Summary
Nanopodia zijn dun maar kwetsbare membraan kanalen die reiken tot 100 urn van toonaangevende voor-of naloopas van een cel en voelen de cellulaire omgeving. Direct fixatie bij 37 ° C, zacht wassen, en het vermijden van organische oplosmiddelen zoals ethanol, methanol of aceton en hogere Triton X-100 concentraties nodig zijn om de cellulaire structuren te nemen.
Abstract
Hechtende cellen in kweek te houden een gepolariseerde staat om beweging en intercellulaire interacties ondersteunen. Nanopodia zijn dun, langwerpig, grotendeels F-actine-negatieve membraan projecties in endotheliale en kanker cellen die kunnen worden gevisualiseerd door middel van TM4SF1 (Transmembrane-4-L-zes-familie-1) immunofluorescentiekleuring. TM4SF1 clusters 100-300 micrometer diameter TMED (TM 4SF1 e nriched micro d omains) die 3 tot maar liefst 14 individuele TM4SF1 moleculen. TMED intermitterend gerangschikt langs nanopodia op een regelmatige afstand van 1 tot 3 TMED per μ m en stevig verankeren nanopodia matrix. Hierdoor nanopodia meer dan 100 μ m loopt van de toonaangevende voor-of naloopas van gepolariseerd endotheliale of tumorcellen en veroorzaakt membraan resten achterblijven op matr worden achtergelatenix wanneer de cel zich verwijdert. TMED en nanopodia over het hoofd gezien vanwege hun extreme kwetsbaarheid en gevoeligheid voor temperatuur. Routine wassen en fixatie verstoren de structuur. Nanopodia bewaard door directe fixatie in paraformaldehyde (PFA) bij 37 ° C, gevolgd door korte blootstelling aan 0,01% Triton X-100 voor kleuring. Nanopodia nieuwe perspectieven te openen in de celbiologie: ze beloven om ons begrip van hoe cellen voelen hun omgeving vorm te geven, op te sporen en te identificeren andere cellen op een afstand, initiëren intercellulaire interacties op nauw contact, en van de signalering mechanismen die betrokken zijn bij beweging, proliferatie en cel -cel communicatie. De werkwijzen die zijn ontwikkeld voor het bestuderen TM4SF1 afgeleide nanopodia nuttig voor studies van nanopodia dat andere celtypes door tussenkomst van klassieke tetraspanins, met name het alom tot expressie CD9, CD81, en CD151 vormen.
Introduction
Tijdens polarisatie voor beweging, dierlijke cellen uit te breiden een verscheidenheid aan dynamische, membraan uitsteeksels uit hun oppervlakken, waaronder filopodia, lamellipodia, retractie vezels, en ruches 1. Recent toegevoegd aan deze lijst waren nanopodia, een nieuw erkende type dunne (100-300 micrometer in doorsnede), langwerpig (tot 50-100 micrometer lang) membraan projectie die membraan kanalen voor de uitbreiding van de F-actine structuren zoals filopodia bieden en terugtrekken vezels, en die vlek positief met TM4SF1 (Transmembrane-4-L-zes-familie-1) in gekweekte endotheliale cellen en tumorcellen 2,3.
TM4SF1 is een eiwit met tetraspanine-achtige topologie die oorspronkelijk bekend was als een tumorcel antigen 4 vóór de ontdekking dat het molecuul een endotheelcel biomarker die een essentiële rol in endotheliale celproliferatie en migratie 2,3 speelt. Immunofluorescentiekleuring bleek dat TM4SF1 is gelokaliseerd aan perinucLear blaasjes en het plasmamembraan en wordt verrijkt met TM 4SF1 e nriched micro d omains (TMED). TMED anker nanopodia naar matrix en aanwezig in een regelmatige afstand van elkaar gestreepte patroon van 1-3 TMED / um lengte van nanopodia. Nanopodia typisch verlengen van toonaangevende voorzijde een cel en naloopas tijdens cel polarisatie voor beweging. Vanwege de stevige hechtende aard van TMED, nanopodia zijn niet in staat om terug te trekken in de cel als het beweegt weg; verlaten nanopodia residuen dus sporen uit het pad van de cellulaire beweging. Nanopodia bieden membraan kanalen voor F-actine en uitschuiven, en zijn sites van intercellulaire interacties en communicatie 2,3. Deze kenmerken betekenen dat nanopodia een unieke gelegenheid om de onderliggende mechanismen van F-actine assemblage tijdens cellulaire polarisatie, cellulaire sensing van het milieu, de bepaling van het pad en de richting van de cel beweging, en intercellulaire interacties te bestuderen bieden eennd communicatie.
Wegens het zeer hydrofobe karakter van TMED en de dunne en fragiele membraneuze aard van nanopodia, speciale zorg moet worden genomen om TMED en nanopodia behouden. De vernietiging van nanopodia en verwijdering van TMED door gemeenschappelijke laboratoriumtechnieken is een mogelijke reden waarom slechts drieënzestig publicaties zijn verschenen op TM4SF1 sinds de eerste ontdekking in 1986 1 en voor het volledige gebrek aan kennis van TM4SF1 verrijking in 100-300 urn microdomeinen op het celoppervlak tot het verslag van TM4SF1 in endotheelcellen in 2009 2.
Conventionele methoden immunokleuring algemeen organische oplosmiddelen zoals ethanol, methanol of aceton om cellen te repareren en te gebruiken 0,1% of hoger Triton X-100 concentratie cellen permeabilize 5. Studies beschreven uitgevoerd drie grote veranderingen in de conventionele werkwijze te openbaren TMED en nanopodia: (i) 37 ° C 4% PFA en zet cellen in een 3776, C incubator, (ii) zachtjes kamertemperatuur PBS wassen, en (iii) minder dan 0,03% Triton X-100 slechts kort cellen permeabilize vóór toevoeging van primair antilichaam, zoals Triton X-100 hoger dan 0,03% zullen halen TM4SF1.
Alle tetraspanins vormen microdomeinen op de celmembraan 6 en sommige colocalize met TMED in endotheliale cellen en tumorcellen 2,3. Zoals tetraspanins zoals CD9, CD81 en CD151 alomtegenwoordig worden uitgedrukt, kan de kleuringsprotocol hier beschreven worden uitgebreid tot veel verschillende soorten cellen die TM4SF1 missen voor de studies van nanopodia functie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cel Cultuur op Collageen Gecoat glas Disk
- Plaats het glas schijven (12 mm in diameter) in een glazen pot (4 oz) en autoclaaf om de schijven te steriliseren.
- Breng 25 ml 70% ethanol in een 50 ml Falcon buis en plaats deze in een celkweek kap. Deze oplossing kan worden hergebruikt meerdere keren totdat het niveau van de oplossing daalt tot 20 ml.
- Plaats een scherpe tang met een extra fijne punt in de 70% ethanol gedurende 5 minuten alvorens het te gebruiken om de glazen plaat af te handelen.
- Verwijder voorzichtig de tang uit de tube en sluit het deksel, dan plaats voorzichtig het ethanol behandeld tang op de top van de buis aan de lucht drogen gedurende 2 minuten. Sta niet toe dat de punt van de tang om iets aan te raken in de kap.
- Gebruik de steriele tang om een steriele glazen schijf halen uit de glazen pot en plaats het op een goed van de 24-well celkweek plaat. Herhaal dit tot het gewenste aantal putten is gevuld met schijven.
- Zet 500 ul van Bovine collageen oplossing (50 ng / ml) in elk putje dat een glazen plaat bevat en plaats deze in een 37 ° C, 5% CO 2 celkweek incubator gedurende ten minste 30 minuten. Er is geen kwaad in een langere incubatietijd.
- Harvest HUVEC (humane navelstreng endotheelcellen) of PC3 (prostaat tumorcellen) die reeds in 150 mm celkweekplaat gekweekt werden door behandeling met trypsine en blokkeren de trypsine-activiteit met behulp van de volledige kweekmedium. Verzamel cellen in een 15 ml Falcon buis.
- Tel het aantal cellen en zorg ervoor dat de leefbaarheid groter is dan 90%.
- Pellet de cellen door centrifugeren bij 200 g gedurende 10 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
- Gebruik het kweekmedium om de cellen te verdunnen tot 10 5 cellen / ml. Plaats cellen op ijs.
- Zuig het collageen in de celkweek kap en plaats voorzichtig 500 ui celsuspensie aan elk putje waarin glazen schijven werden vooraf bekleed met collageen. 5 x 10 4 cellen / putje in de 24-well plaat zal conf geven 60%luency voor HUVEC en 30% confluentie voor PC3 cellen. Opmerking: voeg meer celsuspensie voor hogere celdichtheid.
- Kweek van de cellen in een 37 ° C, 5% CO2 incubator gedurende 1 uur, 2 uur, 4 uur, 6 uur, of 24 uur tot nanopodia activiteiten en celpassage volgen. Meestal zal cellen hechten aan de glazen plaat in de eerste 30 minuten, start polariseren en migreren in het eerste uur en uitvoeren intercellulaire interacties en celdeling in het volgende voorbeeld.
2. Cel Fixatie
- Elk goed moet 500 pi 4% PFA (paraformaldehyde) om de cellen te repareren. Hetzij commercieel vervaardigd of vers 4% PFA worden gebruikt. Bereken de hoeveelheid PFA nodig op basis van het aantal putten bereid en plaats PFA in een 15 ml Falcon buis. LET OP: paraformaldehyde is een verdacht carcinogeen.
- Zet de falcon buis in een piepschuim stand die reeds was op zijn plaats in een 37 ° C incubator. Laat de buis in de incubator gedurende 30 minuten naar de oorlogm up de PFA tot 37 ° C.
- Plaats een verwarmingselement in de cultuur kap en zet hem aan.
- Neem de 24-well celkweek plaat en de voorverwarmde PFA uit de incubator en plaats deze boven op de verwarming pad.
- Gebruik een hand om het medium te zuigen uit een put, en direct na gebruik de andere hand om schuif 500 pi PFA in de put door de goed kant. Voor gemakkelijker aspiratie, kantel de cultuur plaat op ongeveer 45 °, leunend tegen het piepschuim stand zodat het stabiel op die hoek. Dit aspiratie en het toevoegen PFA oplossing van de put zonder de cellen in kweek te bevorderen. Dit is de meest cruciale stap om de oorspronkelijke celstructuur van celactiviteiten behouden.
- Herhaal de procedure tot alle putjes met een glazen schijf PFA hebben ontvangen. Opmerking: alle stappen die moeten reeds bestaande oplossing uit de put te veranderen zal dezelfde aspiratie procedures toe te passen.
- Plaats de plaat op 37 ° C gedurende 5 minuten. Neem de plaat terug naar de cultuur kap en kantelen tegen piepschuim zoals beschreven in stap 2.5. Gebruik een hand om voorzichtig overdracht van de PFA van het goed in een verzameling buis; Gebruik anderzijds onmiddellijk daarna plaatsen ten minste 500 pi PBS kamertemperatuur in de put. Nadat alle putjes zijn gewassen, terug en nog een keer herhalen de PBS wassen in elke goed. Leeg de verzamelde PFA in een gevaarlijk afval container.
- Bereid ICC blokkeerbuffer door toevoeging van 2% foetaal runderserum PBS. 0,04% natriumazide (verdunning van 20% voorraadoplossing) wordt toegevoegd als conserveermiddel. LET OP: sodium azide is een giftige stof. De buffer kan op 4 ° C worden opgeslagen gedurende langere tijd zonder bacteriële contaminatie.
- Met de cultuur plaat nog gekanteld tegen een stand, nogmaals doorlopen elk putje opzuigen naar PBS te verwijderen en onmiddellijk daarna het toevoegen van 500 pi van ICC blokkerende buffer. Cellen zijn nu klaar voor immunofluorescentiekleuring. Indien nodig, degefixeerde cellen kunnen in een 4 ° C koelkast een week worden opgeslagen zonder significant verlies van TM4SF1 eiwit.
3. TM4SF1 immunofluorescentiekleuring van Nanopodia
- In elk putje Vervang de ICC 500 ul blokkeerbuffer een nieuwe blokkerende buffer die 0,01% Triton X-100 en laat het op kamertemperatuur gedurende 1 uur. Gebruik meer dan 0,03% Triton X-100 zoals TM4SF1 zal verwijderen uit celmembranen. PBS gewassen cellen van stap 2.10 kan direct worden verplaatst naar de blokkerende buffer bevattende Triton als de kleuring is klaar om meteen worden gestart.
- Verdun primaire anti-TM4SF1 (of anti-CD9) antilichaam tot 0,5 ug / ml in blokkeerbuffer ICC.
- In elk putje, verwijder de ICC/0.01% Triton buffer en te vervangen door 300 ul van de anti-TM4SF1-antilichaam oplossing. Incubeer 2 uur bij kamertemperatuur of een nacht laten staan bij 4 ° C.
- Was elk putje met niet minder dan 500 pi PBS. Herhaal 3x; elke keer geven op least 5 min incubatie tijd.
- Bereid een secundair antilichaam en phalloidin oplossing ICC blokkerende buffer, met een 1000 maal verdunning van Alexa 488 gelabelde ezel anti-muis secundair antilichaam (2 ug / ml uiteindelijke concentratie) en 1000 x verdunning van phalloidin (50 ng / ml uiteindelijke concentratie).
- Verwijder de PBS en voeg 300 ul van het secundaire antilichaam en phalloidin oplossing in elk putje en incubeer gedurende 2 uur en laat een nacht bij 4 ° C.
- Herhaal de stappen PBS wassen met minstens een 5 min incubatie per wasbeurt. In de laatste wasbeurt, laat elk putje in PBS gedurende 1 uur.
- Laat een druppel (~ 10 pi) van anti-fade afdekmiddel op een glasplaatje.
- Buig de punt van een 19 G 1 ½ in naald 90 ° door zachtjes te drukken op een harde ondergrond. Gebruik een hand om gebogen naald vast te houden en voorzichtig omhoog een glazen schijf uit de put, en met de andere hand om de schijf te begrijpen met behulp van de scherpe tang.
- Draai het glas schijf &# 160; naar beneden laten van de cel kant contact op met de montage media op het glaasje. Plaats voorzichtig de glazen plaat en laat het een nacht drogen op een donkere plaats bij kamertemperatuur.
- Ga verder met het imago van de immunofluorescentie gekleurd nanopodia, of de dia's in een dia doos bewaren bij -20 ° C. De slides zichtbaar voor een paar maanden in de -20 ° C blijven
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voor Stap 1:
Indien cellen (zoals HUVEC en PC3 in deze studie) kunnen normaal groeien, zullen de cellen hechten aan de met collageen beklede plaat binnen 30 minuten nadat ze zijn gezaaid, polariseren en word mobiele spoedig daarna en nanopodia vóór hun pad verlengen verkeer. Figuren 1A en 1B respectievelijk toont een gepolariseerde en prolifererende HUVEC. Figuur 2A toont gepolariseerde PC3 cellen in een mobiele toestand.
Voor Stap 2:
Met voorverwar van 4% PFA tot 37 ° C, bevestigen cellen bij 37 ° C gedurende 20 minuten en wassen met zachte kamertemperatuur PBS, cellulaire staten worden goed bewaard. Algemeen geïsoleerde individu HUVEC (Figuur 1A, 1) of PC3 (Figuur 2A) cellen een gepolariseerde morfologie vertonen, tenzij cellen in de staat van celdeling (Figuur 1B, 1). Intercellulaire interactieswat leidt tot cel knooppunt vorming (figuur 1C, 1) zijn ook vaak waargenomen. Nanopodia moet op de cel periferie en F-actine vaak aanwezig zijn in delen van de nanopodia proximaal van de cel. Koude temperaturen veroorzaken F-actine om weer in de cellen achterlatend nanopodia membraankanalen intrekken. Suboptimale temperaturen, zoals in de voorbeelden met 4 ° C PFA fixatie en koud PBS wassen, verstoren en nanopodia structuur vernietigen gepolariseerde cellen (Figuur 1A, 2), prolifererende cellen (Figuur 1B, 2), en kunstmatig produceren openingen bij intercellulaire juncties (Figuur 1C, 2).
Voor Stap 3:
Veel membraangebonden eiwitten waaronder TM4SF1 zeer gevoelig Triton X-100 en worden verwijderd uit het celoppervlak wanneer de concentraties hoger dan 0,03% wordt gebruikt 2,3. Om zo celoppervlak TM4SF1, P bewarenFA gefixeerde cellen uitsluitend verzorgingsmiddel met 0,01% Triton X-100 met blokkerende buffer gedurende een uur voordat u anti-TM4SF1 primair antilichaam dat is verdund in een gewone blokkerende buffer die Triton X-100 bevat. Zoals nanopodia zijn dun en lang membraan projecties en hechten aan matrix door TMED, zal TMED intensiteit waarschijnlijk moeten worden verbeterd door helderheid en contrast functies voor beeldverwerking software zoals Photoshop om te onthullen en volgen het pad van de cel beweging door nanopodia residuen (figuur 1, 2 inzetstukken).
Figuur 1. Nanopodia projecties tijdens endotheelcellen beweging, celdeling, en knooppunt formatie. HUVEC waren vers gekweekt gedurende 6 uur after plating op 60% confluentie op collageen gecoate glazen plaat. Cellen werden gefixeerd met (1) de gemodificeerde werkwijze waarbij cellen direct werden gefixeerd in 37 ° C 4% PFA in PBS zonder voorwas, en geplaatst in een 37 ° C incubator gedurende 20 minuten fixatie tijd, of (2) een gebruikelijke methode kleuring wanneer de cellen werden gewassen met PBS kamertemperatuur tweemaal en gefixeerd in 4% PFA gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Nanopodia, lang en dun membraan extensies die worden gekenmerkt door een intermitterend, gestreepte patroon van TMED (witte pijlen) en die vaak omsluiten-phalloidin gekleurde F-actine (roze pijlen) in porties proximale naar de cel, werden immunofluorescentie gekleurd met behulp van anti-TM4SF1 Ab. Drie representatieve HUVEC beelden werden vastgelegd om het uiterlijk van nanopodia in (A) polarisatie, (B) celdeling, en (C) intercellulaire knooppunt vorming vertonen. Inzetbakjes tonen sterkere vergrotingen van nanopodia. Tijdens gepolariseerd (A) of retracted cellulaire staten (B, C), werden de nanopodia projecties bewaard door direct vaststelling van cellen in 37 ° C PFA, terwijl de structuren grotendeels werden verwijderd door wassen en vaststelling van de cellen in kamertemperatuur PBS en PFA. (C) 37 ° C PFA fixatie behoudt intercellulaire juncties (blauwe pijlen), terwijl kruispunten worden verstoord door koudere temperaturen die ervoor zorgen dat cellen zich terug te trekken, het creëren van een kloof tussen cellen overbrugd door nanopodia waarvan de meeste bevatten F-actine (roze pijlen) en enkele niet (witte pijlen) Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 2. Nanopodia tonen de richting van PC3 tumorcel beweging. (A)PC3 tumorcellen werden gekweekt vers 6 uur na uitplaten op 60% confluentie op collageen gecoate glazen plaat. Cellen werden direct op 37 ° C 4% PFA gefixeerd en geplaatst in een 37 ° C incubator gedurende 20 minuten tot nanopodia behouden. Nanopodia (witte pijlen) en F-actine (roze pijlen) waren immunofluorescentie gekleurd met behulp van anti-TM4SF1 Ab en phalloidin, respectievelijk. De inzetbakjes toont nanopodia bij hogere vergroting. Dit representatief beeld laat zien dat TM4SF1 expressie in PC3 cellen is heterogeen; een PC3 cel met sterke TM4SF1 kleuring (gele pijl) geproduceerd lang nanopodia en is omgeven door twee zwak TM4SF1 gebeitst PC3-cellen (rode pijlen). Nanopodia residuen aan de achterrand (ib) geven de richting van PC3 cel beweging tijdens de 6 uur celkweek periode. Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 3. Visualisatie van nanopodia door tetraspanine CD9. (A) HUVEC waren vers gekweekt gedurende 6 uur na plating op 60% confluentie op een collageen gecoate glas schijf. Cellen werden gefixeerd in 37 ° C 4% PFA en nanopodia (witte pijlen) werden geopenbaard door middel van anti-CD9 Ab. F-actine (roze pijlen) werd gekleurd met behulp phalloidin. Dit representatief beeld laat zien dat CD9 lokaliseert ook nanopodia. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nanopodia dun celmembraan kanalen die stevig aan matrix door TMED en kan meer dan 100 urn uitstrekken vanaf een mobiel gepolariseerde cel milieu voelen en intercellulaire interacties mediëren 2,3. Nanopodia houden zo stevig dat residuen achterblijven als de cel verwijdert zich matrix (figuren 1 en 2). Nanopodia dus kunnen we bestuderen hoe cellen voelen hun omgeving en bepalen het pad van de cel bewegen, en hoe genexpressie of behandeling met geneesmiddelen veranderingen beweging. Vanwege de kwetsbaarheid van deze dunne (100-300 um breedte) membraanconstructies, voorzichtigheid moet worden genomen om ze te bewaren.
Om cellulaire activiteiten trouw op te nemen zonder te storen nanopodia, en te bestuderen hoe experimentele omstandigheden beïnvloeden nanopodia activiteiten en het pad van de cel bewegen, moet men eerst nagaan of cellen groeien effectief in compleet medium voor pursuing het experiment. Normale gezonde primaire endotheelcellen, zoals HUVEC, in vers EGM2-MV volledige kweekmedium normaal verdelen ongeveer elke 18 uur gedurende de log-fase groei binnen zes passages van hun cultuur. Men moet het gebruik van HUVEC die groter zijn dan passage-6 als hogere passage nummers zal leiden tot een verhoogd aantal verouderde of binucleaire cellen in kweek 7 en zullen cellen 'vermogen om te polariseren en produceren nanopodia 2 affect te vermijden. PC3 prostaat tumorcellen stabieler culturen (ongepubliceerde waarneming), maar men moet toch het gebruik van cellen meer dan tien passages van hun verwijdering uit de bevroren toestand voorkomen.
Gezonde hechtende cellen typisch hechten aan collageen gecoate schijven binnen de eerste 30 minuten nadat ze zijn gezaaid, kort daarna gevolgd door cel polarisatie. Aldus zou men verwachten dat de meeste endotheelcellen zien in een gepolariseerde toestand aan het einde van het eerste uur incubatie. Alsmeerderheid van de endotheelcellen niet hechten aan het glasoppervlak, dan controleren of (a) collageen de vervaldatum is verstreken, (b) behandeling met trypsine gedurende cel oogst was te streng, of (c) cellen zijn ongezond. PC3-cellen polariseren langzamer dan endotheelcellen, maar moet een gepolariseerde morfologie aantonen binnen 2 uur na het uitzaaien. Bij verontreiniging optreedt in cultuur, dan onderzoeken of glas schijven of tang goed waren gesteriliseerd. Als alternatief kan men overwegen om de kamer dia's; de hier beschreven protocol suggereert het gebruik van glas schijven in 24 putjes in om kosten te besparen en om gemakkelijker omgaan met een groot aantal monsters.
Conventionele immunostaining methoden, gebruik van PBS om cellen te wassen voor het toevoegen kamertemperatuur fixatief, gemakkelijk verstoren fijne cellulaire structuren zoals nanopodia en zal hen tijdens de kleuring proces te vernietigen. Dit is grotendeels te wijten aan het feit dat de fysieke belasting zoals temperatuurschommelingen in cel fixatiop of strenge PBS wassen tijdens de kleuring proces zijn de belangrijkste oorzaken van fragmentatie of verwijdering van nanopodial structuren. Met drie eenvoudige methodologische wijzigingen - (i) geen cel polarisatietoestand verstoren door wassen met PBS voor fixatie, (ii) vast cellen direct in 37 ° C voorverwarmd PFA en incubeer cellen bij 37 ° C gedurende fixatie, en (ii) voorzichtig wassen cellen in kamertemperatuur PBS - nanopodia zijn grotendeels bewaard gebleven Figuur 1 laat zien hoe PFA en PBS temperaturen invloed op het behoud van nanopodia in gekweekte endotheelcellen; Figuur 2A toont dat TM4SF1 expressie is heterogeen in PC3-cellen en die cellen met de sterkste TM4SF1 kleuring geven het langst. nanopodia. Temperatuur bekend om F-actine en tubuline activiteiten integriteit 8,9 beïnvloeden. Aldus vaststelling cellen bij dezelfde temperatuur waarbij cellen werden gekweekt (dit is 37 ° C in het hier beschreven protocol) is wil de gepolariseerde toestand cellulaire beter behouden (
PFA is niet het enige reagens dat in fixatie; organische oplosmiddelen zoals methanol, ethanol en aceton worden ook vaak gebruikt in mobiele bevestiging voor immunokleuring 10.De beste fixatief wordt vaak bepaald door de locatie van een epitoop specifiek antilichaam dat bij de kleuring (ongepubliceerde gegevens). Voor de muis anti-humaan antilichaam dat TM4SF1 extracellulaire domeinen van de TM4SF1 (Millipore, in deze studie) herkent, PFA de enige fixeermiddel die TMED openbaart bij immuun-kleuring, wat aangeeft dat andere organische oplosmiddelen vernietigen epitoop. Daarentegen, konijn anti-humaan TM4SF1 polyklonaal antilichaam uit Acris (gegevens niet getoond), waarvan de epitoop zich in achttien aminozuren bij de N-terminale gebied, werkt ook met ethanol gefixeerde cellen. Echter, de Acris antilichaam Geen goede manier TM4SF1 kleuring, waarschijnlijk omdat de N-terminale epitoop bezorgd over TM4SF1 interacties met cytosolische molecuul (moleculen) die gedeeltelijk de epitoop.
Triton X-100 is een niet-ionische oppervlakteactieve stof en wordt vaak gebruikt in immuun-kleuring teneinde de permeabilisatie celmembraan en verminderen oppervlaktespanning van waterige oplossingen 11,12. However, deze mogelijkheid brengt ook het risico van oplosbaar membraaneiwitten. TM4SF1 volledig is verwijderd uit het celoppervlak van Triton X-100 concentratie van meer dan 0,05% 2,3. Daarom is slechts 1 uur behandeling met 0,01% Triton X-100 voor toevoeging van het primaire antilichaam dat bij de hier beschreven werkwijze. Deze behandeling permeabilizes het membraan hebben een peri-nucleaire TM4SF1 mogelijk goed worden beoordeeld door de antilichamen met behoud meeste TM4SF1 op de celmembraan. Voor dubbele kleuring van TM4SF1 eiwitten in de kern gelokaliseerd, gebruik 0.03% Triton X-100 in de voorincubatie fase als 0,01% Triton werkt niet. Dit Triton X-100 puncturing van de kernmembraan vergemakkelijken.
TM4SF1 zeer specifiek is voor endotheliale cellen en tumorcellen; de meeste andere celtypes ofwel niet TM4SF1 uiten of uiten het op een zeer laag niveau 2,3. Echter, klassieke tetraspanins - een familie die drieëndertig leden includin omvatg CD9, CD81 en CD151 - zijn alomtegenwoordig uitgedrukt 6, en kan ook worden gevonden in membraandomeinen in nanopodia 2,3 (figuur 3A). Zo vlekken klassieke tetraspanins via dezelfde immuun-kleuring methode voor TM4SF1 kan de studies van nanopodia staat in celtypen die niet uitdrukken TM4SF1. PC3 tumorcellen die TM4SF1 uitdrukken sterk de neiging om voortdurend te verplaatsen in een enkele richting, terwijl PC3 cellen die zwak uitdrukken TM4SF1 niet een duidelijk omschreven richting van de beweging (Figuur 2A en ongepubliceerde gegevens) hebben. TM4SF1 expressieniveau in tumorcellen is bekend dat gecorreleerd met hun metastatisch potentieel 13, en onderzoeken zijn nog gaande koppeling tumorcellen vermogen om TM4SF1 expressie en produceren nanopodia hun metastatisch potentieel.
Samengevat, beheersing van effectieve methoden voor het kleuren nanopodia stelt onderzoekers om het pad van de cel beweging bijhouden via nanopodia residues, bestuderen hoe cellen voelen hun omgeving te bewegen, hoe cel beweging wordt gewijzigd door verandering van de expressie van genen (hetzij overexpressie of het uitschakelen van genen van belang). Nanopodia vertegenwoordigen een nieuw hulpmiddel voor het onderzoek van de cel polarisatie en cel beweging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij erkennen Dr Harold Dvorak voor nuttige discussies waaronder de suggestie om fixatie proberen in 37 ° C PFA. Dit werk werd ondersteund door NIH subsidie P01 CA92644 en door een contract van de National Foundation for Cancer Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass disks | Fisher Scientific | 12-545-82 | 12 mm diameter |
| Glass jar | Fisher Scientific | 02-912-310 | Certified Clean Clear Glass Straight-Sided Jars, 4 oz |
| Glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides |
| 50 ml Falcon tube | BD Falcon | 352070 | 50 ml high-clarity polypropylene conical centrifuge tube, 16,000 rcf rating. Sterile. |
| 15 ml Falcon tube with Styrofoam rack | Corning | 430790 | Corning 15 ml PP Centrifuge Tubes |
| Sharp forceps | Fisher Scientific | 13-812-42 | Dissecting Extra Fine Pointed Splinter Forceps |
| 24-well Cell culture plate | BD Bioscience | 353047 | 24-well Cell Culture Plate |
| 150 mm Cell culture plate | BD Bioscience | 353025 | 150 mm cell culture plate |
| 19 G 1 ½ Syringe needle | BD Bioscience | 309635 | 19 G 1 ½ |
| Ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2701 | Decon's Pure Ethanol 200 Proof |
| Collagen solution | BD Bioscience | 354249 | Collagen I, High Concentration, rat tail, 100 mg |
| Trypsin/EDTA | Cellgro | 25-053-CI | 0.25% Trypsin-EDTA 1x |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate |
| 10x PBS | Affymetrix | 75889 5 LT | PBS, 10x Solution, pH 7.4 |
| PFA (paraformaldehyde) | Affymetrix | 19943 1 LT | 4% in PBS |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135-500ML | Fetal Bovine Serum |
| EGM2-MV | Lonza | CC-3162 | EGM-2 BulletKit, EBM-2 Basal Medium 500 ml and EGM-2 SingleQuot Kit Supplement & Growth Factors |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002-25G | Solubilized in water. 4% stock solution and working concentration is 0.4%. |
| Mouse anti-human TM4SF1 antibody | Millipore | MAB3127 | Epitope is located in extracellular domain |
| Mouse anti-human CD9 antibody | BD Bioscience | 555370 | Epitope is located in extracellular domain |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouse 2nd antibody | Life Technologies | A-21202 | Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) |
| Phalloidin | Chemicon | 90324 | Rhodamine-conjugated Phalloidin |
| Anti-fade mounting media | Life Technologies | P-36931 | ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI |
| 70% Ethanol | 17.5 ml of ethanol (200 proof) 7.5 ml of double-deionized water |
||
| 10x PBS (make 200 ml) | 20 ml of 10x PBS 180 ml of double-deionized water |
||
| 20% Triton X-100 (make 20 ml) | 4 ml Triton X-100 16 ml double-deionized water |
||
| 4% NaN3 (make 25 ml) | 1 g of NaN3 25 ml of double-deionized water |
||
| 50 ng/ml Bovine collagen solution in PBS (make 5 ml) | Stock solution of 50 μg/ml (50 ml) 830 μl of Collagen I (3 mg) 50 ml PBS |
||
| ICC Blocking Buffer (50 ml) | 49 ml PBS 2% FBS (add 1 ml) 0.04% NaN3 (add 100 μl of 4% NaN3) |
||
| ICC Blocking Buffer/0.01% Triton X-100 (make 50 ml) | 50 ml of ICC Blocking Buffer 25 μl of 20% Triton X-100 |
||
| HUVEC | Lonza | C2517A | www.lonza.com |
| PC3 | ATCC | CRL-1435 | www.atcc.org |
| Cell culture hood | NuAIRE | Nu-425-600 | NU-425 (Series 60) Biological Safety Cabinet |
| 37 °C, 5% CO2 Cell culture incubator | CellStar | QWJ300DABA | Cellstar CO2 Water Jacketed Incubator |
| Heating pad | K&H Manufacturing | 1020 | K&H Lectro Kennel Heated Pad with Free Fleece Cover (www.amazon.com) |
| Centrifuge | Sorvall | T6000B | Sorvall T6000 (B) Benchtop Centrifuge |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemocytometer |
References
- Chhabra, E. S., Higgs, H. N. The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures. Nat. Cell Biol. 9, 1110-1121 (2007).
- Shih, S. C., et al. The L6 protein TM4SF1 is critical for endothelial cell function and tumor angiogenesis. Cancer Res. 69, 3272-3277 (2009).
- Zukauskas, A., et al. TM4SF1: a tetraspanin-like protein necessary for nanopodia formation and endothelial cell migration. Angiogenesis. 14, 345-354 (2011).
- Hellstrom, I., Beaumier, P. L., Hellstrom, K. E. Antitumor effects of L6, an IgG2a antibody that reacts with most human carcinomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 7059-7063 (1986).
- Jang, Y. Y., Ye, Z., Cheng, L. Molecular imaging and stem cell research. Mol. Imag. 10, 111-122 (2011).
- Hemler, M. E. Tetraspanin functions and associated microdomains. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 801-811 (2005).
- Vasile, E., Tomita, Y., Brown, L. F., Kocher, O., Dvorak, H. F. Differential expression of thymosin beta-10 by early passage and senescent vascular endothelium is modulated by VPF/VEGF: evidence for senescent endothelial cells in vivo at sites of atherosclerosis. FASEB. 15, 458-466 (2001).
- Itoh, T. J., Hotani, H. Microtubule dynamics and the regulation by microtubule-associated proteins (MAPs). Uchu Seibutsu Kagaku. 18, 116-117 (2004).
- Caplow, M., Shanks, J., Ruhlen, R. L. Temperature-jump studies of microtubule dynamic instability. J. Biol. Chem. 263, 10344-10352 (1988).
- Pollice, A. A., et al. Sequential paraformaldehyde and methanol fixation for simultaneous flow cytometric analysis of DNA, cell surface proteins, and intracellular proteins. Cytometry. 13, 432-444 (1992).
- Macarulla, J. M., et al. Membrane solubilization by the non-ionic detergent triton X-100. A comparative study including model and cell membranes. Revista Espanola de Fisiologia. 45 Suppl, 1-8 (1989).
- Koley, D., Bard, A. J. Triton X-100 concentration effects on membrane permeability of a single HeLa cell by scanning electrochemical microscopy (SECM). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16783-16787 (2010).
- Chang, Y. W., et al. CD13 (aminopeptidase N) can associate with tumor-associated antigen L6 and enhance the motility of human lung cancer cells. Int. J. Cancer. 116, 243-252 (2005).
