Summary
Nanopodia sono canali di membrana sottile ma fragili che si estendono fino a 100 micron dai principali anteriore o posteriore finale di una cella e percepiscono l'ambiente cellulare. Fissaggio diretto a 37 ° C, lavaggio delicato, e di evitare di solventi organici come l'etanolo, metanolo o acetone e di maggiori Triton X-100 le concentrazioni sono tenuti ad osservare queste strutture cellulari.
Abstract
Cellule aderenti in coltura mantenere uno stato polarizzato per sostenere il movimento e le interazioni intercellulari. Nanopodia sono sottili, di forma allungata, in gran parte F actina-negativo-proiezioni di membrana in cellule endoteliali e tumorali che possono essere visualizzati attraverso TM4SF1 (transmembrana-4-L-sei-famiglia-1) immunofluorescenza. Cluster TM4SF1 di 100-300 micron di diametro TMED (TM 4SF1 e nriched micro omains d) contenente da 3 a ben 14 singoli TM4SF1 molecole. TMED sono disposte in modo intermittente lungo nanopodia ad una distanza regolare di 1 a 3 TMED per μ m ed ancorare saldamente nanopodia a matrice. Ciò consente nanopodia di estendere oltre 100 μ m dalla porta anteriore o posteriore finale delle cellule endoteliali tumorali o polarizzati, e fa sì che i residui di membrana di essere lasciato in matrix quando la cella si allontana. TMED e nanopodia sono stati trascurati a causa della loro estrema fragilità e sensibilità alla temperatura. Lavaggio di routine e la fissazione disturbare la struttura. Nanopodia sono conservate mediante fissaggio diretto in paraformaldeide (PFA) a 37 ° C, seguito da una breve esposizione al 0,01% Triton X-100 prima della colorazione. Nanopodia aprire nuovi orizzonti in biologia cellulare: promettono di rimodellare la nostra comprensione di come le cellule percepiscono il loro ambiente, rilevare e identificare altre cellule a distanza, avviare interazioni intercellulari a stretto contatto, e dei meccanismi di segnalazione coinvolte nel movimento, la proliferazione, e la cella -CELL comunicazioni. I metodi che sono sviluppati per lo studio nanopodia TM4SF1-derivati possono essere utili per gli studi di nanopodia che si formano in altri tipi di cellule attraverso l'agenzia di tetraspanine classici, in particolare il ubiquitariamente espressa CD9, CD81 e CD151.
Introduction
Durante la polarizzazione per il movimento, cellule animali si estendono una serie di dinamiche, protrusioni di membrana dalle loro superfici, tra cui filopodia, lamellipodia, fibre di retrazione, e volant 1. Recentemente aggiunto a questa lista fosse nanopodia, un tipo recentemente riconosciuta sottile (100-300 micron di diametro), allungato (fino a 50-100 micron), membrana di proiezione che forniscono canali di membrana per l'estensione delle strutture di F-actina come filopodia e fibra di svincolo e quella macchia positivamente con TM4SF1 (transmembrana-4-L-sei-famiglia-1) in endoteliali tumorali e cellule in coltura 2,3.
TM4SF1 è una proteina con topologia tetraspanin-come originariamente conosciuto come un antigene sulla cellula tumorale 4 prima della scoperta che la molecola è un biomarker cellule endoteliali che gioca un ruolo essenziale nella proliferazione delle cellule endoteliali e la migrazione 2,3. Immunofluorescenza ha rivelato che TM4SF1 è localizzato perinucvescicole Lear e alla membrana plasmatica, e si arricchisce in TM 4SF1 e nriched micro omains d (TMED). TMED ancoraggio nanopodia alla matrice e presente in uno schema a fasce regolarmente distanziate di 1-3 lunghezza TMED / micron di nanopodia. Nanopodia tipicamente estendono dalla porta anteriore di una cella e finali posteriore durante polarizzazione cellulare per il movimento. A causa della natura aderente ditta di TMED, nanopodia sono in grado di rientrare nella cella mentre si allontana; residui nanopodia abbandonati tracciano così il percorso del movimento cellulare. Nanopodia fornire canali di membrana per l'estensione F-actina e retrazione, e sono siti di interazioni intercellulari e comunicazioni 2,3. Queste caratteristiche fanno sì che nanopodia offrono un'opportunità unica di studiare i meccanismi alla base di montaggio F-actina durante la polarizzazione cellulare, rilevamento cellulare dell'ambiente, la determinazione del percorso e la direzione del movimento delle cellule, e le interazioni intercellulari unnd comunicazioni.
A causa della natura altamente idrofoba TMED e la natura membranoso sottile e fragile di nanopodia, particolare attenzione deve essere presa al fine di preservare TMED e nanopodia. La distruzione di nanopodia e la rimozione di TMED con metodi di laboratorio più comuni è un possibile motivo per cui solo sessantatré pubblicazioni sono apparsi su TM4SF1 fin dalla sua prima scoperta nel 1986 1 e per la totale mancanza di conoscenza di TM4SF1 arricchimento 100-300 micron microdomini su superficie delle cellule fino alla relazione del TM4SF1 in cellule endoteliali nel 2009 2.
Metodi di immunoistochimica convenzionali comunemente utilizzare solventi organici come etanolo, metanolo, acetone o riparare cellule e usare 0,1% o maggiore concentrazione di Triton X-100 per permeabilize celle 5. Gli studi qui descritti implementati tre importanti modifiche al metodo convenzionale per rivelare TMED e nanopodia: (i) utilizzano 37 ° C 4% PFA e fissare le cellule a 3776; C incubatore, (ii) applicare dolce temperatura ambiente lavaggio PBS, e (iii) utilizzare meno dello 0,03% Triton X-100 solo brevemente permeabilize celle prima aggiunta di anticorpo primario, come Triton X-100 superiore a 0,03% estrarrà TM4SF1.
Tutti tetraspanine formano microdomini sulla membrana cellulare 6 e alcuni colocalize con TMED in endoteliali e cellule tumorali 2,3. Come tetraspanine come CD9, CD81 e CD151 sono espressi ubiquitariamente, il protocollo di colorazione qui descritto può essere estesa a diversi tipi di cellule che mancano TM4SF1 per il controllo della funzione nanopodia.
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Protocol
1. Coltura cellulare sul collagene rivestito disco di vetro
- Dischi Luogo di vetro (12 mm di diametro) in un barattolo di vetro (4 oz) e autoclave per sterilizzare i dischi.
- Mettete 25 ml di etanolo al 70% in un tubo Falcon da 50 ml e metterlo in una cappa di coltura cellulare. Questa soluzione può essere riutilizzato più volte fino a quando il livello della soluzione scende a 20 ml.
- Posizionare una pinza nitide con un punto extra fine in etanolo al 70% per 5 minuti prima di utilizzarlo per gestire il disco di vetro.
- Rimuovere con cautela la pinza dal tubo e chiudere il tappo, quindi inserire delicatamente i etanolo trattati pinza sulla parte superiore del tubo di aria secca per 2 min. Non permettere che la punta delle pinze per toccare nulla nel cofano.
- Utilizzare le pinze sterili per afferrare un disco di vetro sterile fuori del vaso di vetro e metterla in un pozzetto della piastra di coltura cellulare di 24 pozzetti. Ripetere l'operazione fino a quando il numero desiderato di pozzetti è stato popolato con dischi.
- Mettete 500 ml di soluzione di collagene bovino (50 ng / ml) in ciascun pozzetto contenente un disco di vetro e porlo in 37 ° C, 5% CO 2 incubatore di coltura cellulare per almeno 30 min. Non vi è nulla di male in un incubazione più lungo.
- Harvest HUVEC (cellule umane ombelicale Vena endoteliali) o PC3 (prostata cellule tumorali) che erano già coltivate in 150 millimetri piastra di coltura cellulare attraverso tripsinizzazione e bloccano l'attività tripsina utilizzando il suo terreno di coltura completo. Raccogliere le cellule in una provetta Falcon da 15 ml.
- Contare il numero di cellulare e assicurarsi che la redditività è superiore al 90%.
- Agglomerare le cellule per centrifugazione a 200 xg per 10 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante.
- Utilizzare il mezzo di coltura per diluire le cellule a 10 5 cellule / ml. Posizionare cellule su ghiaccio.
- Aspirare il collagene nella cappa coltura cellulare e posizionare delicatamente 500 ml di sospensione cellulare in ciascun pozzetto in cui i dischi di vetro sono state fase solida con collagene. 5 x 10 4 cellule / pozzetto della piastra a 24 pozzetti darà il 60% confluency per HUVEC e il 30% di confluenza di cellule PC3. Nota: aggiungi sospensione più cellulare per densità delle cellule superiore.
- Cultura le celle di una 37 ° C, 5% CO 2 incubatore per 1 ora, 2 ore, 4 ore, 6 ore, o 24 ore per tracciare le attività nanopodia e il passaggio delle cellule. Tipicamente, le cellule saranno allegare al disco di vetro nei primi 30 min, poi iniziano a polarizzare e migrare nella prima ora, e svolgono interazioni intercellulari e divisione cellulare nelle ore successive.
2. Fissazione delle cellule
- Ogni bene avrà bisogno di 500 microlitri 4% PFA (paraformaldeide) per fissare le cellule. Sia fabbricata commercialmente o appena fatto 4% PFA può essere utilizzato. Calcolare la quantità di PFA necessario in base al numero di pozzetti preparati, e posizionare PFA in un tubo Falcon da 15 ml. ATTENZIONE: paraformaldeide è un sospetto cancerogeno.
- Inserire il tubo falco in uno stand di polistirolo che era già in atto in un 37 ° C incubatore. Lasciare il tubo in incubatrice per 30 min alla guerram il PFA a 37 ° C.
- Posizionare una piastra elettrica nel cofano cultura e accenderlo.
- Estrarre la piastra di coltura cellulare di 24 pozzetti e preriscaldata PFA fuori dell'incubatore e collocarlo sulla parte superiore del pad di riscaldamento.
- Utilizzare una sola mano per aspirare il mezzo da un pozzo, e subito dopo utilizzare l'altra mano per far scorrere delicatamente 500 microlitri PFA nel pozzo attraverso il bordo bene. Per facilitare l'aspirazione, inclinare la piastra di coltura a circa 45 °, appoggiandola contro il supporto polistirolo in modo che sia stabile a tale angolo. Ciò faciliterà l'aspirazione e l'aggiunta di soluzione PFA al pozzo senza disturbare le cellule in coltura. Questo è il passo più importante per preservare la struttura cellulare delle attività cellulari.
- Ripetere il processo fino a quando tutti i pozzetti con un disco di vetro hanno ricevuto PFA. Nota: tutti i passi che devono cambiare soluzione pre-esistente dal pozzo si applicano stesse procedure di aspirazione.
- Porre la piastra in 37 ° C per 5 min. Prendere la piastra posteriore alla cappa cultura e inclinare contro Styrofoam come descritto al punto 2.5. Con una mano per trasferire delicatamente la PFA dal pozzo in un tubo di raccolta; utilizzare l'altra mano per posizionare subito dopo almeno 500 microlitri camera temperatura PBS nel pozzo. Dopo che tutti i pozzetti sono stati lavati, tornare e ripetere il lavaggio PBS ancora una volta in ogni bene. Svuotare la raccolta PFA in un contenitore per rifiuti pericolosi.
- Preparare tampone di bloccaggio ICC con l'aggiunta di 2% siero fetale bovino da PBS. Sodio azide 0,04% (diluito dal 20% soluzione madre) è aggiunto come conservante. ATTENZIONE: sodio azide è un composto tossico. Il tampone può essere conservato in 4 ° C per un lungo periodo di tempo senza contaminazione batterica.
- Con la piastra di coltura ancora inclinata contro uno stand, ancora una volta, il ciclo attraverso ogni bene aspirando per rimuovere PBS e subito dopo l'aggiunta di 500 ml di ICC tampone di bloccaggio. Le cellule sono ora pronti per immunofluorescenza. Se necessario, lacellule fisse possono essere memorizzati in un frigorifero a 4 ° C per una settimana senza significativa perdita di proteine TM4SF1.
3. TM4SF1 immunofluorescenza colorazione di Nanopodia
- In ogni pozzetto, sostituire il tampone bloccante 500 microlitri ICC con un nuovo tampone di bloccaggio contenente 0,01% Triton X-100 e lasciare riposare a temperatura ambiente per 1 ora. Non utilizzare superiore a 0,03% Triton X-100 in cui solleverà TM4SF1 dalle membrane cellulari. PBS lavato cellule dal punto 2.10 possono essere spostati direttamente al tampone bloccante contenente Triton se la colorazione è pronta per essere avviata immediatamente.
- Diluire l'anticorpo primario anti-TM4SF1 (o anti-CD9) a 0,5 mg / ml a ICC tampone di bloccaggio.
- In ogni pozzetto, rimuovere il tampone Triton ICC/0.01% e sostituirlo con 300 microlitri della soluzione anti-TM4SF1-anticorpo. Incubare 2 ore a temperatura ambiente o lasciare per una notte a 4 ° C.
- Lavare ogni pozzetto con non meno di 500 microlitri di PBS. Ripetere 3x; ogni volta dare a least 5 min di tempo di incubazione.
- Preparare una soluzione di anticorpo e phalloidin secondario ICC tampone di bloccaggio, utilizzando una diluizione 1.000 volte di Alexa 488 marcato asino anti-topo anticorpo secondario (2 mg / ml concentrazione finale) e 1000 x diluizione falloidina (50 ng / ml concentrazione finale).
- Rimuovere PBS e aggiungere 300 ml di anticorpo secondario e la soluzione phalloidin ad ogni pozzetto e incubare per 2 ore o lasciare tutta la notte a 4 ° C.
- Ripetere i passaggi di lavaggio PBS con almeno 5 minuti di incubazione per lavaggio. In ultimo lavaggio, lasciare ogni bene in PBS per 1 ora.
- Cada una sola goccia (~ 10 ml) di fissaggio anti-sbiadimento media su un vetrino.
- Piegare la punta di un 19 G 1 ½ in siringa 90 ° premendo delicatamente su una superficie dura. Con una mano tenere l'ago piegato e sollevare delicatamente un disco di vetro dal pozzo, e utilizzare l'altra mano per afferrare il disco usando le pinze taglienti.
- Ruotare il disco di vetro &# 160; rivolto verso il basso lasciando il contatto lato della cella del supporto di montaggio sul vetrino. Inserire delicatamente il disco di vetro e lasciare asciugare durante la notte in un luogo buio a temperatura ambiente.
- Procedere con l'immagine immunofluorescenza macchiato nanopodia, o conservare le diapositive in una scatola di diapositive a -20 ° C. Le diapositive resteranno visibili per alcuni mesi in -20 ° C.
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Representative Results
Per la Fase 1:
Se le cellule (come HUVEC e PC3 utilizzato in questo studio) sono in grado di crescere normalmente, le cellule si attaccano al disco collagene rivestite entro 30 minuti dopo che sono teste di serie, polarizzano e diventano mobili poco dopo, e si estendono nanopodia prima del loro percorso di movimento. figure 1A e 1B mostrano rispettivamente una polarizzata e proliferanti HUVEC. Figura 2A mostra cellule PC3 polarizzate in uno stato mobile.
Per la Fase 2:
Con preriscaldamento del 4% PFA a 37 ° C, che fissa le cellule a 37 ° C per 20 min, e lavaggio delicato con temperatura ambiente PBS, stati cellulari devono essere ben conservati. Generalmente, isolato individuo HUVEC (Figura 1A, 1) o PC3 (Figura 2A) cellule mostrerà una morfologia polarizzata, a meno che le cellule sono in stato di divisione cellulare (Figura 1B, 1). Interazioni intercellulariportando alla formazione di giunzione cellula (Figura 1C, 1) sono anche comunemente osservati. Nanopodia dovrebbe apparire sulla periferia cellulare, e F-actina sarà spesso presente nelle porzioni prossimale nanopodia alla cella. Le temperature fredde provocano F-actina a ritirare di nuovo in cellule lasciando dietro di canali di membrana nanopodia. Temperatura ottimale, come mostrato negli esempi utilizzando 4 ° C PFA fissaggio e lavaggio PBS freddo, disturberà e distruggere struttura nanopodia in cellule polarizzate (Figura 1A, 2), cellule proliferanti (Figura 1B, 2), e produrre artificialmente distanze in giunzioni intercellulari (Figura 1C, 2).
Per Passo 3:
Molte proteine legate alla membrana compreso TM4SF1 sono molto sensibili al Triton X-100 e saranno rimossi dalla superficie cellulare se si utilizzano concentrazioni superiori allo 0,03% 2,3. Per preservare la maggior parte di TM4SF1 superficie cellulare, PCellule FA fissi devono essere trattati con 0,01% Triton X-100 contenente tampone bloccante per un'ora prima di passare a anti-TM4SF1 anticorpo primario che è stato diluito in un tampone di bloccaggio regolare che non contiene Triton X-100. Come nanopodia sono proiezioni di membrana sottili e lunghe e allegare alla matrice attraverso TMED, intensità TMED sarà probabilmente bisogno di essere rafforzato attraverso le funzioni di luminosità e contrasto nel software di elaborazione delle immagini come Photoshop per rivelare e monitorare il percorso del movimento delle cellule attraverso i residui nanopodia (Figura 1, 2 inserti).
Figura 1. Proiezioni Nanopodia durante il movimento delle cellule endoteliali, la divisione cellulare e la formazione di svincolo. HUVEC erano appena coltivate per 6 ore after placcatura al 60% di confluenza sul disco di vetro rivestite di collagene. Le cellule sono state fissate con (1) il metodo modificato in cui le cellule sono state fissate in 37 ° C 4% PFA direttamente senza prelavaggio in PBS, e poste in un incubatore a 37 ° C durante il tempo di fissazione 20 min, o (2) un metodo di colorazione convenzionale in cui le cellule sono state lavate con PBS a temperatura ambiente per due volte e fissate in 4% PFA per 20 min a temperatura ambiente. Nanopodia, estensioni membrane sottili e lunghe che sono contrassegnati da un intermittente, modello a bande di TMED (frecce bianche), e che spesso racchiudono phalloidin macchiate di F-actina (frecce rosa) in porzioni prossimale alla cella, sono stati immunofluorescenza macchiato con anti-TM4SF1 Ab. Tre immagini rappresentative HUVEC sono state catturate per mostrare l'aspetto di nanopodia durante (A) polarizzazione, (B) divisione cellulare, e (C) formazione di giunzione intercellulare. Scatole Inset mostrano ingrandimenti maggiori di nanopodia. Durante polarizzata (A) o retractestati cellulari d (B, C), le proiezioni nanopodia sono stati conservati fissando direttamente le cellule a 37 ° C PFA, mentre le strutture sono state in gran parte rimosse con il lavaggio e fissa le celle a temperatura ambiente PBS e PFA. (C) 37 ° C PFA fissazione conserva giunzioni intercellulari (frecce blu), mentre le giunzioni sono disturbati da temperature più fredde che causano le cellule a ritrattare, creando un divario tra le cellule a ponte da nanopodia, di cui la maggior parte contengono F-actina (frecce rosa) e alcuni non (frecce bianche) Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 2. Nanopodia dimostrare la direzione del movimento delle cellule tumorali PC3. (A)Cellule tumorali PC3 erano appena coltivati per 6 ore dopo la placcatura al 60% di confluenza sul disco di vetro rivestite di collagene. Le cellule sono state fissate direttamente in 37 ° C 4% PFA e poste in un incubatore a 37 ° C per 20 min per preservare nanopodia. Nanopodia (frecce bianche) e F-actina (frecce rosa) erano immunofluorescenza colorati con anti-TM4SF1 Ab e falloidina, rispettivamente. La casella inserto mostra nanopodia a maggiore ingrandimento. Questa immagine rappresentativa dimostra che l'espressione TM4SF1 nelle cellule PC3 è eterogenea; una cella PC3 con una forte colorazione TM4SF1 (freccia gialla) ha prodotto lungo nanopodia ed è circondato da due cellule PC3 debolmente TM4SF1-macchiati (frecce rosse). Residui Nanopodia sul bordo d'uscita (ib) indicano la direzione del movimento delle cellule PC3 durante il periodo di coltura cellulare 6 ore. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 3. Visualizzazione di nanopodia attraverso tetraspanine CD9. (A) HUVEC sono stati di recente in coltura per 6 ore dopo la placcatura al 60% di confluenza su un disco di vetro rivestite di collagene. Le cellule sono state fissate nel 37 ° C 4% PFA e nanopodia (frecce bianche) sono stati rivelati mediante anti-CD9 Ab. F-actina (frecce rosa) è stato macchiato con falloidina. Questa immagine rappresentativa dimostra che CD9 localizza anche a nanopodia. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Nanopodia sono sottili canali di membrana cellulare che attaccano saldamente alla matrice attraverso TMED e può estendersi più di 100 micron da una cella cellulare polarizzata di percepire l'ambiente e mediare le interazioni intercellulari 2,3. Nanopodia aderire alla matrice così fermamente che i residui sono lasciati alle spalle come le cellule si allontana (figure 1 e 2). Nanopodia permettono quindi di studiare come le cellule percepiscono il loro ambiente e determinare il percorso di movimento delle cellule, e di come il movimento cambiamenti di espressione genica o farmaco di trattamento. Tuttavia, a causa della fragilità di queste sottili (100-300 micron di larghezza) strutture a membrana, la cautela deve essere presa al fine di preservarli.
Al fine di registrare fedelmente attività cellulari senza disturbare nanopodia, e per studiare come condizioni sperimentali influenzano le attività nanopodia e il percorso del movimento delle cellule, si dovrebbe prima verificare che le cellule crescono in modo efficace in mezzo completo prima pursuing l'esperimento. Le cellule normali sane primarie endoteliali, come HUVEC, in fresco mezzo di coltura completo EGM2-MV normalmente divide circa ogni 18 ore durante la fase di log della crescita entro i sei passaggi della loro cultura. Si dovrebbe evitare l'uso di HUVEC che sono maggiori di passaggio-6 come numeri di passaggio più alti porteranno a un aumento del numero delle cellule senescenti o binucleari nella cultura 7 e influenzeranno la capacità delle cellule di polarizzare e produrre nanopodia 2. Le cellule tumorali della prostata PC3 sono più stabili alle culture (osservazione inedito), ma si dovrebbe comunque evitare l'uso di cellule più di dieci passaggi dal loro allontanamento dallo stato congelato.
Cellule aderenti sane in genere attribuiscono ai dischi collagene rivestite entro i primi 30 minuti dopo che sono teste di serie, seguiti poco dopo da polarizzazione cellulare. Così si dovrebbe aspettare di vedere la maggior parte delle cellule endoteliali in uno stato polarizzato alla fine della prima ora di incubazione. Se unmaggior parte delle cellule endoteliali non attaccare alla superficie del vetro, quindi verificare se (a) collagene ha superato la data di scadenza, (b) tripsinizzazione durante la raccolta delle cellule era troppo severo, o (c) le cellule sono malsani. Cellule PC3 polarizzano più lento di cellule endoteliali, ma devono dimostrare una morfologia polarizzata entro 2 ore dopo la semina. In caso di contaminazione si verifica in cultura, quindi esaminare se i dischi di vetro o pinze sono stati correttamente sterilizzati. In alternativa, si può considerare l'utilizzo di slides da camera; il protocollo qui descritto suggerisce l'uso di dischi di vetro in piastre di coltura da 24 pozzetti in modo da ridurre i costi e di gestire più facilmente un gran numero di campioni.
Metodi di immunoistochimica convenzionali, l'uso di PBS per lavare le cellule prima di aggiungere fissativo temperatura ambiente, facilmente disturbare strutture cellulari pregiati come nanopodia e li distruggerà durante il processo di colorazione. Ciò è dovuto al fatto che gli stress fisici, come variazioni di temperatura durante fixati cellulario rigorosa lavaggio PBS durante il processo di colorazione sono le principali cause di frammentazione o rimozione di strutture nanopodial. Con tre semplici modifiche metodologiche - (i) non disturbare cella stato di polarizzazione mediante lavaggio con PBS prima del fissaggio, (ii) risolvere le cellule direttamente nel 37 ° C preriscaldata PFA e incubare le cellule a 37 ° C durante la fissazione, e (ii) lavare delicatamente celle a temperatura ambiente PBS - nanopodia sono largamente conservate figura 1 mostra come temperature PFA e PBS influenzano la conservazione di nanopodia in cellule endoteliali coltivate; la figura 2A mostra che l'espressione TM4SF1 è eterogeneo cellule PC3 e che le cellule con la più forte TM4SF1 colorazione visualizzano la più lunga. nanopodia. La temperatura è noto a pregiudicare le attività di F-actina e l'integrità tubulina 8,9. Fissa così le cellule alla stessa temperatura in cui sono state coltivate cellule (questo è 37 ° C nel protocollo qui descritto) è probabile che meglio preservare lo stato cellulare polarizzata (
PFA non è l'unico reagente utilizzato nella fissazione; solventi organici come metanolo, etanolo, acetone e sono spesso utilizzati in fissazione delle cellule per immunoistochimica 10.Il miglior fissativo è spesso deciso dalla posizione epitopo di un anticorpo specifico utilizzato nella colorazione (dati non pubblicati). Per il mouse TM4SF1 antiumana anticorpo che riconosce domini extracellulari del TM4SF1 (Millipore, utilizzato in questo studio), PFA è l'unico fissativo che rivela TMED in immuno-colorazione, indicando che altri solventi organici distruggono l'epitopo. Al contrario, coniglio anti-umano TM4SF1 anticorpo policlonale da Acris (dati non mostrati), la cui epitopo si trova in diciotto aminoacidi vicino alla regione N-terminale, funziona anche con cellule fissate etanolo. Tuttavia, l'anticorpo Acris non cede buona colorazione TM4SF1, probabilmente perché l'epitopo N-terminale è preoccupato dalle interazioni TM4SF1 con molecola citosolico (s) che coprono parzialmente l'epitopo.
Triton X-100 è un tensioattivo non ionico ed è spesso usato in immuno-colorazione con l'obiettivo di permeabile la membrana cellulare e ridurre la tensione superficiale di soluzioni acquose 11,12. However, questa capacità porta anche il rischio di solubilizzare le proteine di membrana. TM4SF1 viene completamente rimosso dalla superficie cellulare da Triton X-100 concentrazioni superiori allo 0,05% 2,3. Per questo motivo, solo un trattamento di 1 ora con 0,01% Triton X-100 prima dell'aggiunta dell'anticorpo primario viene utilizzato nel metodo qui descritto. Questo trattamento permeabilizes la membrana sufficiente per permettere TM4SF1 peri-nucleare essere ben valutata dagli anticorpi, preservando più TM4SF1 sulla membrana cellulare. Per doppia colorazione di TM4SF1 con proteine situate nel nucleo, utilizzare 0,03% Triton X-100 in fase di preincubazione se 0,01% Triton non funziona. Ciò faciliterà Triton X-100 perforazione della membrana nucleare.
TM4SF1 è altamente specifico per le cellule endoteliali e cellule tumorali; la maggior parte degli altri tipi di cellule o non esprimono TM4SF1 o esprimono ad un livello molto basso 2,3. Tuttavia, tetraspanine classici - una famiglia che comprende trentatré membri sapg CD9, CD81 e CD151 - sono ubiquitariamente espressi 6, e si possono trovare anche in domini di membrana in nanopodia 2,3 (Figura 3A). Così, colorazione tetraspanine classici attraverso lo stesso metodo immuno-colorazione utilizzata per TM4SF1 può abilitare gli studi di nanopodia in tipi di cellule che non esprimono TM4SF1. Cellule tumorali che esprimono PC3 TM4SF1 altamente tendono a muoversi continuamente in una sola direzione, mentre le cellule PC3 debolmente esprimono TM4SF1 non hanno una direzione chiaramente definita di movimento (Figura 2A e dati non pubblicati). TM4SF1 livello di espressione nelle cellule tumorali è noto essere correlata con la loro potenziale metastatico 13, e ricerche sono attualmente in corso la capacità delle cellule tumorali linking 'esprimere TM4SF1 e produrre nanopodia al loro potenziale metastatico.
In sintesi, padronanza di metodi efficaci per la colorazione nanopodia consente ai ricercatori di tracciare il percorso del movimento cellulare attraverso nanopodia residues, studiare come le cellule percepiscono il loro ambiente per il movimento, come il movimento delle cellule è modificato con l'alterazione dei livelli di espressione dei geni (sia iperespressione o atterramento di geni di interesse). Nanopodia rappresentare un nuovo strumento per la ricerca di polarizzazione delle cellule e il movimento delle cellule.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Noi riconosciamo il dottor Harold Dvorak per utili discussioni, tra cui il suggerimento di provare fissazione in 37 ° C PFA. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concedere P01 CA92644 e da un contratto della Fondazione Nazionale per la Ricerca sul Cancro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass disks | Fisher Scientific | 12-545-82 | 12 mm diameter |
| Glass jar | Fisher Scientific | 02-912-310 | Certified Clean Clear Glass Straight-Sided Jars, 4 oz |
| Glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides |
| 50 ml Falcon tube | BD Falcon | 352070 | 50 ml high-clarity polypropylene conical centrifuge tube, 16,000 rcf rating. Sterile. |
| 15 ml Falcon tube with Styrofoam rack | Corning | 430790 | Corning 15 ml PP Centrifuge Tubes |
| Sharp forceps | Fisher Scientific | 13-812-42 | Dissecting Extra Fine Pointed Splinter Forceps |
| 24-well Cell culture plate | BD Bioscience | 353047 | 24-well Cell Culture Plate |
| 150 mm Cell culture plate | BD Bioscience | 353025 | 150 mm cell culture plate |
| 19 G 1 ½ Syringe needle | BD Bioscience | 309635 | 19 G 1 ½ |
| Ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2701 | Decon's Pure Ethanol 200 Proof |
| Collagen solution | BD Bioscience | 354249 | Collagen I, High Concentration, rat tail, 100 mg |
| Trypsin/EDTA | Cellgro | 25-053-CI | 0.25% Trypsin-EDTA 1x |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate |
| 10x PBS | Affymetrix | 75889 5 LT | PBS, 10x Solution, pH 7.4 |
| PFA (paraformaldehyde) | Affymetrix | 19943 1 LT | 4% in PBS |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135-500ML | Fetal Bovine Serum |
| EGM2-MV | Lonza | CC-3162 | EGM-2 BulletKit, EBM-2 Basal Medium 500 ml and EGM-2 SingleQuot Kit Supplement & Growth Factors |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002-25G | Solubilized in water. 4% stock solution and working concentration is 0.4%. |
| Mouse anti-human TM4SF1 antibody | Millipore | MAB3127 | Epitope is located in extracellular domain |
| Mouse anti-human CD9 antibody | BD Bioscience | 555370 | Epitope is located in extracellular domain |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouse 2nd antibody | Life Technologies | A-21202 | Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) |
| Phalloidin | Chemicon | 90324 | Rhodamine-conjugated Phalloidin |
| Anti-fade mounting media | Life Technologies | P-36931 | ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI |
| 70% Ethanol | 17.5 ml of ethanol (200 proof) 7.5 ml of double-deionized water |
||
| 10x PBS (make 200 ml) | 20 ml of 10x PBS 180 ml of double-deionized water |
||
| 20% Triton X-100 (make 20 ml) | 4 ml Triton X-100 16 ml double-deionized water |
||
| 4% NaN3 (make 25 ml) | 1 g of NaN3 25 ml of double-deionized water |
||
| 50 ng/ml Bovine collagen solution in PBS (make 5 ml) | Stock solution of 50 μg/ml (50 ml) 830 μl of Collagen I (3 mg) 50 ml PBS |
||
| ICC Blocking Buffer (50 ml) | 49 ml PBS 2% FBS (add 1 ml) 0.04% NaN3 (add 100 μl of 4% NaN3) |
||
| ICC Blocking Buffer/0.01% Triton X-100 (make 50 ml) | 50 ml of ICC Blocking Buffer 25 μl of 20% Triton X-100 |
||
| HUVEC | Lonza | C2517A | www.lonza.com |
| PC3 | ATCC | CRL-1435 | www.atcc.org |
| Cell culture hood | NuAIRE | Nu-425-600 | NU-425 (Series 60) Biological Safety Cabinet |
| 37 °C, 5% CO2 Cell culture incubator | CellStar | QWJ300DABA | Cellstar CO2 Water Jacketed Incubator |
| Heating pad | K&H Manufacturing | 1020 | K&H Lectro Kennel Heated Pad with Free Fleece Cover (www.amazon.com) |
| Centrifuge | Sorvall | T6000B | Sorvall T6000 (B) Benchtop Centrifuge |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemocytometer |
References
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