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Neuroscience

नवजात pial सतह Electroporation

Published: May 7, 2014 doi: 10.3791/51319
* These authors contributed equally

Summary

pial सतह बढ़ती ध्यान दिया जा रहा है कि सीएनएस में एक अद्वितीय पूर्वज क्षेत्र है. इस के साथ साथ, विस्तार एक संशोधित electroporation पद्धति का उपयोग करके इस पूर्वज क्षेत्र का तेजी से आनुवंशिक हेरफेर के लिए एक विधि हम. यह प्रक्रिया सेल प्रजातियों और सेल भेदभाव में शामिल संकेत दे रास्ते के सेलुलर और आणविक जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और बेटी की कोशिकाओं के भाग्य और गुणों को स्पष्ट करने के लिए.

Abstract

पिछले कई वर्षों से pial सतह की चोट के बाद सहित, भ्रूण प्रसवकालीन और वयस्क न्यूरो और gliogenesis दौरान महत्व की एक कीटाणु जगह के रूप में पहचान की गई है. हालांकि, आनुवंशिक रूप से इन पूर्वज आबादी से पूछताछ और उनके वंश पर नज़र रखने के लिए तरीके विशिष्टता या समय वायरस का उत्पादन खपत की कमी के कारण सीमित कर दिया गया था. इस प्रकार, इस क्षेत्र में प्रगति इस स्थान की जांच की केवल एक मुट्ठी के साथ अपेक्षाकृत धीमी रही है. Electroporation भ्रूण में तंत्रिका स्टेम सेल गुणों का अध्ययन करने के लिए एक दशक से अधिक के लिए इस्तेमाल किया, और अधिक हाल ही में प्रसव के बाद मस्तिष्क में किया गया है. यहाँ हम एक अनुकूलित electroporation के दृष्टिकोण पर आधारित pial सतह progenitors के आनुवंशिक हेरफेर के लिए एक कुशल, तेजी से, और सरल तकनीक का वर्णन. Pial सतह electroporation इस प्रकार इन कोशिकाओं के अध्ययन के लिए एक समय की बचत और आर्थिक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व, इन progenitors के सतही आनुवंशिक लेबलिंग और हेरफेर के लिए अनुमति देता है.

Introduction

तंत्रिका स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं स्तनधारी सीएनएस 1, 2 भर में मौजूद हैं. उनके स्वभाव और मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के निलय क्षेत्रों के आसपास के भ्रूण और वयस्क कीटाणु क्षेत्रों में गुण बड़े पैमाने पर पिछले एक दशक से 1-3 में दर्ज किया गया है. बड़े भाग में, इस वजह से इस तरह के floxed alleles या 4 अनुरेखण रेट्रोवायरल वंश के तंत्रिका तंत्र विशिष्ट Cre पुनर्संयोजन के रूप में तेजी से सटीक आनुवंशिक उपकरण, के विकास के लिए किया गया है. हालांकि, एक पूर्वज क्षेत्र pial सतह पूर्वज ही हाल ही में किसी भी विस्तार से 5-7 में वर्णित किया गया क्षेत्र है और इंतजार कर रहा है व्यापक परीक्षा.

मस्तिष्क की pial सतह मस्तिष्क की सतह और आसपास के तानिका 8 के बीच इंटरफेस के रूप में परिभाषित किया गया है. बाद में विकास, neuroepithelial और, के दौरान, रेडियल glial अंत पैरों इस सतह 9,10 के लिए देते हैं. एफआईआर के कुछमानव मस्तिष्क और कई neuronal mitoses में सेंट न्यूरॉन्स इस क्षेत्र में 11 में मनाया जाता है. बाद में, भ्रूण neurogenesis के दौरान, cortical interneurons मध्यवर्ती क्षेत्र और subventricular क्षेत्र 12-14 में उनके प्रवासी मार्गों के अलावा, pial क्षेत्र पार करने के लिए जाना जाता है. इस अवधि के दौरान स्टेम कोशिकाओं को इस क्षेत्र से संवर्धित किया जा सकता है और यह न्यूरो और gliogenesis 5 के एक सक्रिय साइट प्रतीत होता है. वयस्क दिमाग में, यह interneurons hypoxic चुनौती 7 निम्नलिखित pial सतह progenitors से पैदा हो सकता है कि सूचना मिली है. हालांकि, भ्रूण और प्रसव के बाद विकास के दौरान Genensis करने के लिए अपने को इस क्षेत्र के योगदान की वजह से विशेष रूप से इस क्षेत्र में 6 की जांच की कठिनाई की वजह से भाग में अस्पष्ट बनी हुई है. बेहतर colliculus में और प्रमस्तिष्क प्रांतस्था में, सतही (या प्रांतस्था में परत मैं) interneurons अंतर्निहित उत्तेजक न्यूरॉन आबादी के सर्किट उत्पादन मिलाना और इस तरह signific योगदान कर सकते हैंइन संरचनाओं के कार्य करने के लिए antly. विशेष रूप से, परत 1 interneurons cortical कॉलम 15,16 के सतही और गहरी परतों को उनके व्यापक कनेक्टिविटी दी सेरेब्रल कॉर्टेक्स की ऊपरी परत भर में न्यूरॉन्स की फायरिंग को विनियमित करने के लिए प्रधानमंत्री की स्थिति में हैं. इसी तरह, क्षैतिज interneurons एक अपेक्षाकृत व्यापक क्षेत्र पर cortical और रेटिना फाइबर, परियोजना से उत्तेजक इनपुट प्राप्त करते हैं और दूरदराज के दृश्य उत्तेजनाओं 17,18 का जवाब देने neuronal आबादी के निषेध के लिए मध्यस्थता करने के लिए अनुमान लगाया जाता है. इसके अलावा, उनकी आकृति विज्ञान विकासशील दृश्य प्रणाली 19 में नमूनों तरंग गतिविधि में एक संभावित भूमिका निभाने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है. दिलचस्प है, interneuron विकास और परिपक्वता postnatally एक बड़ी हद तक होता है. इसके अलावा, यह परिपक्वता की प्रक्रिया neuronal गतिविधि द्वारा विनियमित किया जाना पाया गया है और इसलिए सर्किट समारोह 20,21 पर आजीवन परिणामों के साथ विकास plasticity की एक सब्सट्रेट है. विशेष रूप से, nओ प्रमोटरों विशेष रूप से transgenically इन कोशिकाओं को लक्षित कर सकते हैं जो वर्णित हैं. डिवाइडिंग progenitors रेट्रोवायरस 7 के साथ लक्षित किया जा सकता लेकिन वायरस उत्पादन समय लगता है और सेल पारगमन के लिए आवश्यक उच्च titers उपज के लिए कौशल की आवश्यकता है.

यह तंत्रिका progenitors 4, 22, 23 में संकेत दे रास्ते के तेजी से और कुशल आनुवंशिक पूछताछ के लिए अनुमति देता है के रूप में electroporation सक्षम के चिकित्सकों के अध्ययन में एक पुनर्जागरण के लिए प्रेरित किया है. Electroporation unidirectionally निलय 4, 22, 23 के आसपास के proliferating progenitors में डीएनए ड्राइव करने के लिए सिर के बाहर करने के लिए बिजली के दालों के वितरण के द्वारा पीछा प्लास्मिड डीएनए इंजेक्शन,, शामिल है. Electroporation प्लाज्मिड transgenes 24 की अभिव्यक्ति के लिए सेल चक्र के एम चरण के माध्यम से कोशिकाओं के पारगमन की आवश्यकता प्रतीत होता है. विशेष रूप से, यह पाया गया है कि केवलplasmids के electroporation की 8 घंटे के भीतर एम दौर से गुजर कोशिकाओं निलय दीवार 24 ~ 160 मीटर के भीतर सभी कोशिकाओं को उनके प्रभावी वितरण के बावजूद transgenes व्यक्त करेंगे. यह परमाणु permeabilization रसायनों के कारण पद mitotic कोशिकाओं 25 में plasmids की अभिव्यक्ति को प्रेरित कर सकते हैं, क्योंकि यह episomal plasmids के परमाणु पहुँच के लिए अनुमति देने में परमाणु लिफाफा टूटने के लिए की जरूरत की वजह से है कि अनुमान लगाया है. मूल रूप से भ्रूण 22 में कार्यरत, electroporation बहुत बाद में 26, 27 प्रसव के बाद मस्तिष्क में इस्तेमाल के लिए अनुकूलित किया गया था. हाल ही में, हम pial सतह progenitors 6 की आनुवंशिक हेरफेर में उपयोग के लिए electroporation ढाल लिया है. इसके अलावा, इस दृष्टिकोण का उपयोग हम progenitors के दो अलग प्रजातियों इस क्षेत्र interneuronal और astrocytic 6 में जाहिरा तौर पर कर रहे हैं कि पता चला है. इस प्रोटोकॉल पूछताछ के लिए इन कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए एक सरल, तेजी से, और शक्तिशाली तरीका विवरणइन कोशिकाओं के तंत्र विनियमन विकास की.

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Protocol

यह प्रक्रिया देवदारों सीनै IACUC आवश्यकताओं के अनुसार है. जांचकर्ता पूर्व कार्यवाही करने के लिए संस्थागत IACUC अनुपालन सुनिश्चित करना चाहिए. सभी उपकरणों और अभिकर्मकों का उपयोग करने से पहले निष्फल होना चाहिए.

1. उपकरण तैयार करना, समाधान, और डीएनए के मिश्रण

  1. एक micropipette खींचने में 100 मिमी आग पॉलिश borosilicate ग्लास केशिका ट्यूब डालें. लगभग 17.5 मिमी की पिपेट टिप के लिए फार्म का मानक भारित खींचने के लिए अनुमति देने के लिए ताप सेट करें. मोटे तौर पर एक 100 माइक्रोन व्यास खोलने बनाने के लिए टिप की शुरुआत से एक दूरी लगभग 8-9 मिमी पर तेज शल्य कैंची के साथ सुझावों काटें.
  2. एक शेयर 1% w / ड्राई तेजी से हरे रंग के साथ (20 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर का उपयोग) फ़िल्टर्ड nuclease मुक्त पानी के मिश्रण से फास्ट ग्रीन समाधान वी बनाओ.
  3. Tris EDTA (ते) बफर में पतला अत्यधिक ध्यान केंद्रित किया है कि शुद्ध endotoxin मुक्त प्लास्मिड डीएनए (यानी> 3 माइक्रोग्राम / μl), अलग. प्लाज्मिड जोड़ें वांछित मात्रामिश्रण करने के लिए ते बफर में पतला और (डब्ल्यू / तेजी से हरे रंग की अंतिम एकाग्रता वी एक 0.1% कर) 1% फास्ट ग्रीन समाधान का एक 1:10 अनुपात जोड़ें. Transgenes की मजबूत अभिव्यक्ति के लिए प्लाज्मिड की एक 0.5-2.0 माइक्रोग्राम / μl अंतिम एकाग्रता का प्रयोग करें.

2. जानवर संज्ञाहरण, पिपेट लोड हो रहा है, और pial सतह प्लाज्मिड इंजेक्शन

  1. 5-8 मिनट (पिल्ला उम्र / वजन पर निर्भर समय) के लिए बर्फ पर रखा गया है कि एक पेट्री डिश पर उन्हें रखने के द्वारा 1-2 दिन प्रसव के बाद चूहों पर हाइपोथर्मिया संज्ञाहरण प्रेरित. हाइपोथर्मिया पैर की अंगुली बन्द रखो और / या पूंछ पलटा से आंदोलन की कमी से पुष्टि होती है, चूहों इंजेक्शन जा के लिए तैयार हैं. दर्द सजगता स्पष्ट कर रहे हैं, तो बर्फ पर जानवरों वापस जगह है. हाइपोथर्मिया, इंजेक्शन, और electroporation प्रक्रियाओं के हिसाब से उपयुक्त संज्ञाहरण बनाए रखने के लिए समय तो इंजेक्शन प्रक्रिया और electroporation कुल में कम से कम 2-3 मिनट ले.
  2. संज्ञाहरण के दौरान, एक मानक विंदुक का प्रयोग, ध्यान पिपेट plasmi की राशि वांछितडी संदर्भ के लिए पैराफिन मोम फिल्म के एक टुकड़े पर (0.5-2 μl) इंजेक्ट किया मिश्रण. इधर, प्लाज्मिड मिश्रण के 0.5 μl की कुल मात्रा इंजेक्ट किया जाता है. इसके बाद, एक सूक्ष्म सुई लगानेवाला का उपयोग कर, ध्यान से युक्त ट्यूब प्लाज्मिड मिश्रण में इकट्ठे गिलास केशिका पिपेट डालें. यह ट्यूब के किनारों स्पर्श नहीं करता है यकीन है कि बनाकर टूटने से टिप को रोकने के लिए अतिरिक्त सावधानी रखना. धीरे धीरे स्थानांतरण डायल वापस डायल करके पिपेट में समाधान aspirate. एक पर्याप्त मात्रा पिपेट में लोड किया गया है एक बार, 0 एचपीए के तटस्थ स्थान के लिए दबाव देता है जब तक आगे डायल.
  3. (2.2) से pipetted पैराफिन मोम फिल्म संदर्भ इंजेक्शन पास टिप जगह, यहां तक ​​कि pial सतह / तानिका संबंधी अंतरिक्ष के भरने के लिए उपयुक्त दबाव को सुनिश्चित करने और एक बेदखल करने के लिए सूक्ष्म सुई लगानेवाला से पैर पेडल का उपयोग करने के लिए इंजेक्शन के लिए 300-450 एचपीए दबाव का प्रयोग पैराफिन मोम फिल्म पर मात्रा. निकली राशि पहले से pipetted referenc के बराबर होती है जब तक तदनुसार दबाव को समायोजित करेंई की मात्रा.
  4. टिप equilibrated किया गया है और संज्ञाहरण की पुष्टि हो जाने के बाद पिल्ले इंजेक्शन बनने के लिए तैयार हैं.
  5. प्रयोग का उद्देश्य pial सतह progenitors (चित्रा 1 ए) में नीचे की तरफ डीएनए electroporation के लिए अनुमति देने के लिए खोपड़ी के तहत और pial सतह से ऊपर प्लाज्मिड मिश्रण इंजेक्षन है. प्रांतस्था इंजेक्शन के लिए, अंगूठे और कम प्रमुख हाथ की तर्जनी का उपयोग पिल्ला दबाए रखें. cortical गोलार्द्धों और इस तरह के बेहतर colliculi के रूप में अन्य सतही संरचनाओं इन संरचनाओं (चित्रा 1 बी) के सुगम लक्ष्यीकरण के लिए अनुमति देता है, P0 और p2 के बीच दिखाई दे रहे हैं. प्रांतस्था का प्रमुख हाथ और लक्ष्य वांछित क्षेत्र (आदि यानी मोटर, somatosensory,) का उपयोग करना, मस्तिष्क धमनियों से बचने के ख्याल रख रही त्वचा और खोपड़ी अतीत पिपेट डालें. (सिर्फ खोपड़ी छेदने के बाद आगे प्रतिरोध के अभाव ने संकेत दिया है जो) खोपड़ी पिछले टिप के किसी भी आगे प्रवेश को रोकने के लिए सुनिश्चित करें.
  6. प्लाज्म इंजेक्षनआईडी समाधान सूक्ष्म सुई लगानेवाला के पैर पेडल का उपयोग और यकीन है कि यह ऊतक (2A चित्रा) में समान रूप से disperses बनाते हैं.
    नोट: यह empirically कारण द्रव दबाव को रक्तगुल्म से परहेज करते हुए प्लाज्मिड प्रसव कि अधिकतम एक दृष्टिकोण निर्धारित करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है. इस इंजेक्शन की अवधि, कोण, मात्रा, और संवहनी व्यवधान से बचने के लिए सटीक लक्ष्य साइट का समायोजन करके किया जा सकता है.
  7. कोशिश करते हैं और मोम कागज या प्लास्टिक आयल फिल्म पर पहले किए गए इंजेक्शन से परीक्षण बूंदों में टिप रखकर इंजेक्शन के बीच में सुखाने से टिप रखना सुनिश्चित करें. इस टिप और असंगत वितरण खंडों के clogging में परिणाम कर सकते हैं जो सुखाया और crystalized डीएनए समाधान, की नोक संचय को रोकने के लिए आवश्यक है.

3. Electroporation

  1. प्रत्येक नाड़ी के बीच में 950 मिसे के अंतराल के साथ, 50 मिसे स्थायी, पाँच दालों के लिए 135-150 वी के Electroporator सेट करें. प्रवाहकत्त्व बढ़ाने के लिए औरत्वचा के जल को रोकने, electroporation जेल के साथ 3 मिमी प्लैटिनम tweezertrodes को कवर किया. संज्ञाहरण सुनिश्चित करने के लिए इस बिंदु पर पैर की अंगुली बन्द रखो और पूंछ सजगता के लिए जाँच करें. उत्तरदायी हैं, anesthetize के लिए कई मिनट के लिए बर्फ पर जगह है.
  2. प्रांतस्था (और बेहतर colliculus) इंजेक्शन के लिए, (- निलय क्षेत्र electroporation के लिए उपयोग किया जाता है और 10 मिमी इलेक्ट्रोड, 7 के साथ तुलना में) पिल्ले की व्यवहार्यता को बढ़ाने के लिए एक 3 मिमी इलेक्ट्रोड (चित्रा 2 बी) को काम पर. इलेक्ट्रोड अभिविन्यास midline (चित्रा -2) के लिए एक 45-60 डिग्री कोण रिश्तेदार पर है कि इस तरह के आंख के नीचे contralateral क्षेत्र के आसपास इंजेक्शन क्षेत्र और सकारात्मक आरोप लगाया जांच खत्म इलेक्ट्रोड का आरोप लगाया नकारात्मक जांच जगह.
  3. वक्रता के लिए लेखांकन जब वर्तमान ट्रिगर करने के लिए electroporator के पैर पेडल का प्रयोग और प्रभावी रूप से अंतर्निहित pial सतह कोशिकाओं में डीएनए को लक्षित, पिल्ला उम्र और वजन के आधार पर, 3-5 दालों के लिए जगह में tweezertrodes पकड़गोलार्द्धों के.
    नोट: नकारात्मक ध्रुव दालों या एक बड़ा इलेक्ट्रोड electroporated क्षेत्र में वृद्धि करने के लिए नियोजित किया जा सकता है के बीच में इंजेक्शन क्षेत्र के ऊपर बह जा सकता है.
  4. तुरंत electroporation के बाद, ध्यान से पिल्ले से जेल को साफ और लगभग 5 मिनट के लिए एक गर्मी दीपक के तहत उन्हें जगह है.
  5. पिल्ले तीव्रता से नीलिमा की वजह से electroporation के बाद मिनटों में उनके प्राकृतिक लाल, गुलाबी रंग खो देंगे. उनके पिंजरों में उन्हें लौटने से पहले प्राकृतिक रंग और सामान्य आंदोलन की दीक्षा की वसूली के लिए पिल्ले को ध्यान से देखें.
  6. वह वापस घोंसला करने के पिल्ले लाता है और उन्हें संवारने शुरू होता है कि क्या देख कर मां के साथ फिर से समाजीकरण सुनिश्चित करें. वह आक्रामक हो जाता है, तो सुनिश्चित करें पिल्ले जेल के अवशेष है और पिल्ले के लिए गंध स्थानांतरित करने के लिए बिस्तर से कुछ के साथ उन्हें सेते नहीं करते हैं.

4. सुपीरियर Colliculi लक्ष्य निर्धारण के लिए संशोधन

लक्ष्य निर्धारण:

  1. Injeसीटी बेहतर प्रांतस्था के रूप में एक ही फैशन में colliculus लेकिन लक्ष्य क्षेत्र अभी पीछे और लैम्ब्डा के लिए पार्श्व और मोटे तौर पर midline पर झूठ ध्यान दें कि (आंकड़े 3 ए और 3 बी). सफल इंजेक्शन के साथ, प्लाज्मिड मिश्रण स्वाभाविक रूप से बेहतर colliculus की आकृति भरता है. इंजेक्शन सफलतापूर्वक लाए जाने के बाद, जानवरों electroporation के लिए तैयार हैं.

Electroporation:

  1. एक बहुत ही इसी तरह फैशन में, बेहतर colliculus इंजेक्शन के लिए, बेहतर colliculus की सतही क्षेत्रों (चित्रा -3 सी) में डीएनए ड्राइविंग, इंजेक्शन क्षेत्र और आंख, थूथन या ठोड़ी के आसपास सकारात्मक आरोप लगाया जांच खत्म इलेक्ट्रोड का आरोप लगाया नकारात्मक जांच जगह . इस मामले में, इलेक्ट्रोड अभिविन्यास midline के लिए एक 25-40 डिग्री कोण रिश्तेदार पर है.

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Representative Results

कोशिकाओं ज्यादातर progenitors-पर या pial सतह 6 के पास में प्लास्मिड डीएनए की अभिव्यक्ति में pial सतह electroporation परिणाम. अधिक विशेष रूप से, इलेक्ट्रोड के उन्मुखीकरण प्लाज्मिड आंदोलन और बाद में अभिव्यक्ति की दिशा हुक्म में महत्वपूर्ण है. इस प्रकार, दोहरी इलेक्ट्रोड विन्यास में, प्लाज्मिड नकारात्मक और सकारात्मक इलेक्ट्रोड के बीच मोटे तौर पर एक सीधे वेक्टर में निर्देश दिया है. नकारात्मक ध्रुव इंजेक्शन स्थल पर रखा और सकारात्मक ध्रुव नकारात्मक पोल से उदर है, इसलिए, प्लाज्मिड pial सतह के लिए मजबूर हो जाएगा. यह सतह को सीधा वर्तमान वैक्टर निर्माण करने के लिए इलेक्ट्रोड orienting सबसे आदर्श होगा कि माना जाता है. उचित इलेक्ट्रोड अभिविन्यास और छोटे, अधिक focally लक्षित इलेक्ट्रोड के उपयोग के साथ, अस्तित्व के 100% है. हालांकि, इस तरह मध्यमस्तिष्क के रूप में कुछ क्षेत्रों में, देखभाल दिल बंद हो सकता है कि मौजूदा वितरण से बचने के लिए लिया जाना है, और इस तरह causई electroporated माउस पिल्ले की व्यवहार्यता कम कर दिया. नव वर्णित त्रिकोणीय इलेक्ट्रोड विन्यास या अन्य संशोधनों के इस तरह के हृदय की दर 28 के रूप में महत्वपूर्ण कार्यों में शामिल संरचनाओं से बचने के द्वारा और अधिक कठिन क्षेत्रों को लक्षित करने में सहायता कर सकते हैं. यह आंदोलन और रंग से स्पष्ट है जो उनके प्राकृतिक शरीर का तापमान, को फिर से वार्मिंग समुचित लिए पिल्ले को देखने के लिए महत्वपूर्ण है. वे रंग में लौटने के लिए, वे घोंसले में वापस रखा जा सकता है. हम सबसे अधिक बार है कि रोजगार चूहों की CD1 तनाव से माताओं तुरंत लौट पिल्ले पोषण शुरू करते हैं. हालांकि, अन्य उपभेदों आक्रामक या लापरवाह होता जा रहा है, और अधिक चर हो सकता है. पिल्ले के लिए बिस्तर की गंध के हस्तांतरण आम तौर पर इन मुद्दों को रोकता है. उपेक्षा या आक्रामकता गंभीर हैं जहां उपभेदों में, CD1 तनाव से माताओं को पिल्ले को बढ़ावा देने का सबसे अच्छा समाधान है.

लेबल कोशिकाओं आम तौर पर electroporation 6 के बाद कई महीनों से मनाया जाता है. हालांकि, किसी भी एल के साथ के रूप मेंectroporation विधि, प्लास्मिड डीएनए कोशिका विभाजन 29 के साथ dilutes. तेजी से साइकिल चालन आबादी (जैसे SVZ पूर्वज) में देखा प्लाज्मिड कमजोर पड़ने का एक ही डिग्री कम प्रसार 6, सुझाव हमारे pial सतह आबादी में नहीं मनाया जाता है. बहरहाल, अब हम जीनोमिक डीएनए 29, 30 में transposons के स्थिर प्रविष्टि के लिए अनुमति देकर कुल मिलाकर इस कमजोर पड़ने की समस्या को कम करने के लिए हाल ही में वर्णित स्थानांतरण टेक्नोलॉजीज (जैसे piggyBac) रोजगार. वैकल्पिक रूप से, Cre recombinase व्यक्त plasmids इन कोशिकाओं को 31 के स्थिर आनुवंशिक ट्रेसिंग मध्यस्थता Cre संवाददाता चूहों में electroporated जा सकता है.

हमारे प्रारंभिक परिणाम हमारी कोशिकाओं के बहुमत भ्रूण सीएनएस विशेष रूप में वर्णित डेटा के साथ ध्यान में रखते हुए, electroporation 6 के समय mitotic हैं कि सुझाव दिया है, कि electroporation एस और सेल चक्र 2 एम चरणों के बीच proliferating कोशिकाओं का एक सेट लेबल4. हालांकि, आगे की जांच पड़ताल pial सतह पर electroporated कोशिकाओं की पहचान और प्रजातियों को परिभाषित करने के साथ ही साहित्य 4 में नकली रासायनिक और कोशिकाओं के आनुवंशिक लेबलिंग के कई उदाहरण के रूप में वहाँ निश्चित उनके proliferative चरित्र का पता लगाने की जरूरत है. इसके अलावा, हम स्थानीय इंजेक्शन साइट रक्तगुल्म, खासकर प्रांतस्था जब देखभाल में छोटी मात्रा या जब संवहनी व्यवधान से बचने के लिए उचित सावधानियों का पालन नहीं कर रहे हैं देने के लिए नहीं लिया है का उल्लेख किया है.

Astrocytic व्यापारियों और interneuron progenitors 6 - हमारे पिछले लक्षण वर्णन कोशिकाओं के कम से कम दो प्रजातियों को इंगित करता है. Astrocytes pial सतह (चित्रा -4 ए) में रह जाते हैं और हर सेल परिधीय astrocytic के घने बादल 6 प्रक्रियाओं रूपों. Interneurons ज्यादातर pial सतह पर बने हुए हैं लेकिन कुछ कोशिकाओं बेहतर colliculus 6 में लगभग सभी cortical परतों या गहरे में पाया जा सकता है. गुप्रति घंटा न्यूरॉन्स के रूप में लंबे समय से कई सौ माइक्रोन (चित्रा 4 बी) के रूप में किया जा सकता है जो व्यापक डेन्ड्राइट, दिखा रहे हैं. हम प्रांतस्था 6 में oligodendrocytes या उत्तेजक न्यूरॉन्स की लेबलिंग के लिए सबूत नहीं मनाया है. electroporated कोशिकाओं के बहुमत ईपी प्रक्रिया प्रांतस्था 6 के करीब अस्थायी निकटता में पिंजरे का बँटवारा के माध्यम से पारित कर दिया है दिखाई देते हैं. विशेष रूप से, पहले इस thymidine एनालॉग (आंकड़े 4C-4C 3) के साथ 2 घंटा स्पंदित जब EGFP + कोशिकाओं के डीएनए प्रतिकृति मार्कर BrdU के साथ डबल लेबल हैं electroporated. हालांकि, यह हम इन क्षेत्रों में 6 pericytic और / या endothelial सेल लेबलिंग का सबूत देखा है कि नोट करना महत्वपूर्ण है.

चित्रा 1
चित्रा 1. Electroporation कीइंजेक्शन पर लक्षित है कि प्रांतस्था के क्षेत्र दिखा नवजात pial सतह (ए) राज्याभिषेक अनुभाग योजनाबद्ध. प्रांतस्था की परतों के साथ प्रदर्शित प्रकोष्ठों interneuronal progenitors और astrocystic व्यापारियों सहित electroporated कोशिकाओं की वास्तविक मनाया मिश्रित आबादी के उदाहरण हैं. (बी) pial सतह हित के क्षेत्रों रूपरेखा इंजेक्शन के लिए पहले एक प्रसव के बाद दिन 2 माउस, की छवि, प्रांतस्था (CTX) और बेहतर colliculus (अनुसूचित जाति).

चित्रा 2
चित्रा 2. सतही प्रांतस्था पूर्व electroporation के लिए आंख और लैम्ब्डा के बीच मध्य, लक्षित करने के बाद पृष्ठीय प्रांतस्था के (ए) उदाहरण इंजेक्शन के प्रसव के बाद electroporation. (बी) के आधार परपिल्ले और ब्याज के क्षेत्र, प्लैटिनम tweezertrodes के लचीलेपन विभिन्न आकारों की उम्र electroporation के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (3 मिमी, 7 मिमी, और 9 मिमी). 3 मिमी व्यास इलेक्ट्रोड आम तौर पर pial सतह electroporation (चर्चा के लिए पाठ देखें) के लिए उपयोग किया जाता है. प्रांतस्था (सी) में electroporation. उदर पक्ष के लिए प्रेरित किया जा करने के लिए वर्तमान की अनुमति, आंख के नीचे सकारात्मक जांच रखकर, tweezertrodes की नियुक्ति नोट.

चित्रा 3
चित्रा 3. बेहतर colliculus anesthetized पिल्ला और सिर्फ खोपड़ी परे पिपेट टिप की नियुक्ति का मार्गदर्शन संयम दिखा, प्रसव के बाद electroporation (ए) बेहतर colliculus में एक 2 दिन पुराने पिल्ला इंजेक्शन को निशाना बनाया. (बी) छितरी प्लाज्म दिखा इंजेक्शनबेहतर colliculus (एससी) के क्षेत्र में आईडी डीएनए समाधान. अनुसूचित जाति की electroporation, इंजेक्शन स्थल पर अनुसूचित जाति के पृष्ठीय सतह की ओर डीएनए ड्राइविंग के लिए tweezertrodes (सी) प्लेसमेंट. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
चित्रा 4. बेहतर colliculus चेहरा एन प्रसव के बाद electroporation (ए) को निशाना बनाया, confocal छवि का अधिकतम प्रक्षेपण ~ 2 सप्ताह व्यक्त नियंत्रण फ्लोरोसेंट संवाददाता plasmids के electroporation के बाद dorsolateral प्रांतस्था से ढेर झिल्ली टैग क्लोवर 32 (हरा) और TagBFP2 33 परमाणु प्रोटीन (नीली प्रतिदीप्ति पुनश्च) लाल eudocolored. एक cortical interneuron मोटे तौर पर दो महीने के बाद electroporation की (बी) के राज्याभिषेक अनुभाग, व्यापक डेन्ड्राइट प्रदर्शित. स्केल सलाखों (बी) में 100 (ए, सी) में माइक्रोन और 40 माइक्रोन उपाय. (सीसी 3) EGFP + कोशिकाओं के बहुमत से पहले electroporation के लिए BrdU 2 घंटा की एक नाड़ी द्वारा चिह्नित कर रहे हैं कि प्रदर्शन बेहतर colliculus की pial सतह के बाण के समान अनुभाग.

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Discussion

pial सतह progenitors के सफल electroporation के लिए सबसे महत्वपूर्ण पहलू हैं: 1) pial सतह को प्लाज्मिड मिश्रण का लक्ष्य; 2) इंजेक्शन स्थल पर रक्तगुल्म की पीढ़ी से परहेज; और 3) मध्यमस्तिष्क electroporation के साथ जुड़े मृत्यु से बचने.

उचित रूप से pial सतह को लक्षित pial सतह की पहुंच से बचने के लिए खोपड़ी की मापी और सावधान puncturing द्वारा पूरा किया है. धीरे ऊतक (यानी तेजी से हरे रंग की त्वचा और संयोजी ऊतक में खोपड़ी के ऊपर ही सीमित नहीं है) मलाई पर त्वचा के साथ तेजी से हरे रंग की 1) विस्थापन: overlying त्वचा या अंतर्निहित निलय या मस्तिष्क पैरेन्काइमा को लक्षित कर अनुचित इसका सबूत है किया जाएगा या 2) प्लाज्मिड मिश्रण वेंट्रिकल और / या पैरेन्काइमा में चला गया है यह दर्शाता है कि मस्तिष्क में तेजी से हरे रंग के लापता होने से. प्लाज्मिड मिश्रण का उचित pial सतह स्थानीयकरण खोपड़ी वें तहत डाई संचय करके इसका सबूत दिया जाएगापर कोमल त्वचा विस्थापन से परेशान नहीं किया जा सकता. फिर भी, अभ्यास और कौशल इस सफल लक्ष्यीकरण के लिए आवश्यक है. रक्तगुल्म गठन की संभावना प्लाज्मिड इंजेक्शन द्वारा वाहिका संरचना के विघटन के कारण होता है. रक्त के थक्के ऊतक एकत्र किया जाता है जब electroporation के बाद के दिनों और हफ्तों में इंजेक्शन के स्थल पर मनाया जाएगा. रक्तगुल्म से बचने के लिए, तरल पदार्थ इंजेक्शन की नाड़ी की लंबाई को समायोजित करने और / या पोत विघटन से बचने के लिए मस्तिष्क vasculature की सामान्य परिपाटी का ध्यान रखना. सामान्य में, बेहतर colliculus थक्के को कम संभावना है. कारण tweezertrodes ने दिया बिजली चालू करने के लिए मौत को आसानी से अधिक focally वर्तमान देने के लिए 3 मिमी tweezertrodes का उपयोग करके और दूर के रूप में प्रदर्शन उदर मध्यमस्तिष्क (आंकड़े -2 सी और -3 सी) से इलेक्ट्रोड निर्देशन करने से बचा जाता है.

तकनीक का एक प्रमुख कमी लक्षित क्षेत्र प्लाज्मिड समाधान प्रसार के आकार के द्वारा सीमित हैऔर इलेक्ट्रोड का आकार. प्लाज्मिड के 0.5 μl का वितरण लगभग 3 मिमी के एक क्षेत्र उत्पन्न करता है और, इस प्रकार, 3 मिमी इलेक्ट्रोड आकार को अच्छी तरह से मिलान है. जो भी उपाय (समाधान प्रसार क्षेत्र या इलेक्ट्रोड चप्पू क्षेत्र) छोटे electroporated कोशिकाओं के पैच के अंतिम आकार हुक्म चलाना होगा है. इसके अलावा, कोशिकाओं का केवल एक उप कारण transgene अभिव्यक्ति 24 के लिए पिंजरे का बँटवारा के लिए जरूरत के लिए चिह्नित कर रहे हैं. हालांकि, यह स्टेम या पूर्वज आबादी और सेल भेदभाव के अध्ययन के लिए फायदेमंद है.

Pial सतह electroporation pial सतह progenitors और उनके वंश की मजबूत आनुवंशिक हेरफेर के लिए अनुमति देता है एक विधि है. इस तकनीक को केवल अन्य तुलनीय दृष्टिकोण रेट्रोवायरल पारगमन के साथ तुलना में जब इन कोशिकाओं को निशाना बनाने का एक और अधिक विशिष्ट और आसान साधन उपलब्ध कराने, तेजी से सरल और कुशल है. उच्च टिटर वायरल उत्पादन समय के कौशल, सप्ताह लगते हैं, और सुरक्षा जोखिम बना हुआ है - विशेष रूप से pantropic pseudot के मामले मेंyped रेट्रोवायरस. यह वायरल क्लोनिंग और उत्पादन की आवश्यकता नहीं है के रूप में इसके अलावा, electroporation कुछ अधिक लचीला है. कोई यूकेरियोटिक अभिव्यक्ति वेक्टर वायरल plasmids सहित नियोजित किया जा सकता. इसके अलावा, maxiprep एड plasmids मिलाया और सह electroporation आसान के लिए मिलान किया जा सकता है. आमतौर पर, इसी तरह के प्रमोटरों के साथ किसी भी दिए गए दो plasmids के लिए एक ~ 90-95% सह अभिव्यक्ति है. हम केवल प्रांतस्था और बेहतर colliculus में इस लक्ष्यीकरण तकनीक कार्यरत है, जबकि विधि सीएनएस के सबसे pial या सतही क्षेत्रों के लिए उत्तरदायी होना चाहिए कि ध्यान दिया जाना चाहिए में प्लास्मिड डीएनए के स्थानीय संचय के लिए अंतरिक्ष पूर्व मौजूदा वितरण करने के लिए नहीं है, बशर्ते कि .

प्रकृति द्वारा electroporation mitotic कोशिकाओं 24 के पारगमन के पक्ष में जाता है. इस प्रकार, वयस्क जानवरों की electroporation संभव होना चाहिए, लेकिन संभावना बहुत कम कोशिकाओं की उम्र बढ़ने के साथ कम proliferative गतिविधि के कारण transgenes व्यक्त नतीजा होगा. हालांकि, के रूप में हाल ही में Jaubodin द्वारा विस्तृतपरमाणु लिफाफा 25 permeablilizing द्वारा परमाणु प्लाज्मिड पहुँच के लिए अनुमति देता है जो diol, - और उनके सहयोगियों ने इस क्षेत्र में postmitotic कोशिकाओं को निशाना पार cyclohexane -1, 2 को रोजगार से संभव हो सकता है. इसके अलावा, electroporation Cre प्रौद्योगिकियों या अन्य इंजीनियर माउस प्रकार 31 के साथ बहुत ज्यादा संगत है. अंत में, transposon प्रौद्योगिकी इस आबादी में 29, 30 के स्थिर दैहिक transgenesis के लिए अनुमति देगा. कुल मिलाकर, pial सतह electroporation इन अद्वितीय पूर्वज डोमेन की आनुवंशिक हेरफेर के लिए एक उत्कृष्ट और लचीला उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

लेखकों देवदारों सीनै के पुनर्योजी चिकित्सा संस्थान, और गुएरिन परिवार से शमूएल Oschin व्यापक कैंसर संस्थान कैंसर रिसर्च फोरम पुरस्कार से समर्थन के साथ ही धन स्वीकार करना चाहते हैं. वर्णित परियोजना अनुसंधान संसाधन, ग्रांट UL1RR033176 के लिए राष्ट्रीय केन्द्र द्वारा वित्त पोषित एक CTSI कोर वाउचर के रूप में समर्थन किया है, और translational विज्ञान, ग्रांट UL1TR000124 आगे बढ़ाने के लिए राष्ट्रीय केन्द्र पर अब हो गया है. सामग्री केवल लेखकों की ज़िम्मेदारी है और करता एनआईएच की आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करता है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fire Polished Borosilicate Tubing World Precision Instruments, Inc. 1B100F-4
Micropipette Puller Sutter Instruments Company P-30
Fast Green FCF Sigma Aldrich, Inc. F7528
XenoWorks Digital Microinjector Sutter Instruments Company
ECM 830 Generator Harvard Apparatus, BTX Instrument Div 45-0052
3-mm Platinum Tweezertrodes Harvard Apparatus, BTX Instrument Div 45-0487
SignaGel Electrode Gel Cardinal Health 70315-025
Tris-EDTA Buffer, pH 8.0 Integrated DNA Technologies, Inc. 11-01-02-05
Infrared Heat Lamp VWR 36547-009
Fine Scissors Sharp Fine Science Tools 14060-09

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Levy, R., Molina, J., Danielpour, M., Breunig, J. J. Neonatal Pial Surface Electroporation. J. Vis. Exp. (87), e51319, doi:10.3791/51319 (2014).

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