Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Neonatal PIAL Surface Electroporation

Published: May 7, 2014 doi: 10.3791/51319
* These authors contributed equally

Summary

Pial overflaten er en unik stamfar sone i CNS som får stadig større oppmerksomhet. Heri, we detalj en fremgangsmåte for hurtig genetisk manipulering av denne progenitor sonen ved hjelp av en modifisert metode electroporation. Denne prosedyren kan brukes til cellulære og molekylære undersøkelser av celle linjene og signalveier er involvert i celledifferensiering og å belyse skjebnen og egenskaper av datterceller.

Abstract

I løpet av de siste årene pial overflaten har blitt identifisert som en germinal nisje av betydning under embryonal, perinatal og voksen nevro-og gliogenesis, inkludert etter skade. Men metoder for genetisk avhøre disse progenitor populasjoner og sporing sine linjene hadde vært begrenset på grunn av manglende spesifisitet eller tidkrevende produksjon av virus. Således har utviklingen på dette område vært relativt langsomt med kun en håndfull av undersøkelser av denne plasseringen. Electroporation har blitt brukt i over et tiår å studere nevrale stamcelleegenskaper i embryo, og mer nylig i barsel hjernen. Her beskriver vi en effektiv, rask og enkel teknikk for genetisk manipulering av pial overflate progenitors basert på en tilpasset electroporation tilnærming. Pial overflaten elektroporering åpner for lettvinte genetisk merking og manipulering av disse stamfedre, og dermed representerer en tidsbesparende og økonomisk tilnærming for å studere disse cellene.

Introduction

Nevrale stamceller og stamceller er til stede i hele pattedyr CNS 1, 2. Deres natur og egenskaper i embryonale og adulte germinale soner omkring de ventrikulære regioner av hjernen og ryggmargen har blitt grundig dokumentert i det siste tiåret 1-3. I stor grad har dette vært på grunn av utviklingen av stadig mer presise genetiske verktøy, for eksempel nervesystemet bestemt Cre rekombinasjon av floxed alleler eller retroviral avstamning tracing fire. Men en stamfar region-pial overflaten stamfar sone-har bare nylig blitt beskrevet i detalj 5-7 og venter omfattende undersøkelse.

Den pial overflaten av hjernen er definert som et grensesnitt mellom overflaten av hjernen og de ​​omkringliggende meninges 8. Under utviklingen neuroepithelial og, senere, radiale gliaceller slutt føtter feste til denne overflaten 9,10. Noen av granst nevroner i den menneskelige hjerne og mange nevrale mitoses er observert i denne regionen 11. Senere, under embryonisk neurogenesis, er kortikale interneuroner kjent for å traversere pial region, i tillegg til sin migrasjonsveier i den mellomliggende sone og subventricular sone 12-14. I løpet av denne perioden, kan stamceller dyrkes fra denne sonen, og det ser ut til å være en aktiv side av nevro-og gliogenesis fem. I den voksne hjernen, har det blitt rapportert at interneurons kan bli født fra pial overflate progenitors følgende hypoksisk utfordring 7. Men, har bidraget fra denne regionen til hans å genensis under embryonal og postnatal utvikling vært obskure delvis på grunn av vanskelighetene med spesifikt undersøke denne regionen seks. I den overlegne colliculus og i hjernebarken, kan overfladiske (eller laget jeg i cortex) interneurons modulere krets utgang av underliggende eksitatoriske nevroner bestander og dermed bidra significantly til funksjonen av disse strukturene. Spesielt lag 1 interneuroner er i glimrende posisjon til å regulere avfyring av nerveceller gjennom de øvre lagene av hjernebarken gitt sin omfattende tilkoblingsmuligheter til de overfladiske og dype lag av kortikale kolonner 15,16. På lignende måte, horisontale interneurons mottar eksitatoriske input fra kortikale og retinal fibre, prosjekt over et forholdsvis bredt område, og er spekulert å mediere hemming av neuronale populasjoner som svarer til fjern visuelle stimuli 17,18. Dessuten er deres morfologi godt egnet til å spille en potensiell rolle i den mønstrede bølgeaktivitet i utviklings visuelle systemet 19. Interessant, interneuron utvikling og modning skjer i stor grad etter fødselen. Dessuten har denne modningsprosessen er funnet å være regulert av neuronal aktivitet og er derfor et substrat av utviklings plastisitet med livslang konsekvenser på kretsfunksjon 20,21. Spesielt, no arrangører er beskrevet som kan spesifikt mot disse cellene transgenically. Oppdeling av stamceller kan målrettes med retrovirus 7, men virusproduksjon er tidkrevende og krever dyktighet for å gi de høye titere som er nødvendig for celle transduksjon.

Electroporation har ført til en renessanse i studiet av neurodevelopment som det gir mulighet for rask og effektiv genetisk avhør av signalveier i nevrale stamceller 4, 22, 23. Electroporation innebærer injeksjon av plasmid-DNA, etterfulgt av leveringen av elektriske pulser til utsiden av hodet, for å ensrettet drive DNA inn i de prolifererende stamceller som omgir ventriklene 4, 22, 23.. Electroporation ser ut til å kreve transport av celler gjennom M-fasen av cellesyklusen for ekspresjon av plasmid transgener 24. Nærmere bestemt er det blitt funnet at bareceller som passerer gjennom M fase innen 8 hr av elektroporering av plasmider vil uttrykke transgener til tross for deres effektiv levering til alle cellene i ~ 160 mikrometer av ventrikkel veggen 24. Det er spekulert på at dette er på grunn av behovet for atom konvolutt sammenbrudd i slik at for atom tilgang av episomal plasmider, som kjemikalier forårsaker atom permeabilization kan indusere ekspresjon av plasmider i innlegget mitotiske celler 25. Opprinnelig benyttet i embryo 22, ble elektroporering tilpasset for bruk i postnatal hjernen mye senere 26, 27. Nylig har vi tilpasset electroporation for bruk i den genetiske manipulering av pial overflate progenitorer 6. Videre, ved hjelp av denne tilnærmingen vi har vist at det er tydeligvis to forskjellige linjer av stamfedre i denne region-interneuronal og astrocytic seks. Denne protokollen detaljer en enkel, rask og effektiv måte å målrette disse cellene for avhøreti mekanismene som regulerer utviklingen av disse cellene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne fremgangsmåten er i samsvar med Cedars-Sinai IACUC krav. Etterforskerne skal sikre institusjonell IACUC etterlevelse før du fortsetter. Alle verktøy og reagenser bør steriliseres før bruk.

En. Utarbeidelse av verktøy, løsninger, og DNA Blanding

  1. Sett 100-mm brann polert borsilikatglass kapillarrør inn en mikropipette avtrekker. Sett oppvarming for å tillate standard vektet pull å danne pipettespissen på ca 17,5 mm. Skjær tips med skarpe kirurgiske sakser i en avstand omtrent 8-9 mm fra begynnelsen av spissen for å lage en omtrent 100 mikrometer i diameter åpning.
  2. Gjør en lager 1% vekt / volum fast grønn oppløsning ved å blande filtrert nuclease-fritt vann (anvendelse av en 20-um sprøytefilter) med tørt fast grønt.
  3. Isoler renset endotoxin-fritt plasmid DNA som er sterkt konsentrert (dvs.> 3 ug / ul), fortynnet i Tris-EDTA (TE) buffer. Legg ønskede mengder av plasmidtil blandingen fortynnet i TE-buffer, og legge til et 01:10-forhold av 1% fast grønn løsning (slik at en 0,1% vekt / volum sluttkonsentrasjon på rask grønn). Bruk en 0,5-2,0 pg / mL sluttkonsentrasjon på plasmid for sterk ekspresjon av transgener.

2. Animal Anestesi, Pipette Laster, og PIAL Surface Plasmid Injection

  1. Hypotermi anestesi på 1-2 dagers postnatal mus ved å plassere dem på en petriskål som plasseres på is i 5-8 min (tiden er avhengig av valpen alder / vekt). Etter nedkjøling blir bekreftet ved mangel på bevegelse fra tå-klemming og / eller halerefleks, mus er klar til å bli injisert. Plasser dyrene tilbake på isen hvis smerte reflekser er tydelig. Injeksjonsprosedyren og elektroporering ta mindre enn 2-3 min i total så tid til nedkjøling, injeksjon, og electroporation prosedyrer tilsvarende for å opprettholde passende anestesi.
  2. Under bedøvelse, ved å bruke en standard pipette, omhyggelig pipette ønskede mengde av plasmid bland som skal injiseres (0,5-2 pl) på et stykke av parafinvoks film som referanse. Her blir et totalt volum på 0,5 pl av plasmid blandingen injiseres. Deretter ved bruk av en mikro injektor, forsiktig sette sammen glass kapillær pipette inn i rør inneholdende plasmid-blanding. Ta ekstra forholdsregler for å hindre spissen fra å bryte ved å gjøre at det ikke berører kantene av røret. Aspirer løsningen inn i pipetten ved sakte å ringe tilbake overføringen hjulet. Når et tilstrekkelig volum har blitt lastet inn i pipetten, ringe frem til trykket går tilbake til nøytral posisjon 0 hPa.
  3. Bruke 300-450 hPa press for injeksjon for å sikre hensiktsmessig press for jevn påfylling i pial overflaten / meningeal plass, plassere tuppen nærheten av pipettert parafinvoks film referansen injeksjon (fra 2,2) og bruke fotpedalen fra mikro injektor for å løse ut en volum på parafinvoks film. Juster trykket tilsvarende inntil beløpet kastet ut tilsvarer den tidligere pipettert reference volum.
  4. Når spissen er blitt ekvilibrert og anestesi har blitt bekreftet, pups er klar til å bli injisert.
  5. Målet med forsøket er å injisere plasmid mix under skallen og over pial flater, for DNA elektroporering nedover i de pial overflatestamfedre (Figur 1a). For cortex injeksjoner, hold valpen ned ved hjelp av tommelen og pekefingeren på den mindre dominerende hånd. Kortikale halvkuler og andre overflatiske strukturer som den overlegne colliculi er synlig mellom P0 og P2, noe som åpner for lettvinte målretting av disse strukturene (Figur 1b). Bruke den dominerende hånd og målet ønsket region av cortex (dvs. motor, somatosensoriske, etc.), setter pipette forbi huden og kraniet ta vare å unngå cerebrale arterier. Sørge for å hindre enhver ytterligere gjennomtrengning av spissen forbi hodeskallen (som er indikert ved mangel på ytterligere motstand like etter at nålen er stukket gjennom skallen).
  6. Sprøyt plasmid løsning ved hjelp av fotpedalen av mikro injektor og sørg for at den sprer seg jevnt over vevet (Figur 2A).
    Merk: Det er svært viktig å empirisk bestemme en tilnærming som maksimerer plasmid levering og samtidig unngå hematom som følge av væsketrykket. Dette kan gjøres ved å justere varigheten av injeksjonen, den vinkel, volumet, og den eksakte target området for å unngå vaskulære forstyrrelser.
  7. Pass på å prøve og holde spissen tørker inn mellom injeksjoner ved å plassere spissen i testdråper fra injeksjoner gjort tidligere på voks papir eller plast parafin film. Dette er nødvendig for å hindre at spissen akkumulering av fordampet og krystallisert DNA-løsning, noe som kan resultere i tilstopping av tuppen og inkonsekvente leveringsmengder.

Tre. Electroporation

  1. Sett Electroporator til 135-150 V for fem pulser, som varer 50 msek, med 950 msek intervaller mellom hver puls. For å øke konduktans oghindre brenning av huden, omfatter 3 mm platina tweezertrodes med elektroporering gel. Sjekk for toe-klemming og hale reflekser på dette punktet for å sikre anestesi. Hvis responsive, legg på is i flere minutter for å bedøve.
  2. For cortex (og superior colliculus) injeksjoner, benytter en 3 mm elektrode (figur 2B) for å øke levedyktigheten av unger (sammenlignet med 7 - og 10-mm-elektroder, som er brukt for ventrikulær sone electroporation). Plasser negativt ladet probe av elektroden over injiserte området, og de ​​positivt ladede sonde rundt den kontralaterale region under øyet slik at elektroderetningen er ved en 45-60 ° vinkel i forhold til midtlinjen (figur 2C).
  3. Bruk fotpedalen av electroporator å utløse nåværende og hold tweezertrodes på plass for 3-5 pulser, avhengig av valpen alder og vekt, effektivt målrette DNA inn i underliggende pial overflateceller ved regnskapsføring kurvaturav halvkuler.
    Merk: Den negative pol kan feies over injeksjonsområdet mellom pulser eller en større elektrode kan anvendes for å øke electroporated området.
  4. Umiddelbart etter elektroporering, forsiktig vaske av gel fra unger og plassere dem under en varmelampe i ca 5 min.
  5. Valper vil akutt mister sin naturlige rødlig-rosa fargetone i minuttene etter elektroporering grunn cyanose. Observere valpene for utvinning av naturlige farge og initiering av normal bevegelse før han returnerte dem til sine bur.
  6. Sørg for re-sosialisering med moren ved å observere om hun bringer valpene tilbake til reiret og begynner grooming dem. Hvis hun blir aggressiv, sørge for at valpene ikke har rester av gel og ruge dem med noen av sengetøy å overføre lukt til valpene.

4. Modifikasjoner for målretting Superior Colliculi

Targeting:

  1. Inject superior colliculus på samme måte som cortex, men merk at målområdet ligger like bakre og lateralt for lambda, og omtrent på midtlinjen (figurene 3A og 3B). Med vellykkede injeksjoner, plasmidet blanding naturligvis fyller konturene av superior colliculus. Når injeksjoner er foretatt med hell, dyr er klar for elektroporering.

Electroporation:

  1. I en svært tilsvarende måte, for colliculus superior injeksjoner, plasserer den negativt ladede probe av elektroden enn det injiserte område, og den positivt ladede sonde rundt øyet, snute eller hake, kjøre DNA inn i de overfladiske regioner av superior colliculus (figur 3C) . I dette tilfelle er elektroden orientering ved en 25-40 ° vinkel i forhold til midtlinjen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Pial overflate electroporation resulterer i ekspresjon av plasmid-DNA i celler, for det meste-progenitorer ved eller nær pial flaten 6. Mer spesifikt, er orienteringen av elektrodene kritisk i dikterer retning av plasmid bevegelse og påfølgende ekspresjon. Således, i to elektrode-konfigurasjoner, er plasmidet rettet i nesten rett vektor mellom den negative og positive elektroden. Derfor, hvis negative pol er plassert over injeksjonsstedet, og den positive pol er ventral til den negative pol, plasmid vil bli tvunget inn i den pial overflate. Det forutsettes at innrette elektrodene for å produsere løpende vektorer vinkelrett på overflaten ville være mest ideelle. Med passende elektrode retning, og bruk av mindre, mer focally målrettede elektroder, er overlevelse 100%. Men i noen regioner, som for eksempel midthjernen, har omsorg for å bli tatt for å unngå dagens leveranse som kan stoppe hjertet, og dermed cause redusert levedyktighet av electroporated museunger. Nylig beskrevet tri-elektrodekonfigurasjoner eller andre modifikasjoner kan hjelpe til å målrette mer vanskelige områder ved å unngå strukturer involvert i vitale funksjoner som hjertefrekvens 28. Det er viktig å se pups for riktig re-oppvarming til deres naturlige kroppstemperatur, noe som er tydelig ved bevegelse og farge. Når de kommer tilbake til farge, kan de plasseres tilbake i reiret. Mødre fra CD1 stamme av mus som vi oftest benytter umiddelbart begynne å pleie de returnerte valpene. Imidlertid kan andre stammer være mer variabel, blir aggressive eller neglisjerende. Overføre lukten av sengetøy til valpene vanligvis hindrer disse problemene. I stammer hvor omsorgssvikt eller aggresjon er alvorlig, fremme valper til mødre fra CD1 belastningen er den beste løsningen.

Merkede celler blir vanligvis observert i mange måneder etter elektroporering 6.. Men, som med alle electroporation metoden, utvanner med celledeling 29 plasmid DNA. Den samme grad av plasmid fortynning sett i raske sykkel populasjoner (f.eks SVZ stamfedre) er ikke observert i vår pial overflaten befolkningen, noe som tyder på mindre spredning seks. Men, har vi nå ansette nylig beskrevet transponering teknologier (f.eks piggyBac) for å dempe denne fortynningen problemet helt ved å tillate for stabil innsetting av transposoner inn i genomisk DNA 29, 30. Alternativt kunne Cre rekombinase-uttrykker plasmider bli elektroporert inn Cre reporter mus å megle stabil genetisk sporing av disse cellene 31.

Våre innledende resultater har antydet at størstedelen av cellene er mitotiske ved elektroporering 6, i overensstemmelse med data som er beskrevet i embryonale CNS-spesifikt, etiketter som elektroporering et sett av prolifererende celler mellom S-og M-fasene av cellesyklusen 24.. Imidlertid er videre undersøkelser for å definere identiteten til og slektsnavn for electroporated celler ved pial overflaten, så vel som å endelig fastslå deres proliferative karakter som det er mange eksempel på falsk kjemisk og genetisk merking av celler i litteraturen 4.. Videre har vi registrert lokalt hematom på injeksjonsstedet, spesielt i cortex-når omsorg er ikke tatt for å levere små volumer, eller når nødvendige forholdsregler for å unngå vaskulær avbrudd er ikke fulgt.

Vår forrige karakterisering indikerer minst to linjer av celler - astrocytic forløpere og interneuron stamfedre 6. Astrocytter pleier å ligge på pial overflaten (Figur 4A) og hver celle danner en tett sky av perifer astrocytic behandler seks. Interneuroner stort sett ligge på pial overflaten, men noen celler kan bli funnet i nesten alle kortikale lag eller dypere i den overlegne colliculus seks. ThESE nevroner stille omfattende dendritter, som kan være så lenge som flere hundre mikrometer (Figur 4B). Vi har ikke observert bevis for merking av oligodendrocytes eller eksitatoriske nevroner i hjernebarken seks. Flertallet av electroporated celler synes å ha gått gjennom mitose i nær tidsmessig nærhet til EP prosedyre cortex seks. Spesielt elektroporert EGFP + celler er dobbeltmerket med DNA replikering markør BrdU når pulset 2 hr før med denne tymidin analog (Tall 4C-4C 3). Det er imidlertid viktig å merke seg at vi har sett tegn på pericytic og / eller endoteliale cellemerking i disse regionene 6.

Figur 1
Figur 1. Electroporation avneonatal pial overflate (A) Koronal seksjon skjematisk viser det område av cortex som er rettet ved injeksjon. Celler som vises langs lag av hjernebarken er eksempler på faktiske observerte blandede populasjoner av electroporated celler, inkludert stamceller og interneuronal astrocystic forløpere. (B) Bilde av en postnatal dag to mus før injeksjon, som beskriver de regionene i pial overflaten interesse, cortex (CTX) og overlegen colliculus (SC).

Fig. 2
Figur 2. Postnatal elektroporering av det overfladiske cortex (A) Eksempel injeksjon av dorsal cortex etter rettet mot midtpunktet mellom øyet og lambda, før elektroporering. (B) Avhengig avfylte pups og regionen av interesse, fleksibilitet varierte størrelser av platina tweezertrodes kan brukes for elektroporering (3-mm, 7 mm, og 9 mm). 3 mm i diameter elektroder brukes vanligvis for pial overflaten elektroporering (se tekst for diskusjon). (C) Electroporation av hjernebarken. Legg merke til plasseringen av tweezertrodes, å plassere den positive probe under øyet, tillater strøm å bli drevet til den ventrale side.

Figur 3
Figur 3. Superior colliculus målrettet postnatal elektroporering (A) Injeksjon av en to-dagers gammel valp i den overlegne colliculus, viser den manuelle beherskelse av bedøvet valp og plassering av pipettespissen rett utenfor skallen. (B) Injeksjon viser dispergert plasmaetsid DNA-løsning i området av superior colliculus (SC). (C) Plassering av tweezertrodes for elektroporering av SC, kjøring DNA mot dorsal overflaten av SC på injeksjonsstedet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Superior colliculus målrettet postnatal elektroporering (A) En face, stabler maksimal projeksjon av confocal bilde fra dorsolaterale cortex ~ 2 uker etter elektroporering av kontroll fluorescerende reporter plasmider uttrykker membran-merket Clover 32 (grønn) og TagBFP2 33 atom protein (blå fluorescens pseudocolored rød). (B) Koronal delen av en kortikal interneuron omtrent to måneder etter elektroporering, viser omfattende dendritter. Skala bar måler 100 mikrometer i (A, C) og 40 mikrometer i (B). (CC 3) sagittal-delen av pial overflaten av colliculus superior viser at størstedelen av EGFP + celler er merket med en enkelt puls av BrdU i 2 timer før elektroporering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den mest kritiske aspekt for vellykket elektroporering av pial overflate progenitorer er: 1) målretting av plasmid blanding til pial overflaten; 2) å unngå generering av hematomer på injeksjonsstedet; og 3) å unngå dødelighet assosiert med midthjernen elektroporering.

Hensiktsmessig rettet pial overflate oppnås ved målte og forsiktig punktering av hodet for å unngå gjennomtrengning av pial overflate. Feilaktig målretting til den overliggende hud og underliggende ventrikkel eller hjerne parenchyma bekreftes ved: 1) forskyvning av den raske grønne fargestoff med huden ved forsiktig å gni vevet (dvs. den raske grønt er lokalisert over skallen i hud og bindevev) eller 2) ved bortfall av den raske grønt fargestoff inn i hjernen, som indikerer at plasmidet blandingen har gått inn i ventrikkel og / eller parenchyma. Riktig pial overflaten lokalisering av plasmidet blandingen vil bli dokumentert av fargestoff akkumulering under skallen thpå kan ikke bli forstyrret av myk hud fortrengning. Likevel er praksis og dyktighet som kreves for denne vellykkede målretting. Hematoma formasjonen er sannsynligvis forårsaket av forstyrrelse av blodkar etter injeksjon plasmid. Blodpropp vil bli observert på injeksjonsstedet i dagene og ukene etter elektroporering når vevet blir samlet. For å unngå hematomer, justere pulslengde på væsken injeksjon og / eller ta notat av det generelle mønsteret av hjernens blodforsyning for å unngå fartøy avbrudd. Generelt, er den overlegne colliculus mindre utsatt for koagulering. Død på grunn av elektrisk strøm levert av tweezertrodes er lett unngås ved å bruke 3 mm tweezertrodes til mer focally levere strøm og ved å dirigere elektrodene bort fra ventral midthjernen som demonstrert (Tall 2C og 3C).

En sjefs brist av teknikken er at målområdet er begrenset av størrelsen på plasmidet løsning spredningog størrelsen av elektrodene. En levering av 0,5 pl av plasmid genererer et område på omtrent 3 mm, og således er godt tilpasset til 3 mm elektrodestørrelse. Uansett hvilken tiltaket er mindre (løsning spredt område eller elektrode padle område) vil diktere den endelige størrelsen på oppdateringen av electroporated celler. Dessuten er bare et undersett av celler som er merket på grunn av behovet for mitose for transgen ekspresjon 24.. Men dette er en fordel for å studere stammen eller progenitor populasjoner og celledifferensiering.

Pial overflaten elektroporering er en metode som åpner for robust genetisk manipulering av pial overflatestamfedre og deres etterkommere. Denne teknikken er hurtig, enkel og effektiv, og gir et mer spesifikt og enklere måte å målrette disse celler når sammenlignet med den eneste andre sammenlign tilnærming retroviral transduksjon. Høy titer virusproduksjonen foregår dyktighet, uker av gangen, og utgjør sikkerhetsrisiko - spesielt i tilfellet av pantropic pseudotyped retrovirus. Videre er elektroporering noe mer fleksibelt som den ikke krever viral kloning og produksjon. Enhver eukaryot ekspresjonsvektor som kan anvendes, innbefatter virus plasmider. Videre kan maxiprep-ed plasmider blandes og matches for enkel co-elektroporering. Vanligvis er det en ~ 90-95% ko-ekspresjon for to gitte plasmider med tilsvarende promotorer. I bør bemerkes at mens vi har bare benyttet denne teknikk rettet i cortex og superior colliculus, bør fremgangsmåten være mottakelig for de fleste pial eller overfladiske regioner av CNS, forutsatt at det er plass for den lokale akkumulering av plasmid-DNA før strømleverings .

Electroporation av natur har en tendens til å favorisere transduksjon av mitotiske celler 24. Således bør elektroporering av voksne dyr være mulig, men ville sannsynligvis resultere i mange færre celler som uttrykker transgener på grunn av redusert proliferativ aktivitet ved aldring. Men som nylig beskrevet av Jaubodinog kolleger, målretting av postmitotic celler i denne regionen kan være mulig ved å bruke trans-sykloheksan-1, 2 - diol, som åpner for atom plasmid tilgang ved permeablilizing kjernefysiske konvolutten 25. Dessuten er elektroporering veldig mye kompatibel med Cre teknologier eller andre konstruert musetyper 31. Til slutt, vil transposon teknologi tillater stabil somatisk transgenesis av denne populasjonen 29, 30. Til sammen representerer pial overflaten elektroporering en fremragende og fleksibelt verktøy for den genetisk manipulering av disse unike progenitor domener.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å takke støtte fra Samuel Oschin Comprehensive Cancer Institute Cancer Research Forum Award samt midler fra Regenerative Medicine Institute of Cedars-Sinai, og den Guerin familie. Prosjektet er beskrevet ble støttet i form av en CTSI Kjerne Voucher finansiert av National Center for Forskning Resources, Grant UL1RR033176, og er nå på Nasjonalt Senter for Advancing Translasjonsforskerne Sciences, Grant UL1TR000124. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis de offisielle visningene av NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fire Polished Borosilicate Tubing World Precision Instruments, Inc. 1B100F-4
Micropipette Puller Sutter Instruments Company P-30
Fast Green FCF Sigma Aldrich, Inc. F7528
XenoWorks Digital Microinjector Sutter Instruments Company
ECM 830 Generator Harvard Apparatus, BTX Instrument Div 45-0052
3-mm Platinum Tweezertrodes Harvard Apparatus, BTX Instrument Div 45-0487
SignaGel Electrode Gel Cardinal Health 70315-025
Tris-EDTA Buffer, pH 8.0 Integrated DNA Technologies, Inc. 11-01-02-05
Infrared Heat Lamp VWR 36547-009
Fine Scissors Sharp Fine Science Tools 14060-09

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Breunig, J. J., Haydar, T. F., Rakic, P. Neural stem cells: historical perspective and future prospects. Neuron. 70 (4), 614-625 (2011).
  2. Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287 (5457), (2000).
  3. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
  4. Breunig, J. J., Arellano, J. I., Macklis, J. D., Rakic, P. Everything that glitters isn't gold: a critical review of postnatal neural precursor analyses. Cell Stem Cell. 1 (6), 612-627 (2007).
  5. Costa, M. R., Kessaris, N., Richardson, W. D., Gotz, M., Hedin-Pereira, C. The marginal zone/layer I as a novel niche for neurogenesis and gliogenesis in developing cerebral cortex. J Neurosci. 27 (42), 11376-11388 (2007).
  6. Breunig, J. J., et al. Rapid genetic targeting of pial surface neural progenitors and immature neurons by neonatal electroporation. Neural Dev. 7, (2012).
  7. Ohira, K., et al. Ischemia-induced neurogenesis of neocortical layer 1 progenitor cells. Nat Neurosci. 13 (2), 173-179 (2010).
  8. Bystron, I., Blakemore, C., Rakic, P. Development of the human cerebral cortex: Boulder Committee revisited. Nat Rev Neurosci. 9 (2), 110-122 (2008).
  9. Schmechel, D. E., Rakic, P. A Golgi study of radial glial cells in developing monkey telencephalon: morphogenesis and transformation into astrocytes. Anat Embryol (Berl. 156 (2), 115-152 (1979).
  10. Halfter, W., Dong, S., Yip, Y. P., Willem, M., Mayer, U. A critical function of the pial basement membrane in cortical histogenesis. J Neurosci. 22 (14), 6029-6040 (2002).
  11. Bystron, I., Rakic, P., Molnar, Z., Blakemore, C. The first neurons of the human cerebral cortex. Nat Neurosci. 9 (7), 880-886 (2006).
  12. Tanaka, D. H., Maekawa, K., Yanagawa, Y., Obata, K., Murakami, F. Multidirectional and multizonal tangential migration of GABAergic interneurons in the developing cerebral cortex. Development. 133 (11), 2167-2176 (2006).
  13. Ang Jr, E. S., Haydar, T. F., Gluncic, V., Rakic, P. Four-dimensional migratory coordinates of GABAergic interneurons in the developing mouse cortex. J Neurosci. 23 (13), 5805-5815 (2003).
  14. Tamamaki, N., Fujimori, K. E., Takauji, R. Origin and route of tangentially migrating neurons in the developing neocortical intermediate zone. J Neurosci. 17 (21), 8313-8323 (1997).
  15. Larkum, M. E. The yin and yang of cortical layer 1. Nat Neurosci. 16 (2), 114-115 (2013).
  16. Jiang, X., Wang, G., Lee, A. J., Stornetta, R. L., Zhu, J. J. The organization of two new cortical interneuronal circuits. Nat Neurosci. 16 (2), 210-218 (2013).
  17. Endo, T., Isa, T. Functionally different AMPA-type glutamate receptors in morphologically identified neurons in rat superficial superior colliculus. Neuroscience. 108 (1), 129-141 (2001).
  18. Schmidt, M., Ozen Boller, M., G,, Hall, W. C. Disinhibition in rat superior colliculus mediated by GABAc receptors. J Neurosci. 21 (2), 691-699 (2001).
  19. Ackman, J. B., Burbridge, T. J., Crair, M. C. Retinal waves coordinate patterned activity throughout the developing visual system. Nature. 490 (7419), 219-225 (2012).
  20. De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes. Nature. 472 (7343), 351-355 (2011).
  21. Boller, M., Schmidt, M. Postnatal maturation of GABA(A) and GABA(C) receptor function in the mammalian superior colliculus. Eur J Neurosci. 14 (8), 1185-1193 (2001).
  22. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
  23. De Vry, J., et al. In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery. Prog Neurobiol. 92 (3), 227-244 (2010).
  24. Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex. J Neurosci. 30 (20), 7028-7036 (2010).
  25. De la Rossa, A., et al. In vivo reprogramming of circuit connectivity in postmitotic neocortical neurons. Nat Neurosci. 16 (2), 193-200 (2013).
  26. Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PLoS One. 3 (4), (2008).
  27. Chesler, A. T., Le Pichon, C. E., Brann, J. H., Araneda, R. C., Zou, D. J., Firestein, S. Selective gene expression by postnatal electroporation during olfactory interneuron nurogenesis. PLoS One. 3 (1), (2008).
  28. dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nat Commun. 3, (2012).
  29. Yoshida, A., Yamaguchi, Y., Nonomura, K., Kawakami, K., Takahashi, Y., Miura, M. Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system. Genes Cells. 15 (5), 501-512 (2010).
  30. Chen, F., LoTurco, J. A method for stable transgenesis of radial glia lineage in rat neocortex by piggyBac mediated transposition. J Neurosci Methods. 207 (2), 172-180 (2012).
  31. Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A. Neonatal subventricular zone electroporation. J Vis Exp. , (2013).
  32. Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nat Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).
  33. Subach, O. M., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Verkhusha, V. V. An enhanced monomeric blue fluorescent protein with the high chemical stability of the chromophore. PLoS One. 6 (12), (2011).

Tags

Neuroscience Developmental Biology neonatal gnager skjebne kartlegging avstamning tracing genetisk manipulasjon plasmid DNA piggyBac tol2 transposon TCHD elektroporering
Neonatal PIAL Surface Electroporation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Levy, R., Molina, J., Danielpour,More

Levy, R., Molina, J., Danielpour, M., Breunig, J. J. Neonatal Pial Surface Electroporation. J. Vis. Exp. (87), e51319, doi:10.3791/51319 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter