Summary
De pial oppervlak is een uniek voorlopercellen zone in het CZS, die krijgt steeds meer aandacht. Hierin hebben we gedetailleerd een methode voor snelle genetische manipulatie van deze voorlopercellen zone met een aangepaste elektroporatiewerkwijze. Deze procedure kan worden gebruikt voor cellulaire en moleculaire analyses van cellijnen en signaalwegen betrokken bij celdifferentiatie en het lot en de eigenschappen van dochtercellen helderen.
Abstract
In de afgelopen jaren de pial oppervlak is geïdentificeerd als een germinal niche van belang tijdens de embryonale, perinatale en volwassen neuro-en gliogenesis, ook na een blessure. Echter, had werkwijzen voor genetisch uitlezen van deze populaties voorlopercellen en bijhouden van hun lijnen beperkt door een gebrek aan specificiteit of tijdrovend productie virussen. Zo heeft de vooruitgang in deze regio relatief traag met slechts een handvol van onderzoeken van deze plaats geweest. Elektroporatie is gebruikt voor meer dan een decennium om neurale stamcellen eigenschappen in het embryo te bestuderen, en meer recent in de postnatale hersenen. Hier beschrijven we een efficiënte, snelle en eenvoudige techniek voor de genetische manipulatie van pial oppervlak voorlopers gebaseerd op een aangepaste elektroporatie benadering. Pial oppervlak elektroporatie zorgt voor gemakkelijke genetische etikettering en manipulatie van deze voorouders, zodat aan een tijdbesparend en economische benadering voor het bestuderen van deze cellen.
Introduction
Neurale stamcellen en stamcellen aanwezig zijn in de hele zoogdier CZS 1, 2. De aard en eigenschappen van embryonale en volwassen germinal zones rond de ventriculaire gebieden van de hersenen en het ruggenmerg zijn uitgebreid gedocumenteerd in het afgelopen decennium 1-3. Voor een groot deel is dit te wijten aan de ontwikkeling van steeds precieze genetische hulpmiddelen, zoals het zenuwstelsel specifieke Cre recombinatie van floxed allelen of retrovirale lineage tracing 4. Echter, een voorouder regio-de pial oppervlak voorlopercellen zone-pas onlangs beschreven in detail 5-7 en wacht op uitgebreid onderzoek.
De pial oppervlak van de hersenen wordt gedefinieerd als de interface tussen het oppervlak van de hersenen en het omliggende hersenvliezen 8. Tijdens de ontwikkeling neuro en later radiale gliale einde voetjes aan dit oppervlak 9,10. Sommige van de sparst neuronen in de menselijke hersenen en vele neuronale mitoses waargenomen in dit gebied 11. Later, tijdens de embryonale neurogenese, corticale interneuronen waarover de pial regio doorkruisen, naast hun migratieroutes in de tussenliggende zone subventriculaire zone 12-14. Gedurende deze periode kunnen stamcellen worden gekweekt uit deze zone en het lijkt een actieve plaats van neuro-en gliogenesis 5 zijn. In de volwassen hersenen, het is gemeld dat interneuronen kunnen worden geboren uit pial oppervlak voorouders volgende hypoxische challenge 7. Echter, is de bijdrage van deze regio te zijn om genensis tijdens de embryonale en postnatale ontwikkeling duister bleef gedeeltelijk te wijten aan de moeilijkheid van specifiek onderzoek naar deze regio 6. In de colliculus superior en de cerebrale cortex kan oppervlakkige (of laag I in de cortex) interneuronen de circuituitgang onderliggende excitatoire neuron populaties moduleren en zo bijdragen significantly de functie van deze structuren. Vooral laag 1 interneuronen in uitstekende positie aan het afvuren van neuronen gehele bovenste lagen van de hersenschors gezien hun uitgebreide verbinding met de oppervlakkige en diepe lagen van de corticale kolommen 15,16 regelen. Op soortgelijke wijze, horizontale interneuronen ontvangen prikkelende input van corticale en retinale vezels, project over een relatief groot gebied en worden gespeculeerd remming van neuronale populaties reageren op externe stimuli visuele 17,18 mediëren. Ook hun morfologie is goed geschikt voor een mogelijke rol spelen in de gevormde golf activiteit in de ontwikkelende visuele systeem 19. Interessant, interneuron ontwikkeling en rijping gebeurt er met een grote mate postnataal. Verder is dit rijpingsproces gevonden door neuronale activiteit worden gereguleerd en derhalve een substraat van ontwikkelingsplasticiteit met levenslange gevolgen circuitfunctie 20,21. Met name, no promotors beschreven die specifiek kunnen richten deze cellen transgeen. Splitsen voorlopers kunnen worden gericht met retrovirus 7 maar virusproductie is tijdrovend en vereist vaardigheid om de hoge titers die nodig is voor cel transductie opleveren.
Elektroporatie heeft geleid tot een renaissance in de studie van neurologische omdat het zorgt voor een snelle en efficiënte genetische ondervraging van signaalwegen in neurale voorlopercellen 4, 22, 23. Elektroporatie omvat de injectie van plasmide-DNA, gevolgd door levering van elektrische pulsen aan de buitenkant van de kop, om het DNA in een richting rijdt de prolifererende voorlopers rond de ventrikels 4, 22, 23. Elektroporatie lijkt doorvoer van cellen vereisen door M fase van de celcyclus voor expressie van transgenen plasmide 24. Specifiek is gevonden dat slechtscellen die door M-fase binnen 8 uur van elektroporatie van plasmiden zal transgenen uiten ondanks hun effectieve levering aan alle cellen binnen ~ 160 micrometer van de ventriculaire wand 24. Er wordt gespeculeerd dat dit vanwege de noodzaak voor de afbraak van nucleaire envelop waardoor nucleaire toegang van de episomale plasmiden, chemicaliën waardoor nucleaire permeabilisatie expressie plasmiden kan induceren in plaats mitotische cellen 25. Oorspronkelijk gebruikt in het embryo 22 werd elektroporatie veel later 26, 27 aangepast voor de postnatale hersenen. Onlangs hebben we elektroporatie aangepast voor de genetische manipulatie van pial oppervlak voorlopers 6. Verder is het gebruik van deze aanpak hebben we laten zien dat er blijkbaar twee verschillende geslachten van voorouders in deze regio-Interneuronale en astrocytaire 6. Dit protocol detailleert een eenvoudige, snelle en krachtige manier om deze cellen te richten voor de ondervragingvan de mechanismen betrokken in de ontwikkeling van deze cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze procedure is in overeenstemming met het Cedars-Sinai IACUC eisen. Onderzoekers moeten institutionele IACUC naleving alvorens verder te gaan zorgen. Alle instrumenten en reagentia moeten worden gesteriliseerd.
1. Bereiding van gereedschap, oplossingen en DNA Mengsel
- Steek 100-mm brand gepolijst borosilicaatglas capillaire buizen in een micropipet trekker. Stel verwarming te laten voor standaard gewogen pull om pipettip van ongeveer 17,5 mm. Snijd tips met scherpe chirurgische schaar op een afstand ongeveer 8-9 mm vanaf het begin van de tip om ongeveer een opening van 100 micrometer diameter te creëren.
- Maak een voorraad 1% w / v snelle groene oplossing door het mengen gefilterd nuclease-vrij water (met behulp van een 20-um spuit filter) met droge snel groen.
- Isoleer gezuiverde endotoxine vrije plasmide DNA die sterk geconcentreerd (dwz> 3 ug / ul), verdund in Tris-EDTA (TE) buffer. Gewenste voegen hoeveelheden plasmideom verdund in TE-buffer en voeg een 01:10 verhouding van de 1% snelle groene oplossing (die een 0,1% w / v eindconcentratie van snel groen). Gebruik een 0,5-2,0 ug / ul eindconcentratie plasmide voor robuuste expressie van transgenen.
2. Dier Anesthesie, Pipette Laden en Pial Surface Plasmid Injectie
- Induceren onderkoeling narcose op 1-2 dag postnatale muizen door ze op een petrischaal die op ijs wordt geplaatst gedurende 5-8 minuten (tijd afhankelijk van de pup de leeftijd / gewicht). Zodra hypothermie wordt bevestigd door gebrek aan beweging uit-teen knijpen en / of staart reflex, muizen zijn klaar om te worden geïnjecteerd. Plaats dieren terug op het ijs als de pijn reflexen zijn evident. De injectie procedure en elektroporatie in minder dan 2-3 min in totaal dus tijd dat de onderkoeling, injectie en elektroporatie procedures dienovereenkomstig geschikte anesthesie te onderhouden.
- Tijdens de anesthesie, met een standaard pipet voorzichtig pipet gewenste hoeveelheid plasmid mix te worden geïnjecteerd (0,5-2 pi) op een stuk van paraffine film voor referentie. Hier wordt een totaal volume van 0,5 pl plasmide mengsel geïnjecteerd. Vervolgens wordt met behulp van een micro-injector, plaats voorzichtig gemonteerd glazen capillaire pipet in buis met plasmide mengsel. Neem extra voorzorgsmaatregelen om te voorkomen dat de tip van het breken door ervoor te zorgen dat niet de randen van de buis raken. Zuig de oplossing in de pipet door langzaam te bellen terug de overdracht wijzerplaat. Zodra een voldoende volume heeft in de pipet is geladen, bellen naar voren totdat de druk terug naar de neutrale stand van 0 hPa.
- Met behulp van 300-450 hPa druk voor injectie om adequate druk zorgen, zelfs voor het vullen van de pial oppervlak / meningeale ruimte, plaatst de punt vlakbij de pipetted paraffine film verwijzing injectie (vanaf 2.2) en gebruik het voetpedaal van de micro-injector om een uit te werpen volume op de paraffine film. Stel de druk dienovereenkomstig tot de hoeveelheid uitgestoten gelijk is aan de eerder gepipetteerd reference volume.
- Zodra de punt in evenwicht is gebracht en anesthesie is bevestigd, pups zijn klaar om te worden geïnjecteerd.
- Het doel van dit experiment is het plasmide mengsel te injecteren onder de schedel en boven het pial oppervlak om DNA elektroporatie beneden in het pial oppervlak voorlopercellen (Figuur 1A). Voor cortex injecties, houd de pup naar beneden met de duim en wijsvinger van de minder dominante hand. De corticale hemisferen en andere oppervlakkige structuren zoals de superieure colliculi zijn zichtbaar tussen P0 en P2, waardoor facile gerichtheid van deze structuren (Figuur 1B). Met behulp van de dominante hand en doel gewenste regio cortex (dwz motor, somatosensorische, enz.), plaatst pipet langs de huid en de schedel en zorg ervoor dat cerebrale slagaders te voorkomen. Zorg ervoor dat verdere penetratie van de punt langs de schedel (die wordt aangegeven door het ontbreken van extra weerstand net na het doorboren van de schedel) voorkomen.
- Injecteren plasmid oplossing met het voetpedaal van de micro-injector en zorg ervoor dat het verspreidt gelijkmatig over de weefsel (Figuur 2A).
Opmerking: Het is belangrijk empirisch bepalen van een benadering die plasmide productietijd maximaliseert terwijl het vermijden hematoom door fluïdumdruk. Dit kan door het aanpassen van de duur van de toediening, de hoek, het volume en de precieze doelplaats vasculaire verstoringen voorkomen. - Zorg ervoor om te proberen en de tip van drogen in tussen de injecties door de punt in de test druppeltjes uit injecties eerder op vetvrij papier of plastic paraffine film. Dit is nodig om tip accumulatie van afgedampt en gekristalliseerd DNA-oplossing, die kan leiden tot verstopping van de tip en inconsistente geleverde hoeveelheden voorkomen.
3. Electroporation
- Stel de Electroporatie om 135-150 V voor vijf pulsen, blijvende 50 msec, met 950 msec intervallen tussen elke puls. Om de geleiding verhogen enverbranding van de huid te voorkomen, dekken 3-mm platina tweezertrodes met elektroporatie gel. Controleer op-teen knijpen en staart reflexen op dit punt aan de anesthesie te garanderen. Als responsieve, plaats op ijs gedurende enkele minuten te verdoven.
- Voor cortex (en superior colliculus) injecties, gebruik van een 3-mm elektrode (figuur 2B) om de levensvatbaarheid van pups toenemen (ten opzichte van de 7 - en 10-mm elektroden, die worden gebruikt voor ventriculaire zone elektroporatie). Plaats de negatief geladen sonde van de elektrode via geïnjecteerde stippellijn de positief geladen sonde in de contralaterale gebied onder het oog, dat de elektrode oriëntatie op een 45-60 ° hoek ten opzichte van de middellijn (figuur 2C).
- Gebruik het voetpedaal van de electroporator op gang te brengen huidige en houd tweezertrodes in de plaats voor 3-5 pulsen, afhankelijk van de pup leeftijd en gewicht, doelgerichtere DNA in onderliggende pial huidcellen bij de verantwoording van de krommingvan de hemisferen.
Opmerking: De negatieve pool kan worden geveegd via injectiegebied tussen pulsen of grotere elektrode kan worden gebruikt om de geëlektroporeerde gebied te vergroten. - Onmiddellijk na elektroporatie, zorgvuldig schoon uit gel van pups en leg ze onder een warmtelamp voor ongeveer 5 minuten.
- Pups zullen acuut verliezen hun natuurlijke rood-roze tint in de minuten na elektroporatie vanwege cyanose. Let op de pups voor het herstel van natuurlijke kleur en de inleiding van normale beweging alvorens terug te keren ze naar hun kooien.
- Zorgen voor re-socialisatie met de moeder door het observeren of ze brengt de jongen terug naar het nest en begint verzorgen hen. Als ze agressief wordt, zorg ervoor dat pups geen resten van gel te hebben en incubeer ze in met wat van het beddengoed om de geur te dragen aan de pups.
4. Modificaties voor Gericht op de Superior colliculi
Targeting:
- Inject de superieure colliculus op dezelfde manier als de cortex maar merk op dat het doelgebied ligt juist achter en laterale lambda en ongeveer op de middellijn (Figuren 3A en 3B). Met succes injecties, het plasmide mix natuurlijk vult de contouren van de colliculus superior. Zodra injecties met succes zijn gemaakt, dieren zijn klaar voor elektroporatie.
Elektroporatie:
- In een zeer vergelijkbare wijze, voor een superieure colliculus injecties, plaatst de negatief geladen sonde van de elektrode in het geïnjecteerde gebied en de positief geladen sonde rond de ogen, snuit en kin, het besturen van DNA in de oppervlakkige gebieden van de colliculus superior (figuur 3C) . In dit geval is de elektrode oriëntatie op een 25-40 ° hoek ten opzichte van de middellijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Pial oppervlak elektroporatie resulteert in de expressie van nucleïnezuren in cellen-voornamelijk voorlopercellen-bij of nabij het pial oppervlak 6. Meer specifiek, de oriëntatie van de elektroden is kritiek in dicteren de richting van plasmide beweging en daaropvolgende expressie. Aldus in dual elektrodenconfiguraties is het plasmide aangegeven in vrijwel rechte vector tussen de negatieve en positieve elektrode. Daarom, als de negatieve pool op de injectieplaats wordt geplaatst en de positieve pool is ventraal van de negatieve pool, plasmide zal worden gedwongen in de pial oppervlak. Aangenomen wordt dat het oriënteren van de elektroden huidige vectoren loodrecht op het oppervlak meest ideaal zou zijn. Met de juiste elektrode oriëntatie en het gebruik van kleinere, meer focaal gerichte elektroden, overleving van 100%. In sommige gebieden, zoals de middenhersenen, zorg moet worden genomen om stroomafgifte dat het hart mogelijk niet voorkomen, en dus cause verminderde levensvatbaarheid van de geëlectroporeerd muisjongen. Onlangs beschreven tri-elektrode configuraties of andere wijzigingen kunnen helpen bij het richten moeilijker regio's door het vermijden van structuren die betrokken zijn bij de vitale functies zoals hartslag 28. Het is belangrijk voor een goede pups opnieuw verwarmen hun natuurlijke lichaamstemperatuur, hetgeen blijkt door beweging en kleur kijken. Bij terugkomst kleur, kunnen worden terug in het nest geplaatst. Moeders uit CD1 stam van muizen die we het vaakst in dienst onmiddellijk beginnen met het voeden van de pups terug. Maar ook andere stammen zijn meer variabel, worden agressief of nalatig. Het overbrengen van de geur van het beddengoed om de pups voorkomt meestal deze kwesties. In stammen waarvan verwaarlozing of agressie ernstig zijn, het bevorderen van pups aan moeders uit de CD1 stam is de beste oplossing.
Gelabelde cellen worden gewoonlijk vele maanden na elektroporatie 6 waargenomen. Echter, zoals met elke electroporation methode, plasmide DNA verdunt met celdeling 29. Dezelfde mate van plasmide verdunning gezien snellopende populaties (bijv. SVZ voorlopers) wordt niet waargenomen in onze pial oppervlak bevolking, suggereert minder proliferatie 6. Echter, we nu onlangs beschreven omzetting technologieën (bijv. piggyBac) gebruiken om deze verdunning probleem helemaal te verzachten door toe te staan voor een stabiele plaatsing van transposons in het genomisch DNA 29, 30. Als alternatief zou Cre Recombinase expressie plasmiden worden geëlektroporeerd in Cre reporter muizen voor stabiele genetische opsporing van deze cellen 31 bemiddelen.
Initiële resultaten suggereren dat de meeste van onze cellen mitotische bij de elektroporatie 6, in overeenstemming met gegevens in de embryonale CNS-specifiek beschreven, dat elektroporatie etiketten een aantal prolifererende cellen tussen S en M fasen van de celcyclus 24. Echter verder onderzoek nodig om de identiteit en de geslachten van geëlektroporeerde cellen voorschriften op het pial oppervlak als definitief bepalen hun proliferatieve vermogen omdat er veel voorbeeld van valse chemische en genetische kenmerken van cellen in de literatuur 4. Bovendien hebben we opgemerkt plaatselijke injectieplaats hematoom, vooral in de cortex-als zorg ondernomen om kleine hoeveelheden of wanneer geschikte voorzorgsmaatregelen vasculaire verstoringen voorkomen worden niet gevolgd leveren.
Onze vorige karakterisering geeft aan ten minste twee geslachten van cellen - astrocytische precursoren en interneuron voorlopers 6. Astrocyten hebben de neiging bij het pial oppervlak (Figuur 4A) te blijven en elke cel vormt een dichte wolk van perifere astrocytaire processen 6. Interneuronen meestal blijven op de pial oppervlakte, maar sommige cellen zijn te vinden in bijna alle corticale lagen of dieper in de superieure colliculus 6. These neuronen vertonen uitgebreide dendrieten, die zolang honderden microns (figuur 4B) kan zijn. We hebben geen bewijs waargenomen voor de etikettering van oligodendrocyten of prikkelende neuronen in de cortex 6. De meerderheid van de geëlektroporeerde cellen blijken te zijn gepasseerd door mitose tijdelijk in nauwe nabijheid van de EP procedure cortex 6. Concreet geëlectroporeerd EGFP + cellen zijn dubbel-gelabeld met de DNA-replicatie marker BrdU als gepulst 2 uur voorafgaand aan deze thymidine analoog (figuren 4C-4C 3). Het is echter belangrijk op te merken dat we bewijs pericytic en / of endotheelcellen etikettering deze gebieden 6 gezien.
Figuur 1. Elektroporatie vande neonatale pial oppervlak (A) Frontale doorsnede toont schematisch het gebied van de cortex die is gericht bij injectie. Cellen weergegeven langs de lagen van de cortex zijn voorbeelden van de werkelijke waargenomen gemengde populaties van geëlektroporeerde cellen, waaronder Interneuronale progenitorcellen en astrocystic precursoren. (B) Afbeelding van een postnatale dag 2 muis voorafgaand aan de injectie, waarin de regio's van pial oppervlak belang, de cortex (Ctx) en superieure colliculus (SC).
Figuur 2. Postnatale elektroporatie van de buitenste cortex (A) Voorbeeld injectie van de dorsale cortex na gericht het midden tussen het oog en lambda, voorafgaand aan elektroporatie. (B) Afhankelijk van deleeftijd pups en omgeving plaats, flexibiliteit verschillende maten platina tweezertrodes kan worden gebruikt voor elektroporatie (3 mm, 7 mm en 9 mm). 3-mm elektroden worden doorgaans gebruikt voor pial oppervlakte elektroporatie (zie tekst voor discussie). (C) Elektroporatie van de cortex. Let op de plaatsing van de tweezertrodes, plaatsen van de positieve probe onder het oog, zodat stroom naar de buikzijde aan te drijven.
Figuur 3. Superieure colliculus gerichte postnatale elektroporatie (A) injectie van een 2 dagen oude pup in de superieure colliculus, die de handleiding beperking van de verdoofde pup en de plaatsing van de pipetpunt net voorbij de schedel. (B) Injectie met de verspreide plasmaid DNA-oplossing in het gebied van de superior colliculus (SC). (C) Plaatsing van de tweezertrodes voor elektroporatie van de SC, rijden DNA naar het dorsale oppervlak van de SC op de injectieplaats. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4. Superior colliculus gerichte postnatale elektroporatie (A) En face, maximale projectie van confocale beeld stapels van dorsolaterale cortex ~ 2 weken na elektroporatie van controle fluorescerende reporter plasmiden die membraan-gelabeld Clover 32 (groen) en TagBFP2 33 nucleaire eiwit (blauwe fluorescentie pseudocolored rood). (B) Frontale doorsnede van een corticale interneuron ongeveer twee maanden na de elektroporatie, het weergeven van uitgebreide dendrieten. Schaalbalken zijn 100 um (A, C) en 40 urn (B). (CC 3) Sagittale doorsnede van het pial oppervlak van de colliculus superior aangetoond dat de meerderheid van EGFP + cellen gelabeld door een enkele puls met BrdU 2 uur voorafgaand aan de elektroporatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het meest kritische onderdeel voor een succesvolle elektroporatie van pial oppervlakte voorouders zijn: 1) het richten van plasmide mix om de pial oppervlak; 2) Het ontstaan van hematomen op de injectieplaats; en 3) het voorkomen van sterfte door middenhersenen elektroporatie.
Adequaat gericht op de pial oppervlak wordt bereikt door gemeten en zorgvuldige doorprikken van de schedel om de penetratie van de pial oppervlak te voorkomen. Onjuist richten naar de overliggende huid of onderliggende ventrikel of de hersenen parenchym worden aangetoond door: 1) verplaatsing van de snelle groene kleurstof met de huid zachtjes te wrijven op het weefsel (dwz de snelle groene boven de schedel in de huid en het bindweefsel is gelokaliseerd) of 2) door het verdwijnen van de snelle groene kleurstof in de hersenen, wat aangeeft dat het plasmide mix is gegaan in het ventrikel en / of parenchym. Juiste pial oppervlak lokalisatie van het plasmide mix te worden aangetoond door kleurstof accumulatie onder de schedel ebij kan niet gestoord worden door zachte huid verplaatsing. Toch is de praktijk en beweeglijkheid vereist deze succesvolle targeting. Hematoomvorming wordt waarschijnlijk veroorzaakt door verstoring van het vaatstelsel van plasmide injectie. Bloedstolsels wordt op de injectieplaats worden waargenomen in de dagen en weken na elektroporatie wanneer het weefsel wordt verzameld. Om hematomen te voorkomen, passen de puls lengte van de vloeistof injectie en / of kennis te nemen van het algemene patroon van de bloedvaten van de hersenen tot verstoring schip te voorkomen. In het algemeen, de superior colliculus minder gevoelig voor stolling. Dood door elektrische stroom door de tweezertrodes geleverd wordt gemakkelijk vermeden worden door het gebruik van 3 mm tweezertrodes meer focaal stroom leveren en door de leiding van de elektroden uit de buurt van de ventrale middenhersenen zoals aangetoond (figuur 2C en 3C).
Een voornaamste nadeel van de techniek is dat het doelgebied wordt beperkt door de grootte van het plasmide oplossing spreaden de grootte van de elektroden. Een levering van 0,5 pi plasmide genereert een gebied van ongeveer 3 mm en dus goed afgestemd op de grootte van de elektrode 3 mm. Welke maatregel is kleiner (oplossing spread gebied of elektrode paddle gebied) zal de uiteindelijke grootte van de patch van geëlektroporeerde cellen dicteren. Ook slechts een subset van cellen gelabeld door de noodzaak van mitose van transgenexpressie 24. Dit is echter gunstig voor het bestuderen stam-of voorlopercellen populaties en celdifferentiatie.
Pial oppervlak elektroporatie is een methode waardoor de robuuste genetische manipulatie van pial oppervlak voorouders en hun nakomelingen. Deze techniek is snel, eenvoudig en efficiënt een meer specifieke en eenvoudiger middelen die op deze cellen in vergelijking met de enige andere vergelijkbare aanpak-retrovirale transductie. Hoge titer virale productie neemt vaardigheid, weken tijd en brengt veiligheidsrisico's - vooral bij pantropische pseudotyped retrovirus. Bovendien elektroporatie enigszins flexibeler omdat het niet virale klonen en productiecycli. Eukaryotische expressievector kan worden gebruikt, waaronder virale plasmiden. Verder kan maxiprep-ed plasmiden worden gemengd en afgestemd voor eenvoudige co-elektroporatie. Meestal is er een ~ 90-95% co-expressie van twee willekeurige plasmiden met gelijke promoters. In opgemerkt dat hoewel we alleen in dienst deze targeting techniek in de cortex en superieure colliculus moet de bepaling vatbaar meeste pial of oppervlakkige gebieden van het CZS op voorwaarde dat er voldoende ruimte voor de lokale accumulatie van plasmide-DNA voor stroomafgifte .
Elektroporatie van nature de neiging om de transductie van mitotische cellen 24 bevorderen. Daarom moet elektroporatie van volwassen dieren haalbaar maar zou waarschijnlijk resulteren in veel minder cellen die transgenen door verminderde proliferatieve activiteit veroudering. Echter, zoals onlangs beschreven door Jaubodinen collega's aan gerichte postmitotische cellen in dit gebied mogelijk zou zijn door het gebruik van trans-cyclohexaan-1, 2 - diol, waardoor toegang nucleaire plasmide door permeablilizing kern envelop 25. Ook elektroporatie is zeer compatibel met Cre technologieën of andere gemanipuleerde muis types 31. Ten slotte zal transposon technologie zorgen voor een stabiele somatische transgenese van deze populatie 29, 30. In totaal pial oppervlak elektroporatie vertegenwoordigt een uitstekende en flexibele tool voor de genetische manipulatie van deze unieke voorlopercellen domeinen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
De auteurs willen graag de steun van de Samuel Oschin Comprehensive Cancer Institute Cancer Research Forum Award evenals fondsen erkennen van de Regeneratieve Geneeskunde Instituut voor Cedars-Sinai, en de Guerin Family. De beschreven project werd ondersteund in de vorm van een CTSI Core Voucher gefinancierd door het National Center for Research Resources, Grant UL1RR033176, en is nu in het Nationaal Centrum voor de bevordering van Translational Wetenschappen, Grant UL1TR000124. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fire Polished Borosilicate Tubing | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments Company | P-30 | |
| Fast Green FCF | Sigma Aldrich, Inc. | F7528 | |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter Instruments Company | ||
| ECM 830 Generator | Harvard Apparatus, BTX Instrument Div | 45-0052 | |
| 3-mm Platinum Tweezertrodes | Harvard Apparatus, BTX Instrument Div | 45-0487 | |
| SignaGel Electrode Gel | Cardinal Health | 70315-025 | |
| Tris-EDTA Buffer, pH 8.0 | Integrated DNA Technologies, Inc. | 11-01-02-05 | |
| Infrared Heat Lamp | VWR | 36547-009 | |
| Fine Scissors Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 |
References
- Breunig, J. J., Haydar, T. F., Rakic, P. Neural stem cells: historical perspective and future prospects. Neuron. 70 (4), 614-625 (2011).
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287 (5457), (2000).
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
- Breunig, J. J., Arellano, J. I., Macklis, J. D., Rakic, P. Everything that glitters isn't gold: a critical review of postnatal neural precursor analyses. Cell Stem Cell. 1 (6), 612-627 (2007).
- Costa, M. R., Kessaris, N., Richardson, W. D., Gotz, M., Hedin-Pereira, C. The marginal zone/layer I as a novel niche for neurogenesis and gliogenesis in developing cerebral cortex. J Neurosci. 27 (42), 11376-11388 (2007).
- Breunig, J. J., et al. Rapid genetic targeting of pial surface neural progenitors and immature neurons by neonatal electroporation. Neural Dev. 7, (2012).
- Ohira, K., et al. Ischemia-induced neurogenesis of neocortical layer 1 progenitor cells. Nat Neurosci. 13 (2), 173-179 (2010).
- Bystron, I., Blakemore, C., Rakic, P. Development of the human cerebral cortex: Boulder Committee revisited. Nat Rev Neurosci. 9 (2), 110-122 (2008).
- Schmechel, D. E., Rakic, P. A Golgi study of radial glial cells in developing monkey telencephalon: morphogenesis and transformation into astrocytes. Anat Embryol (Berl. 156 (2), 115-152 (1979).
- Halfter, W., Dong, S., Yip, Y. P., Willem, M., Mayer, U. A critical function of the pial basement membrane in cortical histogenesis. J Neurosci. 22 (14), 6029-6040 (2002).
- Bystron, I., Rakic, P., Molnar, Z., Blakemore, C. The first neurons of the human cerebral cortex. Nat Neurosci. 9 (7), 880-886 (2006).
- Tanaka, D. H., Maekawa, K., Yanagawa, Y., Obata, K., Murakami, F. Multidirectional and multizonal tangential migration of GABAergic interneurons in the developing cerebral cortex. Development. 133 (11), 2167-2176 (2006).
- Ang Jr, E. S., Haydar, T. F., Gluncic, V., Rakic, P. Four-dimensional migratory coordinates of GABAergic interneurons in the developing mouse cortex. J Neurosci. 23 (13), 5805-5815 (2003).
- Tamamaki, N., Fujimori, K. E., Takauji, R. Origin and route of tangentially migrating neurons in the developing neocortical intermediate zone. J Neurosci. 17 (21), 8313-8323 (1997).
- Larkum, M. E. The yin and yang of cortical layer 1. Nat Neurosci. 16 (2), 114-115 (2013).
- Jiang, X., Wang, G., Lee, A. J., Stornetta, R. L., Zhu, J. J. The organization of two new cortical interneuronal circuits. Nat Neurosci. 16 (2), 210-218 (2013).
- Endo, T., Isa, T. Functionally different AMPA-type glutamate receptors in morphologically identified neurons in rat superficial superior colliculus. Neuroscience. 108 (1), 129-141 (2001).
- Schmidt, M., Ozen Boller, M., G,, Hall, W. C. Disinhibition in rat superior colliculus mediated by GABAc receptors. J Neurosci. 21 (2), 691-699 (2001).
- Ackman, J. B., Burbridge, T. J., Crair, M. C. Retinal waves coordinate patterned activity throughout the developing visual system. Nature. 490 (7419), 219-225 (2012).
- De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes. Nature. 472 (7343), 351-355 (2011).
- Boller, M., Schmidt, M. Postnatal maturation of GABA(A) and GABA(C) receptor function in the mammalian superior colliculus. Eur J Neurosci. 14 (8), 1185-1193 (2001).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
- De Vry, J., et al. In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery. Prog Neurobiol. 92 (3), 227-244 (2010).
- Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex. J Neurosci. 30 (20), 7028-7036 (2010).
- De la Rossa, A., et al. In vivo reprogramming of circuit connectivity in postmitotic neocortical neurons. Nat Neurosci. 16 (2), 193-200 (2013).
- Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PLoS One. 3 (4), (2008).
- Chesler, A. T., Le Pichon, C. E., Brann, J. H., Araneda, R. C., Zou, D. J., Firestein, S. Selective gene expression by postnatal electroporation during olfactory interneuron nurogenesis. PLoS One. 3 (1), (2008).
- dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nat Commun. 3, (2012).
- Yoshida, A., Yamaguchi, Y., Nonomura, K., Kawakami, K., Takahashi, Y., Miura, M. Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system. Genes Cells. 15 (5), 501-512 (2010).
- Chen, F., LoTurco, J. A method for stable transgenesis of radial glia lineage in rat neocortex by piggyBac mediated transposition. J Neurosci Methods. 207 (2), 172-180 (2012).
- Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A. Neonatal subventricular zone electroporation. J Vis Exp. , (2013).
- Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nat Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).
- Subach, O. M., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Verkhusha, V. V. An enhanced monomeric blue fluorescent protein with the high chemical stability of the chromophore. PLoS One. 6 (12), (2011).
