec,'' और'' Mechastem परियोजनाओं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM | JPK | NanoWizard | All the 3-generation are able to do the work with the same preferment. |
| AFM stage | JPK | CellHesion | Required for sample with low topography (less than 11 µm between the lowest and the highest point in the area of force scanning). |
| AFM optics | JPK | Top View Optics | Very important in order to position the sample. Could be replaced by long range binoculars or a microscope. |
| Stereo microscope | Leica | M125 | Any type of stereo microscope could do. |
| 150 nm mounted cantilever | Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland | R150-NCL-10 | To measure only the cell wall at the surface of the epidermis use. |
| 1 µm mounted cantilever | Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland | SD-Sphere-NCH-S-10 | To measure the mechanics of the cell wall orthogonal to the surface of the epidermis. |
| Tipless cantilever | Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland | TL-NCH-20 | To measure the local mechanics of the tissue (2-3 cell wide) use a 5 µm mounted cantilever. We attached a 5 µm borosilicate bead to a tipless cantilever. |
| 5 µm silicon microspheres | Corpuscular | C-SIO-5 | |
| Araldite | Bartik S.A. 77170 Coubet, France | Araldite for fixing the bead to the tipless cantilever. | |
| Low melting agarose | Fisher Scientific Fair Lawn, New Jersey 07410 | BP160-100 | 34-45 °C gelation temperature |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 USA | M4125-500G | |
| 2 Stainless Steel No. 5 Tweezers | Ideal-Tek 6828 Balerna, Switzerland | 951199 |
References
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