Summary
Nanopodia sont des canaux membranaires minces mais fragiles qui s'étendent jusqu'à 100 um de leader avant ou arrière de l'arrière de la cellule et le sens de l'environnement cellulaire. Fixation directe à 37 ° C, un lavage doux, et d'éviter les solvants organiques tels que l'éthanol, le méthanol, ou l'acétone et de l'augmentation de Triton X-100 concentrations sont tenus de respecter ces structures cellulaires.
Abstract
Les cellules adhérentes en culture maintenir un état de polarisation pour soutenir le mouvement et les interactions intercellulaires. Nanopodia sont minces, de forme allongée, en grande partie F-actine négatif projections membranaires dans les cellules endothéliales et les cancers qui peuvent être visualisées par TM4SF1 (transmembranaire-4-L-six-famille-1) immunofluorescence. Grappes TM4SF1 à 100-300 diamètre um TMED (TM 4SF1 e nriched micro omains d) contenant de 3 à moins de 14 individuels TM4SF1 molécules. TMED sont agencées de manière intermittente le long de nanopodia à un espacement régulier de 1 à 3 TMED par μ m et à ancrer fermement nanopodia matrice. Cela permet de prolonger nanopodia plus de 100 μ m du front avant ou arrière à l'arrière des cellules endothéliales tumorales ou polarisées, et provoque des résidus de membranes d'être laissé sur matrix lorsque la cellule s'éloigne. TMED et nanopodia ont été négligés en raison de leur extrême fragilité et sensibilité à la température. Lavage régulier et la fixation perturbent la structure. Nanopodia sont conservés par fixation directe dans paraformaldéhyde (PFA) à 37 ° C, suivie d'une brève exposition à 0,01% de Triton X-100 avant la coloration. Nanopodia ouvrir de nouvelles perspectives en biologie cellulaire: ils promettent de remodeler notre compréhension de la façon dont les cellules détectent leur environnement, de détecter et d'identifier d'autres cellules à distance, initier des interactions intercellulaires au contact étroit, et des mécanismes de signalisation impliquées dans le mouvement, la prolifération et la cellule -cellulaires communications. Les méthodes développées pour étudier nanopodia TM4SF1 dérivés peuvent être utiles pour les études de nanopodia qui se forment dans d'autres types cellulaires par l'intermédiaire de tétraspanines classiques, notamment le CD9 exprimée de manière ubiquitaire, CD81, CD151 et.
Introduction
Au cours de la polarisation pour le mouvement, des cellules animales s'étendent une série de saillies membranes dynamiques, à partir de leurs surfaces, y compris des filopodes, lamellipodes, les fibres de rétraction, et une volants. Récemment ajoutés à cette liste étaient nanopodia, un nouveau type reconnu de fin (100-300 m de diamètre), de forme allongée (jusqu'à 50-100 m de long) projection de la membrane qui fournissent des canaux membranaires pour l'extension des structures F-actine tels que filopodia et les fibres de rétraction, et que la tache positive avec TM4SF1 (transmembranaire-4-L-six-famille-1) en endothéliales et tumorales des cellules cultivées 2,3.
TM4SF1 est une protéine ayant une topologie de tétraspanines analogue qui a été initialement connu comme un antigène de cellule tumorale 4 avant la découverte du fait que la molécule est un marqueur biologique des cellules endothéliales qui joue un rôle essentiel dans la prolifération des cellules endotheliales et de la migration 2,3. Immunofluorescence a révélé que TM4SF1 est localisée à perinucLear et des vésicules à la membrane plasmique, et est enrichie en TM 4SF1 e nriched micro omains d (TMED). TMED ancre nanopodia à la matrice et présente dans un motif à bandes régulièrement espacées de 1-3 longueur TMED / um de nanopodia. Nanopodia s'étendent généralement de leader avant d'une cellule et arrière arrière pendant la polarisation de la cellule pour se déplacer. En raison de la nature solide adhérente de TMED, nanopodia sont incapables de se rétracter de nouveau dans la cellule comme il se déplace à une distance; résidus de nanopodia abandonnés oligo donc sur la trajectoire du mouvement cellulaire. Nanopodia fournir des canaux membranaires pour l'extension F-actine et de rétraction, et sont des sites d'interactions et de communications intercellulaires 2,3. Ces caractéristiques font que nanopodia offrent une occasion unique d'étudier les mécanismes sous-jacents ensemble F-actine pendant la polarisation cellulaire, détection cellulaire de l'environnement, de la détermination de la trajectoire et la direction du mouvement de la cellule, et les interactions intercellulaires unend communications.
En raison de la nature hautement hydrophobe de TMED et la nature membraneuse mince et fragile de nanopodia, un soin particulier doit être pris afin de préserver TMED et nanopodia. La destruction de nanopodia et l'élimination des TMED par des méthodes courantes de laboratoire est une raison possible pour laquelle seulement soixante-trois publications ont paru sur TM4SF1 depuis sa première découverte en 1986 et 1 pour l'absence totale de connaissance de l'enrichissement TM4SF1 à 100-300 um microdomaines sur la surface de la cellule jusqu'à ce que le rapport de TM4SF1 dans les cellules endothéliales en 2009 2.
Méthodes d'immunomarquage classiques utilisent souvent des solvants organiques tels que l'éthanol, le méthanol, l'acétone ou de fixer les cellules et utiliser une concentration plus élevée de Triton X-100 0,1% ou à perméabiliser les cellules 5. Études décrites ici mis en œuvre trois changements majeurs à la méthode conventionnelle de révéler TMED et nanopodia: (i) utilisent 37 ° C 4% PFA et fixer les cellules dans un 3776; incubateur, (ii) appliquer la température ambiante douce PBS lavage, et (iii) utiliser moins de 0,03% de Triton X-100 que brièvement pour perméabiliser les cellules avant l'addition de l'anticorps primaire, comme le Triton X-100 supérieure à 0,03% extraira TM4SF1.
Tous les tétraspanines forment des microdomaines de la membrane de la cellule 6 et à une certaine colocalisent TMED endothéliales dans les cellules tumorales et 2,3. Comme tétraspanines comme CD9, CD81, CD151 et sont exprimés de façon ubiquitaire, le protocole de coloration décrit ici peut être étendue à de nombreux types différents de cellules qui manquent TM4SF1 pour les études de la fonction nanopodia.
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Protocol
Une. Culture cellulaire sur collagène verre enduit de disque
- Lieu disques de verre (12 mm de diamètre) dans un bocal de verre (4 onces) et autoclave pour stériliser les disques.
- Placer 25 ml de 70% d'éthanol dans un tube Falcon de 50 ml et le placer dans une hotte de culture cellulaire. Cette solution peut être réutilisé de multiples fois jusqu'à ce que le niveau de la solution tombe à 20 ml.
- Placez tranchants pince avec un point extra fine dans de l'éthanol à 70% pendant 5 minutes avant de l'utiliser pour traiter le disque de verre.
- Retirez délicatement la pince sur le tube et refermer le bouchon, puis placez délicatement la pince d'éthanol traité sur le dessus du tube de sécher à l'air pendant 2 min. Ne laissez pas la pointe de la pince de toucher quoi que ce soit dans la hotte.
- Utilisez les pinces stériles d'attraper un disque de verre stérile sur le pot de verre et le placer dans un puits de la plaque de culture cellulaire de 24 puits. Répétez jusqu'à ce que le nombre souhaité de puits a été rempli avec des disques.
- Mettre 500 ul de solution de collagène bovin (50 ng / ml) dans chaque puits qui contient un disque de verre et le placer dans un 37 ° C, 5% CO 2 incubateur de culture cellulaire pendant au moins 30 min. Il n'y a pas de mal à une incubation plus longue.
- Récolte des cellules HUVEC (cellules endothéliales de veine ombilicale humaine) ou PC3 (cellules tumorales de la prostate), qui ont déjà été cultivées dans 150 mm de plaque de culture cellulaire à travers trypsinisation et bloquent l'activité de la trypsine en utilisant le milieu de culture complet. Prélever des cellules dans un tube Falcon de 15 ml.
- Compter le nombre de cellules et de s'assurer de la viabilité est supérieure à 90%.
- Sédimenter les cellules par centrifugation à 200 xg pendant 10 min à 4 ° C. Retirer le surnageant.
- Utilisation du milieu de culture pour diluer les cellules à 10 5 cellules / ml. Placez les cellules sur la glace.
- Aspirer le collagène dans la hotte de culture cellulaire et placez doucement 500 pl de suspension cellulaire dans chaque puits, dans lequel les disques de verre ont été pré-revêtues avec du collagène. 5 x 10 4 cellules / puits dans la plaque à 24 puits donnera 60% confluency pour les cellules HUVEC et 30% de confluence de cellules PC3. Remarque: ajouter plus de suspension cellulaire de la densité cellulaire plus élevée.
- Culture des cellules à 37 ° C, 5% de CO 2 pendant 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, ou 24 h pour suivre les activités de nanopodia et passage de cellule. Habituellement, les cellules se fixeront sur le disque de verre dans les 30 premières minutes, puis commencent à polariser et migrer dans la première heure, et effectuer des interactions intercellulaires et la division cellulaire dans les heures suivantes.
2. Fixation cellule
- Chaque puits devra 500 pi 4% PFA (paraformaldéhyde) pour fixer les cellules. Soit fabriqué commercialement ou fraîchement préparé PFA 4% peut être utilisée. Calculez le montant de PFA nécessaire sur la base du nombre de puits préparés, et placer PFA dans un tube Falcon de 15 ml. ATTENTION: paraformaldéhyde est soupçonné d'être cancérigène.
- Mettez le tube Falcon dans un stand de styromousse qui était déjà en place dans un incubateur à 37 °. Laisser le tube dans l'incubateur pendant 30 min à la guerresuis la PFA à 37 ° C.
- Placez un coussin chauffant dans la hotte de culture et allumez-le.
- Sortez la plaque de culture cellulaire de 24 puits et la préchauffé PFA de l'incubateur et placez-le sur le dessus du coussin chauffant.
- Utilisez une main pour aspirer le moyen d'un puits, et immédiatement après utiliser l'autre main pour glisser doucement 500 pi PFA dans le puits à travers le bord bien. Pour faciliter l'aspiration, incliner la plaque de culture à environ 45 °, appuyé contre le support en polystyrène de sorte qu'il est stable à cet angle. Cela facilitera l'aspiration et l'ajout de solution PFA au bien sans déranger les cellules en culture. Cette étape est la plus cruciale pour préserver la structure cellulaire initiale des activités cellulaires.
- Répétez le processus jusqu'à ce que tous les puits avec un disque de verre ont reçu PFA. Note: toutes les mesures qui doivent changer solution pré-existante du puits s'appliqueront mêmes procédures d'aspiration.
- Placer la plaque dans 37 ° C pendant 5 min. Prenez la plaque arrière de la hotte de culture et incliner contre styromousse comme décrit dans l'étape 2.5. Utilisez une main pour transférer doucement la PFA du puits dans un tube de collecte; utiliser l'autre main pour placer immédiatement après au moins 500 pi salle de PBS température dans le puits. Après tous les puits ont été lavés, retourner et répéter le lavage PBS une fois de plus dans chaque puits. Vider la PFA recueillies dans un conteneur de déchets dangereux.
- Préparer tampon de blocage de la CPI en ajoutant 2% de sérum bovin fœtal à PBS. Azoture de sodium 0,04% (dilution de 20% solution mère) est ajouté comme agent de conservation. ATTENTION: L'azoture de sodium est un composé toxique. Le tampon peut être stocké dans 4 ° C pendant une longue période de temps sans risque de contamination bactérienne.
- Avec la plaque de culture encore inclinée contre un support, une fois de plus parcourir chaque aspiration bien pour enlever PBS et immédiatement après addition de 500 pi de tampon de blocage de la CPI. Les cellules sont maintenant prêts pour immunofluorescence. Si nécessaire, l'cellules fixées peuvent être stockés dans un réfrigérateur à 4 C ° pendant une semaine sans perte significative de la protéine TM4SF1.
3. TM4SF1 immunofluorescence de Nanopodia
- Dans chaque puits, remplacer le tampon de blocage de 500 pi de la CPI avec un nouveau tampon de blocage contenant 0,01% de Triton X-100 et laisser reposer à température ambiante pendant 1 heure. Ne pas utiliser plus élevée que 0,03% de Triton X-100 comme il va supprimer TM4SF1 à partir des membranes cellulaires. PBS lavé les cellules de l'étape 2.10 peuvent être directement déplacés vers le tampon de blocage contenant du Triton si la coloration est prêt à démarrer tout de suite.
- Diluer l'anticorps primaire anti-TM4SF1 (ou anti-CD9) à 0,5 pg / ml dans du tampon de blocage CPI.
- Dans chaque puits, enlever le tampon Triton ICC/0.01%, et le remplacer par 300 pi de la solution anti-TM4SF1-anticorps. Incuber 2 h à la température ambiante ou à laisser une nuit à 4 ° C.
- Laver chaque puits avec pas moins de 500 pi de PBS. Répétez 3x; chaque fois donner à least 5 min de temps d'incubation.
- Préparer une solution d'anticorps et phalloïdine secondaire dans CPI du tampon de blocage, à l'aide d'un mille fois la dilution de l'Alexa 488 d'anticorps secondaire d'âne anti-souris marquée (2 ug / ml de concentration finale) et 1000 x dilution de la phalloïdine (50 ng / ml de concentration finale).
- Retirer du PBS et ajouter 300 ul de l'anticorps secondaire et solution de phalloidin à chaque puits et incuber pendant 2 heures ou laisser toute la nuit à 4 ° C.
- Répétez PBS étapes de lavage avec au moins une incubation de 5 min par lavage. Dans le dernier lavage, laisser chaque puits dans du PBS pendant 1 h.
- Tomber une seule goutte (~ 10 pi) de montage anti-fade médias sur une lame de verre.
- Pliez la pointe d'un 19 G 1 ½ à aiguille de la seringue de 90 ° en appuyant doucement sur une surface dure. Utilisez une main pour tenir l'aiguille pliée et soulevez délicatement un disque de verre du bien, et utiliser l'autre main pour saisir le disque à l'aide des pinces acérées.
- Tournez le disque de verre &# 160; face vers le bas en laissant le contact côté de la cellule du milieu de montage sur la lame de verre. Placez délicatement le disque de verre et laissez-le sécher pendant la nuit dans un endroit sombre à température ambiante.
- Passez à l'image de la immunofluorescence teinté nanopodia, ou de stocker les lames dans une boîte à lames à -20 ° C. Les diapositives seront rester visibles pendant quelques mois en -20 ° C.
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Representative Results
Pour l'étape 1:
Si les cellules (comme les cellules HUVEC et PC3 utilisée dans cette étude) sont capables de se développer normalement, les cellules se fixent sur le disque revêtu de collagène dans les 30 minutes après ils sont ensemencées, polarisent et deviennent mobiles peu après, et s'étendent nanopodia avance sur leur chemin de mouvement. figures 1A et 1B montrent respectivement un polarisée et la prolifération des cellules HUVEC. figure 2A montre des cellules PC3 polarisés dans un état mobile.
Pour l'étape 2:
Avec préchauffage de PFA 4% à 37 ° C, la fixation des cellules à 37 ° C pendant 20 min, et un lavage doux à la température ambiante PBS, états cellulaires soient bien conservées. Généralement, isolé individuel HUVEC (Figure 1A, 1) ou PC3 (figure 2A) de cellules montrent une morphologie sera polarisée, à moins que les cellules sont dans l'état de la division cellulaire (Figure 1B, 1). Interactions intercellulairesconduisant à la formation de la jonction de la cellule (figure 1C, 1) sont également fréquemment observées. Nanopodia devrait apparaître sur la périphérie de la cellule, et la F-actine est souvent présente dans les parties du nanopodia à proximité de la cellule. Le froid provoquent des F-actine à se rétracter dans les cellules, laissant derrière canaux membranaires de nanopodia. Température optimales, comme indiqué dans les exemples utilisant 4 ° C PFA fixation et lavage PBS froid, va perturber et détruire la structure de nanopodia dans les cellules polarisées (figure 1A, 2), les cellules en prolifération (figure 1B, 2), et de produire artificiellement des lacunes dans les jonctions intercellulaires (Figure 1C, 2).
Pour l'étape 3:
De nombreuses protéines liées à la membrane y compris TM4SF1 sont très sensibles au Triton X-100 et seront éliminés de la surface de la cellule si des concentrations supérieures à 0,03% sont utilisés 2,3. Afin de conserver la plupart de TM4SF1 de surface cellulaire, PFA cellules fixes ne doivent être traités avec 0,01% de Triton X-100 contenant un tampon de blocage pendant une heure avant de passer à l'anticorps primaire anti-TM4SF1 qui a été diluée dans un tampon de blocage ordinaire qui ne contient pas de Triton X-100. Comme nanopodia sont des projections de la membrane mince et longue et s'attachent à la matrice par TMED, intensité TMED devra probablement être améliorée grâce à des fonctions de luminosité et de contraste dans les logiciels de traitement d'image comme Photoshop afin de révéler et de suivre la trajectoire de déplacement de la cellule par des résidus nanopodia (Figure 1, 2 encarts).
Figure 1. Nanopodia saillies pendant le déplacement des cellules endothéliales, la division cellulaire et la formation de jonction. HUVEC ont été fraîchement cultivées pendant 6 h AFTEr placage à 60% de confluence sur le disque de verre enduit de collagène. Les cellules ont été fixées en utilisant (1) la méthode modifiée dans laquelle les cellules ont été fixées à 37 ° C, 4% de PFA directement sans prélavage dans une solution PBS, et on les place dans un incubateur à 37 ° C pendant le temps de fixation de 20 min, ou (2) un procédé classique de coloration où les cellules ont été lavées avec de la température ambiante, deux fois par du PBS et fixées dans 4% de PFA pendant 20 min à température ambiante. Nanopodia, extensions membranaires fines et longues qui sont marqués par un intermittent, modèle bandes de TMED (flèches blanches) et qui entourent souvent phalloidin teinté F-actine (flèches roses) dans les parties proximale de la cellule, ont été immunofluorescence coloré utilisant des anticorps anti-TM4SF1 Ab. Trois images HUVEC représentatifs ont été capturés pour montrer l'apparence de nanopodia cours (A) la polarisation, (B) la division cellulaire, et (C) intercellulaire formation de jonction. Boîtes encart montrent un grossissement plus de nanopodia. Pendant polarisée (A) ou retracted états cellulaires (B, C), les saillies de nanopodia ont été conservés en fixant directement les cellules à 37 ° C PFA, tandis que les structures ont été en grande partie éliminés par lavage et la fixation des cellules à la température ambiante PBS et PFA. (C) 37 ° C PFA fixation préserve jonctions intercellulaires (flèches bleues), alors que les jonctions sont perturbés par des températures plus froides que causent les cellules de se rétracter, la création d'un fossé entre les cellules pontés par nanopodia dont la plupart contiennent des F-actine (flèches roses) et certains ne pas (flèches blanches) Cliquez ici pour agrandir l'image.
Figure 2. Nanopodia démontrer la direction de déplacement des cellules tumorales PC3 (A).Cellules PC3 tumorales ont été fraîchement cultivées pendant 6 heures après placage à 60% de confluence sur le disque de verre enduit de collagène. Les cellules ont été fixées directement à 37 ° C, 4% de PFA et placées dans un incubateur à 37 ° C pendant 20 min pour préserver nanopodia. Nanopodia (flèches blanches) et F-actine (flèches roses) étaient immunofluorescence colorées à l'aide anti-TM4SF1 Ab et phalloidin, respectivement. Le médaillon montre nanopodia à plus fort grossissement. Cette image représentant montre que l'expression TM4SF1 dans les cellules PC3 est hétérogène; une cellule de PC3 avec une coloration TM4SF1 forte (flèche jaune) produit à long nanopodia et est entouré par deux cellules PC3 faiblement TM4SF1 colorées (flèches rouges). Résidus Nanopodia au bord de fuite (ib) indiquent la direction du mouvement des cellules PC3 cours de la période de culture de cellules de 6 h. Cliquez ici pour agrandir l'image.
Figure 3. Visualisation de nanopodia travers tétraspanines CD9. (A) Des cellules HUVEC ont été fraîchement cultivées pendant 6 heures après l'étalement à 60% de confluence sur un disque de verre revêtu de collagène. Les cellules ont été fixées en 37 ° C 4% PFA et nanopodia (flèches blanches) ont été révélés par l'anti-CD9 Ab. F-actine (flèches roses) a été coloré en utilisant phalloidin. Cette image représentant montre que CD9 localise également nanopodia. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Nanopodia sont des canaux membranaires cellulaires minces qui se fixent solidement à la matrice par TMED et peuvent s'étendre à plus de 100 um d'une cellule polarisée mobile pour détecter l'environnement et la médiation des interactions intercellulaires 2,3. Nanopodia adhérer à la matrice si bien que les résidus sont laissés comme les cellules s'éloigne (figures 1 et 2). Nanopodia permet donc d'étudier comment les cellules sentent leur environnement et de déterminer la trajectoire de déplacement de la cellule, et comment les changements d'expression génique ou médicament traitement mouvement. Toutefois, en raison de la fragilité de ces minces (100-300 largeur de um) structures membranaires, la prudence doit être pris afin de les préserver.
Afin d'enregistrer fidèlement les activités cellulaires sans déranger nanopodia, et d'étudier comment les conditions expérimentales affectent les activités de nanopodia et la trajectoire de déplacement de la cellule, il faut d'abord vérifier que les cellules se développent efficacement dans un milieu complet avant pursuing l'expérience. Cellules endothéliales normales en bonne santé primaires, comme HUVEC, dans un milieu frais de culture complet EGM2-MV normalement diviser environ toutes les 18 heures pendant leur phase de croissance logarithmique dans les six passages de leur culture. Il faut éviter l'utilisation de HUVEC qui sont supérieures passage-6 comme le nombre de passage plus élevés entraînent une augmentation du nombre de cellules sénescentes ou deux noyaux dans la culture 7 et auront une incidence sur la capacité des cellules à se polariser et produire nanopodia 2. Les cellules tumorales de la prostate PC3 sont plus stables à des cultures (d'observation non publiée), mais il faut toujours éviter l'utilisation de cellules plus de dix passages de leur retrait de l'état congelé.
Cellules adhérentes santé seront généralement attachent à disques revêtus de collagène dans les 30 premières minutes après ils sont ensemencées, suivi peu après par la polarisation de la cellule. Ainsi, on devrait s'attendre à voir la plupart des cellules endothéliales dans un état de polarisation à la fin de la première heure d'incubation. Si unmajorité des cellules endothéliales ne s'attache pas à la surface du verre, puis de vérifier si (a) collagène a dépassé sa date d'expiration, (b) la trypsine pendant la récolte des cellules était trop stricte, ou (c) les cellules sont insalubres. cellules PC3 polarisent plus lent que les cellules endothéliales, mais doivent démontrer une morphologie polarisée à 2 h après l'ensemencement. En cas de contamination de la culture, puis examiner si les disques de verre ou de forceps ont été correctement stérilisés. Alternativement, on peut envisager d'utiliser des lames de chambre; le protocole décrit ici suggère l'utilisation de disques de verre dans des plaques de culture à 24 puits en vue de réduire les coûts et de traiter plus facilement un grand nombre d'échantillons.
Méthodes d'immunomarquage classiques, l'utilisation de PBS à laver les cellules avant d'ajouter fixateur de la température ambiante, facilement perturber les structures cellulaires fines comme nanopodia et les détruira pendant le processus de coloration. Ceci est largement dû au fait que les contraintes physiques tels que les fluctuations de température pendant le FIXATI cellulairesou rigoureuse lavage PBS pendant le processus de coloration sont les principales causes de la fragmentation ou enlèvement de structures de nanopodial. Avec trois changements méthodologiques simples - (i) ne dérange pas l'état de polarisation de la cellule par lavage avec du PBS avant la fixation, (ii) corriger des cellules directement dans 37 ° C préchauffé PFA et incuber les cellules à 37 ° C lors de la fixation, et (ii) Laver doucement les cellules de la température ambiante PBS - nanopodia sont en grande partie conservées figure 1 montre comment les températures PFA et PBS affectent la préservation de nanopodia dans les cellules endothéliales en culture, la figure 2A montre que l'expression TM4SF1 est hétérogène dans les cellules PC3 et que les cellules ayant la plus forte coloration de TM4SF1 présentent la plus longue. nanopodia. Température est connu pour affecter les activités de F-actine et de l'intégrité de la tubuline 8,9. Ainsi, les cellules de fixation à la même température dans laquelle les cellules ont été cultivées (ce qui est 37 ° C dans le protocole décrit ici) est de nature à mieux préserver l'état cellulaire polarisée (
PFA n'est pas le seul réactif utilisé dans la fixation; des solvants organiques comme le méthanol, l'éthanol et l'acétone sont également fréquemment utilisés dans la fixation de cellules pour une immunocoloration 10.Le meilleur fixateur est souvent déterminée par la localisation de l'épitope d'un anticorps spécifique utilisée dans la coloration (données non publiées). Pour l'anticorps anti-humain TM4SF1 souris qui reconnaît domaines extracellulaires de la TM4SF1 (Millipore; utilisé dans cette étude), le PFA est le seul fixateur qui révèle TMED en immuno-coloration, ce qui indique que d'autres solvants organiques détruisent l'épitope. En revanche, les anticorps de lapin anti-anticorps humain polyclonal de TM4SF1 Acris (données non représentées), dont l'épitope est situé à dix-huit acides aminés à proximité de la région N-terminale, fonctionne également avec des cellules fixées à l'éthanol. Cependant, l'anticorps Acris ne donne pas une bonne coloration de TM4SF1, probablement parce que l'épitope N-terminal est préoccupé par des interactions avec TM4SF1 molécule (s) cytosolique, qui couvrent partiellement l'épitope.
Triton X-100 est un agent tensio-actif non ionique et est souvent utilisé dans les immuno-coloration dans le but de perméabiliser la membrane cellulaire et en réduisant la tension superficielle de solutions aqueuses 11,12. Uter, cette capacité permet également le risque de solubiliser les protéines membranaires. TM4SF1 est complètement enlevée de la surface de la cellule par Triton X-100 des concentrations supérieures à 0,05% de 2,3. Pour cette raison, seul un traitement en 1 heure avec 0,01% de Triton X-100 avant l'addition de l'anticorps primaire est utilisé dans le procédé décrit ici. Ce traitement perméabilise la membrane suffisante pour permettre TM4SF1 péri-nucléaire à être bien évalué par les anticorps, tout en préservant le plus TM4SF1 sur la membrane cellulaire. Pour une double coloration des protéines avec TM4SF1 situés dans le noyau, en utilisant 0,03% de Triton X-100 dans l'étape de pré-incubation si 0,01% de Triton ne fonctionne pas. Cela facilitera le Triton X-100 à la perforation de la membrane nucléaire.
TM4SF1 est hautement spécifique pour les cellules endothéliales et les cellules tumorales; la plupart des autres types de cellules, soit n'expriment pas TM4SF1 ou expriment à un niveau très bas de 2,3. Cependant, tétraspanines classiques - une famille qui comprend trente-trois membres including CD9, CD81, CD151 et - sont exprimés de manière ubiquitaire 6, et peuvent également être trouvés dans des domaines membranaires dans nanopodia 2,3 (figure 3A). Ainsi, la coloration tétraspanines classiques par la même méthode immuno-coloration utilisé pour TM4SF1 peut permettre des études de nanopodia dans des types cellulaires qui n'expriment pas TM4SF1. Cellules tumorales PC3 qui expriment fortement TM4SF1 ont tendance à se déplacer en continu dans un seul sens, alors que les cellules PC3 qui expriment faiblement TM4SF1 n'ont pas un sens bien défini de mouvement (Figure 2A et données non publiées). TM4SF1 niveau d'expression dans les cellules tumorales est connu pour être en corrélation avec leur potentiel métastatique 13, et investigations n'y a la capacité de liaison des cellules tumorales en cours pour exprimer et produire TM4SF1 nanopodia à leur potentiel métastatique.
En résumé, la maîtrise de méthodes efficaces pour la coloration nanopodia permet aux enquêteurs de suivre la trajectoire de déplacement de la cellule par nanopodia residues, étudient comment les cellules sentent leur environnement pour le mouvement, comment le mouvement des cellules est modifié par la modification des niveaux de gènes (soit la surexpression ou knockdown de gènes d'intérêt) expression. Nanopodia représenter un nouvel outil pour l'étude de la polarisation de la cellule et le mouvement des cellules.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous reconnaissons le Dr Harold Dvorak pour des discussions utiles, y compris la suggestion d'essayer fixation à 37 ° C PFA. Ce travail a été soutenu par NIH P01 CA92644 et par un contrat de la Fondation nationale pour la recherche sur le cancer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass disks | Fisher Scientific | 12-545-82 | 12 mm diameter |
| Glass jar | Fisher Scientific | 02-912-310 | Certified Clean Clear Glass Straight-Sided Jars, 4 oz |
| Glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides |
| 50 ml Falcon tube | BD Falcon | 352070 | 50 ml high-clarity polypropylene conical centrifuge tube, 16,000 rcf rating. Sterile. |
| 15 ml Falcon tube with Styrofoam rack | Corning | 430790 | Corning 15 ml PP Centrifuge Tubes |
| Sharp forceps | Fisher Scientific | 13-812-42 | Dissecting Extra Fine Pointed Splinter Forceps |
| 24-well Cell culture plate | BD Bioscience | 353047 | 24-well Cell Culture Plate |
| 150 mm Cell culture plate | BD Bioscience | 353025 | 150 mm cell culture plate |
| 19 G 1 ½ Syringe needle | BD Bioscience | 309635 | 19 G 1 ½ |
| Ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2701 | Decon's Pure Ethanol 200 Proof |
| Collagen solution | BD Bioscience | 354249 | Collagen I, High Concentration, rat tail, 100 mg |
| Trypsin/EDTA | Cellgro | 25-053-CI | 0.25% Trypsin-EDTA 1x |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate |
| 10x PBS | Affymetrix | 75889 5 LT | PBS, 10x Solution, pH 7.4 |
| PFA (paraformaldehyde) | Affymetrix | 19943 1 LT | 4% in PBS |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135-500ML | Fetal Bovine Serum |
| EGM2-MV | Lonza | CC-3162 | EGM-2 BulletKit, EBM-2 Basal Medium 500 ml and EGM-2 SingleQuot Kit Supplement & Growth Factors |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002-25G | Solubilized in water. 4% stock solution and working concentration is 0.4%. |
| Mouse anti-human TM4SF1 antibody | Millipore | MAB3127 | Epitope is located in extracellular domain |
| Mouse anti-human CD9 antibody | BD Bioscience | 555370 | Epitope is located in extracellular domain |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouse 2nd antibody | Life Technologies | A-21202 | Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) |
| Phalloidin | Chemicon | 90324 | Rhodamine-conjugated Phalloidin |
| Anti-fade mounting media | Life Technologies | P-36931 | ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI |
| 70% Ethanol | 17.5 ml of ethanol (200 proof) 7.5 ml of double-deionized water |
||
| 10x PBS (make 200 ml) | 20 ml of 10x PBS 180 ml of double-deionized water |
||
| 20% Triton X-100 (make 20 ml) | 4 ml Triton X-100 16 ml double-deionized water |
||
| 4% NaN3 (make 25 ml) | 1 g of NaN3 25 ml of double-deionized water |
||
| 50 ng/ml Bovine collagen solution in PBS (make 5 ml) | Stock solution of 50 μg/ml (50 ml) 830 μl of Collagen I (3 mg) 50 ml PBS |
||
| ICC Blocking Buffer (50 ml) | 49 ml PBS 2% FBS (add 1 ml) 0.04% NaN3 (add 100 μl of 4% NaN3) |
||
| ICC Blocking Buffer/0.01% Triton X-100 (make 50 ml) | 50 ml of ICC Blocking Buffer 25 μl of 20% Triton X-100 |
||
| HUVEC | Lonza | C2517A | www.lonza.com |
| PC3 | ATCC | CRL-1435 | www.atcc.org |
| Cell culture hood | NuAIRE | Nu-425-600 | NU-425 (Series 60) Biological Safety Cabinet |
| 37 °C, 5% CO2 Cell culture incubator | CellStar | QWJ300DABA | Cellstar CO2 Water Jacketed Incubator |
| Heating pad | K&H Manufacturing | 1020 | K&H Lectro Kennel Heated Pad with Free Fleece Cover (www.amazon.com) |
| Centrifuge | Sorvall | T6000B | Sorvall T6000 (B) Benchtop Centrifuge |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemocytometer |
References
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- Hellstrom, I., Beaumier, P. L., Hellstrom, K. E. Antitumor effects of L6, an IgG2a antibody that reacts with most human carcinomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 7059-7063 (1986).
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