Summary
Nanopodia ערוצי קרום דקים אך שבירים שמרחיבים עד 100 מיקרומטר מהאחורי המוביל קדמי או נגרר של תא ולחוש את הסביבה הסלולרית. קיבעון ישיר על 37 ° C, כביסה עדינה, והימנעות מממסים אורגניים כמו אתנול, מתנול, או אצטון ושל X-100 ריכוזי טריטון גבוהים יותר נדרש כדי לבחון מבנים הסלולר אלה.
Abstract
תאים חסיד בתרבות לשמור על מדינה מקוטבת כדי לתמוך בתנועה ויחסי גומלין בין תאית. Nanopodia דק, מוארך, במידה רבה, ה-F-אקטין שלילי תחזיות קרום בתאי האנדותל והסרטן שניתן דמיינו באמצעות TM4SF1 (הטרנסממברני-4-L-שש משפחה-1) מכתים immunofluorescence. אשכולות TM4SF1 בקוטר 100-300 מיקרומטר TMED (ה TM 4SF1 nriched omains ד מיקרו) המכילה 3 עד כמה ש14 TM4SF1 מולקולות בודדות. TMED מסודר לסירוגין לאורך nanopodia במרווח קבוע של 1 עד 3 TMED למ μ ותקיפות לעגן nanopodia למטריקס. זה מאפשר nanopodia להאריך יותר מ -100 μ מ 'מהחלק האחורי המוביל קדמי או נגרר של תאי האנדותל או גידול מקוטבים, וגורם לשאריות קרום להישאר מאחור בmatrix כאשר התא עובר משם. TMED וnanopodia כבר התעלמו בגלל השבריריות הקיצוניות שלהם והרגישות לטמפרטורה. שטיפה וקיבוע שיגרתי לשבש את המבנה. Nanopodia נשמרים על ידי קיבוע ישיר בparaformaldehyde (PFA) ב 37 מעלות צלזיוס, ואחריה חשיפה קצרה ל0.01% טריטון X-100 לפני הצביעה. Nanopodia לפתוח אופקים חדשים בביולוגיה של תא: הם מבטיחים לעצב מחדש את ההבנה של איך תאים לחוש את סביבתם שלנו, לאתר ולזהות תאים אחרים במרחק, ליזום אינטראקציות בין תאית במגע קרוב, ושל מנגנוני האיתות מעורבים בתנועה, שגשוג, ותא תאי תקשורת. השיטות שפתחו ללימוד nanopodia נגזר TM4SF1 עשויות להיות שימושיות עבור מחקרים של nanopodia היוצרים בסוגי תאים אחרים דרך הסוכנות של tetraspanins הקלאסי, בעיקר CD9 הביע כל מקום בגוף, CD81, וCD151.
Introduction
במהלך קיטוב לתנועה, תאים של בעלי החיים להאריך מגוון של בליטות דינמיות, קרום מהשטח שלהם, ובכלל זה filopodia, lamellipodia, סיבי הכחשה, וסלסולי 1. לאחרונה התווסף לרשימה זו היתה nanopodia, סוג מוכר חדש של דק (100-300 מיקרומטר קוטר), הקרנה מוארכת (באורך של עד 50-100 מיקרומטר) קרום המספקים ערוצי קרום להארכה של מבני F-אקטין כגון filopodia וסיבים הכחשה, וכתם שחיובי עם TM4SF1 (הטרנסממברני-4-L-שש משפחה-1) בתאי אנדותל וגידול בתרבית 2,3.
TM4SF1 הוא חלבון עם טופולוגיה כמו tetraspanin-שהיה ידוע במקור אנטיגן תאים סרטניים 4 לפני הגילוי כי המולקולה היא סמן ביולוגי של תאי האנדותל שממלא תפקיד חיוני בהתפשטות תאי אנדותל והגירה 2,3. מכתים immunofluorescence גילה כי TM4SF1 הוא מקומי לperinucשלפוחית ליר וקרום הפלזמה, והוא מועשר בomains TM 4SF1 דואר nriched מייקר ד (TMED). nanopodia TMED עוגן למטריקס ובהווה בדפוס פסים של מרווח קבוע של 1-3 אורך TMED / מיקרומטר של nanopodia. Nanopodia להאריך בדרך כלל מהחזית המובילה של תא ונגרר מאחור בתא קיטוב לתנועה. בשל אופי חסיד משרד עורכי TMED, nanopodia לא מצליח לחזור חזרה לתא כפי שהוא נע משם; שאריות nanopodia נטושות וכך לאתר את הנתיב של תנועה סלולרית. Nanopodia לספק ערוצי קרום להארכה והכחשה F-אקטין, ואתרים של אינטראקציות ותקשורת בין תאית 2,3. מאפיינים אלה אומר כי nanopodia מספקים הזדמנות ייחודית ללמוד את מנגנוני הרכבה F-אקטין במהלך קיטוב סלולארי, חישה סלולרית של הסביבה, קביעת הנתיב וכיוון התנועה של תא, ואינטראקציות בין תאיתnd תקשורת.
בשל האופי הידרופובי מאוד של TMED והטבע הקרומי הדק ושברירי של nanopodia, טיפול מיוחד צריך להילקח על מנת לשמר TMED וnanopodia. הרס nanopodia והסרת TMED ידי שיטות מעבדה משותפות הוא סיבה אפשרית לכך שרק שישימה ושלושה פרסומים שהופיעו בTM4SF1 מאז הגילוי הראשון שלה בשינה 1986 1 ולחוסר ידע של העשרת TM4SF1 ב100-300 מיקרומטר microdomains על מלא פני התא ועד לדו"ח של TM4SF1 בתאי האנדותל ב2009 2.
שיטות immunostaining קונבנציונליות נפוצות שימוש בממסים אורגניים כמו אתנול, מתנול, או אצטון כדי לתקן תאים ולהשתמש 0.1% או ריכוז טריטון X-100 גבוה יותר לpermeabilize תאים 5. מחקרים שתוארו כאן מיושמים שלושה שינויים משמעותיים בשיטה המקובלת לחשוף TMED וnanopodia: (i) להשתמש 37 מעלות צלזיוס PFA 4% ולתקן תאים ב3776; C חממה, (ii) חלה כביסה PBS טמפרטורת חדר עדינה, וכן (iii) להשתמש בפחות מ 0.03% טריטון X-100 רק לזמן קצר לpermeabilize תאים לפני תוספת של נוגדן ראשוני, כפי שטריטון X-100 גבוה יותר מאשר 0.03% יהיה לחלץ TM4SF1.
כל tetraspanins יוצר microdomains על קרום התא 6 וחלק colocalize עם TMED בתאי האנדותל וגידול 2,3. כtetraspanins כמו CD9, CD81, ובאים לידי ביטוי בכל מקום בCD151, הפרוטוקול מכתים המתוארים כאן יכול להיות מורחב לסוגי תאים רבים ושונים, כי חוסר TM4SF1 למחקרים של תפקוד nanopodia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תא תרבות בדיסק זכוכית מצופה קולגן
- דיסקי זכוכית מקום (12 מ"מ קוטר) בתוך צנצנת זכוכית (4 גר ') וחיטוי לעקר את הדיסקים.
- שים 25 מיליליטר 70% אתנול בצינור פלקון 50 מיליליטר ולמקם אותו במכסת מנוע בתרבית תאים. פתרון זה ניתן לעשות שימוש חוזר מספר פעמים עד לרמה של הפתרון יורדת ל 20 מיליליטר.
- הנח מלקחיים חדים עם נקודת קנס נוספת באתנול 70% למשך 5 דקות לפני השימוש בו לטיפול בזכוכית קשיח.
- מוציא בזהירות את המלקחיים מהצינור ולסגור את המכסה, ולאחר מכן מניח בעדינות את המלקחיים אתנול טופל בחלק העליון של הצינור לייבוש באוויר למשך 2 דקות. אל תאפשר לקצה המלקחיים לגעת בשום דבר במכסת המנוע.
- השתמש במלקחיים סטריליות כדי לתפוס את דיסק זכוכית סטרילית אחד מתוך צנצנת הזכוכית ולמקם אותו בטוב של צלחת תרבית תאי 24 גם. חזור על פעולה עד המספר הרצוי של בארות כבר מאוכלס עם דיסקים.
- שים 500 μl של פתרון קולגן שור (50 ng / ml) לתוך באר כל אחד שמכילה כוס דיסק ולמקם אותו במעלות צלזיוס 37, 5% תרבות חממת CO 2 תא לפחות 30 דקות. אין כל רע בדגירה ארוכה יותר.
- קציר HUVEC (אדם תאי טבור הווריד האנדותל) או PC3 (תאים סרטניים בערמונית) שכבר גדלו בצלחת תרבית תאי 150 מ"מ דרך trypsinization ולחסום את פעילות טריפסין באמצעות מדיום התרבות השלם שלה. איסוף תאים לתוך צינור פלקון 15 מיליליטר.
- לספור את מספר התא ולוודא את הכדאיות גדולה יותר מ90%.
- גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ב XG 200 10 דקות ב 4 ° C. הסר את supernatant.
- השתמש במדיום התרבות לדלל את התאים ל10 5 תאים / מיליליטר. מקום תאים על קרח.
- לשאוב את הקולגן במכסת המנוע בתרבית תאים ומניחים בעדינות 500 μl של השעיה תא היטב כל אחד שבדיסקי זכוכית precoated עם קולגן. 5 x 10 4 תאים / היטב בצלחת 24 גם ייתן 60% confluency לHUVEC וconfluency 30% לתאי PC3. הערה: להוסיף עוד השעיה תא לצפיפות תאים גבוהה יותר.
- תרבות התאים במעלות צלזיוס 37, 5% CO 2 באינקובטור במשך שעה 1, 2 שעות, 4 שעות, 6 שעות, או 24 שעות כדי לעקוב אחר פעילות nanopodia והמעבר תא. בדרך כלל, תאים יצרפו לזכוכית הדיסק ב30 דקות הראשונות, ולאחר מכן להתחיל לקטב ולהעביר בשעה הראשונה, ולבצע אינטראקציות בין תאית וחלוקת תא בשעות שלאחר מכן.
2. קיבוע תא
- כל אחד גם צריכים 500 μl PFA 4% (paraformaldehyde) כדי לתקן את התאים. כך או מיוצר באופן מסחרי או טרי 4% יכול לשמש PFA. לחשב את כמות PFA דרושה המבוסס על מספר הבארות שהוכנו, ולמקם את PFA בצינור בז 15 מ"ל. זהירות: paraformaldehyde הוא קרצינוגן חשד.
- שים את הצינור בז בעמדת קלקר שכבר הייתה במקום בחממה 37 מעלות צלזיוס. השאר את הצינור בחממה במשך 30 דקות למלחמהמ 'עד PFA 37 ° C.
- הנח כרית חימום במכסת המנוע בתרבית ולהפעיל אותו.
- קח את צלחת תרבית תאי 24 גם וPFA מתוך האינקובטור prewarmed ולמקם אותו על גבי כרית החימום.
- השתמש ביד אחת כדי לשאוב את המדיום מן באר, ומייד לאחר השימוש מצד השני להחליק 500 PFA μl עדינות לתוך הבאר דרך הקצה היטב. לשאיפה קלה, להטות את צלחת התרבות ב45 על °, משעין אותו על דוכן הקלקר כך שהוא יציב בזווית זו. זה יקל על השאיפה והוספת פתרון PFA לגם מבלי להפריע לתאים בתרבית. זהו הצעד החשוב ביותר לשימור המבנה התאי המקורי של פעילות תא.
- חזור על התהליך עד שכל הבארות עם כוס דיסק קיבלו PFA. הערה: כל הצעדים שצריך לשנות את הפתרון קיים מהבאר יחולו הליכי שאיפה.
- מניחים את הצלחת ב37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. קח את הצלחת בחזרה למכסת מנוע התרבות ולהטות נגד קלקר כמתואר בשלב 2.5. השתמש ביד אחת כדי להעביר את PFA עדינות מהבאר אל צינור איסוף; להשתמש לעומת זאת למקום מייד אחר כך לפחות 500 טמפרטורת חדר PBS μl בבאר. אחרי הכל הבארות נשטפו, לחזור ולחזור על שטיפת PBS פעם נוספת בכל באר. רוקן את PFA נאסף לתוך מיכל פסולת מסוכן.
- הכן מאגר חסימת ICC על ידי הוספת 2% שור סרום עוברי לPBS. 0.04% אזיד הנתרן (לדלל מ20% פתרון מניות) הוא הוסיף כחומר משמר. זהירות: אזיד הנתרן הוא תרכובת רעילה. החיץ ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך תקופת זמן ארוכה ללא זיהום חיידקים.
- עם צלחת התרבות עדיין מוטה נגד עמדה, שוב לעבור על כל פריט גם aspirating להסיר PBS ומייד אחר כך הוסיף 500 μl של חיץ ICC חסימה. תאים מוכנים למכתים immunofluorescence עכשיו. במידת צורך,ניתן לאחסן את תאים קבועים במקרר 4 ° C במשך שבוע ללא אובדן משמעותי של חלבון TM4SF1.
3. TM4SF1 Immunofluorescence הכתמה של Nanopodia
- בכל טוב, להחליף את חיץ חסימת 500 ICC μl עם מאגר חסימה חדש המכיל 0.01% טריטון X-100 ולתת לו לשבת בטמפרטורת חדר למשך שעה 1. אין להשתמש גבוה יותר מאשר 0.03% טריטון X-100 כפי שהוא יסיר TM4SF1 מקרום תא. PBS שטף תאים מהצעד 2.10 ניתן להעביר ישירות למאגר החסימה המכיל טריטון אם הצביעה היא מוכנה להתחיל מייד.
- לדלל נוגדן ראשוני נגד TM4SF1 (או אנטי CD9) ל0.5 מיקרוגרם / מיליליטר במאגר ICC חסימה.
- בכל טוב, הסר את ICC/0.01% חיץ טריטון ולהחליף אותו עם 300 μl של הפתרון אנטי TM4SF1 הנוגדנים. דגירה 2 שעות בטמפרטורת חדר או להשאיר לילה בשעה 4 ° C.
- לשטוף היטב כל אחד עם לא פחות מ 500 μl PBS. חזור 3x; בכל פעם שנותנת בleAST 5 דקות זמן דגירה.
- הכן פתרון נוגדן וphalloidin המשני בבית הדין הפלילי הבינלאומי חיץ חסימה, באמצעות דילול 1,000 זמנים של אלקסה 488 נוגדן שכותרתו חמור אנטי עכבר המשני (2 מיקרוגרם / מיליליטר בריכוז סופי) ו -1,000 דילול x של phalloidin (50 ng / מיליליטר בריכוז סופי).
- הסר PBS ולהוסיף 300 μl של נוגדנים משני ופתרון phalloidin לכל היטב דגירה עבור שעה 2 או להשאיר אותו לילה בשעה 4 ° C.
- חזור על שלבי כביסה PBS עם לפחות דגירה 5 דקות לכל לשטוף. בכביסה האחרונה, תעזוב את כל הטוב בPBS במשך שעה 1.
- טיפת טיפה אחת (~ 10 μl) של תקשורת אנטי לדעוך הרכבה בשקופית זכוכית.
- בנד קצה 19 G ½ 1 במחט מזרק 90 ° על ידי לחיצה בעדינות על משטח קשה. השתמש ביד אחת להחזיק את המחט והתחננה ובעדינות להרים את כוס דיסק מהבאר, ולהשתמש ביד השנייה כדי לתפוס את הדיסק באמצעות המלקחיים החדים.
- הפעל זכוכית הדיסק &# 160; עם פנים כלפי מטה ומאפשרות מגע בצד תא תקשורת ההרכבה בשקופית הזכוכית. מניח בעדינות את כוס הדיסק ולתת לו להתייבש במשך הלילה במקום חשוך בטמפרטורת חדר.
- המשך לתמונת nanopodia immunofluorescence המוכתם, או לאחסן את השקופיות בקופסא שקופיות ב -20 ° C. השקופיות יישארו לצפייה במשך כמה חודשים ב-20 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
עבור שלב 1:
אם תאים (כגון HUVEC וPC3 השתמש במחקר זה) יכולים לגדול באופן נורמלי, תאים יצרפו לדיסק מצופה קולגן בתוך 30 דקות אחרי שהם זורעים, לקטב ולהיות ניידים זמן קצר לאחר מכן, ולהאריך nanopodia קדימה הנתיב שלהם של תנועה. 1A ו-1B דמויות בהתאמה תערוכות HUVEC. איור 2A מקוטב ומתרבה מראה תאי PC3 מקוטבים במצב נייד.
עבור שלב 2:
עם prewarming של 4% PFA 37 ° C, תיקון תאים על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, וכביסה עדינה עם טמפרטורת חדר PBS, מדינות סלולריות צריכים להיות במצב השתמרות טובה. באופן כללי, (איור 1 א, 1) HUVEC פרט הבודד או (איור 2 א) PC3 תאים יציג מורפולוגיה מקוטבת, אלא אם תאים נמצאים במצב של חלוקת תא (איור 1 ב, 1). אינטראקציות בין תאיתמוביל להיווצרות צומת תא (איור 1 ג, 1) הם גם נצפו בדרך כלל. Nanopodia אמור להופיע בפריפריה התא, וה-F-אקטין יהיה לעתים קרובות להיות נוכח במנות של הפרוקסימלי nanopodia לתא. טמפרטורות קרות גורמות F-אקטין לחזור בחזרה לתוך תאים והותירו אחריו ערוצי קרום nanopodia. טמפרטורה לא טובים, כפי שמוצג בדוגמאות באמצעות 4 ° C קיבעון PFA ושטיפה קרה PBS, תפריע ותהרוס את מבנה nanopodia בתאים מקוטבים (איור 1 א, 2), תאים מתרבים (איור 1, 2), ואופן מלאכותי לייצר פערים בצמתים אינטר (איור 1 ג, 2).
עבור שלב 3:
חלבוני קרום הנכנס רבים, כולל TM4SF1 רגישים מאוד לטריטון X-100 ויוסרו מתא השטח, אם ריכוזים גבוהים יותר מאשר 0.03% משמשים 2,3. על מנת לשמור על רוב TM4SF1 פני תא, Pיש להתייחס אליהם תאים קבועים FA רק עם 0.01% טריטון X-100 מכילים חסימת חיץ במשך שעה לפני שינוי לנוגדן ראשוני נגד TM4SF1 כי כבר בדילול מלא במאגר חסימה רגיל שאינו מכיל טריטון X-100. כnanopodia הן תחזיות קרום דקות וארוכות ולצרף למטריצה באמצעות TMED, עוצמת TMED סביר להניח שצריכה להיות משופרת באמצעות פונקציות בהירות והניגודיות בתוכנת עיבוד תמונה כמו פוטושופ כדי לגלות ולעקוב אחר הנתיב של תנועת תא דרך שאריות nanopodia (איור 1, 2 ריבועי).
איור 1. תחזיות Nanopodia במהלך תנועת אנדותל תא, חלוקת תא, והיווצרות צומת. HUVEC היו טריים בתרבית למשך 6 שעות after ציפוי במפגש 60% על זכוכית דיסק מצופה קולגן. תאים היו קבועים באמצעות (1) השיטה שונה שבו תאים היו קבועים ב37 C ° 4% PFA ישירות ללא prewashing ב-PBS, והושמו באינקובטור 37 מעלות צלזיוס בזמן 20 דקות קיבעון, או (2) שיטת צביעה קונבנציונלית שבו התאים נשטפו עם טמפרטורת חדר PBS פעמיים וקבועות PFA 4% עבור 20 דקות בטמפרטורת חדר. Nanopodia, הרחבות קרום דקות וארוכות, שמסומנות על ידי דפוס לסירוגין, התאגדו של TMED (חצים לבנים) ושלעתים קרובות לתחום מוכתם phalloidin F-אקטין (חיצים הוורודים) בחלקים הפרוקסימלי לתא, היו מוכתמות immunofluorescence באמצעות אנטי TM4SF1 AB. שלוש תמונות HUVEC נציג נתפסו להראות את המראה של nanopodia ב() קיטוב, (ב) חלוקת תא, והיווצרות צומת אינטר (C). תיבות הבלעה להראות בהגדלה גבוהה יותר של nanopodia. במהלך מקוטב (א) או retracteמדינות הסלולר ד (B, C), תחזיות nanopodia השתמרו ישירות על ידי תיקון תאים ב37 מעלות צלזיוס PFA, ואילו המבנים הוצאו במידה רבה על ידי שטיפה ותיקון התאים בטמפרטורת חדר PBS וPFA. (C) 37 מעלות צלזיוס PFA קיבעון שומר צמתים אינטר (חיצים כחולים), ואילו צמתים הם מופרעים על ידי טמפרטורות קרות שגורמות לתאים כדי לחזור, ויוצר פער בין התאים לגישור על ידי nanopodia של אשר רוב להכיל F-אקטין (חיצים הוורודים) ועוד כמה לא (חצים לבנים) לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 2. Nanopodia להדגים את כיוון התנועה של תאי גידול PC3. ()תאים סרטניים PC3 היו בתרבית טריות למשך 6 שעות לאחר ציפוי במפגש 60% על זכוכית דיסק מצופה קולגן. תאים היו קבועים ישירות ב37 מעלות צלזיוס PFA 4% וממוקמים בחממה 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות לשמר nanopodia. Nanopodia (חצים לבנים) ו-F-אקטין (חיצים הוורודים) היה immunofluorescence המוכתם באמצעות אנטי TM4SF1 Ab וphalloidin, בהתאמה. תיבת הבלעה מראה nanopodia בהגדלה גבוהה יותר. תמונה מייצגת זה מראה כי ביטוי TM4SF1 בתאי PC3 הוא הטרוגנית; תא PC3 אחד עם כתמים חזקים TM4SF1 (חץ צהוב) המיוצר על nanopodia הארוך והוא מוקף בשני תאים בחולשה צבעוני TM4SF1 PC3 (חיצים אדומים). שאריות Nanopodia בקצה הנגרר (IB) מציינות את כיוון תנועת תא PC3 במהלך תקופת תרבית תאי 6 שעות. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 3. ויזואליזציה של nanopodia דרך tetraspanin CD9. () HUVEC היו טריים בתרבית למשך 6 שעות לאחר ציפוי בconfluency 60% על זכוכית דיסק מצופה קולגן. תאים היו קבועים ב37 C ° 4% PFA וnanopodia (חצים לבנים) נחשפו באמצעות אנטי CD9 Ab. ה-F-אקטין (חיצים הוורודים) היה מוכתם באמצעות phalloidin. תמונה מייצגת זה מראה כי CD9 גם localizes לnanopodia. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nanopodia ערוצי הממברנה תאית דקים שבתקיפות לצרף מטריקס דרך TMED ויכול להאריך יותר מ -100 מיקרומטר מתא סלולרי מקוטב לחוש את הסביבה ולתווך אינטראקציות בין תאית 2,3. Nanopodia לדבוק מטריצה כך בתוקף כי שאריות הם השאירו מאחוריהם כמהלכי תא משם (איורים 1 ו -2). Nanopodia וכך מאפשר לנו ללמוד כיצד תאים לחוש את סביבתם ולקבוע את דרכה של תנועת תא, וכיצד תנועת שינויי טיפול ביטוי גנים או בסמים. עם זאת, בשל שריריותם של מבנים אלה קרום הדק (100-300 רוחב מיקרומטר), זהירות צריכה לנקוט על מנת לשמר אותם.
על מנת לרשום בנאמנות פעילויות סלולריות מבלי להפריע nanopodia, וללמוד איך תנאי ניסוי משפיעים על פעילות nanopodia ואת נתיב תנועה של תא, יש לוודא תחילה כי תאים לגדול בצורה יעילה במדיום מלא לפני pursuing הניסוי. תאים נורמלים בריאים עיקריים אנדותל, כגון HUVEC, במדיום התרבות הטרי EGM2-MV המלא יהיו בדרך כלל לחלק בערך כל שעות 18 בשלב יומנם של צמיחה בתוך שישה קטעים מהתרבות שלהם. יש להימנע מהשימוש בHUVEC שהם גדולים יותר ממעבר-6 כמספרי מעבר גבוהים יותר יובילו למספרים מוגברים של תאים מזדקנים או binuclear בתרבות 7 וישפיעו על היכולת של תאים לקטב ולייצר nanopodia 2. תאים סרטניים בערמונית PC3 הם יציבים יותר לתרבויות (תצפית לא פורסם), אבל אף אחד עדיין צריכה להימנע מהשימוש בתאים יותר מעשרה קטעים מהסרתם מהמצב הקפוא.
תאים חסיד בריאים בדרך כלל לצרף לדיסקים מצופים קולגן בתוך 30 דקות הראשונות לאחר שהם זורעים, ואחרי זמן קצר לאחר מכן על ידי קיטוב תא. לכן יש לצפות לראות את רוב תאי אנדותל במדינה מקוטבת בסוף השעה הראשונה של דגירה. אםרוב תאי האנדותל אינו נצמד למשטח הזכוכית, ולאחר מכן לבדוק אם (א) קולגן עבר תאריך התפוגה שלו, (ב) trypsinization במהלך מסיק תא היה מחמיר מדי, או (ג) תאים הם לא בריאים. תאי PC3 לקטב איטיים יותר מאשר בתאי האנדותל, אבל צריך להפגין מורפולוגיה מקוטבת בתוך 2 שעות לאחר זריעה. אם זיהום מתרחש בתרבות, ולאחר מכן לבחון האם דיסקי זכוכית או מלקחיים עוקרו כראוי. לחלופין, אפשר לשקול שימוש בשקופיות קאמריות; הפרוטוקול המתואר כאן מצביע על השימוש בדיסקי זכוכית בתרבות צלחות 24 גם על מנת לחסוך בעלויות ולהתמודד עם מספר גדול של דגימות בקלות רבה יותר.
שיטות מקובלות immunostaining, שימוש של PBS לשטוף את התאים לפני הוספה מקבעת טמפרטורת חדר, בקלות להפריע מבנים הסלולר בסדר כמו nanopodia וישמיד אותם בתהליך הצביעה. זה בעיקר בשל העובדה שלחצים פיזיים כמו תנודות טמפרטורה במהלך fixati תאבאו שטיפת PBS קפדני במהלך תהליך הצביעה הם הגורמים העיקריים של פיצול או ההסרה של מבני nanopodial. עם שלושה שינויים מתודולוגיים פשוטים - (i) לא להפריע מצב קיטוב תא על ידי שטיפה עם PBS לפני הקיבעון, (ii) לתקן את התאים ישירות ב37 ° C prewarmed PFA דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס במהלך קיבעון, וכן (ii) לשטוף בעדינות תאים בטמפרטורת חדר PBS - nanopodia נשמרים במידה רבה איור 1 מציג כיצד טמפרטורות PFA וPBS להשפיע שימור nanopodia בתאי אנדותל בתרבית; איור 2A מראה כי ביטוי TM4SF1 הוא הטרוגנית בתאי PC3 וכי תאים עם כתמי TM4SF1 החזקים להציג הארוכים ביותר. nanopodia. טמפרטורה ידועה להשפיע פעילויות F-אקטין ויושרה טובולין 8,9. לכן תיקון תאים באותה הטמפרטורה שבה תאים גדלו (זה 37 מעלות צלזיוס בפרוטוקול המתואר כאן) הוא צפוי לשמר את המצב הסלולר המקוטב טוב יותר (
PFA הוא לא מגיב רק בשימוש בקיבעון; ממסים אורגניים כמו מתנול, אתנול, אצטון וגם משמשים לעתים קרובות בקיבוע תא לimmunostaining 10.מקבע הטוב ביותר הוא החליט לעתים קרובות על ידי מיקום אפיטופ של נוגדן ספציפי המשמש בצביעה (נתונים שלא פורסמו). לנוגדן TM4SF1 אנטי אנושי בעכבר שמזהה תחומים תאיים של TM4SF1 (Millipore; שימש במחקר זה), PFA הוא מקבע היחיד שמגלה TMED בחיסון המכתים, המציין כי ממסים אורגניים אחרים להרוס את epitope. לעומת זאת, נוגדני polyclonal TM4SF1 ארנב נגד אדם מAcris (מידע לא מוצג), אפיטופ שממוקם בשמונה עשר חומצות אמינו ליד אזור N-המסוף, עובד גם עם תאים קבועים אתנול. עם זאת, נוגדני Acris אינו תשואה מכתים TM4SF1 טוב, כנראה בגלל epitope N-המסוף עסוק באינטראקציות TM4SF1 עם מולקולת cytosolic (ים) באופן חלקי אשר מכסות אפיטופ.
טריטון X-100 הוא פעילי שטח nonionic ומשמשים לעתים קרובות בחיסון מכתים במטרה permeabilizing קרום תא ומפחית מתח של תמיסות מימיות 11,12 פני השטח. However, יכולת זו גם מביאה את הסיכון של solubilizing חלבונים בממברנה. TM4SF1 נמחק לחלוטין מתא השטח על ידי טריטון X-100 ריכוז העולה על 0.05% 2,3. מסיבה זו, טיפול 1-HR רק עם 0.01% טריטון X-100 לפני תוספת של הנוגדן הראשוני משמש בשיטה שתוארה כאן. טיפול זה permeabilizes הקרום מספיק כדי לאפשר TM4SF1 פרי גרעיני להיות מוערכים גם על ידי הנוגדנים, תוך השמירה מרבית TM4SF1 על קרום התא. עבור מכתים כפול של TM4SF1 עם חלבונים הממוקמים בגרעין, השתמש 0.03% טריטון X-100 בשלב preincubation אם 0.01% טריטון לא עובדים. זה יקל של קרום גרעין ניקוב טריטון X-100.
TM4SF1 הוא ספציפי ביותר לתאי אנדותל ותאים סרטניים; רוב סוגי תאים אחרים גם לא להביע TM4SF1 או לבטא את זה ברמה מאוד נמוכה 2,3. עם זאת, tetraspanins הקלאסי - משפחה הכוללת שלושים ושלושה חברים includinגרם CD9, CD81, וCD151 - הם בכל מקום בהביעו 6, וניתן למצוא גם בתחומים קרום בnanopodia 2,3 (איור 3 א). לפיכך, מכתים tetraspanins הקלאסי בשיטת החיסון מכתים אותו משמש לTM4SF1 יכול לאפשר המחקרים של nanopodia בסוגי תאים שאינם מבטאים TM4SF1. תאים סרטניים PC3 המבטאים TM4SF1 נוטים מאוד לעבור ברציפות בכיוון אחד, ואילו תאי PC3 שחולשה לבטא TM4SF1 אין לי כיוון מוגדר וברור של תנועה (איור 2 א ונתונים שלא פורסמו). רמת ביטוי TM4SF1 בתאים סרטניים ידועה להיות מתואמים עם 13 הפוטנציאל גרורתי שלהם, וחקירות כרגע את יכולתם של התאים סרטניים מקשרים לדרך להביע TM4SF1 ולייצר nanopodia הפוטנציאל גרורתי שלהם.
לסיכום, שליטה בשיטות יעילות לnanopodia מכתים מאפשרת לחוקרים לעקוב אחר הנתיב של תנועת תא דרך nanopodia מחדשsidues, ללמוד כיצד תאים לחוש את סביבתם לתנועה, כיצד תנועת תא היא שונה על ידי שינוי של רמות הביטוי של גנים (או ביטוי יתר או מציאה של גנים של עניין). Nanopodia מייצג כלי חדש לחקירה של קיטוב תא ותנועה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
אנו מכירים ד"ר הרולד דבוז'ק לדיונים מועילים כולל ההצעה לנסות קיבעון ב37 מעלות צלזיוס PFA. עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH CA92644 P01 ועל ידי חוזה מהקרן הלאומית לחקר הסרטן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass disks | Fisher Scientific | 12-545-82 | 12 mm diameter |
| Glass jar | Fisher Scientific | 02-912-310 | Certified Clean Clear Glass Straight-Sided Jars, 4 oz |
| Glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides |
| 50 ml Falcon tube | BD Falcon | 352070 | 50 ml high-clarity polypropylene conical centrifuge tube, 16,000 rcf rating. Sterile. |
| 15 ml Falcon tube with Styrofoam rack | Corning | 430790 | Corning 15 ml PP Centrifuge Tubes |
| Sharp forceps | Fisher Scientific | 13-812-42 | Dissecting Extra Fine Pointed Splinter Forceps |
| 24-well Cell culture plate | BD Bioscience | 353047 | 24-well Cell Culture Plate |
| 150 mm Cell culture plate | BD Bioscience | 353025 | 150 mm cell culture plate |
| 19 G 1 ½ Syringe needle | BD Bioscience | 309635 | 19 G 1 ½ |
| Ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2701 | Decon's Pure Ethanol 200 Proof |
| Collagen solution | BD Bioscience | 354249 | Collagen I, High Concentration, rat tail, 100 mg |
| Trypsin/EDTA | Cellgro | 25-053-CI | 0.25% Trypsin-EDTA 1x |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate |
| 10x PBS | Affymetrix | 75889 5 LT | PBS, 10x Solution, pH 7.4 |
| PFA (paraformaldehyde) | Affymetrix | 19943 1 LT | 4% in PBS |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135-500ML | Fetal Bovine Serum |
| EGM2-MV | Lonza | CC-3162 | EGM-2 BulletKit, EBM-2 Basal Medium 500 ml and EGM-2 SingleQuot Kit Supplement & Growth Factors |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002-25G | Solubilized in water. 4% stock solution and working concentration is 0.4%. |
| Mouse anti-human TM4SF1 antibody | Millipore | MAB3127 | Epitope is located in extracellular domain |
| Mouse anti-human CD9 antibody | BD Bioscience | 555370 | Epitope is located in extracellular domain |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouse 2nd antibody | Life Technologies | A-21202 | Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) |
| Phalloidin | Chemicon | 90324 | Rhodamine-conjugated Phalloidin |
| Anti-fade mounting media | Life Technologies | P-36931 | ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI |
| 70% Ethanol | 17.5 ml of ethanol (200 proof) 7.5 ml of double-deionized water |
||
| 10x PBS (make 200 ml) | 20 ml of 10x PBS 180 ml of double-deionized water |
||
| 20% Triton X-100 (make 20 ml) | 4 ml Triton X-100 16 ml double-deionized water |
||
| 4% NaN3 (make 25 ml) | 1 g of NaN3 25 ml of double-deionized water |
||
| 50 ng/ml Bovine collagen solution in PBS (make 5 ml) | Stock solution of 50 μg/ml (50 ml) 830 μl of Collagen I (3 mg) 50 ml PBS |
||
| ICC Blocking Buffer (50 ml) | 49 ml PBS 2% FBS (add 1 ml) 0.04% NaN3 (add 100 μl of 4% NaN3) |
||
| ICC Blocking Buffer/0.01% Triton X-100 (make 50 ml) | 50 ml of ICC Blocking Buffer 25 μl of 20% Triton X-100 |
||
| HUVEC | Lonza | C2517A | www.lonza.com |
| PC3 | ATCC | CRL-1435 | www.atcc.org |
| Cell culture hood | NuAIRE | Nu-425-600 | NU-425 (Series 60) Biological Safety Cabinet |
| 37 °C, 5% CO2 Cell culture incubator | CellStar | QWJ300DABA | Cellstar CO2 Water Jacketed Incubator |
| Heating pad | K&H Manufacturing | 1020 | K&H Lectro Kennel Heated Pad with Free Fleece Cover (www.amazon.com) |
| Centrifuge | Sorvall | T6000B | Sorvall T6000 (B) Benchtop Centrifuge |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemocytometer |
References
- Chhabra, E. S., Higgs, H. N. The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures. Nat. Cell Biol. 9, 1110-1121 (2007).
- Shih, S. C., et al. The L6 protein TM4SF1 is critical for endothelial cell function and tumor angiogenesis. Cancer Res. 69, 3272-3277 (2009).
- Zukauskas, A., et al. TM4SF1: a tetraspanin-like protein necessary for nanopodia formation and endothelial cell migration. Angiogenesis. 14, 345-354 (2011).
- Hellstrom, I., Beaumier, P. L., Hellstrom, K. E. Antitumor effects of L6, an IgG2a antibody that reacts with most human carcinomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 7059-7063 (1986).
- Jang, Y. Y., Ye, Z., Cheng, L. Molecular imaging and stem cell research. Mol. Imag. 10, 111-122 (2011).
- Hemler, M. E. Tetraspanin functions and associated microdomains. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 801-811 (2005).
- Vasile, E., Tomita, Y., Brown, L. F., Kocher, O., Dvorak, H. F. Differential expression of thymosin beta-10 by early passage and senescent vascular endothelium is modulated by VPF/VEGF: evidence for senescent endothelial cells in vivo at sites of atherosclerosis. FASEB. 15, 458-466 (2001).
- Itoh, T. J., Hotani, H. Microtubule dynamics and the regulation by microtubule-associated proteins (MAPs). Uchu Seibutsu Kagaku. 18, 116-117 (2004).
- Caplow, M., Shanks, J., Ruhlen, R. L. Temperature-jump studies of microtubule dynamic instability. J. Biol. Chem. 263, 10344-10352 (1988).
- Pollice, A. A., et al. Sequential paraformaldehyde and methanol fixation for simultaneous flow cytometric analysis of DNA, cell surface proteins, and intracellular proteins. Cytometry. 13, 432-444 (1992).
- Macarulla, J. M., et al. Membrane solubilization by the non-ionic detergent triton X-100. A comparative study including model and cell membranes. Revista Espanola de Fisiologia. 45 Suppl, 1-8 (1989).
- Koley, D., Bard, A. J. Triton X-100 concentration effects on membrane permeability of a single HeLa cell by scanning electrochemical microscopy (SECM). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16783-16787 (2010).
- Chang, Y. W., et al. CD13 (aminopeptidase N) can associate with tumor-associated antigen L6 and enhance the motility of human lung cancer cells. Int. J. Cancer. 116, 243-252 (2005).
