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Biology

Nanopodia - सेल आंदोलन और कहनेवाला बातचीत में भूमिकाओं के साथ पतली, नाजुक झिल्ली अनुमान

Published: April 3, 2014 doi: 10.3791/51320
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Center for Vascular Biology Research, Department of of Pathology, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School

Summary

Nanopodia एक सेल के सामने आगे या पीछे पीछे से 100 माइक्रोन तक विस्तार और सेलुलर पर्यावरण भावना है कि पतली लेकिन नाजुक झिल्ली चैनल हैं. 37 डिग्री सेल्सियस, कोमल धोने, और इथेनॉल, मेथनॉल, या एसीटोन जैसे कार्बनिक विलायकों के परिहार पर और उच्च ट्राइटन X-100 सांद्रता का प्रत्यक्ष निर्धारण इन सेलुलर संरचनाओं का निरीक्षण करने के लिए आवश्यक हैं.

Abstract

संस्कृति में पक्षपाती कोशिकाओं आंदोलन और कहनेवाला बातचीत का समर्थन करने के लिए एक polarized स्थिति बनाए रखने के. Nanopodia, पतली लम्बी, TM4SF1 (Transmembrane-4-एल छह परिवार -1) immunofluorescence धुंधला के माध्यम से देखे जा सकते हैं कि endothelial और कैंसर की कोशिकाओं में बड़े पैमाने पर एफ actin नकारात्मक झिल्ली अनुमानों हैं. 100-300 माइक्रोन व्यास TMED में TM4SF1 समूहों के रूप में कई के रूप में 14 व्यक्ति TM4SF1 अणुओं को 3 युक्त (टीएम 4SF1 ई माइक्रो डी omains nriched). TMED 1 μ मीटर प्रति TMED 3 को और मजबूती मैट्रिक्स को nanopodia लंगर की एक नियमित अंतराल पर nanopodia साथ रहकर व्यवस्था कर रहे हैं. इस polarized endothelial या ट्यूमर कोशिकाओं के सामने आगे या पीछे पीछे से 100 से अधिक μ मीटर का विस्तार करने nanopodia सक्षम बनाता है, और matr पर पीछे नहीं छोड़ा जा सकता झिल्ली अवशेषों का कारण बनता हैनौवीं सेल दूर ले जाता है. TMED और nanopodia क्योंकि अपने चरम कमजोरी और तापमान के प्रति संवेदनशीलता की अनदेखी की गई है. नियमित धोने और निर्धारण संरचना को बाधित. Nanopodia धुंधला से पहले 0.01% ट्राइटन X-100 के लिए संक्षिप्त जोखिम है, जिसके बाद 37 डिग्री सेल्सियस paraformaldehyde (पीएफए) में प्रत्यक्ष निर्धारण द्वारा संरक्षित कर रहे हैं. कोशिका जीव विज्ञान में नया खा़का खोलने Nanopodia: वे पता लगाने और एक दूरी पर अन्य कोशिकाओं की पहचान, निकट संपर्क में कहनेवाला बातचीत आरंभ, और आंदोलन, प्रसार में शामिल संकेतन तंत्र की, कोशिकाओं अपने पर्यावरण समझ कैसे की हमारी समझ को नयी आकृति प्रदान करना, और सेल के लिए वादा सेल संचार. TM4SF1 व्युत्पन्न nanopodia के अध्ययन के लिए विकसित कर रहे हैं कि तरीकों क्लासिक tetraspanins, विशेष रूप से सर्वत्र व्यक्त CD9, CD81, और CD151 की एजेंसी के माध्यम से अन्य प्रकार की कोशिकाओं में है कि फार्म nanopodia की पढ़ाई के लिए उपयोगी हो सकता है.

Introduction

आंदोलन के लिए ध्रुवीकरण के दौरान, पशु कोशिकाओं filopodia, lamellipodia, त्याग फाइबर, और झमेलें 1 सहित उनके सतहों से गतिशील, झिल्ली protrusions की एक किस्म का विस्तार. हाल ही में इस सूची में जोड़ा nanopodia, पतली की एक नव मान्यता प्राप्त प्रकार (व्यास में 100-300 माइक्रोन), ऐसे filopodia के रूप में एफ actin संरचनाओं के विस्तार के लिए झिल्ली चैनलों प्रदान कि लम्बी (अप करने के लिए 50-100 मीटर लंबा) झिल्ली प्रक्षेपण थे और त्याग फाइबर, और उस दाग सकारात्मक TM4SF1 (Transmembrane-4-एल छह परिवार -1) सुसंस्कृत endothelial और ट्यूमर कोशिकाओं 2,3 में साथ.

TM4SF1 मूल रूप से अणु endothelial सेल प्रसार और प्रवास 2,3 में एक आवश्यक भूमिका निभाता है कि एक endothelial सेल biomarker है कि खोज से पहले एक ट्यूमर कोशिका प्रतिजन 4 के रूप में जाना जाता था कि tetraspanin तरह टोपोलॉजी के साथ एक प्रोटीन है. Immunofluorescence धुंधला TM4SF1 perinuc के लिए स्थानीय है कि पता चलालेअर vesicles और प्लाज्मा झिल्ली, और टीएम 4SF1 ई nriched सूक्ष्म डी omains (TMED) में समृद्ध है. TMED लंगर मैट्रिक्स nanopodia और nanopodia 1-3 TMED / माइक्रोन लम्बाई की एक नियमित अंतराल पर बंधी पैटर्न में मौजूद. Nanopodia आम तौर पर एक सेल के अग्रणी सामने से विस्तार करने और आंदोलन के लिए सेल ध्रुवीकरण दौरान पीछे अनुगामी. कारण TMED की फर्म पक्षपाती प्रकृति के nanopodia इसे दूर ले जाता है के रूप में सेल में वापस वापस लेना करने में असमर्थ हैं; परित्यक्त nanopodia अवशेषों इस प्रकार सेलुलर आंदोलन के रास्ते बाहर का पता लगा. एफ actin विस्तार और त्याग के लिए झिल्ली चैनलों प्रदान करते हैं, और कहनेवाला बातचीत और संचार 2,3 की साइटों रहे हैं Nanopodia. इन विशेषताओं सेलुलर ध्रुवीकरण, पर्यावरण के सेलुलर संवेदन, सेल आंदोलन की राह और दिशा के निर्धारण, और कहनेवाला बातचीत के दौरान एफ actin विधानसभा अंतर्निहित तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक अनूठा अवसर प्रदान nanopodia का मतलब है कि एकएन डी संचार.

कारण TMED की अत्यधिक हाइड्रोफोबिक प्रकृति और nanopodia की पतली और नाजुक झिल्लीदार प्रकृति को, विशेष देखभाल TMED और nanopodia को संरक्षित करने के क्रम में लिया जाना चाहिए. nanopodia और आम प्रयोगशाला तरीकों से TMED को हटाने का विनाश ही तिरेसठ प्रकाशनों 1986 1 में अपनी पहली खोज के बाद से और पर 100-300 माइक्रोन microdomains में TM4SF1 संवर्धन के ज्ञान का पूर्ण अभाव के लिए TM4SF1 पर दिखाई दिया है क्यों एक संभावित कारण यह है कोशिका की सतह 2009 2 में endothelial कोशिकाओं में TM4SF1 की रिपोर्ट जब तक.

परम्परागत immunostaining तरीकों सामान्यतः कोशिकाओं को ठीक करने और कोशिकाओं 5 permeabilize को 0.1% या अधिक ट्राइटन X-100 एकाग्रता का उपयोग करने के लिए इथेनॉल, मेथनॉल, या एसीटोन जैसे कार्बनिक विलायकों का उपयोग करें. (मैं) 37 डिग्री सेल्सियस 4% पीएफए ​​का उपयोग करें और एक 37 में कोशिकाओं को ठीक: यहां वर्णित अध्ययन TMED और nanopodia प्रकट करने के लिए पारंपरिक विधि के लिए तीन बड़े बदलाव लागू किया76, सी इनक्यूबेटर, (द्वितीय) कोमल कमरे के तापमान पीबीएस धोने लागू होते हैं, और (iii) ट्राइटन X-100 ट्राइटन X-100 0.03% की तुलना में अधिक निकालने के रूप में, प्राथमिक एंटीबॉडी के अलावा पहले कोशिकाओं permeabilize करने के लिए केवल कुछ समय कम से कम 0.03% का उपयोग TM4SF1.

सभी tetraspanins कोशिका झिल्ली 6 पर microdomains फार्म और कुछ endothelial और ट्यूमर कोशिकाओं 2,3 में TMED साथ colocalize. CD9, CD81, और CD151 तरह tetraspanins सर्वत्र व्यक्त कर रहे हैं, यहाँ वर्णित धुंधला प्रोटोकॉल nanopodia समारोह के अध्ययन के लिए TM4SF1 कमी है कि कई अलग अलग प्रकार की कोशिकाओं को बढ़ाया जा सकता है.

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Protocol

1. कोलेजन लेपित ग्लास डिस्क पर सेल संस्कृति

  1. एक ग्लास जार (4 ऑउंस) और डिस्क बाँझ आटोक्लेव में जगह कांच डिस्क (व्यास में 12 मिमी).
  2. एक 50 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब में 25 मिलीलीटर 70% इथेनॉल रखो और एक सेल संस्कृति हुड में जगह है. समाधान का स्तर 20 मिलीलीटर की बूँदें जब तक यह समाधान कई बार reused किया जा सकता है.
  3. कांच डिस्क को संभालने के लिए यह प्रयोग करने से पहले 5 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में एक अतिरिक्त ठीक बिंदु के साथ एक तेज संदंश रखें.
  4. ध्यान से ट्यूब से बाहर संदंश हटाने और टोपी बंद, फिर धीरे से 2 मिनट के लिए शुष्क हवा ट्यूब के शीर्ष पर इथेनॉल इलाज संदंश जगह है. संदंश की नोक हुड में कुछ भी छूने की अनुमति न दें.
  5. ग्लास जार के बाहर एक बाँझ कांच डिस्क हड़पने के लिए और 24 अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट की एक अच्छी तरह से में जगह बाँझ संदंश का प्रयोग करें. कुओं की वांछित संख्या डिस्क के साथ आबादी किया गया है जब तक दोहराएँ.
  6. गोजातीय कोलेजन समाधान के 500 μl (रखो50 एनजी / एमएल) एक गिलास डिस्क होता है और कम से कम 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 सेल कल्चर इनक्यूबेटर में जगह है कि प्रत्येक कुएं में. एक लंबी ऊष्मायन में कोई बुराई नहीं है.
  7. हार्वेस्ट HUVEC (मानव नाल की शिरा endothelial कोशिकाओं) या PC3 पहले से ही trypsinization के माध्यम से 150 मिमी सेल संस्कृति की थाली में वृद्धि हुई है और इसकी पूरी संस्कृति के माध्यम का उपयोग trypsin गतिविधि को ब्लॉक किया गया है कि (प्रोस्टेट ट्यूमर कोशिकाओं). एक 15 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब में कोशिकाओं को इकट्ठा.
  8. सेल संख्या की गणना और व्यवहार्यता 90% से अधिक है सुनिश्चित करें.
  9. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 200 XG पर centrifuging द्वारा गोली कोशिकाओं सतह पर तैरनेवाला निकालें.
  10. 10 5 कोशिकाओं / एमएल कोशिकाओं को कमजोर करने के लिए संस्कृति के माध्यम का प्रयोग करें. बर्फ पर कोशिकाओं रखें.
  11. सेल कल्चर हुड में कोलेजन Aspirate और धीरे गिलास डिस्क कोलेजन के साथ precoated गया जिसमें अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए सेल निलंबन के 500 μl जगह है. 24 अच्छी तरह से थाली में 5 एक्स 10 4 कोशिकाओं / अच्छी तरह से 60% conf दे देंगेHUVEC और PC3 कोशिकाओं के लिए 30% confluency के लिए luency. नोट: उच्च घनत्व सेल के लिए अधिक सेल निलंबन जोड़ें.
  12. संस्कृति एक 37 डिग्री सेल्सियस, 1 घंटा, 2 घंटा, 4 घंटा, 6 घंटा, या nanopodia गतिविधियों और सेल पारित होने को ट्रैक करने के लिए 24 घंटे के लिए 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में कोशिकाओं. आमतौर पर, कोशिकाओं पहले 30 मिनट में कांच डिस्क को जोड़ना होगा, तब फूट डालना और पहले घंटे में विस्थापित करने के लिए शुरू, और निम्न घंटे में कहनेवाला बातचीत और कोशिका विभाजन प्रदर्शन करते हैं.

2. सेल निर्धारण

  1. हर अच्छी तरह से कोशिकाओं को ठीक करने के लिए 500 μl 4% पीएफए ​​(paraformaldehyde) की आवश्यकता होगी. वाणिज्यिक निर्मित या हौसले से 4% पीएफए ​​इस्तेमाल किया जा सकता बना या तो. तैयार कुओं की संख्या के आधार पर की जरूरत पीएफए ​​की राशि की गणना, और एक 15 एमएल फाल्कन ट्यूब में पीएफए ​​जगह है. चेतावनी: paraformaldehyde के एक संदिग्ध कैसरजन.
  2. एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में जगह में पहले से ही था कि एक स्टायरोफोम स्टैंड में फाल्कन ट्यूब रखो. युद्ध के लिए 30 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में ट्यूब छोड़ दो37 डिग्री सेल्सियस तक पीएफए ​​मीटर
  3. संस्कृति हुड में एक हीटिंग पैड प्लेस और यह मोड़ पर.
  4. 24 अच्छी तरह से सेल संस्कृति की थाली और इनक्यूबेटर से बाहर prewarmed पीएफए ​​बाहर ले जाओ और हीटिंग पैड के शीर्ष पर जगह है.
  5. एक अच्छी तरह से मध्यम महाप्राण एक हाथ का उपयोग, और तुरंत बाद धीरे अच्छी तरह से किनारे के माध्यम से कुएं में 500 μl पीएफए ​​स्लाइड करने के लिए दूसरे हाथ का उपयोग करें. आसान आकांक्षा के लिए, यह है कि कोण पर स्थिर है कि इतनी स्टायरोफोम स्टैंड के खिलाफ यह झुकाव, के बारे में 45 डिग्री पर संस्कृति की थाली झुकाव. इस आकांक्षा और संस्कृति में कोशिकाओं के बिना परेशान अच्छी तरह से करने के लिए पीएफए ​​समाधान जोड़ने की सुविधा होगी. इस सेल की गतिविधियों का मूल सेलुलर संरचना की रक्षा करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम है.
  6. एक गिलास डिस्क के साथ सभी कुओं पीएफए ​​प्राप्त किया है जब तक इस प्रक्रिया को दोहराएँ. नोट: अच्छी तरह से पूर्व मौजूदा समाधान को बदलने की जरूरत है कि सभी कदम एक ही आकांक्षा प्रक्रियाओं को लागू करेगा.
  7. 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस में थाली प्लेस. वापस संस्कृति हुड के लिए थाली ले लो और 2.5 कदम के रूप में वर्णित स्टायरोफोम के खिलाफ झुकाव. धीरे एक संग्रह ट्यूब में अच्छी तरह से पीएफए ​​स्थानांतरित करने के लिए एक हाथ का प्रयोग करें; तुरंत बाद अच्छी तरह से में कम से कम 500 μl कमरे तापमान पीबीएस स्थान के लिए दूसरे हाथ का उपयोग. सभी कुओं धोया गया है, के बाद लौट सकते हैं और अच्छी तरह से हर में एक बार फिर पीबीएस धोने दोहराएँ. एक खतरनाक अपशिष्ट कंटेनर में एकत्र पीएफए ​​खाली.
  8. पीबीएस के लिए 2% भ्रूण गोजातीय सीरम जोड़कर आईसीसी अवरुद्ध बफर तैयार करें. 0.04% सोडियम azide (20% शेयर समाधान से पतला) एक संरक्षक के रूप में जोड़ा गया है. चेतावनी: सोडियम azide एक विषाक्त यौगिक है. बफर जीवाणु संक्रमण के बिना समय की एक लंबी अवधि के लिए 4 डिग्री सेल्सियस में संग्रहित किया जा सकता है.
  9. अभी भी एक अच्छी तरह से पीबीएस निकालने के लिए aspirating और तुरंत बाद आईसीसी अवरुद्ध बफर के 500 μl जोड़ने के माध्यम से चक्र एक बार फिर, एक स्टैंड के खिलाफ झुका संस्कृति की थाली के साथ. कोशिकाओं को अब immunofluorescence धुंधला के लिए तैयार हैं. यदि आवश्यक हो,तय कोशिकाओं TM4SF1 प्रोटीन की महत्वपूर्ण नुकसान के बिना एक सप्ताह के लिए एक 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में संग्रहीत किया जा सकता है.

3. Nanopodia की TM4SF1 immunofluorescence धुंधला

  1. प्रत्येक कुएं में, ट्राइटन X-100 0.01% से युक्त एक नया अवरुद्ध बफर के साथ 500 μl आईसीसी अवरुद्ध बफर की जगह है और यह 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर बैठते हैं. यह कोशिका झिल्ली से TM4SF1 निकाल देंगे के रूप में 0.03% ट्राइटन X-100 से अधिक का उपयोग न करें. धुंधला तुरंत शुरू करने के लिए तैयार है अगर पीबीएस 2.10 कदम से कोशिकाओं को धोया सीधे ट्राइटन युक्त अवरुद्ध बफर करने के लिए ले जाया जा सकता है.
  2. आईसीसी अवरुद्ध बफर में 0.5 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर प्राथमिक विरोधी TM4SF1 (या विरोधी CD9) एंटीबॉडी पतला.
  3. प्रत्येक कुएं में, ICC/0.01% ट्राइटन बफर हटाने और विरोधी TM4SF1 एंटीबॉडी समाधान के 300 μl के साथ बदलें. कमरे के तापमान पर 2 घंटा सेते या 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर छोड़ दें
  4. कोई कम से कम 500 से μl पीबीएस के साथ अच्छी तरह से प्रत्येक धो लें. 3x दोहराने; हर बार Le पर देऊष्मायन समय के AST 5 मिनट.
  5. में एक माध्यमिक एंटीबॉडी और phalloidin समाधान तैयार आईसीसी एक एलेक्सा 488 लेबल गधा विरोधी माउस माध्यमिक एंटीबॉडी (2 ग्राम / एमएल अंतिम एकाग्रता) के 1,000 बार कमजोर पड़ने और phalloidin के 1000 x कमजोर पड़ने (50 एनजी / एमएल अंतिम एकाग्रता) का उपयोग कर, अवरुद्ध बफर.
  6. पीबीएस निकालें और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी और phalloidin समाधान के 300 μl जोड़ें और 2 घंटे के लिए सेते या 4 डिग्री सेल्सियस पर यह रातोरात छोड़
  7. धोने के अनुसार कम से कम एक 5 मिनट ऊष्मायन के साथ पीबीएस धोने कदम दोहराएँ. पिछले धोने में, 1 घंटे के लिए पीबीएस में अच्छी तरह से प्रत्येक छोड़ दें.
  8. एक गिलास स्लाइड पर विरोधी फीका बढ़ते मीडिया की एक बूंद (~ 10 μl) ड्रॉप.
  9. बेंड एक कठिन सतह पर धीरे दबाकर सिरिंज सुई 90 डिग्री में एक 19 जी 1 साढ़े की नोक. मुड़ा हुआ सुई पकड़ और धीरे अच्छी तरह से एक गिलास डिस्क उठा, और तेज संदंश का उपयोग डिस्क काबू करने के लिए दूसरे हाथ का उपयोग करने के लिए एक हाथ का प्रयोग करें.
  10. कांच डिस्क और बारी# 160; गिलास स्लाइड पर सेल की ओर से संपर्क बढ़ते मीडिया दे नीचे चेहरा. धीरे गिलास डिस्क जगह है और यह कमरे के तापमान पर एक अंधेरी जगह में रातोंरात सूखी हैं.
  11. छवि को immunofluorescence दाग nanopodia आगे बढ़ें, या -20 डिग्री सेल्सियस पर एक स्लाइड बॉक्स में स्लाइड्स की दुकान स्लाइड्स -20 डिग्री सेल्सियस में कुछ महीनों के लिए देखा जा सकता रहेगा

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Representative Results

चरण 1 के लिए:

(जैसे HUVEC और इस अध्ययन में इस्तेमाल PC3) के रूप में कोशिकाओं सामान्य रूप से विकसित करने के लिए सक्षम हैं, तो कोशिकाओं वे वरीयता प्राप्त करने के बाद, 30 मिनट के भीतर कोलेजन लेपित डिस्क को देते फूट डालना और जल्द ही बाद में मोबाइल बन गया है, और आगे उनके पथ का nanopodia का विस्तार होगा आंदोलन की. आंकड़े 1 ए और 1 बी क्रमशः एक ध्रुवीकृत और proliferating HUVEC. चित्रा 2A एक मोबाइल राज्य में ध्रुवीकृत PC3 कोशिकाओं से पता चलता है दिखाता है.

चरण 2 के लिए:

37 डिग्री सेल्सियस के लिए 4% पीएफए ​​के prewarming के साथ, 20 मिनट, और कमरे के तापमान पीबीएस के साथ कोमल धोने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं फिक्सिंग, सेलुलर राज्यों में अच्छी तरह से संरक्षित किया जाना चाहिए. आम तौर पर, अलग व्यक्ति HUVEC (चित्रा 1 ए, 1) या PC3 (2A चित्रा) कोशिकाओं कोशिकाओं कोशिका विभाजन की स्थिति में हैं, जब तक कि एक polarized आकारिकी शो (चित्रा 1 बी, 1). जाएगा कहनेवाला बातचीतसेल जंक्शन गठन (चित्रा 1C, 1) के प्रमुख के लिए भी अधिक देखी हैं. Nanopodia सेल परिधि पर दिखाई देनी चाहिए, और एफ actin अक्सर सेल को nanopodia समीपस्थ के कुछ भागों में मौजूद रहेंगे. ठंडे तापमान वापस nanopodia झिल्ली चैनलों के पीछे छोड़ने के कक्षों में वापस लेना एफ actin कारण. Suboptimal तापमान 4 डिग्री सेल्सियस पीएफए ​​निर्धारण और ठंड पीबीएस धोने का उपयोग कर उदाहरण के रूप में दिखाया, (चित्रा 1 ए, 2), proliferating कोशिकाओं (चित्रा 1 बी, 2), और कृत्रिम रूप से कहनेवाला जंक्शनों पर अंतराल उत्पादन परेशान और polarized कोशिकाओं में nanopodia संरचना को नष्ट कर देगा (चित्रा 1C, 2).

चरण 3 के लिए:

TM4SF1 सहित कई झिल्ली ही सीमित प्रोटीन ट्राइटन X-100 बहुत संवेदनशील होते हैं और 0.03% की तुलना में उच्च सांद्रता 2,3 उपयोग किया जाता है, तो कोशिका की सतह से निकाल दिया जाएगा. कोशिका की सतह TM4SF1, पी के सबसे बनाए रखने के लिएएफए तय कोशिकाओं केवल 0.01% ट्राइटन X-100 ट्राइटन X-100 शामिल नहीं है कि एक नियमित रूप से अवरुद्ध बफर में पतला कर दिया गया है कि विरोधी TM4SF1 प्राथमिक एंटीबॉडी को बदलने से पहले एक घंटे के लिए बफर अवरुद्ध को रोकने के साथ व्यवहार किया जाना चाहिए. Nanopodia पतली और लंबी झिल्ली अनुमानों हैं और TMED के माध्यम से मैट्रिक्स के लिए देते हैं, TMED तीव्रता संभावना (चित्रा nanopodia अवशेषों के माध्यम से सेल आंदोलन का रास्ता बता और ट्रैक करने के क्रम में फ़ोटोशॉप जैसे इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर में चमक और विपरीत कार्यों के माध्यम से बढ़ाया जा आवश्यकता होगी 1, 2 insets).

चित्रा 1
चित्रा 1. Endothelial सेल आंदोलन, कोशिका विभाजन, और जंक्शन गठन के दौरान Nanopodia अनुमानों. HUVEC 6 घंटा करि के लिए हौसले सुसंस्कृत थेआर कोलेजन लेपित गिलास डिस्क पर 60% संगम पर चढ़ाना. कोशिकाओं पीबीएस में prewashing बिना सीधे पीएफए ​​37 डिग्री सेल्सियस में 4% तय की है, और 20 मिनट निर्धारण समय, या (2) एक पारंपरिक धुंधला विधि के दौरान एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखा गया था, जहां (1) संशोधित पद्धति का उपयोग करके तय किया गया कोशिकाओं को कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 4% पीएफए ​​में दो बार कमरे के तापमान पीबीएस के साथ धोया और तय किया गया है. Nanopodia, TMED की एक आंतरायिक, बंधी पैटर्न (सफेद तीर) द्वारा चिह्नित किया है और कहा कि अक्सर सेल को समीपस्थ भागों में phalloidin दाग एफ actin (गुलाबी तीर) लगा देना रहे हैं कि पतली और लंबी झिल्ली एक्सटेंशन, immunofluorescence विरोधी TM4SF1 दाग का उपयोग कर रहे थे अब. तीन प्रतिनिधि HUVEC छवियों (ए) ध्रुवीकरण, (बी) कोशिका विभाजन, और (सी) कहनेवाला जंक्शन गठन के दौरान nanopodia की उपस्थिति दिखाने के लिए कब्जा कर लिया गया. इनसेट बक्से nanopodia के उच्च आवर्धन दिखा. के दौरान (ए) या ​​retracte polarizedसंरचनाओं काफी हद तक धोने से हटा दिया है और कमरे के तापमान पीबीएस और पीएफए ​​में कोशिकाओं फिक्सिंग कर रहे थे जबकि डी सेलुलर अमेरिका (बी, सी), nanopodia अनुमानों, सीधे 37 डिग्री सेल्सियस पीएफए ​​में कोशिकाओं फिक्सिंग से संरक्षित किया गया. (सी) 37 डिग्री सेल्सियस पीएफए ​​निर्धारण जंक्शनों कोशिकाओं को वापस लेना है कि कारण ठंडा तापमान से परेशान कर रहे हैं, जबकि अधिकांश एफ actin (गुलाबी तीर) होते हैं, जिनमें से nanopodia से पाटने की कोशिकाओं के बीच एक खाई पैदा कर, कहनेवाला जंक्शनों (नीले तीर) को बरकरार रखता है और कुछ (सफेद तीर) नहीं है बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2. PC3 ट्यूमर सेल आंदोलन की दिशा को प्रदर्शित Nanopodia. (ए)PC3 ट्यूमर कोशिकाओं हौसले कोलेजन लेपित गिलास डिस्क पर 60% संगम पर चढ़ाना के बाद 6 घंटे के लिए सुसंस्कृत थे. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस 4% पीएफए ​​में सीधे तय की और nanopodia संरक्षित करने के लिए 20 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखा गया था. Nanopodia (सफेद तीर) और एफ actin (गुलाबी तीर) क्रमश: विरोधी TM4SF1 एबी और FITCphalloidin का उपयोग दाग immunofluorescence थे. इनसेट बॉक्स उच्च बढ़ाई nanopodia से पता चलता है. यह प्रतिनिधि छवि PC3 कोशिकाओं में TM4SF1 अभिव्यक्ति विषम पता चलता है कि; मजबूत TM4SF1 धुंधला (पीले तीर) के साथ एक PC3 सेल लंबे nanopodia उत्पादन किया है और दो कमजोर TM4SF1 से सना हुआ PC3 कोशिकाओं (लाल तीर) से घिरा हुआ है. अनुगामी किनारे पर Nanopodia अवशेष (आईबी) 6 घंटा सेल संस्कृति की अवधि के दौरान PC3 सेल आंदोलन की दिशा संकेत मिलता है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3 चित्रा 3. Tetraspanin CD9 के माध्यम से nanopodia के दृश्य. (ए) HUVEC एक कोलेजन लेपित गिलास डिस्क पर 60% confluency पर चढ़ाना के बाद 6 घंटे के लिए हौसले सुसंस्कृत थे. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस में 4% पीएफए ​​और nanopodia (सफेद तीर) विरोधी CD9 अब के माध्यम से पता चला रहे थे तय किया गया. एफ actin (गुलाबी तीर) FITCphalloidin का उपयोग सना हुआ था. यह प्रतिनिधि छवि CD9 भी nanopodia लिए localizes कि दिखाता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

Nanopodia मजबूती TMED के माध्यम से मैट्रिक्स को देते हैं और पर्यावरण भावना और कहनेवाला बातचीत 2,3 मध्यस्थता करने के लिए एक polarized मोबाइल सेल से 100 से अधिक माइक्रोन विस्तार कर सकते हैं कि पतली सेलुलर झिल्ली चैनल हैं. इतनी मजबूती से अवशेषों को दूर सेल कदम के रूप में पीछे छोड़ दिया जाता है कि मैट्रिक्स का पालन करना Nanopodia (आंकड़े 1 और 2). Nanopodia इस प्रकार हमें कोशिकाओं अपने पर्यावरण समझ कैसे अध्ययन और सेल आंदोलन का रास्ता तय करने के लिए अनुमति देते हैं, और कैसे जीन की अभिव्यक्ति या नशीली दवाओं के उपचार परिवर्तन आंदोलन. हालांकि, इन पतली (100-300 माइक्रोन चौड़ाई) झिल्ली संरचनाओं की कमजोरी को सावधानी उन्हें सुरक्षित रखने के लिए उठाए जाने की जरूरत है.

ईमानदारी nanopodia परेशान बिना सेलुलर गतिविधियों को रिकॉर्ड करने के लिए, और प्रयोगात्मक शर्तों nanopodia गतिविधियों और सेल आंदोलन की राह कैसे प्रभावित अध्ययन करने के लिए आदेश में, एक पहले कोशिकाओं purs से पहले पूरा मध्यम में प्रभावी ढंग से बढ़ने पुष्टि करनी चाहिए किप्रयोग uing. ऐसे HUVEC के रूप में सामान्य स्वस्थ प्राथमिक endothelial कोशिकाओं, ताजा EGM2-एमवी पूर्ण संस्कृति के माध्यम में सामान्य रूप से अपनी संस्कृति के छह अंश के भीतर विकास के अपने प्रवेश के चरण के दौरान लगभग हर 18 घंटे में बांट देंगे. एक उच्च बीतने संख्या संस्कृति 7 में वृद्ध होनेवाला या binuclear कोशिकाओं की बढ़ी संख्या को बढ़ावा मिलेगा और फूट डालना और nanopodia 2 निर्माण करने के लिए 'कोशिकाओं की क्षमता को प्रभावित करेगा के रूप में पारित होने के 6 से अधिक होती है कि HUVEC के उपयोग से बचना चाहिए. PC3 प्रोस्टेट ट्यूमर कोशिकाओं संस्कृतियों (अप्रकाशित अवलोकन) को और अधिक स्थिर हैं, लेकिन अभी भी जमे हुए राज्य से उनके हटाने से कोशिकाओं को अधिक से अधिक दस अंश के उपयोग से बचना चाहिए.

वे वरीयता प्राप्त कर रहे हैं के बाद स्वस्थ पक्षपाती कोशिकाओं आम तौर पर पहले 30 मिनट के भीतर कोलेजन लेपित डिस्क को जोड़ना होगा, सेल ध्रुवीकरण द्वारा जल्द ही बाद में पीछा किया. इस प्रकार एक ऊष्मायन के पहले घंटे के अंत में एक ध्रुवीकृत राज्य में सबसे endothelial कोशिकाओं देखने की उम्मीद करनी चाहिए. यदि एकendothelial कोशिकाओं के बहुमत, (एक) कोलेजन इसकी समाप्ति की तारीख बीत चुका है कि जांच तो, कांच की सतह को संलग्न नहीं है (ख) सेल फसल के दौरान trypsinization भी कड़े था, या (ग) कोशिकाओं अस्वस्थ हैं. PC3 कोशिकाओं endothelial कोशिकाओं की तुलना में धीमी फूट डालना है, लेकिन बोने के बाद 2 घंटा के भीतर एक polarized आकारिकी का प्रदर्शन करना चाहिए. संदूषण संस्कृति में होता है, तो गिलास डिस्क या संदंश ठीक से निष्फल रहे थे कि क्या जांच करते हैं. वैकल्पिक रूप से, एक चैम्बर स्लाइड्स के उपयोग पर विचार कर सकते हैं; यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल लागत बचाने के लिए और अधिक आसानी से नमूनों की एक बड़ी संख्या को संभालने के लिए 24 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों में कांच डिस्क के उपयोग का सुझाव है.

परम्परागत immunostaining के तरीकों, nanopodia तरह ठीक सेलुलर संरचनाओं परेशान आसानी से कमरे के तापमान लगानेवाला जोड़ने से पहले कोशिकाओं को धोने के लिए और धुंधला प्रक्रिया के दौरान उन्हें नष्ट कर देगा पीबीएस का उपयोग. यह काफी हद तक सच कारण है कि सेल fixati दौरान तापमान के उतार चढ़ाव की तरह शारीरिक तनावधुंधला प्रक्रिया पर या कठोर पीबीएस धोने के दौरान विखंडन या nanopodial संरचनाओं को हटाने का मुख्य कारण होते हैं. तीन सरल पद्धति में परिवर्तन के साथ - (i) के निर्धारण से पहले पीबीएस के साथ धोने से सेल ध्रुवीकरण राज्य परेशान मत करो (द्वितीय) पीएफए ​​prewarmed 37 डिग्री सेल्सियस में सीधे कोशिकाओं को ठीक करने और निर्धारण के दौरान 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सेते हैं, और (ii) धीरे धोने कमरे के तापमान पीबीएस में कोशिकाओं - nanopodia काफी हद तक संरक्षित रखा जाता है पीएफए ​​और पीबीएस तापमान सुसंस्कृत endothelial कोशिकाओं में nanopodia के संरक्षण को प्रभावित कैसे 1 से पता चलता है, चित्रा 2A TM4SF1 अभिव्यक्ति PC3 कोशिकाओं में विषम है और सबसे मजबूत TM4SF1 धुंधला के साथ कोशिकाओं सबसे लंबे समय तक प्रदर्शित करते हैं कि पता चलता है. nanopodia. तापमान एफ actin गतिविधियों और ट्यूबिलिन अखंडता 8,9 को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है. इस प्रकार ((इस यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल में 37 डिग्री सेल्सियस है) कोशिकाओं बड़े हो रहे थे, जिसमें एक ही तापमान में बेहतर ध्रुवीकृत सेलुलर राज्य की रक्षा की संभावना कोशिकाओं है फिक्सिंग 1 बी) और कोशिकाओं प्रायोगिक अध्ययन के लिए हटा रहे हैं जब समय पर सेलुलर गतिविधियों की अधिक वफादार रिकॉर्डिंग की अनुमति कहनेवाला जंक्शनों (चित्रा 1C),. Retracting पक्ष पर विपरीत, सेल के प्रमुख मोर्चे पर nanopodia अनुमानों वे आगे 2,3 कदम के रूप में कोशिकाओं को लगातार आगे बढ़ और अग्रणी धार nanopodia उग आया है हिस्से में है, क्योंकि कम रहता है. इस प्रकार अग्रणी मोर्चे पर nanopodia निरीक्षण करने के लिए सबसे अच्छा समय बोने के बाद आदर्श पर चारों ओर 30-60 मिनट, कोशिकाओं मैट्रिक्स से जुड़ी है और केवल आंदोलन आरंभ करने के लिए शुरुआत कर रहे हैं एक समय था जब, कोशिकाओं चढ़ाया जाता है लंबे समय के बाद नहीं है. लाइव सेल इमेजिंग अग्रणी मोर्चे पर nanopodia गतिविधियों का एक सटीक रिकॉर्ड के लिए सक्षम बनाता है, जो एक वैकल्पिक तरीका है.

पीएफए ​​निर्धारण में इस्तेमाल केवल अभिकर्मक नहीं है; मेथनॉल, इथेनॉल, और एसीटोन जैसे कार्बनिक विलायकों भी अक्सर 10 immunostaining के लिए सेल निर्धारण में उपयोग किया जाता है.सर्वश्रेष्ठ लगानेवाला अक्सर धुंधला हो जाना (अप्रकाशित डेटा) में इस्तेमाल एक विशिष्ट एंटीबॉडी का मिलान स्थान के आधार पर फैसला किया है. TM4SF1 की कोशिकी डोमेन पहचानता है कि माउस विरोधी मानव TM4SF1 एंटीबॉडी के लिए (Millipore, इस अध्ययन में इस्तेमाल), पीएफए ​​अन्य कार्बनिक विलायकों का मिलान नष्ट यह दर्शाता है कि प्रतिरक्षा धुंधला में TMED का पता चलता है जो केवल लगानेवाला है. इसके विपरीत, जिसका मिलान एन टर्मिनल क्षेत्र के निकट अठारह अमीनो एसिड में स्थित है Acris (नहीं दिखाया डेटा), से खरगोश विरोधी मानव TM4SF1 पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी इथेनॉल तय कोशिकाओं के साथ भी काम करता है. हालांकि, Acris एंटीबॉडी एन टर्मिनल मिलान आंशिक रूप से मिलान कवर जो साइटोसोलिक अणु (एस) के साथ TM4SF1 बातचीत से व्यस्त है, शायद इसलिए क्योंकि अच्छा TM4SF1 धुंधला उपज नहीं है.

ट्राइटन X-100 एक nonionic surfactant है और अक्सर कोशिका झिल्ली permeabilizing और जलीय समाधान 11,12 की सतह तनाव को कम करने के उद्देश्य से प्रतिरक्षा धुंधला में प्रयोग किया जाता है. Howeveआर, इस क्षमता भी झिल्ली प्रोटीन solubilizing का खतरा लाता है. TM4SF1 पूरी तरह से 0.05% 2,3 से अधिक ट्राइटन X-100 सांद्रता से कोशिका की सतह से हटा दिया है. इस कारण से, प्राथमिक एंटीबॉडी के अलावा पहले 0.01% ट्राइटन X-100 के साथ ही एक 1 घंटा उपचार विधि यहाँ वर्णित में प्रयोग किया जाता है. इस इलाज के कोशिका झिल्ली पर सबसे TM4SF1 जबकि संरक्षण, अच्छी तरह से एंटीबॉडी द्वारा मूल्यांकन किया जाना पेरी परमाणु TM4SF1 सक्षम करने के लिए पर्याप्त झिल्ली permeabilizes. 0.01% ट्राइटन काम नहीं करता है नाभिक में स्थित प्रोटीन के साथ TM4SF1 की डबल धुंधला के लिए, preincubation चरण में 0.03% ट्राइटन X-100 का उपयोग करें. इस परमाणु झिल्ली की ट्राइटन X-100 puncturing की सुविधा होगी.

TM4SF1 endothelial कोशिकाओं और ट्यूमर कोशिकाओं को अत्यधिक विशिष्ट है; अधिकांश अन्य प्रकार की कोशिकाओं TM4SF1 व्यक्त या एक बहुत कम स्तर 2,3 में यह व्यक्त नहीं करते हैं. हालांकि, क्लासिक tetraspanins - तैंतीस सदस्यों includin शामिल एक परिवारजी CD9, CD81, और CD151 - सर्वत्र 6 व्यक्त कर रहे हैं, और भी nanopodia 2,3 (चित्रा 3) में झिल्ली डोमेन में पाया जा सकता है. इस प्रकार, TM4SF1 के लिए इस्तेमाल किया ही प्रतिरक्षा धुंधला विधि के माध्यम से क्लासिक tetraspanins धुंधला TM4SF1 व्यक्त नहीं करते कि प्रकार की कोशिकाओं में nanopodia के अध्ययन के लिए सक्षम कर सकते हैं. TM4SF1 व्यक्त कि PC3 ट्यूमर कोशिकाओं अत्यधिक दुर्बलता TM4SF1 व्यक्त कि PC3 कोशिकाओं आंदोलन का एक स्पष्ट रूप से परिभाषित दिशा (2A चित्रा और अप्रकाशित डेटा) नहीं है, जबकि एक ही दिशा में लगातार चलते हैं. ट्यूमर कोशिकाओं में TM4SF1 अभिव्यक्ति के स्तर उनके metastatic क्षमता 13 के साथ सहसंबद्ध किया जाता है, और जांच फिलहाल TM4SF1 व्यक्त करने और उनके metastatic क्षमता को nanopodia उत्पादन के लिए चल जोड़ने ट्यूमर कोशिकाओं 'क्षमता हो जाता है.

संक्षेप में, धुंधला nanopodia के लिए प्रभावी तरीकों की महारत nanopodia पुन सेल के माध्यम से आंदोलन की राह पर नज़र रखने के लिए जांचकर्ताओं सक्षम बनाता हैsidues, कोशिकाओं सेल आंदोलन जीन (overexpression या हित के जीन की पछाड़ना या तो) की अभिव्यक्ति के स्तर में परिवर्तन के द्वारा संशोधित किया गया है कि कैसे आंदोलन के लिए अपने पर्यावरण समझ कैसे पढ़ते हैं. सेल ध्रुवीकरण और सेल आंदोलन की जांच के लिए एक नए उपकरण का प्रतिनिधित्व Nanopodia.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

हम 37 डिग्री सेल्सियस पीएफए ​​में नियतन की कोशिश करने का सुझाव सहित उपयोगी विचार विमर्श के लिए डॉ. हेरोल्ड ड्वोरक को स्वीकार करते हैं. इस काम एनआईएच अनुदान P01 CA92644 द्वारा और कैंसर अनुसंधान के लिए नेशनल फाउंडेशन से एक अनुबंध द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass disks Fisher Scientific 12-545-82 12 mm diameter
Glass jar Fisher Scientific 02-912-310 Certified Clean Clear Glass Straight-Sided Jars, 4 oz
Glass slide Fisher Scientific 12-544-1 Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides
50 ml Falcon tube BD Falcon 352070 50 ml high-clarity polypropylene conical centrifuge tube, 16,000 rcf rating. Sterile.
15 ml Falcon tube with Styrofoam rack Corning 430790 Corning 15 ml PP Centrifuge Tubes
Sharp forceps Fisher Scientific 13-812-42 Dissecting Extra Fine Pointed Splinter Forceps
24-well Cell culture plate BD Bioscience 353047 24-well Cell Culture Plate
150 mm Cell culture plate BD Bioscience 353025 150 mm cell culture plate
19 G 1 ½ Syringe needle BD Bioscience 309635 19 G 1 ½
Ethanol Decon Laboratories, Inc. 2701 Decon's Pure Ethanol 200 Proof
Collagen solution BD Bioscience 354249 Collagen I, High Concentration, rat tail, 100 mg
Trypsin/EDTA Cellgro 25-053-CI 0.25% Trypsin-EDTA 1x
DMEM Life Technologies 11965-092 DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate
10x PBS Affymetrix 75889 5 LT PBS, 10x Solution, pH 7.4
PFA (paraformaldehyde) Affymetrix 19943 1 LT 4% in PBS
FBS Sigma-Aldrich F4135-500ML Fetal Bovine Serum
EGM2-MV Lonza CC-3162 EGM-2 BulletKit, EBM-2 Basal Medium 500 ml and EGM-2 SingleQuot Kit Supplement & Growth Factors
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 Triton X-100
NaN3 Sigma-Aldrich S2002-25G Solubilized in water. 4% stock solution and working concentration is 0.4%.
Mouse anti-human TM4SF1 antibody  Millipore MAB3127 Epitope is located in extracellular domain
Mouse anti-human CD9 antibody  BD Bioscience 555370 Epitope is located in extracellular domain
Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouse 2nd antibody Life Technologies A-21202 Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)
Phalloidin Chemicon 90324 Rhodamine-conjugated Phalloidin
Anti-fade mounting media  Life Technologies P-36931 ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI
70% Ethanol  17.5 ml of ethanol (200 proof)
7.5 ml of double-deionized water
10x PBS (make 200 ml) 20 ml of 10x PBS
180 ml of double-deionized water
20% Triton X-100 (make 20 ml)  4 ml Triton X-100
16 ml double-deionized water
4% NaN3 (make 25 ml) 1 g of NaN3
25 ml of double-deionized water
50 ng/ml Bovine collagen solution in PBS (make 5 ml) Stock solution of 50 μg/ml (50 ml)
830 μl of Collagen I (3 mg)
50 ml PBS
ICC Blocking Buffer (50 ml) 49 ml PBS
2% FBS (add 1 ml)
0.04% NaN3 (add 100 μl of 4% NaN3)
ICC Blocking Buffer/0.01% Triton X-100 (make 50 ml) 50 ml of ICC Blocking Buffer
25 μl of 20% Triton X-100
HUVEC  Lonza C2517A www.lonza.com
PC3 ATCC CRL-1435 www.atcc.org
Cell culture hood NuAIRE Nu-425-600 NU-425 (Series 60) Biological Safety Cabinet 
37 °C, 5% CO2 Cell culture incubator  CellStar QWJ300DABA Cellstar CO2 Water Jacketed Incubator
Heating pad  K&H Manufacturing 1020 K&H Lectro Kennel Heated Pad with Free Fleece Cover (www.amazon.com)
Centrifuge Sorvall T6000B Sorvall T6000 (B) Benchtop Centrifuge
Hemocytometer Sigma-Aldrich Z359629 Bright-Line Hemocytometer

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References

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सेलुलर जीवविज्ञान अंक 86 nanopodia TM4SF1 endothelial सेल ट्यूमर सेल एफ actin immunofluorescence धुंधला tetraspanin
Nanopodia - सेल आंदोलन और कहनेवाला बातचीत में भूमिकाओं के साथ पतली, नाजुक झिल्ली अनुमान
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Lin, C. I., Lau, C. Y., Li, D., Jaminet, S. C. Nanopodia - Thin, Fragile Membrane Projections with Roles in Cell Movement and Intercellular Interactions. J. Vis. Exp. (86), e51320, doi:10.3791/51320 (2014).

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