Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Electroporation שטח pial ילודים

Published: May 7, 2014 doi: 10.3791/51319
* These authors contributed equally

Summary

שטח pial הוא אזור אב ייחודי במערכת העצבים המרכזית, כי הוא מקבל תשומת לב גוברת. בזאת, אנו פירוט שיטה למניפולציה גנטית מהירה של אזור זה באמצעות אב שיטת electroporation שונה. הליך זה יכול לשמש לחקירות תאיות ומולקולרית של שושלות תאים ומסלולי איתות המעורבים בהתמיינות תאים ועל מנת להבהיר את גורלו ואת המאפיינים של תאי בת.

Abstract

בשנים האחרונות שטח pial זוהה כנישה נבטי חשיבות בנוירו וgliogenesis עובריים, לידה ומבוגר, ביניהם לאחר פציעה. עם זאת, שיטות לחקירה גנטית אוכלוסיות אב אלה ומעקב אחר השושלות שלהם היו מוגבלות בשל חוסר ספציפי או זמן רב ייצור של וירוסים. לכן, התקדמות באזור זה הייתה איטי יחסית עם רק קומץ של חקירות של מיקום זה. Electroporation שמש במשך יותר מעשור כדי ללמוד מאפיינים של תאי גזע עצביים בעובר, ולאחרונה גם במוח לאחר הלידה. כאן אנו מתארים טכניקה יעילה, מהירה, ופשוט למניפולציה הגנטית של אבות שטח pial מבוססים על גישת electroporation מותאמת. electroporation שטח pial מאפשר תיוג קליל גנטי ומניפולציה של אבות אלה, ובכך מייצג גישת חיסכון בזמן וחסכוני לחקר תאים אלה.

Introduction

תאי גזע עצביים ומצויים כעת בכל 1 במערכת העצבים המרכזית של היונקים, 2. הטבע והנכסים באזורים נבטי עובריים ובוגרים המקיפים את אזורי חדרית של המוח וחוט השדרה שלהם תועדו בהרחבה בעשור האחרון 1-3. במידה רבה, זה כבר בשל פיתוח כלים גנטיים מדויקים יותר ויותר, כגון רקומבינציה Cre הספציפית במערכת עצבים של אללים floxed או שושלת רטרווירלי התחקות 4. עם זאת,-אזור הבדיקה המקיפה-יש אזור מוליד שטח pial לאחרונה תואר רק בכל פרט 5-7 ומחכה אב אחד.

שטח pial של המוח מוגדר כממשק בין פני השטח של המוח וקרומי המוח שמסביב 8. במהלך פיתוח, neuroepithelial, ומאוחר יותר, רגליים סוף גלייה רדיאלי לצרף שטח זה 9,10. חלק מהאשוחנוירונים st במוח האנושי ורבים mitoses עצבי הם נצפו באזור זה 11. מאוחר יותר, במהלך נוירוגנזה עוברית, interneurons קליפת המוח ידוע לחצות את אזור pial, בנוסף למסלולי הנדידה שלהם באזור ביניים והאזור subventricular 12-14. במהלך תקופה זו, יכול להיות מתורבת בתאי גזע מאזור זה וזה נראה אתר פעיל של נוירו וgliogenesis 5. במוח הבוגר, זה כבר דיווח כי יכול להיוולד interneurons מאבות שטח pial הבא אתגר חוסר חמצן 7. עם זאת, תרומתו של אזור זה לו לgenensis במהלך התפתחות עוברית ואחרי הלידה נשארה מעורפלת בין שאר בשל הקושי באופן ספציפי חוקר אזור זה 6. בcolliculus מעולה ובקליפת המוח, interneurons השטחי (או ששכבה בקליפת המוח) יכול לווסת את פלט המעגל של אוכלוסיות נוירון מעוררות בסיסית ובכך לתרום significantly לפונקציה של מבנים אלה. בפרט, interneurons 1 השכבה נמצא בעמדה מעולה כדי להסדיר את הירי של נוירונים בכל השכבות העליונות של קליפת המוח ניתנה הקישוריות הנרחבת שלהם לשכבות השטחיות ועמוקות של עמודות בקליפת המוח 15,16. באופן דומה, interneurons האופקי מקבל קלט מעורר מסיבי קליפת המוח ורשתית, פרויקט על פני שטח רחב יחסית, והם העריכו לתווך עיכוב של אוכלוסיות עצביות מגיבות לגירויים חזותיים מרחוק 17,18. כמו כן, המורפולוגיה שלהם היא מתאימה היטב לתפקיד פוטנציאלי בפעילות הגלים בדוגמת במערכת הראייה מתפתחת 19. מעניין לציין, כי פיתוח interneuron והתבגרות קורה במידה רבה אחרי לידה. יתר על כן, כבר נמצא בתהליך התבגרות זה להיות מוסדר על ידי פעילות עצבית ולכן מצע של פלסטיות התפתחותית עם השלכות לכל החיים על תפקוד מעגל 20,21. יש לציין, nהיזמים o מתוארים בו באופן ספציפי יכולה למקד תאים אלה transgenically. יכולים להיות ממוקדים אבות החלוקה עם רטרווירוס 7 אבל ייצור וירוס הוא זמן רב ודורש מיומנות להניב כותרות גבוהות הנדרשות לתמרת תא.

Electroporation הוביל לתחייה בחקר התפתחות הנוירולוגית שכן היא מאפשרת לחקירה גנטית מהירה ויעילה של מסלולי איתות באבות עצביים 4, 22, 23. Electroporation כולל הזרקה של ה-DNA פלסמיד, ואחריו את המסירה של פולסים חשמליים לחלק החיצוני של הראש, לנהוג unidirectionally דנ"א לתוך תאי האב מתרבים המקיפים את חדרי הלב 4, 22, 23. Electroporation מופיע לדרוש מעבר של תאים דרך שלב M של מחזור התא לביטוי של transgenes פלסמיד 24. באופן ספציפי, זה כבר נמצא כי רקתאים עוברים שלב M בתוך 8 שעות של electroporation של פלסמידים יביעו transgenes למרות המשלוח שלהם היעיל לכל התאים בתוך ~ 160 מיקרומטר של קיר חדרי 24. ישן סברה שזה נובע מצורך בפירוק מעטפת גרעין במאפשר גישה גרעינית של פלסמידים episomal, כמו כימיקלים שגורמים permeabilization הגרעיני יכולים לגרום לביטוי של פלסמידים בתאי הודעה המיטוטי 25. מועסק במקור בעובר 22, electroporation הותאם לשימוש במוח לאחר הלידה הרבה יותר מאוחר 26, 27. לאחרונה, יש לנו להתאים electroporation לשימוש במניפולציה הגנטית של אבות שטח pial 6. יתר על כן, שימוש בגישה זו שהראינו שיש כנראה שתי שושלות שונות של אבות באזור 6-איטרניורונאליים וastrocytic זה. פרוטוקול זה מפרט את דרך פשוטה, מהירה, וחזקה כדי למקד את התאים האלה לחקירהשל פיתוח ויסות מנגנונים של תאים אלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הליך זה בהתאם לדרישות Cedars-Sinai IACUC. חוקרים צריכים להבטיח עמידת IACUC מוסדית לפני שתמשיך. כל הכלים והחומרים הכימיים צריכים להיות מעוקרים לפני השימוש.

1. הכנת כלים, פתרונות, ותערובת ה-DNA

  1. הכנס צינורות זכוכית נימי ורוסיליקט המלוטש אש 100 מ"מ לחולץ micropipette. הגדר חימום כדי לאפשר משיכה משוקללת סטנדרטית כדי ליצור קצה פיפטה של ​​כ 17.5 מ"מ. חותכים טיפים במספריים כירורגית חדים במרחק כ 8-9 מ"מ מההתחלה של הקצה כדי ליצור בערך פתיחת מיקרומטר קוטר 100.
  2. הפוך מניית 1% w / v פתרון ירוק ומהיר על ידי ערבוב מים מסוננים nuclease חינם (ניצול מסנן מזרק 20-מיקרומטר) עם ירוק מהיר יבש.
  3. לבודד את ה-DNA מטוהר ללא רעלן פנימי פלסמיד שמרוכז מאוד (כלומר> 3 מיקרוגרם / μl), בדילול מלא חיץ טריס-EDTA (TE). כמויות להוסיף רצויים של פלסמידלתערובת מדוללת בTE חיץ ולהוסיף יחס 01:10 של הפתרון הירוק מהר 1% (מה שהופך את 0.1% w / v ריכוז סופי של ירוק מהיר). השתמש בריכוז סופי 0.5-2.0 מיקרוגרם / μl של פלסמיד לביטוי חזק של transgenes.

2. בעלי החיים הרדמה, טוען פיפטה, והזרקת פלסמיד שטח pial

  1. לגרום הרדמה היפותרמיה על עכברים לאחר הלידה 1-2 יום על ידי הצבת אותם בצלחת פטרי, כי הוא ממוקם על קרח למשך 5-8 דקות (זמן תלוי בגיל גור / משקל). ברגע שהיפותרמיה היא אושר על ידי חוסר התנועה מרפלקס זנב ו / או צביטת הבוהן, עכברים מוכנים להיות מוזרק. הנח חיות בחזרה על קרח אם רפלקסים כאב ניכרים. הליך ההזרקה וelectroporation לקחת פחות מ 2-3 דקות בסך הכל כל כך זמן היפותרמיה, ההזרקה, ונהלי electroporation בהתאם כדי לשמור על ההרדמה מתאימה.
  2. במהלך הרדמה, באמצעות פיפטה סטנדרטית, בזהירות פיפטה רצויה כמות plasmiד לערבב להיות מוזרקים (0.5-2 μl) על גבי חתיכת סרט שעוות פרפין להתייחסות. כאן, בהיקף כולל של 0.5 μl של תערובת פלסמיד מוזרק. בשלב הבא, באמצעות מזרק מיקרו, להוסיף בזהירות פיפטה נימי זכוכית התאסף לתוך תערובת פלסמיד צינור המכיל. לנקוט אמצעי זהירות נוספת כדי למנוע את הקצה מהשבירה על ידי ביצוע בטוח שזה לא נוגע בקצוות של הצינור. לשאוב את הפתרון לתוך פיפטה על ידי החיוג באיטיות חזרה חיוג ההעברה. ברגע שנפח מספיק כבר נטען לתוך פיפטה, חייג קדימה עד החזרי לחץ למצב הניטרלי של 0 hPa.
  3. שימוש 300-450 לחץ hPa להזרקה כדי להבטיח לחץ מתאים לאף מילוי של פני השטח / חלל קרום מוח pial, מקום הקצה סמוך הזרקת pipetted התייחסות סרט שעוות פרפין (מ2.2) ולהשתמש בדוושת הרגל מהזרקת מיקרו כדי להוציא אחד נפח על סרט שעוות פרפין. התאם את לחץ בהתאם עד הסכום נפלט שווה referenc pipetted בעברדואר בנפח.
  4. ברגע שהקצה כבר equilibrated והרדמה כבר אישרה, גורים הם מוכנים להיות מוזרקים.
  5. מטרת הניסוי היא להזריק את תערובת פלסמיד תחת הגולגולת ומעל פני השטח pial כדי לאפשר electroporation DNA כלפי מטה לתוך אבות pial פני השטח (איור 1 א). עבור זריקות קליפה, החזק את הגור מטה בעזרת האגודל ואצבע המורה של היד הדומיננטית פחות. ההמיספרות בקליפת המוח ומבנים שטחיים אחרים כגון colliculi מעולה גלויות בין P0 ו P2, המאפשרות מיקוד קליל של מבנים אלה (איור 1). שימוש באזור היד הדומיננטי והמטרה הרצויה של קליפת המוח (כלומר, מוטורי, החושית, וכו '), הכנס פיפטה עבר את העור והגולגולת לטפל כדי למנוע עורקי מוח. ודא כדי למנוע כל חדירה נוספת של הקצה האחרון הגולגולת (אשר מסומן על ידי חוסר התנגדות נוספת רק לאחר שרצעתי את הגולגולת).
  6. הזרק plasmפתרון id באמצעות דוושת הרגל של הזרקת מיקרו ולוודא שהוא מפזר באופן שווה על פני (איור 2 א) לרקמות.
    הערה: חשוב מאוד כדי לקבוע את הגישה למיקסום משלוח פלסמיד, תוך הימנעות שטף דם בשל לחץ נוזלים באופן אמפירי. ניתן לעשות זאת על ידי התאמת משך ההזרקה, את הזווית, את עוצמת הקול, ואתר היעד המדויק על מנת למנוע פגיעה בכלי הדם.
  7. הקפד לנסות ולשמור על הקצה מהתייבשות בין זריקות על ידי הצבת הקצה בטיפי בדיקה מזריקות שנעשו בעבר על נייר שעווה או פרפין סרט פלסטיק. זה נדרש כדי למנוע הצטברות קצה של פתרון ה-DNA התאדה והתגבש, אשר עלול לגרום לסתימה של הקצה וכרכי משלוח עולים בקנה אחד.

3. Electroporation

  1. הגדר את electroporator ל135-150 V במשך חמש פעימות, שנמשך 50 אלפית שני, עם 950 מרווחים אלפיות שניים בין כל דופק. על מנת להגדיל את המוליכות ולמנוע שריפה של העור, לכסות tweezertrodes פלטינה 3 מ"מ עם ג'ל electroporation. הגעה לרפלקסים צובט בוהן וזנב בשלב זה, כדי להבטיח הרדמה. אם מגיב, מניח על קרח במשך כמה דקות כדי להרדים.
  2. עבור זריקות קליפת המוח (וcolliculus מעולה), להעסיק אלקטרודה 3 מ"מ (איור 2) כדי להגדיל את הכדאיות של גורים (לעומת 7 - ואלקטרודות 10 מ"מ, המשמשים לelectroporation אזור חדרית). מניחים את חללית מטען השלילית של האלקטרודה מעל האזור המוזרק ובדיקת מטען החשמלית החיובי ברחבי האזור הנגדי מתחת לעין, כך שהנטייה היא באלקטרודה 45-60 ° זווית יחסית לקו האמצע (איור 2 ג).
  3. השתמש בדוושת הרגל של electroporator כדי לעורר נוכחית ולהחזיק tweezertrodes במקום 3-5 קטניות, תלוי בגיל גור ובמשקל, ביעילות מיקוד DNA לתאי שטח pial בסיסי כאשר חשבונאי העקמומיותשל ההמיספרות.
    הערה: הקוטב השלילי ניתן שטף את אזור ההזרקה בבין הפולסים או האלקטרודה גדול יותר יכול להיות מועסק על מנת להגדיל את שטח electroporated.
  4. מייד לאחר electroporation, לנקות בזהירות את הג'ל מגורים ולמקם אותם תחת מנורת חום למשך כ 5 דקות.
  5. גורים בחריפות יאבדו את הגוון אדמדם ורוד הטבעי שלהם בדקות לאחר electroporation בשל כיחלון. שים לב הגורים להתאוששות של צבע טבעי והחניכה של תנועה נורמלית לפני החזרתם לכלובים שלהם.
  6. ודא חיברות מחדש עם האם על ידי התבוננות אם היא מביאה את הגורים בחזרה לקן ומתחילה טיפוחם. אם היא הופכת להיות אגרסיבית, לעשות אין לי גורים בטוחים שאריות של ג'ל דגירה אותם עם חלק מהמצעים להעביר את הריח לגורים.

4. שינויים עבור מיקוד הקוליקולוס העליון

מיקוד:

  1. Inject colliculus מעולה באותו אופן כקליפה אבל שים לב שאזור היעד נמצא ממש אחורי וצדדי למבדה ובערך בקו האמצע (3A ואיורים 3 ב). עם זריקות מוצלחות, תערובת פלסמיד באופן טבעי ממלאת את קווי המתאר של colliculus מעולה. ברגע שזריקות נעשו בהצלחה, בעלי החיים מוכנים לelectroporation.

Electroporation:

  1. באופן דומה מאוד, לזריקות colliculus מעולים, למקם את חללית מטען השלילית של האלקטרודה מעל האזור המוזרק ובדיקת מטען החשמלית החיובי סביב העין, החוטם או הסנטר, נהיגה ה-DNA לתוך האזורים השטחיים של colliculus מעולה (איור 3 ג) . במקרה זה, את כיוון האלקטרודה הוא ב25-40 ° זווית יחסית לקו האמצע.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תוצאות pial משטח electroporation בביטוי של ה-DNA פלסמיד בתאים, בעיקר אבות, או בסמוך לפני שטח pial 6. באופן ספציפי יותר, את הכיוון של אלקטרודות הוא קריטי במכתיב את כיוון התנועה וביטוי פלסמיד שלאחר מכן. כך, בתצורות אלקטרודה כפולה, פלסמיד מופנה בערך וקטור ישר בין האלקטרודה השלילית וחיובית. לכן, אם הקוטב השלילי ממוקם מעל אתר ההזרקה והקוטב החיובי הוא הגחון לקוטב השלילי, פלסמיד ייאלץ לתוך שטח pial. הנחה הוא שמכוון את האלקטרודות לייצר וקטורים הנוכחיים בניצב לפני השטח יהיה אידיאלי ביותר. עם אורינטצית אלקטרודה מתאימה ושימוש באלקטרודות קטנות יותר, יותר ממוקדים focally, הישרדות היא 100%. עם זאת, באזורים מסוימים, כגון המוח התיכון, טיפול יש לנקוט כדי להימנע ממשלוח הנוכחי שעשויה לעצור את הלב, ובכך קאוסדואר מופחת כדאיות של גורי עכבר electroporated. תצורות תלת אלקטרודה שזה עתה תיארו או שינויים אחרים עשויות לסייע במיקוד לאזורים קשים יותר על ידי הימנעות מבנים מעורבים בתפקודים חיוניים, כגון קצב לב 28. חשוב לראות את הגורים לנכונים התחממות מחדש לטמפרטורה הטבעית שלהם בגוף, שהוא לכאורה על ידי תנועה וצבע. כשהם חוזרים לצבע, הם יכולים להיות ממוקמים בקן. אמהות מזן CD1 של עכברים שאנחנו בתדירות הגבוהה ביותר להעסיק באופן מיידי להתחיל לטפח את הגורים חזרו. עם זאת, זנים אחרים יכולים להיות משתנים יותר, הופכים תוקפני או הזנחה. העברת הריח של המצעים לגורים בדרך כלל מונעת את הבעיות הללו. בזנים שבו הזנחה או תוקפנות חמורות, טיפוח גורים לאמהות מזן CD1 הוא הפתרון הטוב ביותר.

תאים שכותרתו בדרך כלל הם נצפו חודשים רבים לאחר electroporation 6. עם זאת, כמו בכל אלשיטת ectroporation, פלסמיד דנ"א מדלל עם חלוקת תא 29. אותה מידת דילול פלסמיד ראה באוכלוסיות מהר רכיבה על אופניים (למשל אבות SVZ) לא נצפתה באוכלוסיית שטח pial שלנו, מה שמרמז פחות ריבוי 6. עם זאת, עכשיו אנחנו מעסיקים טכנולוגיות לאחרונה תיארו טרנספוזיציה (למשל piggyBac) כדי למתן בעיה הדילול זה לגמרי על ידי מתן אפשרות להכנסה יציבה של transposons לתוך הדנ"א הגנומי 29, 30. לחלופין, פלסמידים recombinase-להביע Cre יכולים להיות electroporated לעכברים כתב Cre לתווך התחקות גנטית יציבה של תאים אלה ביום 31.

התוצאות הראשוניות שלנו הראו כי רוב התאים שלנו הם mitotic בזמן electroporation 6, עולה בקנה אחד עם הנתונים שתוארו בCNS-במיוחד העוברי, electroporation כי תוויות קבוצה של תאים מתרבים בין S ושלבי M של מחזור התא 24. עם זאת, יש צורך בחקירה נוספת כדי להגדיר את הזהות ושושלות של תאי electroporated בשטח pial כמו גם לברר בודאות את דמות השגשוג שלהם כמו שיש הרבה דוגמא כימית מזויפים וסימון גנטי של תאים בספרות 4. יתר על כן, שציינו באתר הזרקה מקומי שטף דם, במיוחד בקליפת המוח, כאשר הטיפול לא נלקח כדי לספק כמויות קטנות, או כאשר אמצעי זהירות מתאימה על מנת למנוע פגיעה בכלי הדם אינו אחריו.

האפיון הקודם שלנו מצביע על לפחות שתי שושלות של תאים - מבשרי astrocytic ואבות interneuron 6. האסטרוציטים נוטים להישאר ב( איור 4 א) שטח pial וכל תא יוצר ענן סמיך של astrocytic ההיקפי מעבד 6. Interneurons בעיקר להישאר בשטח pial אך ניתן למצוא כמה תאים כמעט בכל שכבות בקליפת המוח או עמוקות יותר בcolliculus מעולה 6. הנוירונים ESE תערוכת דנדריטים נרחבים, שיכול להיות עוד כמה מאה מיקרונים (איור 4). אנחנו לא נצפו עדויות לתיוג של oligodendrocytes או נוירונים בקליפת המוח מעוררים 6. רוב תאי electroporated נראה שעבר מיטוזה בסמיכות זמן קרובה לקליפת הליך EP 6. באופן ספציפי, electroporated EGFP + תאים הם כפול שכותרתו עם BrdU סמן שכפול הדנ"א כאשר פעמו 2 שעות מוקדמים עם אנלוגי זה תימידין (איורים 4C-4C 3). עם זאת, חשוב לציין כי שראינו עדות לתיוג תא pericytic ו / או אנדותל באזורים אלו 6.

איור 1
איור 1. Electroporation שלשטח pial בילוד () סכמטי סעיף עטרה מראה את האזור של קליפת המוח שהוא ממוקד על זריקה. תאים מוצגים לאורך השכבות של קליפת המוח הם דוגמאות לאוכלוסיות בפועל נצפות מעורבות של תאי electroporated, כוללים אבות איטרניורונאליים ומבשרי astrocystic. (ב) תמונה של יום 2 בעכבר לאחר לידה לפני הזריקה, המתווה את האזורים של עניין שטח pial, קליפת המוח (CTX) וcolliculus מעולה (SC).

איור 2
איור 2. Electroporation אחרי הלידה של השטחית קליפת המוח () הזרקת דוגמא לקליפת המוח הגבי לאחר מיקוד נקודת האמצע בין העין למבדה, לפני electroporation. (ב) בהתאםגיל גורים והאזור של עניין, בגדלים מגוונים גמישות של tweezertrodes פלטינה יכול לשמש לelectroporation (3 מ"מ, 7 מ"מ, 9 מ"מ). אלקטרודות בקוטר 3 מ"מ משמשות בדרך כלל עבור electroporation שטח pial (ראה טקסט לדיון). (C) Electroporation של קליפת המוח. שים לב למיקום של tweezertrodes, הצבת החללית החיובית מתחת לעין, מאפשר נוכחית להיות מונע לצד הגחון.

איור 3
איור 3. Colliculus מעולה ממוקד electroporation לאחר הלידה הזרקה של גור 2 בן היום בcolliculus מעולה (), המציג את האיפוק הידני של הגור הרדים ואת המיקום של קצה פיפטה ממש מעבר לגולגולת. (ב) הזרקה מראה plasm התפזרפתרון ה-DNA מזהה באזור של colliculus מעולה (SC). (ג) מיקום tweezertrodes electroporation של SC, נהיגה DNA לעבר פני השטח הגבי של SC באזור הזריקה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. Colliculus מעולה ממוקד electroporation לאחר לידה () En פנים, הקרנה המרבית של תמונת confocal ערימות מdorsolateral קליפה ~ 2 שבועות לאחר electroporation של פלסמידים כתב ניאון שליטה להביע תלתן 32 (ירוק) ו33 חלבון גרעיני TagBFP2 (הקרינה כחולה מתויג קרום pseudocolored אדום). (ב) סעיף עטרה של interneuron קליפת המוח כשני חודשים לאחר electroporation, בו מוצגות דנדריטים נרחבים. ברים סולם למדוד ב( A, C) 100 מיקרומטר ו40 מיקרומטר ב( ב '). (CC 3) סעיף sagittal של שטח pial של colliculus מעולה הוכחת כי רוב EGFP + תאים מסומנים על ידי דופק יחיד של BrdU 2 שעות לפני electroporation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ההיבט הקריטי ביותר עבור electroporation המוצלח של אבות שטח pial הוא: 1) מיקוד של תערובת פלסמיד אל פני השטח pial; 2) הימנעות מהדור של שטפי דם באזור ההזרקה; ו 3) הימנעות התמותה קשורה עם electroporation המוח התיכון.

כראוי מיקוד שטח pial מושגת על ידי ניקוב מדוד וזהיר של הגולגולת, כדי למנוע חדירה של שטח pial. לא נכון מיקוד לעור שמעליה או חדר בסיסי או parenchyma המוח יהיה שמעיד: 1) עקירה של צבע ירוק המהיר עם העור על לשפשף בעדינות את הרקמה (כלומר ירוק המהיר הוא מקומי מעל הגולגולת בעור ורקמות חיבור) או 2) על ידי היעלמותו של הצבע הירוק במהירות למוח, מה שמעיד כי תמהיל פלסמיד נעלם לתוך החדר ו / או parenchyma. לוקליזציה שטח pial הנכונה של תמהיל פלסמיד תהיה מעידה הצטברות צבע מתחת לגולגולת הבאינו יכול להיות מופרע על ידי עקירת עור עדינה. יחד עם זאת, תרגול ומיומנות נדרש למיקוד המוצלח הזה. היווצרות שטף דם נגרמת ככל הנראה על ידי הפרעה של כלי הדם על ידי הזרקת פלסמיד. קרישי דם יקויימו באתר של הזרקה בימים ובשבועות הבאים electroporation כאשר הרקמה נאסף. כדי למנוע שטפי דם, להתאים את אורך הפולס של הזרקת הנוזל ו / או לרשום את התבנית הכללית של כלי דם במוח על מנת למנוע פגיעה ספינה. באופן כללי, colliculus מעולה הוא פחות רגיש לקרישה. מוות כתוצאה מזרם חשמלי מועבר על ידי tweezertrodes הוא להימנע בקלות על ידי שימוש 3 tweezertrodes מ"מ כדי לספק יותר focally הנוכחי ועל ידי הפניית ממוח תיכון הגחון כפי שמודגם (2C דמויות ו3C) אלקטרודות.

חסרון עיקרי של השיטה הוא שהאזור הממוקד הוא מוגבל על ידי הגודל של התפשטות פתרון פלסמידואת הגודל של האלקטרודות. מסירה של 0.5 μl של פלסמיד יוצרת שטח של כ 3 מ"מ, ולכן הוא גם בהתאמה לגודל אלקטרודה 3 מ"מ. לפי המידה קטנה יותר (אזור פתרון התפשטות או אזור ההנעה האלקטרודה) יכתיב את הגודל הסופי של התיקון של תאי electroporated. כמו כן, רק קבוצת משנה של תאים שכותרתו בשל הצורך במיטוזה לביטוי transgene 24. עם זאת, זה יתרון ללימוד גזע או אוכלוסיות אב והתמיינות תאים.

electroporation שטח pial הוא שיטה המאפשרת מניפולציה הגנטית החזקה של אבות שטח pial וצאצאיהם. טכניקה זו היא מהירה, פשוט, ויעילה, המספקת אמצעים יותר ספציפיים וקלים יותר של מיקוד תאים אלה בהשוואה לתמרת הגישה רטרווירלי רק אחרת דומה. ייצור נגיפי כייל גבוה דורש מיומנות, שבועות של זמן, ומהווה סכנה בטיחותית - במיוחד במקרה של pseudot pantropicרטרווירוס yped. יתר על כן, electroporation הוא קצת יותר גמיש כפי שהוא אינו דורש שיבוט וייצור נגיפיים. כל וקטור ביטוי אוקריוטים יכול להיות מועסק, כולל פלסמידים נגיפיים. יתר על כן, יכולים להיות מעורב פלסמידים maxiprep-ed ומתאים לקל שיתוף electroporation. בדרך כלל, יש ~ 90-95% שיתוף ביטוי לכל שני פלסמידים נתנו עם יזמים דומים. ביצוין כי בעוד שיש לנו רק מועסקים טכניקת המיקוד הזה בקליפת המוח וcolliculus מעולה, השיטה צריכה להיות נוחה למרבית אזורי pial או השטחיים של מערכת העצבים המרכזית ובלבד שיש מקום להצטברות המקומית של ה-DNA פלסמיד לפני המשלוח הנוכחי .

Electroporation על ידי הטבע נוטה לטובת התמרה של תאי mitotic 24. לפיכך, electroporation של בעלי חיים מבוגרים צריך להיות ריאלי, אבל עלול לגרום להרבה פחות תאים לבטא transgenes בשל פעילות שגשוג מופחתת עם הזדקנות. עם זאת, מפורט ככל לאחרונה על ידי Jaubodinועמיתיו, המיקוד של תאי postmitotic באזור זה יכול להיות אפשרי על ידי העסקת טרנס cyclohexane-1, 2 - דיאול, אשר מאפשר גישת פלסמיד הגרעיני על ידי permeablilizing מעטפת גרעין 25. כמו כן, electroporation הוא הרבה יותר תואם מאוד עם טכנולוגיות Cre או סוגי עכבר מהונדסים אחרים ביום 31. לבסוף, טכנולוגית transposon תאפשר לtransgenesis הגופנית היציבה של אוכלוסייה זו 29, 30. בסך הכל, electroporation שטח pial מייצג כלי יוצא מן הכלל וגמיש למניפולציה הגנטית של תחומים אב הייחודיים אלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות תמיכה מחקר סרטן מכון סרטן פורום פרס סמואל Oschin המקיף, כמו גם כספים מהמוסד לרפואת רגנרטיבית של Cedars-Sinai, ומשפחת גרן. הפרויקט המתואר נתמכה בצורה של Core שובר CTSI מומן על ידי המרכז הלאומי לחקר משאבים, גרנט UL1RR033176, והיום הוא במרכז הלאומי לקידום מדעי Translational, גרנט UL1TR000124. התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fire Polished Borosilicate Tubing World Precision Instruments, Inc. 1B100F-4
Micropipette Puller Sutter Instruments Company P-30
Fast Green FCF Sigma Aldrich, Inc. F7528
XenoWorks Digital Microinjector Sutter Instruments Company
ECM 830 Generator Harvard Apparatus, BTX Instrument Div 45-0052
3-mm Platinum Tweezertrodes Harvard Apparatus, BTX Instrument Div 45-0487
SignaGel Electrode Gel Cardinal Health 70315-025
Tris-EDTA Buffer, pH 8.0 Integrated DNA Technologies, Inc. 11-01-02-05
Infrared Heat Lamp VWR 36547-009
Fine Scissors Sharp Fine Science Tools 14060-09

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Breunig, J. J., Haydar, T. F., Rakic, P. Neural stem cells: historical perspective and future prospects. Neuron. 70 (4), 614-625 (2011).
  2. Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287 (5457), (2000).
  3. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
  4. Breunig, J. J., Arellano, J. I., Macklis, J. D., Rakic, P. Everything that glitters isn't gold: a critical review of postnatal neural precursor analyses. Cell Stem Cell. 1 (6), 612-627 (2007).
  5. Costa, M. R., Kessaris, N., Richardson, W. D., Gotz, M., Hedin-Pereira, C. The marginal zone/layer I as a novel niche for neurogenesis and gliogenesis in developing cerebral cortex. J Neurosci. 27 (42), 11376-11388 (2007).
  6. Breunig, J. J., et al. Rapid genetic targeting of pial surface neural progenitors and immature neurons by neonatal electroporation. Neural Dev. 7, (2012).
  7. Ohira, K., et al. Ischemia-induced neurogenesis of neocortical layer 1 progenitor cells. Nat Neurosci. 13 (2), 173-179 (2010).
  8. Bystron, I., Blakemore, C., Rakic, P. Development of the human cerebral cortex: Boulder Committee revisited. Nat Rev Neurosci. 9 (2), 110-122 (2008).
  9. Schmechel, D. E., Rakic, P. A Golgi study of radial glial cells in developing monkey telencephalon: morphogenesis and transformation into astrocytes. Anat Embryol (Berl. 156 (2), 115-152 (1979).
  10. Halfter, W., Dong, S., Yip, Y. P., Willem, M., Mayer, U. A critical function of the pial basement membrane in cortical histogenesis. J Neurosci. 22 (14), 6029-6040 (2002).
  11. Bystron, I., Rakic, P., Molnar, Z., Blakemore, C. The first neurons of the human cerebral cortex. Nat Neurosci. 9 (7), 880-886 (2006).
  12. Tanaka, D. H., Maekawa, K., Yanagawa, Y., Obata, K., Murakami, F. Multidirectional and multizonal tangential migration of GABAergic interneurons in the developing cerebral cortex. Development. 133 (11), 2167-2176 (2006).
  13. Ang Jr, E. S., Haydar, T. F., Gluncic, V., Rakic, P. Four-dimensional migratory coordinates of GABAergic interneurons in the developing mouse cortex. J Neurosci. 23 (13), 5805-5815 (2003).
  14. Tamamaki, N., Fujimori, K. E., Takauji, R. Origin and route of tangentially migrating neurons in the developing neocortical intermediate zone. J Neurosci. 17 (21), 8313-8323 (1997).
  15. Larkum, M. E. The yin and yang of cortical layer 1. Nat Neurosci. 16 (2), 114-115 (2013).
  16. Jiang, X., Wang, G., Lee, A. J., Stornetta, R. L., Zhu, J. J. The organization of two new cortical interneuronal circuits. Nat Neurosci. 16 (2), 210-218 (2013).
  17. Endo, T., Isa, T. Functionally different AMPA-type glutamate receptors in morphologically identified neurons in rat superficial superior colliculus. Neuroscience. 108 (1), 129-141 (2001).
  18. Schmidt, M., Ozen Boller, M., G,, Hall, W. C. Disinhibition in rat superior colliculus mediated by GABAc receptors. J Neurosci. 21 (2), 691-699 (2001).
  19. Ackman, J. B., Burbridge, T. J., Crair, M. C. Retinal waves coordinate patterned activity throughout the developing visual system. Nature. 490 (7419), 219-225 (2012).
  20. De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes. Nature. 472 (7343), 351-355 (2011).
  21. Boller, M., Schmidt, M. Postnatal maturation of GABA(A) and GABA(C) receptor function in the mammalian superior colliculus. Eur J Neurosci. 14 (8), 1185-1193 (2001).
  22. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
  23. De Vry, J., et al. In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery. Prog Neurobiol. 92 (3), 227-244 (2010).
  24. Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex. J Neurosci. 30 (20), 7028-7036 (2010).
  25. De la Rossa, A., et al. In vivo reprogramming of circuit connectivity in postmitotic neocortical neurons. Nat Neurosci. 16 (2), 193-200 (2013).
  26. Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PLoS One. 3 (4), (2008).
  27. Chesler, A. T., Le Pichon, C. E., Brann, J. H., Araneda, R. C., Zou, D. J., Firestein, S. Selective gene expression by postnatal electroporation during olfactory interneuron nurogenesis. PLoS One. 3 (1), (2008).
  28. dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nat Commun. 3, (2012).
  29. Yoshida, A., Yamaguchi, Y., Nonomura, K., Kawakami, K., Takahashi, Y., Miura, M. Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system. Genes Cells. 15 (5), 501-512 (2010).
  30. Chen, F., LoTurco, J. A method for stable transgenesis of radial glia lineage in rat neocortex by piggyBac mediated transposition. J Neurosci Methods. 207 (2), 172-180 (2012).
  31. Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A. Neonatal subventricular zone electroporation. J Vis Exp. , (2013).
  32. Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nat Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).
  33. Subach, O. M., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Verkhusha, V. V. An enhanced monomeric blue fluorescent protein with the high chemical stability of the chromophore. PLoS One. 6 (12), (2011).

Tags

Neuroscience גיליון 87 ביולוגיה התפתחותית מכרסם מיפוי גורל איתור יילודים שושלת מניפולציה גנטית ה-DNA פלסמיד piggyBac Tol2 transposon TCHD electroporation
Electroporation שטח pial ילודים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Levy, R., Molina, J., Danielpour,More

Levy, R., Molina, J., Danielpour, M., Breunig, J. J. Neonatal Pial Surface Electroporation. J. Vis. Exp. (87), e51319, doi:10.3791/51319 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter