Summary
Nanopodia son los canales de membrana delgada pero frágiles que se extienden hasta 100 micras de los principales delantero o trasero trasero de una célula y perciben el entorno celular. La fijación directa a 37 ° C, lavado suave, y la evitación de disolventes orgánicos como etanol, metanol, o acetona y de mayores Triton X-100 concentraciones están obligados a observar estas estructuras celulares.
Abstract
Las células adherentes en cultivo mantienen un estado polarizado para apoyar el movimiento y las interacciones intercelulares. Nanopodia son delgadas, alargadas, en gran parte proyecciones de membrana F-actina negativos en las células endoteliales y de cáncer que se pueden visualizar a través TM4SF1 (transmembrana-4-L-seis-familia-1) la tinción de inmunofluorescencia. Racimos TM4SF1 en 100-300 micras de diámetro TMED (TM 4SF1 e nriched micro omains d) que contiene 3 a un máximo de 14 TM4SF1 moléculas individuales. TMED están dispuestas intermitentemente a lo largo nanopodia con una separación regular de 1 a 3 TMED por μ m y anclar firmemente nanopodia a la matriz. Esto permite nanopodia extender más de 100 μ m de la parte delantera o trasera que conduce trasera del endoteliales tumorales o células polarizadas, y hace que los residuos de la membrana a quedar atrás en matrIX cuando la célula se aleja. TMED y nanopodia han pasado por alto debido a su extrema fragilidad y sensibilidad a la temperatura. Lavado de rutina y fijación interrumpen la estructura. Nanopodia se conservan por fijación directa en paraformaldehído (PFA) a 37 ° C, seguido por una breve exposición a 0,01% de Triton X-100 antes de la tinción. Nanopodia abrir nuevas perspectivas en la biología celular: prometen a remodelar nuestra comprensión de cómo las células perciben su entorno, detectar e identificar otras células a distancia, iniciar interacciones intercelulares en estrecho contacto, y de los mecanismos de señalización que participan en el movimiento, la proliferación celular y la comunicaciones en células. Los métodos que se desarrollan para el estudio nanopodia derivados de TM4SF1 pueden ser útiles para los estudios de nanopodia que se forman en otros tipos de células a través de la agencia de tetraspanins clásicos, especialmente el CD9 expresión ubicua, CD81, CD151 y.
Introduction
Durante la polarización para el movimiento, las células animales se extienden una variedad de salientes, de membrana dinámicos de sus superficies, incluyendo filopodios, lamelipodios, fibras de retracción, y volantes 1. Recientemente añadido a esta lista fueron nanopodia, un tipo recién reconocido de fina (100-300 m de diámetro), alargadas (hasta 50-100 m de largo) de proyección de la membrana que proporcionan los canales de membrana para la extensión de las estructuras de actina F, como filopodios y retracción de la fibra, y que la mancha positivamente con TM4SF1 (transmembrana-4-L-seis-familia-1) en endoteliales y tumorales células cultivadas 2,3.
TM4SF1 es una proteína con topología de tetraspanin como que se conocía originalmente como un antígeno de célula tumoral 4 antes de que el descubrimiento de que la molécula es un biomarcador de células endoteliales que desempeña un papel esencial en la proliferación celular endotelial y la migración 2,3. La tinción de inmunofluorescencia reveló que TM4SF1 se localiza en perinucLear y vesículas a la membrana plasmática, y se enriquece en TM 4SF1 e nriched omains d micro (TMED). TMED nanopodia anclaje a la matriz y el presente en un patrón de bandas espaciadas regularmente de 1-3 longitud TMED / m de nanopodia. Nanopodia típicamente se extienden desde delante líder de una célula y de salida trasera durante la polarización de las células para el movimiento. Debido a la naturaleza adherente firme de TMED, nanopodia son incapaces de retraer de nuevo en la celda de medida que se aleja; por tanto, los residuos abandonados nanopodia trazan la trayectoria de movimiento celular. Nanopodia proporcionar canales de membrana para la extensión F-actina y la retracción, y son los sitios de las interacciones intercelulares y comunicaciones 2,3. Estas características hacen que nanopodia proporcionan una oportunidad única para estudiar los mecanismos subyacentes conjunto de F-actina durante la polarización celular, la detección celular del medio ambiente, la determinación de la ruta de acceso y la dirección de movimiento de la célula, y las interacciones intercelulares unND comunicaciones.
Debido a la naturaleza altamente hidrofóbica de TMED y la naturaleza membranosa delgada y frágil de nanopodia, especial cuidado debe tomarse con el fin de preservar la TMED y nanopodia. La destrucción de nanopodia y remoción de TMED por métodos comunes de laboratorio es una posible razón por la que sólo sesenta y tres publicaciones han aparecido en TM4SF1 desde su primer descubrimiento en 1986 1 y por la falta total de conocimiento de enriquecimiento TM4SF1 en 100-300 micras microdominios en la superficie de la célula hasta que el informe de TM4SF1 en las células endoteliales en 2009 2.
Métodos de inmunotinción convencionales suelen utilizar disolventes orgánicos como etanol, metanol, o acetona para fijar las células y el uso de 0,1% o mayor concentración de Triton X-100 para permeabilizar las células 5. Los estudios aquí descritos implementaron tres grandes cambios con el método convencional para revelar TMED y nanopodia: (i) utilizan 37 ° C 4% PFA y fijar las células en un 3776; incubadora, (ii) aplicar el lavado de PBS temperatura ambiente suave, y (iii) el uso de menos de 0,03% de Triton X-100 sólo brevemente para permeabilizar las células antes de la adición de anticuerpo primario, como X-100 mayor que 0,03% extraerá Tritón TM4SF1.
Todos los tetraspanins forman microdominios en la membrana de la célula 6 y algunos colocalize con TMED en endoteliales y células tumorales 2,3. Como tetraspanins como CD9, CD81, CD151 y se expresan de manera ubicua, el protocolo de tinción descrito aquí se puede extender a muchos tipos diferentes de células que carecen de TM4SF1 para los estudios de la función nanopodia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cultivo de células en el disco de vidrio recubierto de colágeno
- Lugar discos de vidrio (12 mm de diámetro) en un frasco de vidrio (4 oz) y autoclave para esterilizar los discos.
- Ponga etanol 25 ml de 70% en un tubo Falcon de 50 ml y colocarlo en una campana de cultivo celular. Esta solución puede ser reutilizado varias veces hasta que el nivel de la solución se reduce a 20 ml.
- Coloque unas afiladas pinzas con un punto extra fino en el etanol al 70% durante 5 minutos antes de usarla para manejar el disco de vidrio.
- Retire con cuidado la pinza del tubo y cerrar la tapa, a continuación, coloque suavemente la pinza de etanol tratada en la parte superior del tubo se seque al aire durante 2 min. No permita que la punta del fórceps tocar nada en la campana.
- Utilice las pinzas estériles para agarrar uno de los discos de vidrio estéril del frasco de vidrio y lo coloca en un pozo de la placa de cultivo celular de 24 pocillos. Repita hasta que el número deseado de pozos se ha rellenado con los discos.
- Ponga 500 l de solución de colágeno bovino (50 ng / ml) en cada pocillo que contiene un disco de vidrio y colocarlo en un 37 ° C, 5% de CO 2 de células cultura incubadora durante al menos 30 min. No hay ningún daño en una incubación más largo.
- Harvest HUVEC (células endoteliales de vena umbilical humana) o PC3 (células de tumor de próstata) que ya se cultivan en 150 mm placa de cultivo celular mediante tripsinización y bloquean la actividad de la tripsina utilizando su medio de cultivo completo. Recoger las células en un tubo Falcon de 15 ml.
- Contar el número de células y asegúrese de que la viabilidad es superior al 90%.
- Sedimentar las células por centrifugación a 200 xg durante 10 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante.
- Utilice el medio de cultivo para diluir las células a 10 5 células / ml. Coloque las células en hielo.
- Aspirar el colágeno en la campana de cultivo de células y colocar suavemente 500 l de suspensión celular a cada pocillo en el que los discos de vidrio se recubrieron previamente con colágeno. 5 x 10 4 células / pocillo en la placa de 24 pocillos darán 60% confluency para HUVEC y 30% de confluencia para células PC3. Nota: añadir más suspensión de células de más alta densidad celular.
- Cultura de las células en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora durante 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, o de 24 horas para realizar un seguimiento de las actividades nanopodia y pase celular. Normalmente, las células se adherirán a la disco de vidrio en los primeros 30 minutos, y luego comienzan a polarizarse y migrar en la primera hora, y llevar a cabo las interacciones intercelulares y la división celular en las horas siguientes.
2. La fijación de la célula
- Cada pozo tendrá 500 l 4% PFA (paraformaldehído) para fijar las células. De cualquier fabricado comercialmente o recién hecho PFA al 4% puede ser utilizado. Calcular la cantidad de PFA necesario basado en el número de pozos preparados, y colocar PFA en un tubo Falcon de 15 ml. PRECAUCIÓN: paraformaldehído es un posible carcinógeno.
- Coloque el tubo de halcón en un soporte de espuma de poliestireno que ya estaba en su lugar en un 37 ° C incubadora. Deje el tubo en la incubadora durante 30 min a la guerram hasta la PFA a 37 ° C.
- Coloque una almohadilla térmica en la campana de cultivo y vuelva a encenderlo.
- Saque la placa de cultivo celular de 24 pocillos y la PFA precalentado de la incubadora y colóquelo en la parte superior de la almohadilla.
- Utilice una mano para aspirar el medio de un pozo, e inmediatamente después de usar la otra mano para deslizar suavemente 500 l PFA en el pozo a través del borde también. Para la aspiración más fácil, la inclinación de la placa de cultivo a aproximadamente 45 º, que se inclina contra el soporte de espuma de poliestireno de modo que es estable en ese ángulo. Esto facilitará la aspiración y la adición de solución de PFA al pozo sin molestar a las células en cultivo. Este es el paso más importante para preservar la estructura celular original de actividades celulares.
- Repita el proceso hasta que todos los pozos con un disco de vidrio han recibido PFA. Nota: todos los pasos que hay que cambiar la solución pre-existente del pozo se aplicarán mismos procedimientos de aspiración.
- Colocar la placa en 37 ° C durante 5 min. Tome la placa posterior de la campana de cultivo y la inclinación en contra de espuma de poliestireno, como se describe en el paso 2.5. Utilice una mano para transferir suavemente la PFA desde el pozo en un tubo de recogida; utilizar la otra mano para colocar inmediatamente después de al menos 500 l temperatura de PBS habitación en el pozo. Después de todos los pozos se han lavado, volver y repetir el lavado PBS una vez más en todos los pozos. Vacíe la PFA recogido en un contenedor de residuos peligrosos.
- Prepare el tampón de bloqueo ICC mediante la adición de 2% de suero bovino fetal al PBS. Azida de sodio 0,04% (diluir de 20% solución de reserva) se añade como conservante. ATENCIÓN: La azida de sodio es un compuesto tóxico. El tampón puede ser almacenado en 4 ° C durante un largo período de tiempo sin la contaminación bacteriana.
- Con la placa de cultivo todavía inclinado en contra de un stand, una vez más, pasar por cada pozo de aspiración para eliminar PBS e inmediatamente después de añadir 500 l de tampón de bloqueo de la CPI. Las células están listas para la tinción de inmunofluorescencia. Si es necesario, lacélulas fijadas se pueden almacenar en un refrigerador a 4 º C durante una semana sin pérdida significativa de proteína TM4SF1.
3. TM4SF1 Inmunofluorescencia La tinción de Nanopodia
- En cada pocillo, reemplace el amortiguador de bloqueo 500 l ICC con un nuevo tampón de bloqueo que contenía 0,01% de Triton X-100 y se deja reposar a temperatura ambiente durante 1 hora. No utilice más alta que 0,03% de Triton X-100 ya que eliminará TM4SF1 de las membranas celulares. PBS lavó las células de la etapa 2.10 puede ser movido directamente al tampón de bloqueo que contenía Triton si la tinción está listo para ser empezar de inmediato.
- Diluir el anticuerpo primario anti-TM4SF1 (o anti-CD9) a 0,5 g / ml en tampón de bloqueo CPI.
- En cada pozo, eliminar el tampón Triton ICC/0.01% y reemplazarlo con 300 l de la solución anti-TM4SF1-anticuerpo. Incubar 2 horas a temperatura ambiente o dejar toda la noche a 4 ° C.
- Lavar cada pocillo con no menos de 500 l de PBS. Repita 3 veces; cada vez que dan en least 5 min de tiempo de incubación.
- Preparar una solución de anticuerpo y faloidina secundaria en CPI tampón de bloqueo, utilizando una dilución de 1000 veces de Alexa 488 anticuerpo secundario de burro anti-ratón marcado (/ ml de concentración final 2 g) y 1000 x dilución de faloidina (50 ng / ml de concentración final).
- Retire PBS y añadir 300 l de la solución de anticuerpo secundario y phalloidin a cada pocillo y se incuba durante 2 horas o deja toda la noche a 4 ° C.
- Repita los pasos de lavado PBS con al menos una incubación de 5 min por lavado. En el último lavado, deje cada pocillo en PBS durante 1 hora.
- Caída de una sola gota (~ 10 l) de montaje anti-fade medios en un portaobjetos de vidrio.
- Doble la punta de un 19 G 1 ½ en jeringa de aguja 90 ° presionando suavemente sobre una superficie dura. Utilice una mano para sostener la aguja doblada y suavemente levante un disco de vidrio del pozo, y con la otra mano para agarrar el disco con las pinzas cortantes.
- Gire el disco y vidrio# 160; boca abajo dejando que el contacto con las células del medio de montaje en la placa de vidrio. Coloque con cuidado el disco de vidrio y deje que se seque durante la noche en un lugar oscuro a temperatura ambiente.
- Proceder a la imagen de la inmunofluorescencia manchado nanopodia o almacenar las diapositivas de una caja de portaobjetos a -20 ° C. Las diapositivas permanecerán visibles durante unos meses en -20 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Para el Paso 1:
Si las células (como HUVEC y PC3 utilizado en este estudio) son capaces de crecer normalmente, las células se unen al disco revestido con colágeno dentro de 30 minutos después de que se siembran, se polarizan y se convierten en móvil poco después, y se extienden nanopodia por delante de su camino de movimiento. Figuras 1A y 1B, respectivamente, muestran un polarizada y la proliferación de HUVEC. Figura 2A muestra células PC3 polarizadas en un estado móvil.
Para el paso 2:
Con precalentamiento de PFA al 4% a 37 ° C, la fijación de las células a 37 ° C durante 20 min, y lavado suave con PBS temperatura ambiente, estados celulares deben ser bien conservados. Generalmente, aislado individual HUVEC (Figura 1A, 1) o PC3 (Figura 2A) las células se muestran una morfología polarizada, a menos que las células están en el estado de la división celular (Figura 1B, 1). Interacciones intercelularesdando lugar a la formación de salida de células (Figura 1 C, 1) son también comúnmente observado. Nanopodia debe aparecer en la periferia de la célula, y la F-actina será a menudo presentes en las porciones de la proximal nanopodia a la célula. Las bajas temperaturas hacen que la F-actina para retraer nuevamente dentro de las células que salen de detrás de los canales de membrana nanopodia. Temperatura óptima, como se muestra en los ejemplos utilizando 4 ° C PFA fijación y lavado de PBS frío, perturbará y destruir la estructura nanopodia en células polarizadas (Figura 1A, 2), células en proliferación (Figura 1B, 2), y producir artificialmente huecos en las uniones intercelulares (Figura 1C, 2).
Para el paso 3:
Muchas proteínas unidas a la membrana incluyendo TM4SF1 son muy sensibles a Triton X-100 y se eliminan de la superficie de la célula si la mayor concentración de 0,03% se utilizan 2,3. Con el fin de preservar la mayor parte de TM4SF1 superficie de la célula, PCélulas FA fijos sólo deben ser tratados con 0,01% de Triton X-100 que contiene tampón de bloqueo durante una hora antes de cambiar a los anti-TM4SF1 anticuerpo primario que se ha diluido en un tampón de bloqueo regular que no contiene Triton X-100. Como nanopodia son proyecciones de la membrana delgada y larga y se adhieren a la matriz a través de TMED, probablemente necesita intensidad TMED ser mejorada a través de funciones de brillo y contraste en el software de procesamiento de imágenes como Photoshop para revelar y realizar un seguimiento de la trayectoria del movimiento de la célula a través de residuos nanopodia (Figura 1, 2 inserciones).
Figura 1. Proyecciones Nanopodia durante el movimiento de células endoteliales, la división celular, y la formación de salida. HUVEC fueron recién cultivadas durante 6 horas AFTER chapado a 60% de confluencia en el disco de vidrio recubierta con colágeno. Las células fueron fijadas usando (1) el método modificado donde las células fueron fijadas en 37 ° C 4% de PFA directamente sin prelavado en PBS, y se colocan en una incubadora a 37 ° C durante el tiempo de fijación 20 min, o (2) un método de tinción convencional donde las células se lavaron con PBS dos veces la temperatura ambiente y se fijaron en PFA al 4% durante 20 min a temperatura ambiente. Nanopodia, las extensiones de la membrana delgada y larga que se caracterizan por un patrón intermitente bandas de TMED (flechas blancas) y que muchas veces encierran F-actina phalloidin-manchado (flechas rosas) en porciones proximal a la célula, se tiñó de inmunofluorescencia utilizando anti-TM4SF1 Ab. Tres imágenes representativas HUVEC fueron capturados para mostrar la apariencia de nanopodia durante (A) de polarización, (B) la división celular, y (c) la formación de unión intercelular. Cajas insertables, muestran mayores aumentos de nanopodia. Durante polarizado (A) o retracted estados celulares (B, C), las proyecciones nanopodia fueron preservados mediante la fijación de las células directamente en 37 ° C PFA, mientras que las estructuras se eliminaron en gran parte por el lavado y la fijación de las células en PBS temperatura ambiente y PFA. (C) 37 º C PFA fijación preserva uniones intercelulares (flechas azules), mientras que los cruces son perturbados por las temperaturas más frías que hacen que las células se retraen, creando una brecha entre las células unidos por nanopodia de los cuales la mayoría contienen actina F (flechas de color rosa) y algunos no (flechas blancas) Haz click aquí para ver la imagen más grande.
Figura 2. Nanopodia demostrar la dirección del movimiento de las células tumorales PC3. (A)Células tumorales PC3 estaban recién cultivadas durante 6 horas después de la siembra a 60% de confluencia en el disco de vidrio recubierta con colágeno. Las células fueron fijadas directamente en 37 ° C PFA al 4% y se colocan en una incubadora a 37 ° C durante 20 min para preservar nanopodia. Nanopodia (flechas blancas) y F-actina (flechas rosas) fueron teñidas utilizando inmunofluorescencia anti-TM4SF1 Ab y phalloidin, respectivamente. El cuadro recuadro muestra nanopodia a mayor aumento. Esta imagen representativa muestra que la expresión TM4SF1 en células PC3 es heterogénea; una célula PC3 con fuerte tinción TM4SF1 (flecha amarilla) produjo mucho nanopodia y está rodeado por dos células PC3 débilmente teñidas con TM4SF1 (flechas rojas). Residuos Nanopodia en el borde de salida (ib) indican la dirección del movimiento de las células PC3 durante el período de cultivo celular de 6 horas. Haz clic aquí para ver la imagen más grande.
Figura 3. Visualización de nanopodia través tetraspanin CD9. (A) HUVEC fueron recién cultivadas durante 6 horas después de la siembra a 60% de confluencia en un disco de vidrio recubierta con colágeno. Las células fueron fijadas en 37 ° C 4% PFA y nanopodia (flechas blancas) se dieron a conocer a través de anti-CD9 Ab. F-actina (flechas rosas) se tiñó utilizando phalloidin. Esta imagen representativa muestra que CD9 también se localiza en nanopodia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nanopodia son canales de la membrana celular delgadas que se adhieren firmemente a la matriz a través de TMED y pueden extenderse a más de 100 m de una célula móvil polarizada para detectar el medio ambiente y mediar en las interacciones intercelulares 2,3. Nanopodia adherirse a la matriz tan firmemente que los residuos se quedan atrás ya que los celulares se aleja (Figuras 1 y 2). Así Nanopodia permite el estudio de cómo las células perciben su entorno y determinar la trayectoria del movimiento celular, y cómo el movimiento cambios en el tratamiento de la expresión génica o el medicamento. Sin embargo, debido a la fragilidad de estas delgadas (100-300 m de anchura) estructuras de la membrana, la precaución debe tomarse con el fin de preservarlos.
Con el fin de registrar con fidelidad las actividades celulares sin molestar nanopodia, y estudiar cómo las condiciones experimentales afectan las actividades nanopodia y la trayectoria del movimiento celular, primero debe comprobar que las células crecen de manera efectiva en un medio completo antes pursuing el experimento. Células primarias endoteliales sanas normales, tales como HUVEC, en medio de cultivo completo EGM2-MV fresca normalmente dividir aproximadamente cada 18 horas durante su fase logarítmica de crecimiento dentro de los seis pasajes de su cultura. Se debe evitar el uso de HUVEC que son mayores que el paso-6 como los números de paso más altas darán lugar a un mayor número de células senescentes o binucleares en la cultura 7 y afectarán a la capacidad de las células a polarizar y producir nanopodia 2. Células tumorales de próstata PC3 son más estables a las culturas (observación no publicada), pero aún se debe evitar el uso de células de más de diez pasajes de su eliminación del estado de congelación.
Células adherentes saludables normalmente se atribuyen a los discos recubiertos de colágeno dentro de los primeros 30 minutos después de que se siembran, seguidos poco después por la polarización celular. Por lo tanto hay que esperar a ver la mayoría de las células endoteliales en un estado polarizado al final de la primera hora de incubación. Si unmayoría de las células endoteliales que no se adhieren a la superficie del vidrio, a continuación, compruebe si (a) el colágeno ha pasado su fecha de caducidad, (b) tratamiento con tripsina durante la cosecha de células era demasiado estricta, o (c) las células no son saludables. Células PC3 polarizan más lento que las células endoteliales, pero deben mostrar una morfología polarizada dentro de 2 horas después de la siembra. Si la contaminación se produce en la cultura, a continuación, examinar si los discos de vidrio o fórceps se esterilizan adecuadamente. Alternativamente, se puede considerar el uso de la cámara de diapositivas; el protocolo descrito aquí sugiere el uso de discos de vidrio en placas de cultivo de 24 pocillos con el fin de ahorrar costes y de manejar más fácilmente un gran número de muestras.
Métodos de inmunotinción convencionales, el uso de PBS para lavar las células antes de añadir fijador temperatura ambiente, fácil de perturbar las estructuras celulares finas como nanopodia y los destruirá durante el proceso de tinción. Esto se debe en gran medida al hecho de que las tensiones físicas como las fluctuaciones de temperatura durante FIJACIÓN celulareso riguroso lavado PBS durante el proceso de tinción son las principales causas de la fragmentación o desmantelamiento de estructuras nanopodial. Con tres cambios metodológicos simples - (i) no molestar estado de polarización de células mediante lavado con PBS antes de la fijación, (ii) REVISIÓN células directamente en 37 ° C precalentado PFA y se incuban las células a 37 ° C durante la fijación, y (ii) lavar suavemente las células en la temperatura ambiente de PBS - nanopodia se conservan en gran medida La Figura 1 muestra cómo las temperaturas de PFA y PBS afectan preservación de nanopodia en células endoteliales cultivadas; Figura 2A muestra que la expresión TM4SF1 es heterogénea en células PC3 y que las células con la tinción más fuerte TM4SF1 muestran el más largo. nanopodia. La temperatura se sabe que afectan a las actividades de F-actina y tubulina integridad 8,9. Por lo tanto la fijación de las células a la misma temperatura en la que se cultivaron células (esto es 37 ° C en el protocolo descrito aquí), puede garantizar mejor el estado celular polarizada (
PFA no es el único reactivo utilizado en la fijación; disolventes orgánicos como metanol, etanol, acetona y también se utilizan frecuentemente en la fijación de células para la inmunotinción 10.La mejor fijador se decide a menudo por la ubicación epítopo de un anticuerpo específico utilizado en la tinción (datos no publicados). Para el anticuerpo TM4SF1 anti-humano de ratón que reconoce los dominios extracelulares de la TM4SF1 (Millipore; utilizado en este estudio), PFA es el único fijador que revela TMED en inmunológico-tinción, lo que indica que otros disolventes orgánicos destruyen el epítopo. En contraste, de conejo anti-humano anticuerpo policlonal TM4SF1 de Acris (datos no mostrados), cuyo epítopo se encuentra en dieciocho aminoácidos cerca de la región N-terminal, funciona también con células fijadas con etanol. Sin embargo, el anticuerpo Acris no produce buena tinción TM4SF1, probablemente debido a que el epítopo N-terminal está preocupado por las interacciones con TM4SF1 molécula citosólica (s) que cubren parcialmente el epítopo.
Triton X-100 es un agente tensioactivo no iónico y se utiliza a menudo en inmunológico-tinción con el objetivo de permeabilización de la membrana celular y la reducción de la tensión superficial de las soluciones acuosas 11,12. HoweveR, esta capacidad también trae el riesgo de solubilizar proteínas de membrana. TM4SF1 se elimina completamente de la superficie de la célula por Triton X-100 concentraciones mayores de 0,05% 2,3. Por esta razón, sólo un tratamiento de 1 hora con 0,01% de Triton X-100 antes de la adición del anticuerpo primario se utiliza en el método descrito aquí. Este tratamiento permeabiliza la membrana suficiente para permitir TM4SF1 peri-nuclear para ser bien evaluado por los anticuerpos, mientras que preserva más TM4SF1 en la membrana celular. Para la doble tinción de TM4SF1 con proteínas localizadas en el núcleo, utilice 0,03% de Triton X-100 en la etapa de preincubación si 0,01% de Triton no funciona. Esto facilitará Triton X-100 de punción de la membrana nuclear.
TM4SF1 es altamente específico para las células endoteliales y células tumorales; la mayoría de otros tipos de células, o bien no expresan TM4SF1 o lo expresan en un nivel muy bajo de 2,3. Sin embargo, tetraspanins clásicas - una familia que abarca treinta y tres miembros including CD9, CD81, CD151 y - se expresan de forma ubicua 6, y también se pueden encontrar en los dominios de membrana en nanopodia 2,3 (Figura 3A). Por lo tanto, la tinción tetraspanins clásicos a través del mismo método inmunológico-tinción utilizado para TM4SF1 puede permitir a los estudios de nanopodia en tipos de células que no expresan TM4SF1. Las células tumorales PC3 que expresan TM4SF1 altamente tienden a moverse continuamente en una sola dirección, mientras que las células PC3 que expresan débilmente TM4SF1 no tienen una dirección claramente definida de movimiento (Figura 2A y datos no publicados). TM4SF1 nivel de expresión en las células tumorales se sabe que está correlacionado con su potencial metastásico 13, y las investigaciones son actualmente la capacidad en curso células tumorales vinculación 'para expresar y producir TM4SF1 nanopodia a su potencial metastásico.
En resumen, el dominio de los métodos eficaces para nanopodia tinción permite a los investigadores realizar un seguimiento de la trayectoria de movimiento célula a través nanopodia residues, estudian cómo las células perciben su entorno para el movimiento, cómo el movimiento celular se ve modificada por la alteración de los niveles de expresión de genes (ya sea de sobreexpresión o desmontables de genes de interés). Nanopodia representar una nueva herramienta para la investigación de la polarización celular y el movimiento celular.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Reconocemos el Dr. Harold Dvorak útil para los debates, incluyendo la sugerencia de probar la fijación en 37 ° C PFA. Este trabajo fue apoyado por el NIH subvención CA92644 P01 y por un contrato de la Fundación Nacional para la Investigación del Cáncer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass disks | Fisher Scientific | 12-545-82 | 12 mm diameter |
| Glass jar | Fisher Scientific | 02-912-310 | Certified Clean Clear Glass Straight-Sided Jars, 4 oz |
| Glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides |
| 50 ml Falcon tube | BD Falcon | 352070 | 50 ml high-clarity polypropylene conical centrifuge tube, 16,000 rcf rating. Sterile. |
| 15 ml Falcon tube with Styrofoam rack | Corning | 430790 | Corning 15 ml PP Centrifuge Tubes |
| Sharp forceps | Fisher Scientific | 13-812-42 | Dissecting Extra Fine Pointed Splinter Forceps |
| 24-well Cell culture plate | BD Bioscience | 353047 | 24-well Cell Culture Plate |
| 150 mm Cell culture plate | BD Bioscience | 353025 | 150 mm cell culture plate |
| 19 G 1 ½ Syringe needle | BD Bioscience | 309635 | 19 G 1 ½ |
| Ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2701 | Decon's Pure Ethanol 200 Proof |
| Collagen solution | BD Bioscience | 354249 | Collagen I, High Concentration, rat tail, 100 mg |
| Trypsin/EDTA | Cellgro | 25-053-CI | 0.25% Trypsin-EDTA 1x |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate |
| 10x PBS | Affymetrix | 75889 5 LT | PBS, 10x Solution, pH 7.4 |
| PFA (paraformaldehyde) | Affymetrix | 19943 1 LT | 4% in PBS |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135-500ML | Fetal Bovine Serum |
| EGM2-MV | Lonza | CC-3162 | EGM-2 BulletKit, EBM-2 Basal Medium 500 ml and EGM-2 SingleQuot Kit Supplement & Growth Factors |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002-25G | Solubilized in water. 4% stock solution and working concentration is 0.4%. |
| Mouse anti-human TM4SF1 antibody | Millipore | MAB3127 | Epitope is located in extracellular domain |
| Mouse anti-human CD9 antibody | BD Bioscience | 555370 | Epitope is located in extracellular domain |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouse 2nd antibody | Life Technologies | A-21202 | Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) |
| Phalloidin | Chemicon | 90324 | Rhodamine-conjugated Phalloidin |
| Anti-fade mounting media | Life Technologies | P-36931 | ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI |
| 70% Ethanol | 17.5 ml of ethanol (200 proof) 7.5 ml of double-deionized water |
||
| 10x PBS (make 200 ml) | 20 ml of 10x PBS 180 ml of double-deionized water |
||
| 20% Triton X-100 (make 20 ml) | 4 ml Triton X-100 16 ml double-deionized water |
||
| 4% NaN3 (make 25 ml) | 1 g of NaN3 25 ml of double-deionized water |
||
| 50 ng/ml Bovine collagen solution in PBS (make 5 ml) | Stock solution of 50 μg/ml (50 ml) 830 μl of Collagen I (3 mg) 50 ml PBS |
||
| ICC Blocking Buffer (50 ml) | 49 ml PBS 2% FBS (add 1 ml) 0.04% NaN3 (add 100 μl of 4% NaN3) |
||
| ICC Blocking Buffer/0.01% Triton X-100 (make 50 ml) | 50 ml of ICC Blocking Buffer 25 μl of 20% Triton X-100 |
||
| HUVEC | Lonza | C2517A | www.lonza.com |
| PC3 | ATCC | CRL-1435 | www.atcc.org |
| Cell culture hood | NuAIRE | Nu-425-600 | NU-425 (Series 60) Biological Safety Cabinet |
| 37 °C, 5% CO2 Cell culture incubator | CellStar | QWJ300DABA | Cellstar CO2 Water Jacketed Incubator |
| Heating pad | K&H Manufacturing | 1020 | K&H Lectro Kennel Heated Pad with Free Fleece Cover (www.amazon.com) |
| Centrifuge | Sorvall | T6000B | Sorvall T6000 (B) Benchtop Centrifuge |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemocytometer |
References
- Chhabra, E. S., Higgs, H. N. The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures. Nat. Cell Biol. 9, 1110-1121 (2007).
- Shih, S. C., et al. The L6 protein TM4SF1 is critical for endothelial cell function and tumor angiogenesis. Cancer Res. 69, 3272-3277 (2009).
- Zukauskas, A., et al. TM4SF1: a tetraspanin-like protein necessary for nanopodia formation and endothelial cell migration. Angiogenesis. 14, 345-354 (2011).
- Hellstrom, I., Beaumier, P. L., Hellstrom, K. E. Antitumor effects of L6, an IgG2a antibody that reacts with most human carcinomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 7059-7063 (1986).
- Jang, Y. Y., Ye, Z., Cheng, L. Molecular imaging and stem cell research. Mol. Imag. 10, 111-122 (2011).
- Hemler, M. E. Tetraspanin functions and associated microdomains. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 801-811 (2005).
- Vasile, E., Tomita, Y., Brown, L. F., Kocher, O., Dvorak, H. F. Differential expression of thymosin beta-10 by early passage and senescent vascular endothelium is modulated by VPF/VEGF: evidence for senescent endothelial cells in vivo at sites of atherosclerosis. FASEB. 15, 458-466 (2001).
- Itoh, T. J., Hotani, H. Microtubule dynamics and the regulation by microtubule-associated proteins (MAPs). Uchu Seibutsu Kagaku. 18, 116-117 (2004).
- Caplow, M., Shanks, J., Ruhlen, R. L. Temperature-jump studies of microtubule dynamic instability. J. Biol. Chem. 263, 10344-10352 (1988).
- Pollice, A. A., et al. Sequential paraformaldehyde and methanol fixation for simultaneous flow cytometric analysis of DNA, cell surface proteins, and intracellular proteins. Cytometry. 13, 432-444 (1992).
- Macarulla, J. M., et al. Membrane solubilization by the non-ionic detergent triton X-100. A comparative study including model and cell membranes. Revista Espanola de Fisiologia. 45 Suppl, 1-8 (1989).
- Koley, D., Bard, A. J. Triton X-100 concentration effects on membrane permeability of a single HeLa cell by scanning electrochemical microscopy (SECM). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16783-16787 (2010).
- Chang, Y. W., et al. CD13 (aminopeptidase N) can associate with tumor-associated antigen L6 and enhance the motility of human lung cancer cells. Int. J. Cancer. 116, 243-252 (2005).
