Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Neonatal Pial Surface Elektroporering

Published: May 7, 2014 doi: 10.3791/51319
* These authors contributed equally

Summary

Den pial ytan är en unik stamfader zon i CNS som får allt större uppmärksamhet. Häri vi detalj en metod för snabb genetisk manipulering av denna progenitor zonen med användning av en modifierad elektroporeringsmetoden. Detta förfarande kan användas för cellulära och molekylära undersökningar av cell linjer och signaleringsvägar involverade i cell-differentiering och för att belysa vad som händer och egenskaperna av dotterceller.

Abstract

Under de senaste åren pial ytan har identifierats som en germinal nisch av betydelse under foster, perinatal och vuxen neuro-och gliogenesis, även efter skada. Men metoder för genetiskt förhöra dessa progenitorceller populationer och spåra deras härstamningar hade begränsats på grund av brist på specificitet eller tidskrävande produktion av virus. Således har framstegen på detta område varit relativt långsam med bara en handfull undersökningar av denna plats. Elektroporation har använts i över ett decennium för att studera neurala stamceller fastigheter i embryot, och mer nyligen i postnatal hjärnan. Här beskriver vi en effektiv, snabb och enkel teknik för genetisk manipulation av pial ytan progenitorer som baseras på ett anpassat elektroporering tillvägagångssätt. Pial yta elektroporering möjliggör facile genetisk märkning och hantering av dessa föregångare, vilket motsvarar en tidsbesparande och ekonomisk metod för att studera dessa celler.

Introduction

Neurala stamceller och stamfaderceller är närvarande i hela CNS hos däggdjur 1, 2. Deras natur och egenskaper i embryonala och vuxna embryon zoner kring kammar regioner i hjärnan och ryggmärgen har utförligt dokumenterat i det senaste decenniet 1-3. Till stor del har detta berott på utvecklingen av mer exakta genetiska verktyg, såsom nervsystemet specifik Cre rekombination av floxed alleler eller retroviral lineage tracing 4. Men en stamfader region-pial ytan gångare zon-har nyligen beskrivits i detalj 5-7 och väntar omfattande undersökning.

Pial hjärnans yta definieras som gränsytan mellan ytan av hjärnan och de omgivande hjärnhinnorna 8. Under utveckling, neuroepiteliala och, senare, radiella gliaceller slut fötter fäster denna yta 9,10. En del av granst nervceller i den mänskliga hjärnan och många neuronala mitoser observeras i denna region 11. Senare, under foster neurogenes, är kortikala intern kända för att korsa pial regionen, utöver sina flyttvägar i mellanzonen och subventrikulära zonen 12-14. Under denna period kan stamceller odlas från denna zon och det verkar vara ett aktivt ställe av neuro-och gliogenesis 5. I den vuxna hjärnan, har det rapporterats att intern kan födas från pial ytan stamceller efter hypoxisk utmaning 7. Däremot har bidrag i denna region till hans att genensis under foster-och postnatal utveckling var fortsatt oklar delvis på grund av svårigheten att specifikt utreda denna region 6. I den överlägsna colliculi och i hjärnbarken, kan ytliga (eller skikt I i cortex) intern modulera utgångskretsen underliggande excitatoriska neuronpopulationer och därmed bidra signifikantaoch art till funktionen hos dessa strukturer. Särskilt lager 1 interneuronen är i utmärkt läge för att reglera bränning av nervceller under de övre lagren av hjärnbarken med tanke på deras omfattande anslutningsmöjligheter till de ytliga och djupa lager av bark-kolonner 15,16. På ett liknande sätt, horisontella interneuronen får excitatoriska input från kortikala och retinala fibrer, projekt över ett relativt stort område och spekulerade att förmedla hämning av neuronala populationer svarar på fjärr visuella stimuli 17,18. Dessutom är deras morfologi väl lämpad för att spela en potentiell roll i den mönstrade våg aktivitet i framkallnings synsystemet 19. Interestingly interneuron utveckling och mognad sker i stor utsträckning postnatalt. Vidare har denna mognadsprocess visat att regleras av nervaktivitet och är därför ett substrat av utvecklings plasticitet med livslånga konsekvenser för kretsfunktion 20,21. Notably, no tagare beskrivs som specifikt kan rikta dessa celler transgent. Delnings progenitorer kan riktas med retrovirus 7 men virusproduktionen är tidskrävande och kräver skicklighet för att ge de höga titrar som behövs för cellöverföring.

Elektroporation har lett till en renässans i studiet av nervsystemets utveckling eftersom det möjliggör snabb och effektiv genetisk förhör av signalvägar i neurala stamceller 4, 22, 23. Elektroporation innebär injektion av plasmid-DNA, följt av avgivning av elektriska pulser till utsidan av huvudet, att ensriktat driva DNA i de prolifererande ursprungsceller som omger kamrarna 4, 22, 23. Elektroporation verkar kräva transitering av celler genom M-fasen av cellcykeln för expression av plasmid-transgener 24. Specifikt har man funnit att endastceller som passerar genom M fas inom 8 timmar av elektroporering av plasmider kommer att uttrycka transgener trots deras effektiva leveranser till alla celler i ~ 160 nm av kammarväggen 24. Det spekuleras i att detta beror på behovet av kärnhöljet uppdelning i att låta för nukleär åtkomst av de episomala plasmider, såsom kemikalier som orsakar nukleär permeabilization kan inducera expression av plasmidema i post mitotiska celler 25. Ursprungligen användes i embryot 22 ades elektroporering anpassad för användning i den postnatala hjärnan mycket senare 26, 27. Nyligen har vi anpassat elektroporation för användning i genetisk manipulation av pial yta gångare 6. Vidare, genom att använda denna metod har vi visat att det finns uppenbarligen två olika linjerna av progenitorer i denna region-interneuronal och astrocytisk 6. Detta protokoll detaljer en enkel, snabb, och kraftfullt sätt att rikta dessa celler för det undersökandeav de mekanismer som styr utvecklingen av dessa celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Detta förfarande är i enlighet med Cedars-Sinai IACUC krav. Utredarna ska säkerställa institutionell IACUC efterlevnad innan du fortsätter. Alla verktyg och reagenser skall steriliseras före användning.

1. Beredning av verktyg, lösningar, och DNA-blandning

  1. Sätt i 100-mm brand polerat borosilikatglas kapillärrör i en mikropipett avdragare. Ställ uppvärmning för att möjliggöra vanlig viktade pull att bilda pipettspetsen på ca 17,5 mm. Skär tips med vassa kirurgiska saxar på ett avstånd omkring 8-9 mm från början av spetsen för att skapa ungefär en öppning xm diameter 100.
  2. Gör ett lager 1% vikt / volym snabb grön lösning genom blandning filtrerades nukleasfritt vatten (med användning av en 20 ^ m sprutfilter) med torr snabb grönt.
  3. Isolera renade endotoxin-fri plasmid-DNA som är mycket koncentrerad (dvs.> 3 ^ g / ^ il), späddes i Tris-EDTA (TE)-buffert. Lägg önskade mängderna av plasmidtill blandningen späddes i TE-buffert och tillsätt en 01:10-förhållande av 1% snabb grön lösning (att göra en 0,1% vikt / vol slutlig koncentration av snabb grönt). Använd en 0,5-2,0 mikrogram / l slutlig koncentration av plasmid för robust uttryck av transgener.

2. Animal Anesthesia, Pipett Loading, och Pial Surface Plasmid Injection

  1. Framkalla hypotermi anestesi på 1-2 dagar efter födseln möss genom att placera dem på en petriskål som placeras på is i 5-8 minuter (tiden beror på valpen ålder / vikt). När hypotermi bekräftas av brist på rörelse från tå-klämmande och / eller svans reflex, möss är färdig att injiceras. Placera djuren tillbaka på is om smärta reflexer är uppenbara. Injektionsproceduren och elektroporation tar mindre än 2-3 min totalt så tid för hypotermi, injektion och elektroporation förfaranden i enlighet därmed för att upprätthålla lämplig anestesi.
  2. Under anestesi, med en vanlig pipett försiktigt pipett önskad mängd plasmid mix som ska injiceras (0,5-2 l) på en bit paraffin film för referens. Här är en total volym på 0,5 l av plasmid blandning injiceras. Nästa, med hjälp av en mikro injektor, omsorgsfullt sätta ihop glas kapillär pipetten i rör innehållande plasmid blandning. Ta extra försiktighetsåtgärd för att förhindra spetsen från att bryta genom att se till att den inte vidrör kanterna på röret. Aspirera lösningen i pipetten genom att långsamt ringer tillbaka överförings ratten. När en tillräcklig volym har laddats in i pipetten, slå framåt tills trycket återgår till det neutrala läget av 0 hPa.
  3. Använda 300-450 hPa påtryckningar för injektion för att säkerställa lämpligt tryck i och med fyllning av pial ytan / meningeal utrymme, placera spetsen i närheten den pipetterade paraffin film referens injektion (från 2,2) och använda fotpedalen från mikro injektor för att ta ut en volym på paraffin filmen. Justera trycket följaktligen tills mängden matas ut är lika med tidigare pipetterats reference volym.
  4. När spetsen har jämviktats och anestesi har bekräftats, pups är färdig att injiceras.
  5. Målet med experimentet är att injicera plasmid mixen under skallen och ovanför pial yta för att tillåta DNA elektroporering nedåt in i de pial ytan progenitorer (Figur 1A). För cortex injektioner, hålla valpen nedåt med tummen och pekfingret på den mindre dominanta handen. De kortikala hemisfärer och andra ytliga strukturer såsom de överlägsna colliculi är synliga mellan P0 och P2, vilket möjliggör facile målinriktning av dessa strukturer (Figur 1B). Med hjälp av den dominanta handen och mål önskad region i hjärnbarken (dvs. motor, somatosensoriska, etc.), sätt pipetten förbi huden och skallen var noga med att undvika cerebrala artärer. Se till att förhindra ytterligare penetrering av spetsen förbi skallen (vilket indikeras av avsaknaden av ytterligare motstånd precis efter piercing skallen).
  6. Injicera plasmid-lösning med fotpedalen av mikro injektorn och se till att den sprider jämnt över vävnaden (Figur 2A).
    OBS: Det är mycket viktigt att empiriskt bestämma en strategi som maximerar plasmiden leverans samtidigt undvika hematom på grund av vätsketryck. Detta kan göras genom att justera varaktigheten för injektion, vinkeln, volymen och den exakta målstället att undvika vaskulära störningar.
  7. Tänk på att försöka hålla spetsen torkar in mellan injektioner genom att placera spetsen i provdroppar från injektioner tidigare gjorda på vax papper eller plast paraffinfilmen. Detta krävs för att förhindra att spetsen ackumulering av indunstades och kristalliserades DNA-lösning, vilket kan resultera i tilltäppning av spetsen och inkonsekventa leveransvolymer.

3. Elektroporation

  1. Ställ Electroporator till 135-150 V för fem pulser, som varar 50 ms, med 950 ms mellanrum mellan varje puls. För att öka ledningsförmågan ochförhindra bränning av huden, omfattar 3-mm platina tweezertrodes med elektroporation gel. Kontrollera om tå-klämmande och svans reflexer på denna punkt för att säkerställa anestesi. Om lyhörd, placera på is i flera minuter för att söva.
  2. För cortex (och överlägsen colliculi) injektioner, anställa en 3-mm elektrod (Figur 2B) för att öka lönsamheten för valpar (jämfört med 7 - och 10-mm elektroder, vilka används för kammarzonen elektroporation). Placera negativt laddad prob för elektroden över det behandlade området och den positivt laddade sonden runt den kontralaterala området under ögat, så att elektroden orienteringen är på en 45 till 60 ° vinkel i förhållande till mittlinjen (Figur 2C).
  3. Använd fotpedalen för elektroporator att utlösa aktuell och håll tweezertrodes på plats för 3-5 pulser, beroende på valp ålder och vikt, effektivt rikta DNA i underliggande pial hudceller vid redovisning av krökningav halvkloten.
    Obs: Den negativa polen kan svepas över injektionsområdet mellan pulser eller en större elektrod kan användas för att öka den elektro området.
  4. Omedelbart efter elektroporation, försiktigt rensa bort gel från valpar och placera dem under en värmelampa i ca 5 minuter.
  5. Valpar kommer akut förlorar sin naturliga röd-rosa nyans i minuter efter elektroporation grund av cyanos. Följ valparna för återvinning av naturliga färg och inledandet av normal rörlighet innan tillbaka dem till sina burar.
  6. Se till re-socialisering med mamman genom att observera om hon tar valparna tillbaka till boet och börjar grooming dem. Om hon blir aggressiv, se till att valparna inte har rester av gel och inkubera dem med några av strö att överföra lukt till valparna.

4. Ändringar för Inriktning Superior colliculi

Inriktning:

  1. Inject superior colliculus på samma sätt som cortex men observera att målregionen ligger strax posteriora och laterala till lambda och ungefär vid mittlinjen (fig. 3A och 3B). Med lyckade injektioner, plasmiden mix fyller naturligt konturerna av den överlägsna colliculi. När injektioner har gjorts med framgång, djuren är redo för elektroporation.

Elektroporation:

  1. På ett mycket liknande sätt för överlägsen colliculus injektioner placerar negativt laddad prob för elektroden över det behandlade området och den positivt laddade sonden runt ögat, nos eller haka, körning DNA i de ytliga regionerna av överlägsen colliculi (Figur 3C) . I detta fall är den elektrod orientering vid en 25 till 40 ° vinkel i förhållande till mittlinjen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Pial ytan elektroporation resulterar i expression av plasmid-DNA i celler-mestadels progenitorer-vid eller nära den pial ytan 6. Mer specifikt är den orientering av elektrod kritisk i att diktera riktningen av plasmid rörelse och efterföljande expression. Således, i dubbla elektrodkonfigurationer är plasmiden riktad leden rakt vektor mellan den negativa och positiva elektroden. Därför, om den negativa polen placeras över injektionsstället och den positiva polen är ventrala till den negativa polen, plasmid kommer att tvingas in i pial ytan. Det antages att orientering av elektroderna för att producera nuvarande vektorer vinkelräta mot ytan som skulle vara mest idealiskt. Med lämplig elektrod orientering och användningen av mindre, mer fokalt-riktade elektroder, är överlevnad 100%. Men i vissa regioner, såsom mellanhjärnan, har man vara noga med att undvika strömleverans som kan stoppa hjärtat och sålunda cause minskad livskraft elektroporerade mus valpar. Nyligen beskrivna tri-elektrodkonfigurationer eller andra modifieringar kan hjälpa till att rikta svårare regioner genom att undvika strukturer som deltar i vitala funktioner såsom puls 28. Det är viktigt att se pups för korrekt förnyad uppvärmning till deras naturliga kroppstemperatur, vilket är uppenbart genom rörelse och färg. När de återvänder till färg, kan de placeras tillbaka i boet. Mödrar från CD1 stam av möss som vi använder oftast påbörjas omgående vårda de returnerade valpar. Däremot kan andra stammar vara mer varierande, blir aggressiv eller försumlig. Överföra lukten av sängkläder till valparna normalt förhindrar dessa frågor. I stammar där försummelse eller aggression är svår, främja valpar till mödrar från CD1-stammen är den bästa lösningen.

Märkta celler är vanligtvis observeras flera månader efter elektroporation 6. Men som med alla electroporation metod, späder plasmid-DNA med celldelning 29. Samma grad av plasmid utspädning sett i snabba cykel populationer (t.ex. SVZ progenitorceller) har inte observerats i vår pial yta befolkning, vilket tyder på mindre spridning 6. Men nu använder vi nyligen beskrivna teknikerna införlivandet (t.ex. piggyBac) för att mildra detta utspädnings problemet helt och hållet genom att möjliggöra en stabil insättning av transposoner in i den genomiska DNA 29, 30. Alternativt kunde Crerekombinas-uttryckande plasmider elektroporeras i Cre reporter möss att medla stabil genetisk spårning av dessa celler 31.

Våra initiala resultat har antytt att de flesta av våra celler är mitotiska vid elektroporation 6, i enlighet med uppgifter som beskrivs i den embryonala CNS-specifikt, märker att elektroporation en uppsättning av celler som förökar sig mellan S-och M-faser av cellcykeln 24. Det krävs dock ytterligare utredning för att fastställa identiteten och härstamningar av elektroporerade celler vid pial ytan samt att slutgiltigt fastställa deras proliferativa karaktär som det finns många exempel på falsk kemisk och genetisk märkning av celler i litteraturen 4. Dessutom har vi noterat injektions lokal plats hematom-särskilt i cortex-när vård inte vidtas för att leverera små volymer eller när lämpliga försiktighetsåtgärder för att undvika vaskulära störningar inte följs.

Vår tidigare karakterisering indikerar minst två linjer av celler - astrocytiska prekursorer och interneuron progenitorceller 6. Astrocyter tenderar att ligga i pial ytan (Figur 4A) och varje cell bildar ett tätt moln av perifer astrocytisk processer 6. Intern mestadels kvar på pial ytan men vissa celler kan hittas i nästan alla kortikala skikt eller djupare i överlägsen colliculi 6. These neuroner uppvisar omfattande dendriter, som kan vara så länge som flera hundra mikron (figur 4B). Vi har inte observerat bevis för märkning av oligodendrocyter eller excitatoriska nervceller i hjärnbarken 6. Majoriteten av elektroporerade celler verkar ha passerat genom mitos tidsmässigt nära anslutning till Europaparlamentet förfarandet cortex 6. Specifikt electroporated EGFP +-celler är dubbelmärkt med den DNA-replikation markör BrdU när pulsad 2 h före med denna tymidinanalog (Figurerna 4C-4C 3). Det är emellertid viktigt att notera att vi har sett bevis på pericytic och / eller endotelcell märkning i dessa regioner 6.

Figur 1
Figur 1. Elektroporering avneonatal pial yta (A) Coronal avsnitt schema som visar det område av kortex som är riktad vid injektion. Celler som visas längs skikten av hjärnbarken är exempel på faktiska konstaterade blandade populationer av elektroporerade celler, inklusive interneuronal progenitorer och astrocystic prekursorer. (B) Bild av en postnatal dag 2 mus före injektion, beskriver regionerna pial yta intresse, cortex (Ctx) och överlägsen colliculi (SC).

Figur 2
Figur 2. Postnatal elektroporation av ytliga cortex (A) Exempel injektion av den dorsala cortex efter inriktning mittpunkten mellan ögat och lambda, före elektroporering. (B), beroende påålder av valpar och regionen av intresse, flexibilitet varierande storlekar av platina tweezertrodes kan användas för elektroporation (3-mm, 7 mm, och 9-mm). Elektroder 3-mm diameter används vanligtvis för pial yta elektroporation (se text för diskussion). (C) Elektroporering av cortex. Notera placeringen av tweezertrodes, placera den positiva sonden under ögat, att ström kan drivas till den ventrala sidan.

Figur 3
Figur 3. Superior colliculus riktad postnatal elektroporation (A) Injektion av en 2-dagars gammal pup i superior colliculus, som visar den manuella fasthållnings av anestetiserad pup och placeringen av pipettspetsen precis utanför skallen. (B) Injektion visar spridda material av dessa arterid DNA-lösning i området för den överlägsna colliculi (SC). (C) Placering av tweezertrodes för elektroporering av SC, kör DNA mot den dorsala ytan av SC vid injektionsstället. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4
Figur 4. Överlägsen colliculus riktade postnatal elektroporation (A) En ansiktet, maximal projektion av konfokala bildstaplar från dorsolateral cortex ~ 2 veckor efter elektroporation kontroll fluorescerande reporter plasmider som uttrycker membran-märkta Clover 32 (grön) och TagBFP2 33 kärnprotein (blå fluorescens pseudocolored röd). (B) Coronal sektion av en kortikal interneuron ungefär två månader efter elektroporation, visar omfattande dendriter. Skalstrecken mäta 100 fim i (A, C) och 40 ^ m i (B). (CC 3) sagittal sektion av pial ytan av överlägsen colliculi som visar att majoriteten av EGFP +-celler är märkta med en enda puls av BrdU 2 h före elektroporering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den mest kritiska aspekten för framgångsrik elektroporation av pial yta gångare är: 1) inriktning av plasmiden mix till pial ytan; 2) undvika alstringen av hematom vid injektionsstället; och 3) att undvika dödlighet i samband med mitthjärnan elektroporation.

Lämpligt riktar pial ytan sker genom uppmätt och noggrann punktering av skallen för att undvika penetration av pial ytan. Felaktig inriktning för att den överliggande huden eller underliggande ventrikel eller hjärnparenkymet bevisas av: 1) förskjutning av snabb grönt färgämne med huden på försiktigt gnugga vävnaden (dvs den snabba gröna är lokaliserad ovanför skallen i hud och bindväv) eller 2) genom att försvinnandet av snabb grönt färgämne in i hjärnan, vilket indikerar att plasmiden mixen har gått in i ventrikeln och / eller parenkymet. Korrekt pial yta lokalisering av plasmiden mix bevisas av färgämne ackumulering under skallen: epå kan inte störas av mild hud förskjutning. Ändå krävs övning och fingerfärdighet för denna framgångsrika inriktning. Hematom är sannolikt orsakas av störningar i kärlsystemet genom plasmiden injektion. Blodproppar kommer att iakttas vid injektionsstället i dagarna och veckorna efter elektroporation när vävnaden samlas. För att undvika hematom, justerar pulslängden för bränsleinsprutning och / eller ta del av det allmänna mönstret för cerebral kärlsystemet för att undvika störningar kärl. I allmänhet är den överlägsna colliculi mindre mottaglig för koagulering. Dödsfall på grund av elektrisk ström som levereras av de tweezertrodes lätt undvikas genom att använda 3 mm tweezertrodes till mer focally leverera ström och genom att rikta elektroderna bort från den ventrala mitthjärnan som påvisas (figur 2C och 3C).

A chief brist i tekniken är att målområdet är begränsad av storleken på plasmiden lösning spridsoch storleken av elektroderna. En leverans av 0,5 pl av plasmiden alstrar ett område på ungefär 3 mm, och således är väl anpassade till den 3 mm elektrodstorleken. Oavsett vilken åtgärd som är mindre (lösning spread område eller elektrod paddla område) kommer att diktera den slutliga storleken på plåstret av elektroporerade celler. Dessutom är endast en delmängd av celler märkta på grund av behovet av mitos för transgen expression 24. Emellertid är detta fördelaktigt för att studera stam eller stamfaderpopulationer och celldifferentiering.

Pial yta elektroporation är en metod som gör det möjligt för den robusta genetisk manipulation av pial yta stamceller och deras ättlingar. Denna teknik är en snabb, enkel och effektiv, vilket ger en mer specifika och enklare sätt att rikta dessa celler jämfört med den enda andra jämförbara synsätt retroviral transduktion. Hög titer viral produktion tar skicklighet, veckors tid, och utgör säkerhetsrisker - i synnerhet när det gäller pantropiska pseudotyped retrovirus. Dessutom är elektroporation något mer flexibla som det inte kräver viral kloning och produktion. Alla eukaryot expressionsvektor kan användas, inklusive virala plasmider. Vidare kan maxiprep-ed plasmider blandas och matchas för enkel co-elektroporering. Typiskt finns det en ~ 90-95% sam-expression för de två givna plasmider med liknande promotorer. I bör noteras att medan vi bara har använt denna inriktning teknik i cortex och överlägsen colliculi bör metoden vara mottaglig för de flesta pial eller ytliga regioner i CNS under förutsättning att det finns plats för den lokala ackumulering av plasmid-DNA före aktuell leverans .

Elektroporation av naturen tenderar att gynna transduktion av mitotiska celler 24. Därför bör elektroporation av vuxna djur vara möjligt, men skulle sannolikt resultera i många färre celler som uttrycker transgener pga minskad proliferativ aktivitet med åldrandet. Såsom nyligen specificerats Jaubodinoch kollegor, kan målsökning av postmitotiska celler i detta område att vara möjligt genom att använda trans-cyklohexan-1, 2 - diol, som möjliggör nukleär plasmid åtkomst genom permeablilizing kärnhöljet 25. Dessutom är elektroporation mycket kompatibel med Cre teknik eller andra iscensatte mus typer 31. Slutligen kommer transposon teknik möjliggör stabil somatisk genmodifiering av denna befolkning 29, 30. Sammantaget representerar pial yta elektroporation en enastående och flexibelt verktyg för genetisk manipulation av dessa unika stamceller domäner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Författarna vill tacka för stöd från Samuel Oschin Comprehensive Cancer Institute Cancer Research Forum Award samt medel från Regenerative Medicine Institute of Cedars-Sinai, och Guerin Familj. Projektet beskrivs stöddes i form av en CTSI Kärna Voucher finansieras av National Center for Research Resources, Grant UL1RR033176, och är nu på National Center for Advancing Translational Vetenskaper, Grant UL1TR000124. Innehållet är ensamt ansvarig för författare och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fire Polished Borosilicate Tubing World Precision Instruments, Inc. 1B100F-4
Micropipette Puller Sutter Instruments Company P-30
Fast Green FCF Sigma Aldrich, Inc. F7528
XenoWorks Digital Microinjector Sutter Instruments Company
ECM 830 Generator Harvard Apparatus, BTX Instrument Div 45-0052
3-mm Platinum Tweezertrodes Harvard Apparatus, BTX Instrument Div 45-0487
SignaGel Electrode Gel Cardinal Health 70315-025
Tris-EDTA Buffer, pH 8.0 Integrated DNA Technologies, Inc. 11-01-02-05
Infrared Heat Lamp VWR 36547-009
Fine Scissors Sharp Fine Science Tools 14060-09

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Breunig, J. J., Haydar, T. F., Rakic, P. Neural stem cells: historical perspective and future prospects. Neuron. 70 (4), 614-625 (2011).
  2. Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287 (5457), (2000).
  3. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
  4. Breunig, J. J., Arellano, J. I., Macklis, J. D., Rakic, P. Everything that glitters isn't gold: a critical review of postnatal neural precursor analyses. Cell Stem Cell. 1 (6), 612-627 (2007).
  5. Costa, M. R., Kessaris, N., Richardson, W. D., Gotz, M., Hedin-Pereira, C. The marginal zone/layer I as a novel niche for neurogenesis and gliogenesis in developing cerebral cortex. J Neurosci. 27 (42), 11376-11388 (2007).
  6. Breunig, J. J., et al. Rapid genetic targeting of pial surface neural progenitors and immature neurons by neonatal electroporation. Neural Dev. 7, (2012).
  7. Ohira, K., et al. Ischemia-induced neurogenesis of neocortical layer 1 progenitor cells. Nat Neurosci. 13 (2), 173-179 (2010).
  8. Bystron, I., Blakemore, C., Rakic, P. Development of the human cerebral cortex: Boulder Committee revisited. Nat Rev Neurosci. 9 (2), 110-122 (2008).
  9. Schmechel, D. E., Rakic, P. A Golgi study of radial glial cells in developing monkey telencephalon: morphogenesis and transformation into astrocytes. Anat Embryol (Berl. 156 (2), 115-152 (1979).
  10. Halfter, W., Dong, S., Yip, Y. P., Willem, M., Mayer, U. A critical function of the pial basement membrane in cortical histogenesis. J Neurosci. 22 (14), 6029-6040 (2002).
  11. Bystron, I., Rakic, P., Molnar, Z., Blakemore, C. The first neurons of the human cerebral cortex. Nat Neurosci. 9 (7), 880-886 (2006).
  12. Tanaka, D. H., Maekawa, K., Yanagawa, Y., Obata, K., Murakami, F. Multidirectional and multizonal tangential migration of GABAergic interneurons in the developing cerebral cortex. Development. 133 (11), 2167-2176 (2006).
  13. Ang Jr, E. S., Haydar, T. F., Gluncic, V., Rakic, P. Four-dimensional migratory coordinates of GABAergic interneurons in the developing mouse cortex. J Neurosci. 23 (13), 5805-5815 (2003).
  14. Tamamaki, N., Fujimori, K. E., Takauji, R. Origin and route of tangentially migrating neurons in the developing neocortical intermediate zone. J Neurosci. 17 (21), 8313-8323 (1997).
  15. Larkum, M. E. The yin and yang of cortical layer 1. Nat Neurosci. 16 (2), 114-115 (2013).
  16. Jiang, X., Wang, G., Lee, A. J., Stornetta, R. L., Zhu, J. J. The organization of two new cortical interneuronal circuits. Nat Neurosci. 16 (2), 210-218 (2013).
  17. Endo, T., Isa, T. Functionally different AMPA-type glutamate receptors in morphologically identified neurons in rat superficial superior colliculus. Neuroscience. 108 (1), 129-141 (2001).
  18. Schmidt, M., Ozen Boller, M., G,, Hall, W. C. Disinhibition in rat superior colliculus mediated by GABAc receptors. J Neurosci. 21 (2), 691-699 (2001).
  19. Ackman, J. B., Burbridge, T. J., Crair, M. C. Retinal waves coordinate patterned activity throughout the developing visual system. Nature. 490 (7419), 219-225 (2012).
  20. De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes. Nature. 472 (7343), 351-355 (2011).
  21. Boller, M., Schmidt, M. Postnatal maturation of GABA(A) and GABA(C) receptor function in the mammalian superior colliculus. Eur J Neurosci. 14 (8), 1185-1193 (2001).
  22. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
  23. De Vry, J., et al. In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery. Prog Neurobiol. 92 (3), 227-244 (2010).
  24. Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex. J Neurosci. 30 (20), 7028-7036 (2010).
  25. De la Rossa, A., et al. In vivo reprogramming of circuit connectivity in postmitotic neocortical neurons. Nat Neurosci. 16 (2), 193-200 (2013).
  26. Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PLoS One. 3 (4), (2008).
  27. Chesler, A. T., Le Pichon, C. E., Brann, J. H., Araneda, R. C., Zou, D. J., Firestein, S. Selective gene expression by postnatal electroporation during olfactory interneuron nurogenesis. PLoS One. 3 (1), (2008).
  28. dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nat Commun. 3, (2012).
  29. Yoshida, A., Yamaguchi, Y., Nonomura, K., Kawakami, K., Takahashi, Y., Miura, M. Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system. Genes Cells. 15 (5), 501-512 (2010).
  30. Chen, F., LoTurco, J. A method for stable transgenesis of radial glia lineage in rat neocortex by piggyBac mediated transposition. J Neurosci Methods. 207 (2), 172-180 (2012).
  31. Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A. Neonatal subventricular zone electroporation. J Vis Exp. , (2013).
  32. Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nat Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).
  33. Subach, O. M., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Verkhusha, V. V. An enhanced monomeric blue fluorescent protein with the high chemical stability of the chromophore. PLoS One. 6 (12), (2011).

Tags

Neurovetenskap utvecklingsbiologi neonatal gnagare öde kartläggning härstamning spårning genmanipulation plasmid-DNA piggyBac tol2 transposon TCHD elektroporation
Neonatal Pial Surface Elektroporering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Levy, R., Molina, J., Danielpour,More

Levy, R., Molina, J., Danielpour, M., Breunig, J. J. Neonatal Pial Surface Electroporation. J. Vis. Exp. (87), e51319, doi:10.3791/51319 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter