Summary
軟膜表面はますます注目を受けているCNSにおけるユニークな前駆ゾーンです。ここで、我々の詳細を修飾エレクトロポレーション法を使用して、この前駆ゾーンの迅速な遺伝子操作のための方法。この手順は、細胞系統および細胞分化に関与するシグナル伝達経路の細胞および分子研究のために使用することができ、娘細胞の運命および特性を解明する。
Abstract
過去数年間で軟膜表面は損傷後を含め、胚周産期および成人の神経およびグリア発生時の重要性の胚ニッチとして同定されている。しかしながら、これらの遺伝的に前駆細胞集団に問い合わせ、それらの系統を追跡するための方法は、特異性またはウイルスの産生時間を消費がないため限定されていた。したがって、この領域での進歩はこの場所の調査のほんの一握りでは比較的遅れている。エレクトロポレーションは、胚の神経幹細胞の特性を研究し、より最近では生後脳におけるする十年間使用されている。ここでは、適合したエレクトロポレーション法に基づく軟膜表面前駆細胞の遺伝子操作のための、効率的で迅速な、かつ簡単な手法について説明します。軟膜表面エレクトロポレーションは、このようにこれらの細胞を研究するための時間の節約で経済的なアプローチを表す、これらの前駆細胞の容易な遺伝標識及び操作を可能にする。
Introduction
神経幹細胞および前駆細胞は、哺乳動物CNS 1、2を通して存在している。その性質や脳と脊髄の心室領域を取り巻く胚および成体胚ゾーンの特性は、広範囲過去十年間1-3に記載されています。大部分は、これは、このようなフロックス対立遺伝子または4をトレースするレトロウイルス系統の神経系の特定のCre組換えとしてますます正確な遺伝的なツールの開発になっている。しかし、1前駆地域軟膜表面前駆ゾーンは、しているのはごく最近では詳細5-7に説明され、総合的な検討を待ってさ。
脳の軟膜表面は、脳の表面と周囲の髄膜8との間のインタフェースとして定義される。後の開発、神経上皮と、中は、放射状グリアエンドフィートは、この表面9,10に接続します。モミの一部人間の脳およびニューロンの多くの有糸分裂における番目のニューロンは、この領域11において観察される。その後、胚の神経発生の間に、皮質ニューロンは、中間ゾーンおよび脳室下帯12-14におけるそれらの遊走の経路に加えて、軟膜領域を横断することが知られている。この期間中に、幹細胞は、このゾーンから培養することができる、それは神経およびグリア5の活性部位であると思われる。成体の脳において、介在ニューロンは、低酸素チャレンジ7以下の軟膜表面前駆細胞から生まれることができることが報告されている。しかし、胚および生後発育中にgenensisに彼に、この領域の寄与は、特にこの領域6を調査することの困難に一部あいまいなままである。上丘におよび大脳皮質において、表面的な（または皮質の層I）介在ニューロンは、下にある興奮性ニューロン集団の回路出力を変調するため、significを貢献するかもしれないこれらの構造の機能にantly。具体的には、レイヤ1介在ニューロンは、皮質の列15,16の表層と深層に彼らの広範な接続性与えられた大脳皮質の上位層を通してニューロンの発火を調整するために主要な位置にある。同様に、水平ニューロンは、比較的広い面積にわたって皮質および網膜繊維、プロジェクトから興奮性入力を受信し、遠隔視覚刺激17,18に応答ニューロン集団の阻害を媒介すると推測される。また、その形態は現像視覚系19におけるパターン化された波の活動に潜在的な役割を果たしてよく適している。興味深いことに、ニューロンの発達と成熟は、出生後大幅に起こります。また、この成熟過程は、神経活動によって調節されることが見出されているので、回路機能20,21上の生涯結果を伴う発達可塑性の基板である。注目すべきことに、NOプロモーターは、特にトランスジェニックこれらの細胞を標的とすることができるが記載されている。除する前駆細胞は、レトロウイルス7でターゲティングすることができるが、ウイルス産生は時間がかかり、細胞形質導入のために必要な高い力価を得るために熟練を要する。
それが神経前駆細胞4、22、23におけるシグナル伝達経路の迅速かつ効率的な遺伝的尋問を可能にするので、エレクトロポレーションは、神経発達の研究でルネサンスにつながっている。エレクトロポレーションは、一方向4脳室の周囲の増殖性前駆細胞にDNAを駆動するために、ヘッドの外部への電気パルスの送出に続いて、プラスミドDNAの注入を伴う22、23。エレクトロポレーションは、プラスミドの導入遺伝子24の発現のために細胞周期のM期を通過する細胞の通過を必要とするように見える。具体的には、それだけであることが見出されているプラスミドのエレクトロポレーションの8時間以内にM期を通過する細胞は、心室壁24の〜160ミクロン内の全ての細胞への効果的な配信にもかかわらず、導入遺伝子を発現する。これは、核透過性を引き起こす化学物質が有糸分裂後の細胞25内のプラスミドの発現を誘導することができるように、これは、エピソームプラスミドの核へのアクセスを可能に核膜破壊の必要性によるものであると推測される。もともと胚22で用い、エレクトロポレーションは、ずっと後26,27生後脳内での使用に適合した。最近では、軟膜表面前駆6の遺伝子操作で使用するためのエレクトロポレーションを適応している。また、このアプローチを使用して我々は、前駆体の二つの異なる系統がこの領域-介在ニューロンおよびアストロサイト6に明らかに存在することが示されている。このプロトコルは、尋問のためにこれらの細胞を標的とするために簡単、迅速、かつ強力な方法を詳述これらの細胞の発達を調節する機構の。
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Protocol
この手順では、ヒマラヤスギシナイ動物実験委員会の要求に従う。調べでは、前に進むための制度IACUCのコンプライアンスを確保する必要があります。すべてのツールと試薬は使用前に滅菌する必要があります。
1。ツールの作成、ソリューション、DNA混合物
- マイクロピペットプラーに100 mmの火ポリッシュホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブを挿入します。約17.5ミリメートルのピペットチップを形成するために、標準的な重み付きプルを可能にするために加熱を設定します。およそ直径100μmの開口部を作成するために、先端の先頭からの距離が約8〜9ミリメートルで鋭い外科ハサミで先端をカットします。
- ドライファストグリーンで（20μmのシリンジフィルターを利用する）フィルタリングヌクレアーゼフリー水を混合することにより、高速な緑色溶液w / vの1％株式を作る。
- トリス-EDTA（TE）緩衝液で希釈し、高度に濃縮されている精製されたエンドトキシンフリーのプラスミドDNA（ すなわち > 3μgの/μl）を、分離します。プラスミドの所望の量を追加します。混合物に、TE緩衝液で希釈し（ファストグリーン0.1重量/容量％の最終濃度にする）、1％ファストグリーン溶液の1:10の比を加える。導入遺伝子の強い発現のためのプラスミドの0.5〜2.0μgの/μLの最終濃度を使用してください。
2。動物麻酔、ピペットロード、軟膜表面プラスミドインジェクション
- 5-8分（PUP年齢/体重に依存時間）、氷上に置かれたペトリ皿に配置して1〜2日出生後のマウスに低体温麻酔を誘導する。低体温は、つま先つまむ、および/または尾レフからの移動の欠如によって確認されると、マウスが注入される準備ができている。痛みの反射が明らかである場合は、氷の上に戻って動物を配置します。低体温症、注射、エレクトロポレーション手順がそれに応じて適切な麻酔を維持するための時間に、注射手順とエレクトロポレーションは、合計未満2〜3分かかる。
- 麻酔中に、標準的なピペットを使用して、慎重にピペットplasmiの量を所望D参照のためにパラフィンワックスフィルム片の上に（0.5-2μl）を注入される混ぜる。ここでは、プラスミドミックス0.5μLの全容量が注入される。次に、マイクロインジェクターを用いて、慎重にプラスミド混合物を含むチューブ内に組み立てられたガラスキャピラリーピペットを挿入する。それは、チューブの端に触れていないことを確認することにより、破損、先端を防ぐために、余分な予防措置をとる。ゆっくりと移動ダイヤルを背面ダイヤルすることによりピペットに溶液を吸引除去する。十分なボリュームがピペットにロードされると、0ヘクトパスカルの中立位置に圧力が戻るまで前方に回します。
- （2.2）からピペットパラフィンワックス膜基準噴射近くチップを配置しても軟膜表面/髄膜空間を充填するために適切な圧力を確保し、一方を排出するマイクロインジェクタからフットペダルを使用する注射用300〜450 hPaの圧力を用いてパラフィンワックス膜上にボリューム。イジェクト量は、以前にピペットでreferencに等しくなるまでそれに応じて圧力を調整Eのボリューム。
- 先端が平衡化されており、麻酔が確認された後、仔を注入する準備ができている。
- 実験の目的は、軟膜表面前駆細胞（ 図1A）内に下方DNAのエレクトロポレーションを可能にするために頭蓋下及び軟膜表面の上方プラスミド混合物を注入することである。皮質注射のために、あまり利き手の親指と人差し指を使って子犬を押したままにします。皮質半球など上丘など他の表面的な構造は、これらの構造（ 図1B）の容易なターゲティングを可能にP0とP2との間表示されます。皮質の利き手とターゲット所望の領域（等すなわちモーター、体性感覚）を用いて、脳動脈を避けるように注意しながら、皮膚や頭蓋骨を過ぎピペットを挿入します。 （ちょうど頭蓋骨を貫通した後に、さらに抵抗性の欠如によって示されます）頭蓋骨過去先端のさらなる浸透を防ぐようにしてください。
- 血漿を注入IDソリューションマイクロインジェクタのフットペダルを使用して、組織（ 図2A）に均等に分散させることを確認してください。
注意：これは、経験的に、流体圧力による血腫を回避しながら、プラスミド送達を最大化するアプローチを決定することは非常に重要である。これは、注入の持続時間、角度、体積、および血管破壊を回避するために正確な標的部位を調整することによって行うことができる。 - 試してみて、パラフィン紙またはプラスチックパラフィンフィルム上に以前に行った注入からの試験液滴でチップを配置することによって、注射の間に乾燥するの先端を保つようにしてください。これは、チップと矛盾送達体積の目詰まりをもたらすことができる蒸発させ、結晶化DNA溶液の先端の蓄積を防止する必要がある。
3。エレクトロ
- 各パルス間に950ミリ秒間隔で、50ミリ秒続く、5パルスの135から150 Vのエレクトロポを設定します。コンダクタンスを増加させるために、及び皮膚の燃焼を防止するため、電気穿孔ゲルで3 mmのプラチナtweezertrodesをカバーしています。麻酔を確実にするために、この時点でつま先つまんで尾反射神経をチェックしてください。応答性の場合、麻酔を数分間氷上に置きます。
- 皮質（および上丘）注射のために、（ -脳室帯のエレクトロポレーションに使用され、10mmの電極7と比較して）仔の生存率を増加させるために3mmの電極（ 図2B）を使用する。注入された領域の上に電極と電極の向きが正中線（ 図2C）に45〜60°の角度であるように、目下の反対側の領域の周囲正に帯電したプローブの負に帯電したプローブを配置します。
- 曲率を占めているときの電流をトリガーするエレクトロのフットペダルを使用して、効果的に基礎と軟膜表面の細胞にDNAを対象に、PUPの年齢と体重に応じて、3〜5パルスのための場所でtweezertrodesを開催半球の。
注：負極のパルスまたは大きな電極がエレクトロポ面積を増加させるために使用することができる間に注入領域にわたって掃引することができる。 - すぐにエレクトロポレーション後、慎重に子犬からゲルをきれいし、約5分間加熱ランプの下に配置します。
- PUPは急性チアノーゼによるエレクトロポレーション後数分で、自然の赤みがかったピンクの色合いを失うことになる。それらのケージに戻す前に、自然な色と通常の移動の開始を回収するために子犬を観察します。
- 彼女が戻って巣に子犬をもたらし、それらをグルーミング始まるかどうか観察することによって、母親と再社会化を確実にする。彼女は攻撃的になった場合、必ず子犬がゲルの残党があり、子犬に臭いを転送するための寝具のいくつかと、それらをインキュベートしないようにしてください。
上丘を標的とする4。変更
ターゲティング：
- 麟蹄皮質と同じ方法で上丘CTが、対象領域がちょうど後方ラムダへとおよそ正中線（ 図3Aと図3B）の横にあることに注意してください。成功した注射で、プラスミドミックスが自然に上丘の輪郭を塗りつぶします。注射は正常に行われると、動物は、エレクトロポレーションの準備ができている。
エレクトロポレーション：
- 非常によく似た方法で、上丘の注射のために、上丘の表面的な領域（ 図3C）にDNAを駆動し、注入されたエリアと目、鼻やあごの周りに正に帯電したプローブ上には、電極の負に帯電したプローブを配置。この場合、電極の向きは正中線に対して25〜40°の角度にある。
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Representative Results
細胞-主に前駆細胞-AT軟膜表面6またはそれに近い中でのプラスミドDNAの発現の軟膜表面のエレクトロポレーションの結果。具体的には、電極の向きは、プラスミドの動きとその後の発現の方向を口述において重要である。従って、二重電極構成において、プラスミドは、負と正電極との間のほぼ直線状ベクターに向けられる。負極が注射部位の上に配置し、正極、負極に腹ですしておけば、プラスミドが軟膜表面に強制されます。これは、面に垂直な電流ベクトルを生成するように電極を配向させることが最も理想的であると仮定される。適切な電極の向きと、より小さく、より局所的に標的化電極を用いて、生存率は100％である。しかしながら、このような脳などのいくつかの地域で、ケアは、心臓を停止することができる電流の送達を避けるように注意しなければならないので、コーEエレクトロポレーション仔マウスの生存率を低下させた。新しく記載トリ電極構成または他の修飾は、例えば、心拍数28などの重要な機能に関与する構造を避けることによって、より困難領域を標的とするのを助けることができる。これは、動きや色によって明らかである彼らの自然な体温に適切な再温暖化の子犬を見ることが重要です。それらは色に戻ったときに、それらが巣に戻され得る。我々が最も頻繁に利用されたマウスのCD1株由来の母親はすぐに返された子犬の育成を開始。しかし、他の株は、攻撃的なまたは怠慢になってきて、より多くの変数を指定できます。子犬に寝具の臭いを転送するには、通常、これらの問題を防ぐことができます。怠慢または攻撃が厳しい株では、CD1株から母親に子犬を育てることは最適なソリューションです。
標識した細胞は通常、エレクトロポレーション6の後に何ヶ月も観察される。しかし、任意のELと同様にectroporation法、プラスミドDNAは、細胞分裂29に希釈する。高速サイクリング集団に見られるプラスミド希釈液（ 例えば、SVZ前駆体）と同程度の、より少ない増殖6を示唆する我々の軟膜表面集団において観察されない。しかし、我々は今、ゲノムDNA 29,30にトランスポゾンの安定な挿入を可能にすることによって完全にこの希釈の問題を軽減するために最近記載転位技術（ 例えば、piggyBac様）を使用する。代わりに、Creをリコンビナーゼを発現するプラスミドは、これらの細胞31の安定した遺伝トレースを媒介するためのCreレポーターマウスにエレクトロポレーションすることができた。
我々の初期の結果は、我々の細胞の大部分が胚で記述されたデータと一致してCNS-具体的には、そのエレクトロポレーションは、細胞周期のS 2とM相の間の増殖細胞の集合をラベル付けする、エレクトロポレーション6時の有糸分裂であることを示唆している4。しかし、さらなる調査が軟膜表面にエレクトロポレーションした細胞の同一性および系統を定義するだけでなく、化学的およびスプリアス文献4における細胞の遺伝標識の多くの例があるので決定的にそれらの増殖文字を確認するために必要とされる。また、我々は地元の注射部位血腫 - 特に皮質血管の混乱を避けるために適切な予防措置に従わないときは注意が小容量を提供するために取られているかにあると指摘している。
我々の以前の特徴付けは、細胞の少なくとも2系統を示している-アストロサイト前駆体およびニューロン前駆細胞6。星状細胞は、軟膜表面（ 図4A）に留まる傾向があり、各セルは、周辺の星状細胞の密な雲が6を処理し形成する。介在ニューロンは、主に軟膜表面に残るが、一部の細胞は上丘6のほぼすべての皮質層以深に記載されています。目ESEニューロンは限り数百ミクロン（ 図4B）のようなことができる大規模な樹状突起を呈する。私たちは、皮質6オリゴデンドロサイトや興奮性神経細胞を標識するための証拠は確認されていません。エレクトロポレーションした細胞の大多数は、EP手順皮質6に時間的に近接して有糸分裂を通過したように見える。具体的には、これより前のチミジン類似体（ 図4C-4C 3）で2時間をパルスした場合に、EGFP +細胞はDNA複製マーカーBrdUで二重標識されたエレクトロポレーション。しかし、それは我々がこれらの地域での6 pericyticおよび/ または内皮細胞標識の証拠を見ていることに注意することが重要です。
図1。のエレクトロ注射すると対象として皮質の領域を示した新生児軟膜表面（A）冠状断面の模式図。大脳皮質の層に沿って表示されたセルは、ニューロン間の前駆細胞とastrocystic前駆体を含むエレクトロポレーションした細胞の実際の観測された混合集団の一例である。 （B）は 、注射前に生後2マウスのイメージ、軟膜表面の関心、皮質（CTX）および上丘（SC）の領域を概説する。
図2。エレクトロポレーションの前に、眼とラムダの間の中間点をターゲットにした後、背側皮質の表層皮質（a）実施例インジェクションの生後エレクトロポレーション 。 （B）によって仔および関心領域、白金tweezertrodesの柔軟性多様なサイズの年齢がエレクトロポレーションのために使用することができる（3 - ミリメートル、7ミリメートル、および9 - mm）である。直径3mmの電極は、典型的には、（議論のためのテキストを参照）軟膜表面のエレクトロポレーションのために使用される。 （C）皮質のエレクトロ。目の下正プローブを配置し、tweezertrodesの配置に注意して、電流が腹側に駆動することができます。
図3。上丘は、麻酔をかけた子犬だけ頭蓋骨を超えたピペットチップの配置を手動で拘束を示し、 出生後のエレクトロポレーション（A）上丘での2日齢の子犬の注入を対象とした 。分散した細胞質を示す（B）注入上丘（SC）の領域におけるID DNA溶液。 SCのエレクトロポレーション、注射部位でのSCの背側表面に向かって、DNAを駆動するためtweezertrodes（C）の配置が。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図4。上丘は膜-タグクローバー32（緑）、TagBFP2 33核タンパク質（青色蛍光を表す、 顔備わっ制御蛍光レポータープラスミドのエレクトロポレーションの後背外側皮質〜2週間から共焦点画像スタックの最大投影を出生後のエレクトロポレーション（A）をターゲットに PS）赤eudocolored。 （B）皮質ニューロンの冠状断面、ほぼ2カ月後、エレクトロポレーション、大規模な樹状突起を表示する。スケールバーは、（B）に（A、C）が100μmと40μmのを測定します。 （CC 3）のEGFP +細胞の大部分がエレクトロポレーションの前にBrdUを2時間の単一パルスによってラベル付けされていることを実証する上丘の軟膜表面の矢状断面。
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Discussion
軟膜表面前駆細胞の正常なエレクトロポレーションのための最も重要な側面は、次のとおりです。1）軟膜表面にプラスミドミックスの標的; 2）注射部位における血腫の発生を回避すること;および3）中脳電気穿孔に関連した死亡率を回避する。
適切に標的化は、軟膜表面は軟膜表面の浸透を避けるために、頭蓋骨の測定と慎重なパンクチャリングすることによって達成される。覆っている皮膚または基礎心室もしくは脳実質に標的に不適切なのによって証明されます。そっとティッシュをこすりすると皮膚とのファストグリーン色素の1）の変位（ファストグリーンは、皮膚および結合組織中の頭蓋骨の上に局在しているIE）または2）ファストグリーン色素の消失によって脳内に、プラスミドミックスは心室および/または実質になったことを示す。プラスミドミックスの適切軟膜表面の局在は、頭蓋骨番目の下での色素の蓄積によって証明されるで穏やかに肌の変位によって妨害することはできません。それにもかかわらず、練習と器用さは、この成功を標的に必要です。血腫形成は可能性が高いプラスミド注射による血管系の破壊が原因で発生します。血餅は、組織が収集されたときにエレクトロポレーション後の数日から数週間で、注射部位で観察されるであろう。血腫を回避するために、流体注入のパルス長さを調節、および/または血管の混乱を避けるために、脳血管系の一般的なパターン、メモ等をとってください。一般的に、上丘は、凝固の影響を受けにくい。によるtweezertrodesによって送達電流に死を容易に、より局所的に送達するために電流3mmのtweezertrodesを使用し、離れて示されているように、腹側中脳（ 図2Cおよび3C）から電極を向けることによって回避される。
技術の主な欠点は、標的領域は、プラスミド溶液の広がりの大きさによって制限されることであるそして、電極の大きさ。 0.5μlのプラスミドの送達は、ほぼ3mmの領域を生成し、したがって、3mmの電極サイズに良好に整合する。どちらの指標は小さくなっている（溶液拡散面積や電極パドルエリア）エレクトロポレーションした細胞のパッチの最終的なサイズを決定します。また、細胞のサブセットのみに起因導入遺伝子発現のための24の有糸分裂の必要性にラベルが付いています。しかしながら、これは、幹細胞または前駆細胞集団および細胞分化を研究するために有利である。
軟膜表面エレクトロポレーションは、軟膜表面前駆細胞とその子孫の堅牢な遺伝子操作を可能にする方法です。この技術は、他の同等のアプローチレトロウイルス形質導入と比較して、これらの細胞を標的とする、より特異的かつより容易な手段を提供し、迅速、簡単かつ効率的である。高力価のウイルス産生は、スキル、時間の週がかかり、安全上のリスクをもたらす - 特に向汎性pseudot例にypedレトロウイルス。また、エレクトロポレーションは、それがウイルスのクローニングと生産を必要としないので、もう少し柔軟性があります。任意の真核生物発現ベクターは、ウイルス性プラスミドを含む、使用することができる。また、マキシプレップ·オピニオンプラスミドを混合し、簡単に同時エレクトロポレーションに一致させることができる。一般的には、同じようなプロモーターを持つ2つの指定されたプラスミドについて〜90から95パーセントの共発現があります。我々は唯一の皮質と上丘にこのターゲット技術を採用しているが、この方法は、CNSの最も軟膜や表面的な地域に適してなければならないことに留意すべきで現在の送達前のプラスミドDNAの局所的蓄積のためのスペースがあることを条件とする。
本来、エレクトロポレーションは、有糸分裂細胞24の形質導入を好む傾向がある。従って、成体動物のエレクトロポレーションは実行可能である必要がありますが、おそらく、多くの少数の細胞が加齢とともに減少し、増殖活性による導入遺伝子の発現にもたらすであろう。しかし、最近になってJaubodinによる詳細核膜25を permeablilizingによって核プラスミドにアクセスすることができジオール、 -らは、この領域での有糸分裂後の細胞の標的化は、トランス-シクロヘキサン、2を使用することによって可能であろう。また、エレクトロポレーションは、Cre技術やその他の改変マウスのタイプ31と非常に互換性があります。最後に、トランスポゾン技術がこの集団29、30の安定した体細胞遺伝子導入を可能にする。全体として、軟膜表面のエレクトロポレーションは、これらのユニークな前駆ドメインの遺伝子操作のための優れた柔軟なツールを表しています。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
著者らは、ヒマラヤスギシナイの再生医療研究所、ゲラン家族からサミュエルOschin総合がん研究所がん研究フォーラム賞からのサポートだけでなく、資金を承認したいと思います。記載されたプロジェクトは、研究資源、グラントUL1RR033176国立センターによって資金を供給CTSIコアバウチャーの形でサポートされ、トランスレーショナル科学、グラントUL1TR000124を進めるためのナショナルセンターで今した。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしもNIHの公式見解を示すものではありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fire Polished Borosilicate Tubing | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments Company | P-30 | |
| Fast Green FCF | Sigma Aldrich, Inc. | F7528 | |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter Instruments Company | ||
| ECM 830 Generator | Harvard Apparatus, BTX Instrument Div | 45-0052 | |
| 3-mm Platinum Tweezertrodes | Harvard Apparatus, BTX Instrument Div | 45-0487 | |
| SignaGel Electrode Gel | Cardinal Health | 70315-025 | |
| Tris-EDTA Buffer, pH 8.0 | Integrated DNA Technologies, Inc. | 11-01-02-05 | |
| Infrared Heat Lamp | VWR | 36547-009 | |
| Fine Scissors Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 |
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