Summary
Pial yüzey artan bir ilgi alıyor MSS benzersiz bir ata bölgesi. Burada, detay değiştirilmiş elektroporasyon yöntemi kullanarak bu progenitör bölgenin hızlı genetik manipülasyon için bir yöntemi biz. Bu prosedür, hücre soyları ve hücre farklılaşması dahil sinyal yollarının hücresel ve moleküler araştırmalar için kullanılabilir ve kız hücrelerin kaderini ve özellikleri ortaya çıkarmak için.
Abstract
Son birkaç yılda Pial yüzey yaralanma sonrası da dahil olmak üzere, embriyonik perinatal ve yetişkin nöro-ve gliogenesis sırasında önemi bir germinal niş olarak tespit edilmiştir. Bununla birlikte, genetik olarak bu hücrelerin popülasyonları sorgulama ve soy izleme için yöntemler, özgünlüğü ya da zaman virüs üretimini tüketen olmaması nedeniyle sınırlı olmuştu. Böylece, bu bölgede ilerleme bu konumu soruşturmaların sadece bir avuç nispeten yavaş olmuştur. Elektroporasyon embriyo nöral kök hücre özelliklerini incelemek için bir on yıl için kullanılan ve son zamanlarda doğum sonrası beyinde olmuştur. İşte biz, bir uyarlanmış elektroporasyon yaklaşıma dayalı pial yüzey atalarıdır genetik manipülasyon için verimli, hızlı ve basit bir teknik açıklar. Pial yüzey elektroporasyon dolayısıyla bu hücrelerin incelenmesi için bir zaman tasarrufu ve ekonomik yaklaşımı temsil eden, bu atalarıdır uyduruk genetik etiketleme ve manipülasyon için izin verir.
Introduction
Sinir kök ve projenitör hücreler, memeli merkezi sinir sistemi 1, 2 mevcut bulunur. Onların doğası ve beyin ve omurilik ventriküler bölgelerini çevreleyen embriyonik ve yetişkin germinal bölgelerinde özellikleri de yoğun geçen on yılda 1-3 belgelenmiştir. Büyük ölçüde, bu nedeniyle böyle floxed alellerin veya 4 izleme retroviral soy sinir sistemi belirli Kre rekombinasyon olarak giderek kesin genetik araçlarının geliştirilmesi olmuştur. Ancak, bir ata bölge Pial yüzey atası sadece son zamanlarda herhangi bir detay 5-7 tarif edilmiş bölge-vardır ve bekliyor kapsamlı inceleme.
Beynin Pial yüzeyi beynin yüzeyine ve çevredeki menenjlerin 8 arasında arabirim olarak tanımlanır. Daha sonra geliştirme, nöroepitel ve sırasında, radyal glial uç ayaklar bu yüzeye 9,10 takmak. Köknar Bazıinsan beyninin nöronal ve birçok mitoz st nöronların bu bölgede 11 'de görülmektedir. Daha sonra, embriyonik nöron sırasında, kortikal nöronlar ara bölge ve subventricular bölge 12-14 kendi göç yolları ek olarak, Pial bölge hareket bilinmektedir. Bu dönemde, kök hücreleri, bu bölgesinden kültürlenebilir ve nöro-ve gliogenesis 5 aktif sitesi olarak görüntülenir. Erişkin beyinde, o internöron hipoksik meydan 7 aşağıdaki Pial yüzey progenitörlerinden doğmuş olabilir bildirilmiştir. Ancak, embriyonik ve postnatal gelişim sırasında genensis için onun için bu bölgenin katkısı nedeniyle özellikle bu bölgeyi 6 araştıran zorluk kısmen belirsiz kalmıştır. Üstün colliculus içinde ve serebral korteks, yüzeysel (ya da kortekste tabaka I) internöron temel uyarıcı nöron popülasyonlarının devre çıkış modüle eden ve bu nedenle signific katkıdaBu yapıların işlevi antly. Özellikle, tabaka 1 internöron kortikal sütun 15,16 yüzeyel ve derin tabakalara göre kapsamlı bağlantı verilen serebral korteksin üst katmanlar boyunca nöronların ateş düzenleyen Başbakan konumda bulunmaktadır. Benzer bir şekilde, yatay internöron nispeten geniş bir alan üzerinde, kortikal ve retinal elyaf, proje uyarıcı girdi almak ve uzak görsel uyaranlara yanıt 17,18 nöron popülasyonlarının inhibisyonunun aracılık ettiği iddia edilmektedir. Ayrıca, kendi morfoloji gelişmekte görme sistemi 19 desenli dalga aktivitesi potansiyel bir rol oynamak için çok uygundur. İlginçtir, interneuron gelişme ve olgunlaşma doğumdan büyük ölçüde olur. Bundan başka, bu olgunlaşma süreci nöronal aktivite ile düzenlenir bulunmuştur ve bu nedenle de fonksiyonu devre 20,21 yaşam boyu sonuçlarıyla gelişim plastisite bir substrattır. Özellikle, no özel promoterler transgenik bu hücreleri hedef olabilir tarif edilmiştir. Bölme progenitörler retrovirüs 7 ile hedef olabilir, ancak virüs üretimi, zaman alıcıdır ve hücre transdüksiyonu için gerekli olan yüksek titrelerini üretmek üzere beceri gerektirir.
Bu sinir progenitörlerin 4, 22, 23, içinde sinyal yollarının hızlı ve etkili genetik sorgulama için izin verdiği Elektroporasyon nörolojik gelişim çalışmada bir rönesans yol açmıştır. Elektroporasyon, tek yönlü olarak ventriküller 4, 22, 23, çevreleyen çoğalan progenitörlerde DNA sürmek için başının dış elektrik darbeleri teslimi takiben plazmid DNA enjeksiyonu, içerir. Elektroporasyon plasmid 24 transgenlerin sentezlenmesi için hücre döngüsüne ait M fazı boyunca hücrelerin geçişini gerekli görünmektedir. Özel olarak, bulunmuştur ki, sadeceplasmidlerin elektroporasyon 8 saat içinde M faz geçen hücreler, ventriküler duvarın 24 ~ 160 um olan tüm hücrelere etkin teslimat rağmen transgenleri ifade edecektir. Nükleer geçirgenliği neden olan kimyasal maddeler postmitotik hücreleri 25 plasmidin sentezlenmesinin uyarılması gibi bu, epizomal plazmidlerin nükleer erişimi için de çekirdek zarı arıza için ihtiyaç nedeniyle olduğu düşünülmektedir. Başlangıçta embriyo 22 istihdam, elektroporasyon daha sonra 26, 27, doğum sonrası beyin kullanılmak üzere uyarlanmıştır. Son zamanlarda, yüzey Pial progenitörlerin 6 genetik manipülasyonu kullanmak için elektroporasyon adapte edilmiştir. Bundan başka, bu yaklaşımı kullanarak progenitörlerinin iki ayrı soylar bu bölge-internöronal ve astrositik 6 görünüşe olduğunu göstermiştir. Bu protokol sorgulama için bu hücreleri hedef için basit, hızlı ve güçlü bir şekilde ayrıntılarıBu hücrelerin gelişim düzenleyici mekanizmalar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu prosedür Cedars-Sinai IACUC gereklerine uygun olduğunu. Müfettişler önce işlem için kurumsal IACUC uyumunu sağlamalıdır. Bütün araçlar ve reaktifler, kullanılmadan önce sterilize edilmelidir.
1.. Araçları'nın hazırlanması, Çözümleri ve DNA Karışım
- Bir mikropipet çektirmesi içine 100 mm yangın parlatılmış borosilikat cam kapiller tüplerin yerleştirin. Yaklaşık 17,5 mm pipet oluşturan standart ağırlıklı çekme sağlamak için ısıtma ayarlayın. Kabaca 100 mikron çapında bir delik oluşturmak için ucu başından itibaren bir mesafe yaklaşık 8-9 mm keskin cerrahi makas ile ipuçları kesti.
- Bir hisse% 1 w / kuru hızlı yeşil (20 mikron şırınga filtresi kullanılarak) süzülür nükleazsız su karıştırılarak hızlı yeşil çözüm v olun.
- Tris-EDTA (TE) tampon maddesi içinde seyreltilmiş yüksek konsantre edilir saflaştırılmış endotoksin içermeyen plasmid DNA (örneğin,> 3 ug / ml), izole edilir. Arzu edilen plazmidin ekleme miktarlarıKarışıma TE tamponu içinde seyreltilmiş ve (w / hızlı yeşil bir son konsantrasyon% 0.1 v hale getirmek)% 1 hızlı yeşil çözelti, bir 01:10 oranına ekleyin. Transgenlerin sağlam ifade plazmidinin bir 0.5-2.0 ug / ul son konsantrasyon kullanın.
2.. Hayvan Anestezi, Pipet Yükleme ve Pial Yüzey Plazmid Enjeksiyon
- 5-8 dakika boyunca (yavru yaş / ağırlığına bağlı olarak zaman) için buz üzerine yerleştirilen bir Petri tabağına yerleştirilerek doğum sonrası 1-2 günlük olan fareler üzerinde hipotermi anestezi neden. Hipotermi toe-kısma ve / veya kuyruk refleks hareketi eksikliği tarafından onaylandıktan sonra, fareler enjekte edilmeye hazır. Ağrı refleksleri belirgindir ise buz üzerine hayvanları geri yerleştirin. Hipotermi, enjeksiyon ve elektroporasyon prosedürler buna uygun anestezi korumak için zaman çok enjeksiyon işlemi ve elektroporasyon toplamda en az 2-3 dakika sürer.
- Anestezi sırasında, standart bir pipet kullanarak dikkatlice pipet plasmi miktarını istenend başvuru için parafin bir film parçası üzerine (0.5-2 ul) enjekte edilmesi için karıştırın. Burada, plasmid karışımı 0.5 ul bir toplam hacim enjekte edilir. Daha sonra, bir mikro enjektör ile, dikkatli bir tüp ihtiva eden plasmid karışımı içine monte edilmiş cam kılcal pipet yerleştirin. Bu tüpün kenarlarına değmeyecek emin yaparak kırılmasını ucu önlemek için ekstra önlem almak. Yavaşça transfer kadranı geri çevirerek pipet içine çözüm aspire. Yeterli hacimde pipet içine konduktan sonra, 0 hPa nötr konuma basınç dönene kadar ileriye çevirin.
- (2,2) Pipetlenen parafin filmi referans enjeksiyon yakın ucu yere, hatta Pial yüzey / meningeal alanı doldurmak için uygun basıncı sağlamak ve bir çıkartmak için mikro enjektör ayak pedalı kullanmak enjeksiyon için 300-450 hPa basınç kullanılarak parafin film üzerine hacmi. Püskürtülen miktar önceden pipetle referenc eşit oluncaya kadar buna basıncını ayarlayıne hacmi.
- Uç dengelenmiş ve anestezi onaylandıktan sonra, yavrular enjekte edilmeye hazırdır.
- Deneyin amacı Pial yüzey soylarının (Şekil 1A) içine aşağı doğru DNA elektroporasyon izin vermek için kafatası altında ve pial yüzey üzerinde plasmid karışımı enjekte etmektir. Korteks enjeksiyonlar için, başparmak ve daha az dominant elin parmağı kullanarak yavru basılı tutun. Kortikal hemisferlerin ve bu üstün kolikül gibi diğer yüzeysel yapıları bu yapılar (Şekil 1B) arasında kolay hedefleme sağlayan, P0 ve P2 arasında görebilir. Korteks dominant el ve hedef istediğiniz bölgeyi (vs yani motor, duyusal,) kullanılarak, serebral arterler önlemek için dikkat çekici bir cilt ve kafatası geçmiş pipet eklemek. (Sadece kafatası delme işleminden sonra daha fazla direnç eksikliği ile gösterilir) kafatası geçen ucun daha fazla nüfuz etmesini önlemek için emin olun.
- Plazmaya enjekteid çözüm mikro enjektör ayak pedalını kullanarak ve emin doku (Şekil 2A) eşit olarak dağıtır olun.
Not: Bu deneysel nedeniyle sıvı basınç hematom kaçınarak plazmid teslimat maksimize bir yaklaşım belirlemek çok önemlidir. Bu, enjeksiyon süresi, açı, hacim ve vasküler bozulmasını önlemek için kesin hedef site ayarlama yapılabilir. - Denemek ve yağlı kağıt veya plastik parafin filmi daha önce yapılan enjeksiyonları testi damlacıklar halinde ucu yerleştirerek enjeksiyonlar arasında kurumasını ucunu tutmak için emin olun. Bu, ucu ve tutarsız uygulama hacimlerinin tıkanma neden olabilir buharlaştırıldı ve kristalize DNA çözeltisi ucu birikmesini önlemek için gereklidir.
3. Elektroporasyon
- Her darbe arasında 950 msn aralıklarla, 50 milisaniye süren beş bakliyat için 135-150 V Electroporator ayarlayın. Iletkenliğini artırmak için vecilt yanan önlemek için, elektroporasyon jel ile 3 mm platin tweezertrodes kapsamaktadır. Anestezi sağlamak için bu noktada ayak-kısma ve kuyruk refleksleri kontrol edin. Duyarlı ise, uyuşturmak için birkaç dakika buz üzerine yerleştirin.
- Korteks (ve birçok colliculus) enjeksiyonu için, (- ventriküler bölge elektroporasyon için kullanılır ve 10 mm elektrotlar, 7 ile karşılaştırıldığında) yavruların yaşama kabiliyetinin arttığı bir 3-mm elektrot (Şekil 2B) kullanır. Elektrot yönlendirme orta hatta (Şekil 2C) için 45-60 ° açıda olduğu şekilde göz altında kontralateral çevresinde enjekte alan ve pozitif yüklü prob üzerindeki elektrot negatif yüklü sonda yerleştirin.
- Eğrilik için muhasebe zaman geçerli tetiklemek için elektroporatörü ayak pedalını kullanarak etkili yatan Pial yüzey hücrelerin içine DNA hedefleme, yavru yaşı ve ağırlığına bağlı olarak, 3-5 bakliyat için yerinde tweezertrodes tutunyarıkürelerinin.
Not: negatif kutup darbe ya da daha büyük bir elektrot elektroporasyona alanını artırmak için kullanılabilir arasında enjeksiyon alanından geçer edilebilir. - Elektroporasyon hemen sonra dikkatlice yavrularından jel temizlemek ve yaklaşık 5 dakika için bir ısı lambası altına yerleştirin.
- Yavrular akut siyanoz nedeniyle elektroporasyon sonra dakika içinde kendi doğal kırmızımsı-pembe renk kaybedersiniz. Kafeslerine onları dönmeden önce, doğal renk ve normal hareketinin başlatılması kurtarma için yavrular gözlemleyin.
- O geri yuvasına yavrular getiriyor ve onları tımar başlar olmadığını gözlemleyerek anne ile yeniden sosyalleşmesini sağlamak. O agresif olursa, emin yavrular jel kalıntıları var ve yavrular için koku aktarmak için yatak bazı onları inkübe yok emin olun.
4.. Üstün kolikül Hedefleme için Değişiklikler
Hedefleme:
- Inject üstün korteks olarak aynı şekilde kollikulus ama hedef bölge sadece posterior ve lambda lateral ve kabaca orta hatta yatıyor unutmayın (Şekil 3A ve 3B). Başarılı enjeksiyonları ile, plazmid karışımı doğal üstün kollikulusun hatlarını doldurur. Enjeksiyonlar başarılı bir şekilde elde edildikten sonra, hayvanlar elektroporasyon için hazırdır.
Elektroporasyon:
- Çok benzer bir şekilde, üstün colliculus enjeksiyonlar için, üstün colliculus yüzeysel bölgesi (Şekil 3C) DNA'nın sürücü, enjekte alan ve göz, burun veya çene etrafında pozitif yüklü prob üzerinde elektrodun negatif yüklü prob yerleştirmek . Bu durumda, elektrot yönlendirme orta hatta bir 25-40 ° açı ile yer almaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hücreleri çoğunlukla progenitorlar-ya da pial yüzeyinin yakınındaki 6 plazmid DNA'nın ifade Pial yüzey elektroporasyon ile sonuçlanır. Daha spesifik olarak, elektrotların oryantasyonu plasmid hareket ve daha sonra ifade yönünü dikte kritiktir. Bu nedenle, çift elektrot yapılandırmalarında, plazmid negatif ve pozitif elektrot arasında yaklaşık düz bir vektör içinde yönlendirilir. Negatif kutup enjeksiyon yerinde üzerine yerleştirilir ve pozitif kutup negatif kutbuna ventral olduğunu, bu nedenle, plazma Pial yüzeyi içine zorlanır. Bu yüzeyine dik akım vektörlerinin üretilmesi için elektrotlar yönlendirme en ideal olacağı varsayılmıştır. Uygun elektrot yönlendirme ve daha küçük, daha odaksal hedefli bir elektrot kullanımı ile, hayatta kalma oranı% 100'dür. Ancak, bu tür Ortabeyin gibi bazı bölgelerde, bakım kalbi durabilir geçerli teslim önlemek için alınması gereken ve böylece CausE Electroporated fare yavrularının canlılığı azalır. Yeni tarif tri-elektrot yapılandırmalar ya da diğer modifikasyonlar, kalp hızı 28 gibi önemli bir fonksiyonları ile ilgili yapılar kaçınarak daha zor bölgeleri hedefleme yardımcı olabilir. Bu hareket ve renk ile belirgindir doğal vücut sıcaklığına yeniden ısınma düzgün için yavrular izlemek için önemlidir. Onlar renk döndüğünüzde, yuva geri konabilir. Biz en sık istihdam farelerin CD1 gerginlik Anneler derhal iade yavrular beslenmesi başlar. Ancak, diğer suşlar saldırgan ya da ihmalkar olma, daha değişken olabilir. Yavrulara yatak kokusu aktarılması, genellikle bu sorunları önler. Ihmal ya da saldırganlık şiddetli suşları, CD1 gerginlik annelere yavrular teşvik en iyi çözümdür.
Etiketli hücreler tipik elektroporasyon 6 sonra aylarca görülür. Ancak, herhangi bir el gibiectroporation yöntem olup, plazmid DNA, hücre bölünmesi 29 seyreltir. Hızlı bisiklet nüfus (örneğin SVZ'una atalar) görülen plazmid seyreltme aynı derecede az çoğalmasını 6 düşündüren, bizim pial yüzey nüfus görülmez. Ancak, şimdi genomik DNA'nın 29, 30 içine transpozonların istikrarlı sokulması için izin vererek tamamen bu seyreltme sorunu azaltmak için son zamanlarda açıklanan hukuka teknolojileri (piggyBac) kullanır. Seçenek olarak ise, Cre Rekombinaz ifade eden plazmidler bu hücrelerin 31 dengeli genetik izleme aracılık ettiği Cre raportör farelere elektropore edilebilir.
Başlangıçtaki sonuçlarımız eden hücrelerin çoğunluğu embriyonik CNS-spesifik olarak açıklanan veriler ile uygun olarak, elektroporasyon 6'nın zamanda mitotik olduğunu ileri sürmüşlerdir ki elektroporasyon S ve hücre döngüsünün 2 M fazları arasındaki çoğalan hücrelerin bir dizi etiket4.. Bununla birlikte, daha fazla araştırma Pial yüzeyinde Elektroporasyona tabi tutulan hücrelerin kimlik ve soy tanımlamak için hem de literatürde 4 yanıltıcı kimyasal ve genetik hücrelerin etiketlenmesi birçok örneği vardır gibi kesin çoğalma karakterini tespit etmek için gereklidir. Ayrıca, lokal enjeksiyon sitesi hematom özellikle korteks-zaman bakım küçük hacimli veya vasküler kesintileri önlemek için uygun önlemleri takip edilmez teslim alınmaz kaydetti.
Astrositik ön-maddeleri ve interneuron progenitorlar 6 - Daha önceki karakterizasyon hücrelerin en az iki soy gösterir. Astrositler Pial yüzeyi (Şekil 4A), kalma eğiliminde ve her hücre çevresel astrositik yoğun bir bulut 6 işler oluşturur. Internöron çoğunlukla pial yüzeyinde kalır, ancak bazı hücrelerin üstün colliculus 6 hemen hemen tüm kortikal katmanları ya da daha derin bulunabilir. These nöronlar sürece, birkaç yüz mikronluk (Şekil 4B) kadar geniş olabilir dendrit sergiler. Biz kortekste 6 oligodentrositler veya uyarıcı nöronların etiketlenmesi için kanıt görülmez. Elektroporasyona tabi tutulan hücrelerin çoğunluğu EP prosedür korteks 6 yakın zamanlarda yakınlık mitoz geçirilir görünmektedir. Özellikle, önce bu timidin analog (Şekil 4C-4C 3) ile 2 saat darbeli zaman EGFP + hücreler DNA replikasyonu işaretleyici BrdU ile çift etiketli elektroporate. Bununla birlikte, bu bölgelerde 6 pericytic ve / veya endotelial hücre etiketleme kanıt görmüş olduğunu not etmek önemlidir.
Şekil 1. Elektroporasyonenjeksiyonu üzerine hedeflenmektedir korteks bölgeyi gösteren neonatal pial yüzeyi (A) koronal kesit şematik. Korteks katmanları boyunca görüntülenen hücreleri ve öncü hücrelerden internöronal astrocystic öncüleri de dahil olmak üzere Elektroporasyona tabi tutulan hücrelerin Normal koşullarda karışık nüfusu, örnekleridir. (B) pial yüzey ilgi bölgeleri özetleyen enjeksiyonu öncesinde bir doğum sonrası günde 2 fare, görüntü, korteks (Ctx) ve üstün kollikulus (SC).
Şekil 2,. Yüzeysel korteks önce elektroporasyon için, göz ve lambda arasındaki orta, hedef sonra dorsal korteks (A) Örnek enjeksiyon bölgesinin Postnatal elektroporasyon. (B) bağlı olarak,yavrular ve ilgi bölgesi, platin tweezertrodes esneklik çeşitli boyutlarda yaş elektroporasyon için kullanılabilir (3 mm, 7 mm, ve 9 mm). 3-mm çaplı elektrotlar genellikle Pial yüzey elektroporasyon (tartışma için metne bakınız) için kullanılır. Korteks (C) Elektroporasyon. Ventral tarafına sürülen akım sağlayan, göz altında pozitif prob yerleştirerek, tweezertrodes yerleştirilmesi unutmayın.
Şekil 3.. Üstün kollikulus anestezi yavru ve sadece kafatası ötesinde pipet yerleştirme manuel kısıtlama gösteren, doğum sonrası elektroporasyon (A) üstün colliculus 2 günlük yavru Enjeksiyon hedeflemiştir. (B) dağılmış plazmaya gösteren Enjeksiyonüstün colliculus (SC) bölgesinde kimliği DNA eriyiği. SC elektroporasyon, enjeksiyon yerinde SC dorsal yüzeyine doğru DNA sürüş için tweezertrodes (C) Yerleştirme. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Şekil 4,. Superior colliculus yüz En postnatal elektroporasyon (A) hedef, eş odaklı görüntünün maksimum projeksiyon ~ 2 haftada ifade kontrol flüoresan raportör plasmidin elektroporasyon sonra dorsolateral korteksinden yığınlar zar-etiketli Clover 32 (yeşil) ve TagBFP2 33 nükleer protein (mavi floresan ps) kırmızı eudocolored. Bir kortikal interneuron yaklaşık iki ay sonrası elektroporasyon (B) Koronal bölümünde, geniş dendrit görüntüleniyor. Ölçek çubukları (B) 100 (A, C) mikron ve 40 mikron ölçer. (CC 3) EGFP + hücrelerinin çoğunluğu önce elektroporasyon BrdU 2 saat tek bir darbesi ile etiketlenir gösteren üstün kollikulusun pial yüzeyinin sagital kesit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Pial yüzey progenitörlerinin başarılı elektroporasyon için en önemli bir yönü vardır: 1) pial yüzeyine plasmid karışımı hedeflenmesi; 2) enjeksiyon sahasında hematom üretilmesini önlemek; ve 3) Ortabeyin elektroporasyon ile ilişkili mortalite kaçınarak.
Uygun Pial yüzeyi hedef Pial yüzeyin nüfuz etmesini önlemek için kafatası ölçülü ve dikkatli bir delik açarak gerçekleştirilir. Hafifçe doku (yani hızlı yeşil deri ve bağ dokusu kafatası üzerinde lokalize) ovuşturarak üzerine deri ile hızlı yeşil boya 1) değiştirmesi: örten deride veya altta yatan ventrikül veya beyin parankimi hedefleyerek uygunsuz kanıtladığı olacak ya da 2) plasmid karışımı ventrikül ve / veya parankimi gitti gösteren beyin içine hızlı yeşil boya, ortadan kalkması ile. Plazmid karışımı Uygun Pial yüzey lokalizasyonu kafatası th altında boya birikimi ile kanıtlanır olacaken nazik cilt deplasman tarafından rahatsız edilemez. Bununla birlikte, uygulama ve maharet bu başarılı hedefleme için gereklidir. Hematoma oluşum büyük olasılıkla plazma enjeksiyon ile damar bozulmasına neden olur. Kan pıhtıları doku ulaşılınca elektroporasyon birkaç gün veya hafta içinde enjeksiyon yerinde gözlenecektir. Hematom önlemek için, sıvı enjeksiyon darbe uzunluğunu ayarlamak ve / veya damar bozukluklarını önlemek için beyin damarlarında genel modeline dikkat çekmek. Genel olarak, üstün colliculus pıhtılaşmasına karşı daha az hassastır. Nedeniyle tweezertrodes tarafından sağlanan elektrik akımı ölüm kolayca daha fazla fokal akım sağlamak için 3 mm tweezertrodes kullanılarak ve uzak gösterildiği gibi ventral orta beyin (Şekiller 2C ve 3C), elektrotları yönlendirerek önlenir.
Tekniğin bir baş eksiklik hedef bölge plazmid çözeltisi yayılmasının büyüklüğü ile sınırlı olmasıdırve elektrotların boyutu. Plazmid 0.5 ul bir teslim yaklaşık 3 mm'lik bir alan oluşturur ve bu nedenle, 3 mm elektrot boyutuna çok iyi bir uyum olduğunu. Hangi ölçü (çözüm yayılma alanı veya elektrot kürek alan) küçük electroporated hücrelerin yama son boyutunu belirleyecektir olacaktır. Aynı zamanda, hücrelerin sadece bir alt yüzünden transgen ekspresyonu için 24 mitoz için ihtiyaç etiketlenir. Bununla birlikte, bu kök veya projenitör popülasyonları ve hücre farklılaşmasını çalışmak için avantajlıdır.
Pial yüzey elektroporasyon Pial yüzey atalarıdır ve onların soyundan sağlam genetik manipülasyon sağlayan bir yöntemdir. Bu teknik sadece diğer benzer bir yaklaşım-retroviral transdüksiyonu ile karşılaştırıldığında, bu hedef hücreleri daha özel bir ve daha kolay bir araç temin, hızlı, basit ve etkilidir. Yüksek titre viral üretim zaman beceri, hafta sürer ve güvenlik riskleri oluşturmaktadır - özellikle pantropik pseudot durumundayped retrovirüs. Viral kopyalama ve üretimini gerektirmez olarak Ayrıca, elektroporasyon biraz daha esnektir. Herhangi bir ökaryotik ifade vektörü viral plazmid de dahil olmak üzere, kullanılabilir. Ayrıca, maxiprep-ed plazmidler karışık ve co-elektroporasyon için kolay eşleştirilmiş olabilir. Tipik olarak, benzer promotörler ile herhangi bir verilen iki plazmid için bir ~% 90-95 eş-ifade yoktur. Sadece korteks ve üstün colliculus bu hedefleme tekniği kullanılabilir iken, yöntem, merkezi sinir sisteminin pek çok Pial veya yüzeysel bölgeleri için uygun olması gerektiği unutulmamalıdır olarak plazmid DNA birikimi için yerel alan önceki teslimat için geçerli olmaması şartıyla .
Doğası gereği Elektroporasyon mitotik hücre 24'ün transdüksiyonunu tercih eder. Bu nedenle, yetişkin hayvanlarda elektroporasyonu uygun olmalıdır, ancak muhtemelen çok daha az hücre yaşlanması ile indirgenerek proliferatif aktivitesi nedeniyle transgenleri ifade neden olur. Ancak, son zamanlarda Jaubodin tarafından ayrıntılıNükleer zarfı 25 permeablilizing nükleer plasmid erişim sağlar diol, - ve arkadaşları, bu bölgede postmitotic hücrelerinin hedeflenmesi trans-sikloheksan-1, 2 kullanılarak mümkün olabilir. Ayrıca, elektroporasyon Cre teknolojileri veya başka işlenmiş fare türlerine 31 ile çok uyumludur. Son olarak, transpozon teknoloji bu nüfus 29, 30 sabit somatik genetik dönüştürme için izin verir. Toplamda, pial yüzey elektroporasyon bu eşsiz progenitör alanların genetik manipülasyon için olağanüstü bir ve esnek bir aracı temsil eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Yazarlar Cedars-Sinai Rejeneratif Tıp Enstitüsü ve Guerin Ailesinden Samuel Oschin Kapsamlı Kanser Enstitüsü Kanser Araştırma Forumu Ödülü desteğini yanı sıra fon kabul etmek istiyorum. Açıklanan Proje Araştırma Kaynakları, Grant UL1RR033176 için Ulusal Merkezi tarafından finanse edilen bir CTSI Çekirdek Fiş şeklinde desteklenen ve Translational Bilimler, Grant UL1TR000124 ilerlemek için Ulusal Merkezi şimdi de edilmiştir. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka NIH resmi görüşlerini temsil etmemektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fire Polished Borosilicate Tubing | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments Company | P-30 | |
| Fast Green FCF | Sigma Aldrich, Inc. | F7528 | |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter Instruments Company | ||
| ECM 830 Generator | Harvard Apparatus, BTX Instrument Div | 45-0052 | |
| 3-mm Platinum Tweezertrodes | Harvard Apparatus, BTX Instrument Div | 45-0487 | |
| SignaGel Electrode Gel | Cardinal Health | 70315-025 | |
| Tris-EDTA Buffer, pH 8.0 | Integrated DNA Technologies, Inc. | 11-01-02-05 | |
| Infrared Heat Lamp | VWR | 36547-009 | |
| Fine Scissors Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 |
References
- Breunig, J. J., Haydar, T. F., Rakic, P. Neural stem cells: historical perspective and future prospects. Neuron. 70 (4), 614-625 (2011).
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287 (5457), (2000).
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
- Breunig, J. J., Arellano, J. I., Macklis, J. D., Rakic, P. Everything that glitters isn't gold: a critical review of postnatal neural precursor analyses. Cell Stem Cell. 1 (6), 612-627 (2007).
- Costa, M. R., Kessaris, N., Richardson, W. D., Gotz, M., Hedin-Pereira, C. The marginal zone/layer I as a novel niche for neurogenesis and gliogenesis in developing cerebral cortex. J Neurosci. 27 (42), 11376-11388 (2007).
- Breunig, J. J., et al. Rapid genetic targeting of pial surface neural progenitors and immature neurons by neonatal electroporation. Neural Dev. 7, (2012).
- Ohira, K., et al. Ischemia-induced neurogenesis of neocortical layer 1 progenitor cells. Nat Neurosci. 13 (2), 173-179 (2010).
- Bystron, I., Blakemore, C., Rakic, P. Development of the human cerebral cortex: Boulder Committee revisited. Nat Rev Neurosci. 9 (2), 110-122 (2008).
- Schmechel, D. E., Rakic, P. A Golgi study of radial glial cells in developing monkey telencephalon: morphogenesis and transformation into astrocytes. Anat Embryol (Berl. 156 (2), 115-152 (1979).
- Halfter, W., Dong, S., Yip, Y. P., Willem, M., Mayer, U. A critical function of the pial basement membrane in cortical histogenesis. J Neurosci. 22 (14), 6029-6040 (2002).
- Bystron, I., Rakic, P., Molnar, Z., Blakemore, C. The first neurons of the human cerebral cortex. Nat Neurosci. 9 (7), 880-886 (2006).
- Tanaka, D. H., Maekawa, K., Yanagawa, Y., Obata, K., Murakami, F. Multidirectional and multizonal tangential migration of GABAergic interneurons in the developing cerebral cortex. Development. 133 (11), 2167-2176 (2006).
- Ang Jr, E. S., Haydar, T. F., Gluncic, V., Rakic, P. Four-dimensional migratory coordinates of GABAergic interneurons in the developing mouse cortex. J Neurosci. 23 (13), 5805-5815 (2003).
- Tamamaki, N., Fujimori, K. E., Takauji, R. Origin and route of tangentially migrating neurons in the developing neocortical intermediate zone. J Neurosci. 17 (21), 8313-8323 (1997).
- Larkum, M. E. The yin and yang of cortical layer 1. Nat Neurosci. 16 (2), 114-115 (2013).
- Jiang, X., Wang, G., Lee, A. J., Stornetta, R. L., Zhu, J. J. The organization of two new cortical interneuronal circuits. Nat Neurosci. 16 (2), 210-218 (2013).
- Endo, T., Isa, T. Functionally different AMPA-type glutamate receptors in morphologically identified neurons in rat superficial superior colliculus. Neuroscience. 108 (1), 129-141 (2001).
- Schmidt, M., Ozen Boller, M., G,, Hall, W. C. Disinhibition in rat superior colliculus mediated by GABAc receptors. J Neurosci. 21 (2), 691-699 (2001).
- Ackman, J. B., Burbridge, T. J., Crair, M. C. Retinal waves coordinate patterned activity throughout the developing visual system. Nature. 490 (7419), 219-225 (2012).
- De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes. Nature. 472 (7343), 351-355 (2011).
- Boller, M., Schmidt, M. Postnatal maturation of GABA(A) and GABA(C) receptor function in the mammalian superior colliculus. Eur J Neurosci. 14 (8), 1185-1193 (2001).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
- De Vry, J., et al. In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery. Prog Neurobiol. 92 (3), 227-244 (2010).
- Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex. J Neurosci. 30 (20), 7028-7036 (2010).
- De la Rossa, A., et al. In vivo reprogramming of circuit connectivity in postmitotic neocortical neurons. Nat Neurosci. 16 (2), 193-200 (2013).
- Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PLoS One. 3 (4), (2008).
- Chesler, A. T., Le Pichon, C. E., Brann, J. H., Araneda, R. C., Zou, D. J., Firestein, S. Selective gene expression by postnatal electroporation during olfactory interneuron nurogenesis. PLoS One. 3 (1), (2008).
- dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nat Commun. 3, (2012).
- Yoshida, A., Yamaguchi, Y., Nonomura, K., Kawakami, K., Takahashi, Y., Miura, M. Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system. Genes Cells. 15 (5), 501-512 (2010).
- Chen, F., LoTurco, J. A method for stable transgenesis of radial glia lineage in rat neocortex by piggyBac mediated transposition. J Neurosci Methods. 207 (2), 172-180 (2012).
- Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A. Neonatal subventricular zone electroporation. J Vis Exp. , (2013).
- Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nat Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).
- Subach, O. M., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Verkhusha, V. V. An enhanced monomeric blue fluorescent protein with the high chemical stability of the chromophore. PLoS One. 6 (12), (2011).
