Summary
Pial overflade er en unik stamfader zone i CNS, som modtager stigende opmærksomhed. Heri vi detaljeret en fremgangsmåde til hurtig genetisk manipulation af denne progenitor zone anvendelse af en modificeret elektroporation metode. Denne procedure kan bruges til cellulære og molekylære undersøgelser af cellelinier og signalveje, der er involveret i celle differentiering og at belyse skæbne og egenskaber datterceller.
Abstract
I løbet af de sidste mange år pial overfladen er blevet identificeret som en germinale niche vigtigt under embryonale, perinatal og voksne neuro-og gliogenesis, også efter skade. Imidlertid havde metoder for genetisk afhøre disse progenitorpopulationer og sporing deres slægter været begrænset på grund af mangel på specificitet eller tidskrævende produktion af virus. Således har udviklingen i denne region været forholdsvis langsom med kun en håndfuld af undersøgelser af denne placering. Elektroporation har været brugt i over et årti at studere neurale stamceller egenskaber i embryonet, og for nylig i den postnatale hjerne. Her beskriver vi en effektiv, hurtig og enkel teknik til genetisk manipulation af pial overflade progenitorer baseret på en tilpasset elektroporation tilgang. Pial overflade elektroporation giver mulighed for letkøbt genetisk mærkning og manipulation af disse stamfædre, og dermed repræsenterer en tidsbesparende og økonomisk tilgang til at studere disse celler.
Introduction
Neurale stamceller og stamfaderceller er til stede i hele pattedyrs CNS 1, 2. Deres art og egenskaber i embryonale og voksne germinale zoner omkring de ventrikulære områder af hjernen og rygmarven er blevet grundigt dokumenteret i det seneste årti 1-3. I store del, har det været på grund af udviklingen af stadig mere præcise genetiske værktøjer, såsom nervesystemet specifik Cre rekombination af floxet alleler eller retroviral afstamning sporing 4. Men en stamfader region-pial overflade stamfader zone-har først for nylig blevet beskrevet i detaljer 5-7 og afventer omfattende undersøgelse.
Pial hjernens overflade defineres som grænsefladen mellem overfladen af hjernen og de omkringliggende meninges 8. Under udviklingen neuroepitel og senere radiale gliøse ende fødder tillægger denne overflade 9,10. Nogle af granst neuroner i den menneskelige hjerne, og mange neuronale Mitoser observeres i denne region 11. Senere under embryonisk neurogenese er corticale interneuroner kendt for at krydse pial region, udover deres træk i den mellemliggende zone og subventricular zone 12-14. I løbet af denne periode, kan stamceller dyrkes fra denne zone, og det ser ud til at være et aktivt sted i neuro-og gliogenesis 5.. I den voksne hjerne, er det blevet rapporteret, at interneurons kan fødes fra pial overflade stamfædre efter hypoxisk udfordring 7. Imidlertid har bidraget i denne region til sin til genensis under embryonisk og postnatal udvikling forblev uklar delvis på grund af vanskeligheden ved specifikt at undersøge dette område 6. I den overlegne colliculus og i hjernebarken kan overfladiske (eller lag I i cortex) interneuroner modulere kredsløbet produktion af underliggende excitatoriske neuron befolkninger og dermed bidrage væsentligtantly til funktionen af disse strukturer. Især Lag 1 interneuroner er i den bedste position til at regulere affyring af neuroner i hele de øverste lag af hjernebarken givet deres omfattende forbindelse til de overfladiske og dybe lag af kortikale søjler 15,16. På en lignende måde, vandrette interneuroner modtager stimulerende input fra kortikal og retinale fibre, projekt over et relativt stort område og er spekuleret at mediere hæmning af neuronale populationer reagerer på remote visuel stimuli 17,18. Også deres morfologi er velegnet til at spille en potentiel rolle i den mønstrede bølge aktivitet i udviklingslandene visuelle system 19. Interessant interneuron udvikling og modning sker i vid udstrækning postnatalt. Endvidere har denne modningsproces er fundet at være reguleret af neuronal aktivitet og er derfor et substrat af udviklingsmæssige plasticitet med livslang konsekvenser for kredsløbsfunktion 20,21. Især no promotorer er beskrevet som specifikt kan målrette disse celler transgent. Fjedre progenitorer kan målrettes med retrovirus 7, men virusproduktion er tidskrævende og kræver dygtighed til opnåelse af de høje titere nødvendige for celle transduktion.
Elektroporation har ført til en renæssance i studiet af nervesystemets, da det giver mulighed for hurtig og effektiv genetisk interrogering af signalveje i neurale stamceller 4, 22, 23. Elektroporation involverer injektion af plasmid-DNA, efterfulgt af levering af elektriske impulser til ydersiden af hovedet, til ensrettet drive DNA'et i prolifererende progenitorceller omkring ventriklerne 4, 22, 23. Elektroporation synes at kræve transit af celler gennem M-fasen af cellens cyklus for ekspression af plasmid transgener 24. Specifikt har det vist sig, at kunceller, der passerer gennem M fase indenfor 8 timer af elektroporation af plasmider vil udtrykke transgener trods deres effektiv levering til alle celler i ~ 160 um ventrikelvæggen 24. Det spekuleres, at dette er på grund af behovet for opdeling kernemembranen at tillade for nuklear adgang for episomale plasmider, som kemikalier, der forårsager nuklear permeabilisering kan inducere ekspression af plasmider i post mitotiske celler 25. Oprindelig ansat i embryonet 22 blev elektroporering tilpasset til anvendelse i den postnatale hjernen meget senere 26, 27. For nylig har vi tilpasset elektroporering anvendes i genmanipulation af pial overflade progenitorer 6. Desuden bruger denne tilgang, vi har vist, at der tilsyneladende er to forskellige slægter af forfædre i denne region-nye indbyrdes og astrocytisk 6. Denne protokol beskriver en enkel, hurtig og effektiv måde at målrette disse celler til forhøraf mekanismer, der regulerer udviklingen af disse celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne procedure er i overensstemmelse med Cedars-Sinai IACUC krav. Efterforskere skal sikre institutionel overholdelse IACUC forud for proceduren. Alt værktøj og reagenser skal steriliseres inden brug.
1.. Udarbejdelse af værktøj, Solutions, og DNA Blanding
- Indsæt 100 mm brand poleret borosilikatglas kapillarrør i en mikropipette aftrækker. Indstil opvarmning for at tillade standard vejede pull til dannelse pipettespids på ca 17,5 mm. Skær tips med skarpe kirurgiske sakse i en afstand på ca 8-9 mm fra begyndelsen af spidsen for at skabe omtrent en 100 um diameter åbning.
- Foretag en lager 1% w / v fast green opløsning ved blanding filtreret nuclease-frit vand (ved anvendelse af en 20-um sprøjtefilter) med tørt fast green.
- Isoler oprenset endotoksinfri plasmid-DNA, der er stærkt koncentreret (dvs.> 3 pg / pl) fortyndet i Tris-EDTA (TE)-buffer. Tilføj ønskede mængder af plasmidtil blandingen fortyndet i TE-buffer og tilføje en 1:10 i 1% hurtigt grønne opløsning (gør en 0,1% vægt / volumen slutkoncentration af fast green). Brug en 0,5-2,0 pg / pl slutkoncentration af plasmid for robust ekspression af transgener.
2.. Animal Anesthesia, Pipette Loading, og pial Surface Plasmid Injection
- Fremkald hypotermi anæstesi på 1-2 dag postnatal mus ved at placere dem på en petriskål, der er placeret på is i 5-8 min (tid afhængig af ungernes alder / vægt). Når hypotermi bekræftes af manglende bevægelse fra tå-klemme og / eller hale refleks, mus er klar til at blive injiceret. Placer dyr tilbage på is, hvis smerte reflekser er indlysende. Proceduren injektion og elektroporation tage mindre end 2-3 min i alt så tid hypotermi, injektion og elektroporation procedurer tilsvarende at opretholde passende anæstesi.
- Under anæstesi, ved hjælp af en standard pipette forsigtigt pipette ønskede mængde plasmid blande skal injiceres (0,5-2 ul) på et stykke paraffin film til reference. Her er et samlet volumen på 0,5 pi plasmid mix injiceres. Dernæst ved hjælp af en mikro injektor omhyggeligt indsætte samles glaskapillar pipette rør indeholdende plasmid blanding. Tage ekstra forholdsregler for at forhindre, at tip fra at bryde ved at sørge for at det ikke rører ved kanten af røret. Aspirer opløsningen i pipetten ved langsomt at ringe tilbage skiven overførsel. Når en tilstrækkelig volumen er blevet læsset ind i pipetten, ringe fremad, indtil trykket vender tilbage til neutral position 0 hPa.
- Brug 300-450 hPa pres til injektion for at sikre passende pres for selv at udfylde den pial overflade / meningitis rum, placere spidsen i nærheden af pipetterede paraffin film henvisning injektion (fra 2.2) og bruge fodpedalen fra mikro injektor for at skubbe en volumen på paraffin film. Juster trykket derfor indtil det beløb skubbet lig den tidligere pipetteret reference volumen.
- Når spidsen er blevet ækvilibreret og anæstesi er blevet bekræftet, hvalpene er klar til at blive injiceret.
- Målet med eksperimentet er at injicere plasmid mix under kraniet og over pial overflade for at tillade DNA elektroporation nedad i pial overflade stamfædre (figur 1a). For cortex injektioner, holde hvalpen ned ved hjælp af tommel-og pegefinger på den mindre dominerende hånd. De kortikale halvkugle og andre overfladiske strukturer såsom de overlegne colliculi er synlige mellem P0 og P2, der giver mulighed for facile målretning af disse strukturer (figur 1b). Brug den dominerende hånd og mål ønskede område af cortex (dvs. motor, somatosensoriske, etc.), indsæt pipette forbi huden og kraniet tage sig for at undgå cerebrale arterier. Sørg for at forhindre yderligere indtrængning af spidsen forbi kraniet (som er indikeret ved manglen på yderligere modstand lige efter piercing kraniet).
- Sprøjt plasmid løsning ved hjælp af fodpedalen af mikro injektor og sørg for at det spreder jævnt over væv (figur 2A).
Bemærk: Det er meget vigtigt empirisk at bestemme en fremgangsmåde, som maksimerer plasmid levering samtidig undgå hæmatom på grund af fluidtryk. Dette kan gøres ved at justere varigheden af indsprøjtningen vinkel volumen, og den præcise målsted for at undgå vaskulære forstyrrelser. - Vær sikker på at forsøge at holde spidsen fra tørring i mellem injektionerne ved at placere spidsen i test dråber fra injektioner foretaget tidligere på voks papir eller plast paraffin film. Dette er nødvendigt for at forhindre spidsen ophobning fordampet og krystalliseret DNA-opløsning, hvilket kan resultere i tilstopning af spidsen og usammenhængende forsyningsmængder.
3. Elektroporation
- Indstil elektroporator til 135-150 V for fem impulser, varig 50 msek, med 950 msek intervaller mellem hver puls. For at øge ledningsevne ogforhindre forbrænding af huden, dækker 3 mm platin tweezertrodes med elektroporation gel. Check for toe-klemme og hale reflekser på dette punkt for at sikre anæstesi. Hvis lydhør placere på is i flere minutter for at bedøve.
- For cortex (og overlegen colliculus) injektioner, anvende en 3 mm elektrode (figur 2B) for at øge levedygtigheden af unger (sammenlignet med 7 - og 10-mm elektroder, som anvendes til ventrikulær zone elektroporation). Placer negativt ladede sonde af elektroden i det injicerede område, og det positivt ladede probe omkring den kontralaterale region under øjet, således at elektroden orientering er ved 45-60 ° vinkel i forhold til midterlinjen (figur 2C).
- Brug fodpedalen af elektroporator at udløse strøm og holde tweezertrodes på plads i 3-5 pulser, afhængig pup alder og vægt, målretning DNA i underliggende pial overflade celler, når der tegner sig for krumningaf halvkugler.
Bemærk: Den negative pol kan fejes over injektionsstedet mellem impulser eller en større elektrode kan anvendes til at øge den elektroporerede område. - Umiddelbart efter elektroporation forsigtigt rense ud gel fra unger og placere dem under en varmelampe i ca 5 min.
- Hvalpe vil akut miste deres naturlige rødlig-lyserød nuance i minutter efter elektroporation grund cyanose. Overhold hvalpe til genopretning af naturlige farve og indledningen af normale bevægelse før returnere dem til deres bure.
- Sørg for re-socialisering med moderen ved at observere, om hun bringer hvalpene tilbage til reden og begynder grooming dem. Hvis hun bliver aggressiv, så sørg hvalpe ikke har rester af gel og inkuberes dem med nogle af strøelse til at overføre lugt til hvalpene.
4.. Ændringer til Målretning Superior colliculi
Målretning:
- Inject den overlegne colliculus på samme måde som cortex, men bemærk, at målet regionen ligger bare posterior og laterale til lambda og nogenlunde på midterlinjen (3A og 3B). Med succesfulde injektioner, plasmidet mix fylder naturligvis konturerne af den overlegne colliculus. Når injektioner er foretaget korrekt, dyr er klar til elektroporation.
Elektroporation:
- I en meget lignende måde, for overlegen colliculus injektioner placere negativt ladede sonde af elektroden i det injicerede område, og det positivt ladede probe omkring øjet, trynen eller hage, kørsel DNA i de overfladiske områder af superior colliculus (figur 3C) . I dette tilfælde elektroden orientering er i en 25-40 ° vinkel i forhold til midterlinjen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Pial overflade elektroporation resulterer i ekspression af plasmid-DNA i celler-meste progenitorer-ved eller nær pial flade 6. Mere specifikt orienteringen af elektroderne er kritisk i dikterer retningen af plasmid bevægelse og efterfølgende ekspression. Således i dobbelt elektrode konfigurationer plasmidet rettet i nogenlunde lige vektor mellem den negative og den positive elektrode. Derfor, hvis den negative pol er placeret over injektionsstedet og den positive pol er ventral til den negative pol, plasmid vil blive tvunget ind i den pial overflade. Det antages, at orientering af elektroder til at producere de aktuelle vektorer vinkelret på overfladen ville være mest ideelt. Med passende elektrode orientering og brug af mindre, mere fokalt målrettede elektroder, overlevelse er 100%. I nogle regioner, såsom midthjernen, pleje skal dog tages for at undgå løbende levering, der kan stoppe hjertet, og dermed Cause reduceret levedygtighed elektroporerede museunger. Nyligt beskrevne tri-elektrodekonfigurationer eller andre ændringer kan hjælpe med at målrette mere vanskelige områder ved at undgå strukturer involveret i vitale funktioner såsom puls 28. Det er vigtigt at se unger for korrekt re-opvarmning til deres naturlige kropstemperatur, som det fremgår af bevægelse og farve. Når de vender tilbage til farve, kan de placeres tilbage i reden. Mødre fra CD1 stamme af mus, som vi oftest ansætter straks begynde at pleje de returnerede hvalpe. Dog kan andre stammer være mere variabel, bliver aggressive eller ligegyldig. Overførsel lugten af strøelse til hvalpene typisk forhindrer disse spørgsmål. I racer, hvor forsømmelse eller aggression er alvorlige, fremme hvalpe til mødre fra CD1 stammen er den bedste løsning.
Mærkede celler er typisk observeret mange måneder efter elektroporation 6. Men som med enhver electroporation metode, plasmid-DNA fortynder med celledeling 29. Den samme grad af plasmid fortynding set i hurtige cykling populationer (f.eks SVZ progenitorer) ikke observeret i vores pial overflade befolkning, hvilket tyder på mindre spredning 6. Men vi nu beskæftiger nylig beskrevne gennemførelse teknologier (f.eks piggyBac) for at afbøde denne udvanding problem helt ved at tillade stabil indsættelse af transposoner i det genomiske DNA 29, 30. Alternativt kunne Cre rekombinase-udtrykkende plasmider elektroporeret i Cre reporter mus for at mægle stabil genetisk opsporing af disse celler 31.
Vores indledende resultater har foreslået, at de fleste af vores celler er mitotisk ved elektroporation 6, i overensstemmelse med data, der er beskrevet i den embryoniske CNS-specifikt etiketter, elektroporering et sæt af prolifererende celler mellem S og M faser af cellecyklus 24.. Dog yderligere undersøgelser for at definere identitet og slægter elektroporerede celler ved pial overflade samt endeligt fastslå deres proliferative karakter, da der er mange eksempel på uægte kemisk og genetisk mærkning af celler i litteraturen 4. Desuden har vi bemærket lokal injektionsstedet hæmatom-især i cortex-når pleje er ikke taget til at levere små mængder, eller når passende forholdsregler for at undgå vaskulær forstyrrelse ikke følges.
Vores tidligere karakterisering indikerer mindst to slægter af celler - astrocytiske prækursorer og interneuron progenitorer 6. Astrocytter tendens til at forblive på pial overflade (figur 4A), og hver celle danner en tyk sky af perifer astrocytisk processer 6.. Interneuroner meste forblive på pial overfladen, men nogle celler kan findes i næsten alle kortikale lag eller dybere i den overlegne colliculus 6. ThESE neuroner udviser omfattende dendritter, som kan være så længe som flere hundrede mikrometer (figur 4B). Vi har ikke observeret evidens for mærkning af oligodendrocytter eller excitatoriske neuroner i cortex 6.. Størstedelen af elektroporerede celler synes at have passeret gennem mitosen i tæt tidsmæssig nærhed til EP procedure cortex 6. Specifikt elektroporeret EGFP +-celler er dobbelt mærket med DNA-replikation markør BrdU når pulseret 2 timer før denne thymidinanalogen (figur 4C-4C 3). Det er dog vigtigt at bemærke, at vi har set beviser på pericytic og / eller endotelceller mærkning i disse regioner 6.
Figur 1. Elektroporation afneonatal pial overflade (A) Koronale afsnit skematisk viser det område af cortex, der er målrettet ved injektion. Celler, der vises langs lag af cortex er eksempler på faktiske observerede blandede populationer af elektroporerede celler, herunder nye indbyrdes progenitorer og astrocystic prækursorer. (B) Billede af en postnatal dag 2 mus før injektion, skitserer de områder af pial overflade interesse, cortex (Ctx) og overlegen colliculus (SC).
Figur 2. Postnatal elektroporering af den overfladiske cortex (A) Eksempel injektion af den dorsale cortex efter målretning midtpunktet mellem øjet og lambda, før elektroporering. (B) Afhængig afalder af hvalpe og region af interesse, fleksibilitet varierede størrelser af platin tweezertrodes kan bruges til elektroporation (3 mm, 7 mm og 9 mm). Elektroder diameter 3 mm anvendes typisk til pial overflade elektroporation (se tekst for diskussion). (C) Elektroporation af cortex. Bemærk placeringen af tweezertrodes, placere den positive probe under øjet, tillader strøm at blive drevet til den ventrale side.
Figur 3. Superior colliculus målrettet postnatal elektroporation (A) Injektion af en 2-dages gamle pup i superior colliculus, viser manuel fastholdelse af den bedøvede pup og placeringen af pipettespidsen lige over kraniet. (B) Injektion viser den dispergerede plasmid DNA-opløsning i området af den overlegne colliculus (SC). (C) Placering af tweezertrodes for elektroporation af SC, kørsel DNA mod ryg overfladen af SC på injektionsstedet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4.. Superior colliculus målrettet postnatal elektroporation (A) En ansigt, maksimal projektion af konfokal billede stakke fra dorsolaterale cortex ~ 2 uger efter elektroporering af kontrol fluorescerende reporter plasmider, der udtrykker membran-mærket Clover 32 (grøn) og TagBFP2 33 kerneprotein (blå fluorescens pseudocolored rød). (B) Koronale afsnit af en cortical interneuron omkring to måneder efter elektroporation, viser omfattende dendritter. Skalapanelerne måler 100 um i (A, C) og 40 um i (B). (CC 3) sagittal sektion af pial overflade af den overlegne colliculus viser, at størstedelen af EGFP +-celler er mærket med en enkelt impuls af BrdU 2 timer forud for elektroporering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det mest kritiske aspekt for en vellykket elektroporering af pial overflade progenitorer er: 1) målretning af plasmid mix pial overflade; 2) at undgå dannelse af hæmatomer på injektionsstedet; og 3) at undgå dødelighed forbundet med midthjernen elektroporation.
Tilstrækkeligt målretning pial overflade opnås ved målte og omhyggelig punktering af kraniet for at undgå indtrængning af pial overflade. Forkert målretning til den overliggende hud eller underliggende ventrikel eller hjerneparenkym fastslås ved: 1) forskydning af den hurtige grønt farvestof med huden ved forsigtigt at gnide det væv (dvs. fast green er lokaliseret over kraniet i hud og bindevæv) eller 2) ved forsvinden af den hurtige grønt farvestof i hjernen, hvilket indikerer, at plasmidet blanding er gået ind i ventriklen og / eller parenkym. Korrekt pial overflade lokalisering af plasmidet mix vil blive dokumenteret ved farvestof ophobning under kraniet thpå kan ikke blive forstyrret af blid hud forskydning. Ikke desto mindre er nødvendig praksis og fingerfærdighed for denne vellykkede målretning. Hæmatom dannelse er sandsynligvis forårsaget af forstyrrelser i karrene ved plasmid injektion. Blodpropper vil blive observeret ved injektionsstedet i dagene og ugerne efter elektroporation når vævet indsamles. For at undgå hæmatomer, justere impulslængden af væsken injektion og / eller notere det generelle mønster af cerebrale kar for at undgå fartøj forstyrrelser. I almindelighed er overlegne colliculus er mindre modtagelige for at størkne. Død på grund af elektrisk strøm leveret fra de tweezertrodes er let undgås ved hjælp af 3 mm tweezertrodes til mere fokalt levere strøm og ved at lede elektroderne væk fra den ventrale midthjernen som påvist (figur 2C og 3C).
En ledende ulempe ved teknikken er, at det pågældende område er begrænset af størrelsen af plasmidet opløsning spredningog størrelsen af elektroderne. En levering af 0,5 pi plasmid genererer et område på omkring 3 mm og dermed er godt tilpasset til 3 mm elektrode størrelse. Uanset hvilken foranstaltning er mindre (løsning spredningen eller elektrode paddle-området) vil diktere den endelige størrelse af plasteret af elektroporerede celler. Desuden er kun en delmængde af celler mærkes på grund af behovet for mitose for transgenekspression 24. Men det er fordelagtigt for at studere stamceller eller progenitorpopulationer og celledifferentiering.
Pial overflade elektroporation er en metode giver mulighed for robust genetisk manipulation af pial overflade stamfædre og deres efterkommere. Denne teknik er hurtig, enkel og effektiv, hvilket giver en mere specifik og lettere at kunne målrette disse celler sammenlignet med den eneste anden sammenlignelig tilgang-retroviral transduktion. Høj titer viral produktion tager dygtighed, ugers tid, og udgør sikkerhedsrisici - især i tilfælde af pantropiske pseudotyped retrovirus. Desuden elektroporation er mere fleksibel, da den ikke kræver kloning og produktion viral. Helst eukaryot ekspressionsvektor kan anvendes, herunder virale plasmider. Endvidere kan maxiprep-ed plasmider blandes og matches for nem co-elektroporation. Typisk er der en ~ 90-95% co-ekspression for to vilkårlige plasmider med tilsvarende promotorer. I bør bemærkes, at mens vi kun har anvendt denne målretning teknik i cortex og overlegen colliculus skal metoden være egnede til de fleste pial eller overfladiske områder af CNS, forudsat at der er plads til lokal akkumulering af plasmid-DNA forud for nuværende levering .
Elektroporation af natur tendens til at favorisere transduktionen af mitotiske celler 24. Således bør elektroporation af voksne dyr være mulig, men vil sandsynligvis resultere i mange færre celler, der udtrykker transgener følge af reduceret proliferativ aktivitet med aldring. Men som for nylig beskrevet af Jaubodinog kolleger, kan målretningen af postmitotiske celler i denne region være muligt ved anvendelse af trans-cyclohexan-1, 2 - diol, som giver mulighed for nuklear plasmid adgang permeablilizing kernekappen 25. Også elektroporation er meget kompatibel med Cre teknologier eller andre manipuleret musetyper 31. Endelig vil transposon teknologi giver mulighed for stabil somatisk transgenese af denne befolkning 29, 30. Sammenlagt pial overflade elektroporation repræsenterer en enestående og fleksibelt værktøj til genmanipulation af disse unikke progenitor domæner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende støtte fra Samuel Oschin Comprehensive Cancer Institute Cancer Research Forum Award samt midler fra regenerativ medicin Institut for Cedars-Sinai, og Guerin familie. Det beskrevne projekt blev støttet i form af en CTSI Core Voucher finansieret af National Center for Research Resources, Grant UL1RR033176, og er nu på National Center for Fremme Translationelle Sciences, Grant UL1TR000124. Indholdet er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fire Polished Borosilicate Tubing | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments Company | P-30 | |
| Fast Green FCF | Sigma Aldrich, Inc. | F7528 | |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter Instruments Company | ||
| ECM 830 Generator | Harvard Apparatus, BTX Instrument Div | 45-0052 | |
| 3-mm Platinum Tweezertrodes | Harvard Apparatus, BTX Instrument Div | 45-0487 | |
| SignaGel Electrode Gel | Cardinal Health | 70315-025 | |
| Tris-EDTA Buffer, pH 8.0 | Integrated DNA Technologies, Inc. | 11-01-02-05 | |
| Infrared Heat Lamp | VWR | 36547-009 | |
| Fine Scissors Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 |
References
- Breunig, J. J., Haydar, T. F., Rakic, P. Neural stem cells: historical perspective and future prospects. Neuron. 70 (4), 614-625 (2011).
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287 (5457), (2000).
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
- Breunig, J. J., Arellano, J. I., Macklis, J. D., Rakic, P. Everything that glitters isn't gold: a critical review of postnatal neural precursor analyses. Cell Stem Cell. 1 (6), 612-627 (2007).
- Costa, M. R., Kessaris, N., Richardson, W. D., Gotz, M., Hedin-Pereira, C. The marginal zone/layer I as a novel niche for neurogenesis and gliogenesis in developing cerebral cortex. J Neurosci. 27 (42), 11376-11388 (2007).
- Breunig, J. J., et al. Rapid genetic targeting of pial surface neural progenitors and immature neurons by neonatal electroporation. Neural Dev. 7, (2012).
- Ohira, K., et al. Ischemia-induced neurogenesis of neocortical layer 1 progenitor cells. Nat Neurosci. 13 (2), 173-179 (2010).
- Bystron, I., Blakemore, C., Rakic, P. Development of the human cerebral cortex: Boulder Committee revisited. Nat Rev Neurosci. 9 (2), 110-122 (2008).
- Schmechel, D. E., Rakic, P. A Golgi study of radial glial cells in developing monkey telencephalon: morphogenesis and transformation into astrocytes. Anat Embryol (Berl. 156 (2), 115-152 (1979).
- Halfter, W., Dong, S., Yip, Y. P., Willem, M., Mayer, U. A critical function of the pial basement membrane in cortical histogenesis. J Neurosci. 22 (14), 6029-6040 (2002).
- Bystron, I., Rakic, P., Molnar, Z., Blakemore, C. The first neurons of the human cerebral cortex. Nat Neurosci. 9 (7), 880-886 (2006).
- Tanaka, D. H., Maekawa, K., Yanagawa, Y., Obata, K., Murakami, F. Multidirectional and multizonal tangential migration of GABAergic interneurons in the developing cerebral cortex. Development. 133 (11), 2167-2176 (2006).
- Ang Jr, E. S., Haydar, T. F., Gluncic, V., Rakic, P. Four-dimensional migratory coordinates of GABAergic interneurons in the developing mouse cortex. J Neurosci. 23 (13), 5805-5815 (2003).
- Tamamaki, N., Fujimori, K. E., Takauji, R. Origin and route of tangentially migrating neurons in the developing neocortical intermediate zone. J Neurosci. 17 (21), 8313-8323 (1997).
- Larkum, M. E. The yin and yang of cortical layer 1. Nat Neurosci. 16 (2), 114-115 (2013).
- Jiang, X., Wang, G., Lee, A. J., Stornetta, R. L., Zhu, J. J. The organization of two new cortical interneuronal circuits. Nat Neurosci. 16 (2), 210-218 (2013).
- Endo, T., Isa, T. Functionally different AMPA-type glutamate receptors in morphologically identified neurons in rat superficial superior colliculus. Neuroscience. 108 (1), 129-141 (2001).
- Schmidt, M., Ozen Boller, M., G,, Hall, W. C. Disinhibition in rat superior colliculus mediated by GABAc receptors. J Neurosci. 21 (2), 691-699 (2001).
- Ackman, J. B., Burbridge, T. J., Crair, M. C. Retinal waves coordinate patterned activity throughout the developing visual system. Nature. 490 (7419), 219-225 (2012).
- De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes. Nature. 472 (7343), 351-355 (2011).
- Boller, M., Schmidt, M. Postnatal maturation of GABA(A) and GABA(C) receptor function in the mammalian superior colliculus. Eur J Neurosci. 14 (8), 1185-1193 (2001).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
- De Vry, J., et al. In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery. Prog Neurobiol. 92 (3), 227-244 (2010).
- Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex. J Neurosci. 30 (20), 7028-7036 (2010).
- De la Rossa, A., et al. In vivo reprogramming of circuit connectivity in postmitotic neocortical neurons. Nat Neurosci. 16 (2), 193-200 (2013).
- Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PLoS One. 3 (4), (2008).
- Chesler, A. T., Le Pichon, C. E., Brann, J. H., Araneda, R. C., Zou, D. J., Firestein, S. Selective gene expression by postnatal electroporation during olfactory interneuron nurogenesis. PLoS One. 3 (1), (2008).
- dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nat Commun. 3, (2012).
- Yoshida, A., Yamaguchi, Y., Nonomura, K., Kawakami, K., Takahashi, Y., Miura, M. Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system. Genes Cells. 15 (5), 501-512 (2010).
- Chen, F., LoTurco, J. A method for stable transgenesis of radial glia lineage in rat neocortex by piggyBac mediated transposition. J Neurosci Methods. 207 (2), 172-180 (2012).
- Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A. Neonatal subventricular zone electroporation. J Vis Exp. , (2013).
- Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nat Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).
- Subach, O. M., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Verkhusha, V. V. An enhanced monomeric blue fluorescent protein with the high chemical stability of the chromophore. PLoS One. 6 (12), (2011).
