Summary
Nanopodiaは、セルの前面を先頭または末尾に背面から100ミクロンにまで拡張し、細胞環境を感知薄いが脆弱な膜チャネルである。 37℃で、穏やかに洗浄し、エタノール、メタノール、アセトン等の有機溶媒の回避でより高いトリトンX-100の濃度の直接的な固定は、これらの細胞構造を観察するために必要とされる。
Abstract
培養液中の接着細胞は、移動や細胞間の相互作用をサポートするために、偏光状態を維持している。 Nanopodiaは、薄く細長い、TM4SF1（膜貫通4-L-6ファミリー-1）免疫蛍光染色によって可視化することができる内皮細胞および癌細胞中の大部分は、F-アクチン負の膜突起で。 100から300ミクロン径TMEDにおけるTM4SF1クラスターのような多くの14のような個々のTM4SF1の分子に3を含む（TM 4SF1 eはマイクロd omainsをnriched。） TMEDは、μメートル当たり1から3 TMEDの規則的な間隔でnanopodiaに沿って断続的に配置されており、しっかりと行列にnanopodiaを固定している。これは、偏内皮細胞または腫瘍細胞の前を先頭または末尾に背面から100以上のμメートルを拡張することnanopodiaが可能となり、MATRに残されるべき膜残基を引き起こすIXの細胞が離れて移動したとき。 TMEDとnanopodiaは、それらの極端な脆弱性および温度に対する感受性見過ごされてきた。ルーチンの洗浄と固定が構造を破壊する。 Nanopodia、染色の前に、0.01％トリトンX-100に短時間曝露し、続いて37℃でパラホルムアルデヒド（PFA）中に直接固定することによって保存される。細胞生物学における新しい展望を開くNanopodia：彼らは検出して距離をおいて他の細胞を識別し、密接な接触で細胞間の相互作用を開始し、移動、増殖に関与するシグナル伝達機構のため、細胞がその環境を感知する方法の理解を再構築し、細胞を約束する - 細胞コミュニケーション。 TM4SF1由来nanopodiaを研究するために開発されている方法は、古典的なテトラスパニン、特に普遍的に発現CD9、CD81、およびCD151の代理店を通じて他の細胞型に形成nanopodiaの研究のために有用である可能性がある。
Introduction
移動用の偏光の間に、動物細胞は糸状仮足、ラメリポディア、後退繊維、フリル1を含め、それらの表面から動的、膜突起、さまざまな拡張。最近、このリストに追加さnanopodia、薄いの新しく認識されたタイプ（直径100〜300μmの）、などの糸状仮足のようなF-アクチンの構造の拡張のための膜チャネルを提供する細長い（最大50〜100ミクロンの長さ）の膜突起があったと後退繊維、その汚れ積極TM4SF1（膜貫通4-L-6ファミリー-1）培養内皮細胞および腫瘍細胞の2,3内で。
TM4SF1は、もともと分子が内皮細胞の増殖および遊走2,3において必須の役割を果たし、内皮細胞バイオマーカーであるという発見の前に、腫瘍細胞抗原4として知られていたテトラスパニン様トポロジーを有するタンパク質である。免疫蛍光染色は、TM4SF1がperinucに局在していることを明らかにしたリア小胞と細胞膜へとは、TM 4SF1 電子 nrichedマイクロd omains（TMED）に富んでいる。 TMEDアンカー行列にnanopodiaとnanopodia 1-3 TMED /ミクロンの長さの等間隔の縞状に存在する。 Nanopodiaは、典型的には、細胞の主要なフロントから延びており、移動のための細胞極性の間にリアトレーリング。原因TMEDしっかり接着性性質のために、nanopodiaはそれが離れて移動するときに戻って、細胞内に後退することはできません。放棄nanopodia残基は、このような細胞移動経路をトレース。 F-アクチン伸縮用の膜チャネルを提供し、細胞間の相互作用や通信2,3のサイトがあるNanopodia。これらの特性は、細胞の偏光、環境の細胞センシング、細胞運動のパスと方向の決定、および細胞間の相互作用の間、F-アクチンアセンブリのメカニズムを研究するユニークな機会を提供nanopodiaことを意味ND通信。
原因TMEDの高度に疎水性の性質とnanopodiaの薄くて壊れやすい膜状性質のために、特別な注意はTMEDとnanopodiaを維持するために注意が必要です。 nanopodiaおよび一般的な実験方法によるTMEDの除去の破壊は六十から三出版物は1986年1年に最初の発見以来、オン、100〜300ミクロンのマイクロドメインにおけるTM4SF1濃縮の知識の完全な欠如のためにTM4SF1に登場してきた理由の可能な理由である細胞表面2009 2での内皮細胞におけるTM4SF1のレポートまでです。
従来の免疫染色法が一般的に細胞を固定し、細胞を5を透過性にするために、0.1％以上のトリトンX-100の濃度を使用するために、エタノール、メタノール、アセトンなどの有機溶剤を使用しています。 （I）37℃、4％PFAを使用すると、37に細胞を固定：ここに記載された研究は、TMEDとnanopodiaを明らかにし、従来の方法に3の主要な変更を実施76、Cインキュベーターは、（ii）は、穏やかに室温PBS洗浄を適用し、（iii）のトリトンX-100トリトンX-100 0.03％以上抽出するように、一次抗体を添加する前に細胞を透過するだけで簡単に0.03％未満を使用TM4SF1。
すべてのテトラスパニンは細胞膜6上のマイクロドメインを形成し、いくつかは、内皮細胞および腫瘍細胞の2,3にTMEDと共局在。 CD9、CD81、およびCD151などテトラスパニンが遍在的に発現されるように、ここに記載の染色プロトコルはnanopodia機能の研究のためにTM4SF1を欠いている多くの異なる細胞型に拡張することができる。
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Protocol
1。コラーゲンコーティングされたガラスディスク上の細胞培養
- ガラスの瓶（4オンス）やディスクを滅菌するオートクレーブ内の場所のガラスディスク（直径12ミリメートル）。
- 50ミリリットルファルコンチューブに25ミリリットルの70％エタノールを入れ、細胞培養フードに入れてください。溶液のレベルが20mlに低下するまでこの溶液を複数回再利用することができる。
- ガラスディスクを処理するためにそれを使用する前に、5分間、70％エタノールに余分な細かい点でシャープな鉗子を配置します。
- 慎重にチューブから鉗子を外し、キャップを閉め、ゆっくり2分間空気乾燥チューブの上にエタノール治療ピンセットを置く。鉗子の先端がフード内には何も触れないようにしてください。
- ガラスの瓶のうちの一方の滅菌ガラスディスクを取得し、24ウェル細胞培養プレートのウェルに入れて滅菌ピンセットを使用する。井戸の所望の数のディスクが読み込まれるまで繰り返します。
- （ウシコラーゲン溶液500μlを入れて50 ng / mlの）ガラスディスクを含有し、少なくとも30分間、37℃、5％CO 2細胞培養インキュベーターに置き、各ウェルに。長いインキュベーションには害はありません。
- 収穫HUVEC（ヒト臍帯静脈内皮細胞）、またはPC3既にトリプシン処理を介して150ミリメートル細胞培養プレート中で増殖させ、その完全な培地を用いてトリプシン活性をブロックした（前立腺腫瘍細胞）。 15ミリリットルのファルコンチューブに細胞を回収します。
- 細胞数をカウントし、生存率が90％以上であることを確認してください。
- 4℃で10分間、200×gで遠心分離して細胞をペレット上清を取り除きます。
- 10 5細胞/ mlに細胞を希釈し、培養培地を使用する。氷の上にセルを配置します。
- 細胞培養フード内でコラーゲンを吸引し、そっとガラスディスクがコラーゲンでプレコートされた各ウェルに細胞懸濁液を500μlを置く。 24ウェルプレート中5×10 4細胞/ウェルを60％のconfにを与えるHUVEC及びPC3細胞を、30％コンフルエントのためluency。注：より高い細胞密度の細胞懸濁液を加える。
- 培養37°C、1時間、2時間、4時間、6時間、又はnanopodia活性および細胞の通過を追跡する24時間、5％CO 2インキュベーター内で細胞が挙げられる。一般的に、細胞は最初の30分でガラスディスクに付着すると、分極と最初の一時間に移行し始めて、次の時間に細胞間相互作用や細胞分裂を行う。
2。細胞固定
- 各ウェルには、細胞を固定するために500μlの4％PFA（パラホルムアルデヒド）が必要になります。商業的に製造された又は新たに4％PFAを用いることができるいずれかからなる。準備井戸の数に基づいて、必要とされるPFAの量を計算し、15 mlのファルコンチューブにPFAを置く。注意：ホルムアルデヒドは、疑いのある発がん性物質である。
- 37℃のインキュベーター内で所定の位置に既にあったスタイロフォームスタンドでファルコンチューブを置く。戦争30分間インキュベーター内チューブを残し37℃にPFAをメートル
- 培養フードに加熱パッドを配置し、電源を入れます。
- 24ウェル細胞培養プレートと培養器から温めておいたPFAを取り出し、加熱パッドの上に置きます。
- 井戸から培地を吸引し、直後に優しく良くエッジを通じてウェルに500μlのPFAをスライドさせるもう一方の手を使って片手で行ってください。それがその角度で安定するように簡単に吸引のために、発泡スチロールの台に対してそれをもたれ、約45℃で培養プレートを傾けます。これは、吸引を容易にし、培養中の細胞を乱すことなくウェルにPFA溶液を添加することであろう。これは、細胞の活動の元の細胞構造を維持するための最も重要なステップである。
- ガラスディスクを持つすべてのウェルがPFAを受け取るまでプロセスを繰り返します。注：井戸から既存のソリューションを変更するために必要なすべてのステップは同じ吸引手順を適用します。
- 5分間、37℃でプレートを置きます。 バック培養フードにプレートを取り、ステップ2.5で説明したように発泡スチロールに対して傾ける。優しくコレクションチューブに井戸からPFAを転送するために片手を使用。直後だけでなく、少なくとも500μlの室温PBSを配置するためにもう一方の手を使用しています。全てのウェルを洗浄した後、戻ってよく、すべての中でもう一度PBS洗浄を繰り返します。有害廃棄物容器に集められたPFAを空にします。
- ICCは、PBS、2％ウシ胎児血清を添加することによりブロッキング緩衝液調製する。 0.04％アジ化ナトリウムを、（20％ストック溶液から希釈）を防腐剤として添加される。注意：アジ化ナトリウムは、毒性化合物である。緩衝液は、細菌汚染のない長期間4℃で保存することができる。
- それでも各ウェルのPBSを除去して吸引し、その直後に、ICCのブロッキング緩衝液500μlを加えることによって、サイクルが再び、スタンドに対して傾いた培養プレートで。セルは現在、免疫蛍光染色のための準備が整いました。必要に応じて、固定した細胞はTM4SF1タンパク質の有意な損失なし週間、4℃の冷蔵庫に保存することができる。
3。 NanopodiaのTM4SF1免疫蛍光染色
- 各ウェルに、トリトンX-100 0.01％を含む新しいブロッキングバッファーで500μlのICCブロッキングバッファーを交換し、それを1時間室温で放置します。それが細胞膜からTM4SF1が削除されますように、0.03％トリトンX-100よりも高く、使用しないでください。染色はすぐに開始する準備ができている場合にはPBSをステップ2.10から細胞を洗浄し、直接トリトンを含むブロッキングバッファーに移動することができます。
- ICCブロッキング緩衝液中0.5μgの/ mlになるように一次抗TM4SF1（または抗CD9）抗体を希釈する。
- 各ウェルに、ICC/0.01％トリトン緩衝液を除去し、抗TM4SF1抗体液を300μlと交換してください。室温で2時間インキュベートするか、4℃で一晩残し
- 劣らず500よりμLのPBSで各ウェルを洗ってください。 3回繰り返します。毎回ルに与えるインキュベーション時間のastの5分。
- 二次抗体およびファロイジン溶液を調製ICCのAlexa 488標識したロバ抗マウス二次抗体（2μg/ mlの最終濃度）の1000倍希釈およびファロイジン1,000×希釈（50 ng / mlの最終濃度）を用いて、ブロッキング緩衝液。
- PBSを削除し、各ウェルに二次抗体とファロイジン溶液を300μLを加え、2時間インキュベートまたは4℃で一晩にしておく
- 洗浄あたり少なくとも5分間のインキュベーションを含むPBS洗浄手順を繰り返します。最後の洗浄では、1時間PBS中で各ウェルを残す。
- スライドガラス上の退色防止封入剤の一滴（〜10μl）をドロップします。
- 曲げ硬い表面を軽く押して、注射針19のG 1.5 90°の先端。曲がった針を保持し、ゆっくりと井戸からガラスディスクを持ち上げ、シャープな鉗子を使用して、ディスクを把握するもう一方の手を使って片手で行ってください。
- ガラスディスクを回し＆＃160;スライドガラス上の細胞側接点封入剤をさせる下向きにセットしてください。穏やかにガラスディスクを配置し、室温で暗所で一晩乾燥させてみましょう。
- イメージに免疫蛍光染色nanopodiaを続行するか、-20℃でスライドボックスでスライドを保存するスライドは、-20℃の中で数ヶ月閲覧可能のままになります
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Representative Results
ステップ1：
（例えば、HUVEC、およびこの研究で使用PC3等）、細胞が正常に成長することができるならば、細胞は播種後、30分以内にコラーゲン被覆ディスクに付着分極と程なく移動となり、先にそれらの経路のnanopodiaを拡張する運動の。 図1Aおよび1Bは、それぞれ偏光と増殖しているHUVEC。 図2（a）は、携帯状態で偏PC3細胞展覧。
手順2の場合：
37℃に4％PFAの予熱、20分間37℃で細胞を固定し、室温PBSで穏やかに洗浄して、細胞の状態がよく保存されるべきである。一般に、単離された個々のHUVEC（ 図1Aは、1）またはPC3（ 図2A）細胞は、細胞が細胞分裂の状態にある限り、偏光形態を示す（ 図1B、1）。う細胞間の相互作用細胞間結合の形成（ 図1C、1）につながることも一般的に観察される。 Nanopodiaは細胞周辺に表示されるべきであり、F-アクチンは、多くの場合、セルにnanopodia近位の部分に存在するであろう。低温は、F-アクチンは、バックnanopodiaの膜チャネルを残して細胞内に後退させます。準最適温度は、4℃PFA固定し、冷PBS洗浄を用いて実施例に示すように、（ 図1A、2）、増殖細胞（ 図1B、2）、人為的に細胞間接合部の隙間を産生乱し、極性細胞でnanopodia構造を破壊する（ 図1C、2）。
ステップ3の場合：
TM4SF1を含む多くの膜結合タンパク質は、トリトンX-100に非常に敏感であり、0.03％よりも高い濃度の2,3使用される場合、細胞表面から除去される。細胞表面TM4SF1、Pの大部分を維持するためにFA固定された細胞は、わずか0.01％のTriton X-100、トリトンX-100を含まない正規のブロッキング緩衝液で希釈された抗TM4SF1一次抗体に変更する前に、時間、ブロッキング緩衝液を含有して扱われるべきである。 nanopodiaとして細長い膜突起でとTMEDを通して行列に添え、TMED強度はおそらく（ 図 nanopodia残基を介して細胞移動経路を明らかにし、追跡するために、Photoshopのような画像処理ソフトでの明るさとコントラスト機能によって強化される必要があります1,2,3 挿入図）。
図1。内皮細胞運動、細胞分裂、接合形成時Nanopodia予測は。HUVECを6時間のAFTE用たて培養したRコラーゲンコートガラスディスク上に60％コンフルエンスでメッキ。細胞は、細胞をPBS中で予洗することなく直接PFA 37℃の4％を固定し、20分間の固定時間、又は（2）従来の染色法の間に37℃のインキュベーターに入れた（1）の変法を用いて固定した細胞を2回室温PBSで洗浄し、室温で20分間、4％PFAで固定した場合。 Nanopodia、TMEDの断続的な、縞模様（白矢印）でマークし、それはしばしば細胞の近位部分にファロイジン染色されたF-アクチン（ピンク矢印）で囲みされて細長い膜拡張は、免疫蛍光抗TM4SF1を用いて染色したAB。 3つの代表HUVEC画像は、（A）偏光、（B）細胞分裂、および（C）間の接合形成の間nanopodiaの外観を示すために捕捉した。インセットボックスはnanopodiaの高倍率を示している。中の（A）またはretracte偏極dの細胞状態（B、C）の構造は、主に洗浄により除去し、室温PBSおよびPFAで細胞を固定したのに対し、nanopodia突起を直接37℃PFA中で細胞を固定して保存した。 （C）37℃、PFA固定は接合が、細胞が後退する原因と低い温度によって妨害されているのに対し、ほとんどがF-アクチン（ピンクの矢印）が含まれているそのうちのnanopodiaによってブリッジセルの間に隙間を作る、細胞間接合（青の矢印）を保持し、いくつかの（白矢印）がありません大きな画像を見るにはここをクリックしてください。
図2。 Nanopodiaは、PC3腫瘍細胞の移動方向を示す。（A）PC3腫瘍細胞を、コラーゲン被覆ガラスディスク上に60％コンフルエンスで播種後6時間新たに培養した。細胞を37℃、4％PFAで固定し、直接nanopodiaを維持するために20分間37℃のインキュベーターに入れた。 Nanopodia（白矢印）とF-アクチン（ピンクの矢印）は、それぞれ、抗TM4SF1 Abおよびファロイジンを用いて染色免疫蛍光ました。インセットボックスは高倍率でnanopodiaを示しています。この代表的な画像は、PC3細胞におけるTM4SF1の発現が不均一であることを示している。強いTM4SF1染色（黄色の矢印）と1 PC3細胞は、長いnanopodiaを生産し、2弱くTM4SF1染色したPC3細胞（赤い矢印）に囲まれています。後縁でNanopodia残基（IB）は、6時間の細胞培養期間中のPC3細胞移動の方向を示している。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図3。テトラスパニンCD9を通じてnanopodiaの可視化（A）HUVECを、コラーゲンコートガラスディスク上の60％の集密度で播種後6時間にわたって新鮮に培養した。細胞を37℃、4％PFAおよびnanopodiaで固定した（白矢印）抗CD9抗体によって明らかにされた。 F-アクチン（ピンクの矢印）がファロイジンを用いて染色した。この代表画像は、CD9もnanopodiaに局在することを示しています。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
NanopodiaはしっかりTMEDを通して、マトリックスに付着して、環境を感知し、細胞間の相互作用2,3を仲介する偏モバイル携帯から100μm以上を拡張することができ、薄い細胞膜チャネルである。 Nanopodiaセルが（ 図1および図2）離れるにつれて残基が残されるように強固に接着マトリックス。 Nanopodiaは、このように私たちは、細胞がその環境を感知する方法の研究と細胞移動経路を決定することを可能にし、どのようにして遺伝子発現または薬物治療の変更の動き。しかし、これらの薄い（100〜300μmの幅）膜構造の脆弱性には注意がそれらを保存するために注意が必要です。
忠実nanopodiaを妨げることなく、細胞活動を記録するために、実験条件はnanopodia活動と細胞移動経路をどのように影響するかを研究するために、1は最初に細胞がpurs前に完全培地中で効果的に成長していることを確認する必要があります実験uing。このようなHUVECなどの正常で健康な初代内皮細胞は、新鮮なEGM2-MV完全培地で正常に彼らの文化の6継代以内に成長の彼らの対数期の間、およそ毎18時間を分割します。一つは、高い継代数は、培養7老化や二核細胞の数の増加につながると分極とnanopodia 2を生産する細胞の能力に影響を与えるような流路6よりも大きいHUVECの使用を避ける必要があります。 PC3前立腺腫瘍細胞は、培養物（未発表の観察）に対してより安定であるが、一方は依然として凍結状態からの除去からの細胞を10継代より多くの使用を避けるべきである。
彼らは播種後の健全な接着細胞は、典型的には、細胞の分極によってすぐにその後に続く、最初の30分以内にコラーゲンコーティングが施されたディスクに付着する。このように1は、インキュベーションの最初の時間の終わりに偏光状態の中で最も内皮細胞を見ることを期待すべきである。もし内皮細胞の大部分は、（a）は、コラーゲンは、その有効期限を経過しているかどうかを確認して、ガラス表面に付着しない（b）細胞の収穫時にトリプシン処理も厳格だった、または（c）細胞が不健康である。 PC3細胞は、内皮細胞よりも遅い分極が、播種後2時間以内に偏光した形態を示すべきである。汚染が文化の中で発生した場合、ガラスディスクや鉗子が適切に滅菌したかどうかを調べる。あるいは、チャンバースライドを使用することを検討することができます。ここで説明するプロトコルは、コストを節約し、より容易に多数の試料を処理するために、24ウェル培養プレート中にガラスディスクの使用を示唆している。
従来の免疫染色法、室温固定剤を追加する前に細胞を洗浄するために、PBSを使用し、簡単にnanopodiaのような細かい細胞構造を乱すと、染色プロセス中にそれらを破壊します。これは事実によるところが大きいという細胞fixati中の温度変動などの物理的ストレス染色工程や厳格なPBS洗浄の際に断片化またはnanopodial構造の除去の主な原因が考えられます。 3つの簡単な方法論的な変更で - （i）は、固定前にPBSで洗浄することにより、細胞の偏光状態を乱さない（II）、PFAを予め温め、37℃で直接細胞を固定し、固定の際に、37℃で細胞をインキュベートし、（II）優しく洗う室温のPBS中の細胞を- nanopodiaは主に保存されたPFAのPBS気温が培養内皮細胞にnanopodiaの保全にどのように影響するかを図1に示す図 、 図2（a）は、TM4SF1の発現はPC3細胞における異質であり、最強のTM4SF1染色で細胞が最も長いが表示されていることをことを示しています。 nanopodia。温度は、F-アクチン、チューブリン活性との整合8,9に影響を及ぼすことが知られている。このようにして（これは、37°C、ここで記載されたプロトコルである）細胞を増殖させたのと同じ温度で細胞を固定した方が偏細胞状態を（保持する可能性がある
PFAは固定で使用される唯一の試薬ではありません。メタノール、エタノール、アセトン等の有機溶媒もしばしば10免疫染色のための細胞の固定に使用される。最良の固定剤は、しばしば染色（未発表データ）で使用される特定の抗体のエピトープの位置によって決定される。 TM4SF1の細胞外ドメインを認識するマウス抗ヒト抗体についてTM4SF1（ミリポア、この研究で使用）を、PFAは、他の有機溶媒がエピトープを破壊することを示す、免疫染色TMEDを明らかにする唯一の固定剤である。エピトープN末端領域付近の18個のアミノ酸に位置し、Acris（データは示さず）からの造影、ウサギ抗ヒトポリクローナル抗体TM4SF1において、エタノール固定した細胞でも機能する。しかし、Acrisの抗体は、N末端エピトープを部分的エピトープをカバーする細胞質ゾル分子（複数）とTM4SF1相互作用によって気を取られているせいか、良いTM4SF1染色が得られない。
トリトンX-100非イオン性界面活性剤であり、しばしば細胞膜を透過性及び水溶液11,12の表面張力を低下させる目的で、免疫染色に使用される。 Howeverは、この機能はまた、膜タンパク質を可溶化するリスクをもたらしますTM4SF1が完全に0.05％を超える2,3トリトンX-100濃度によって細胞表面から除去される。このため、一次抗体の添加前に、0.01％のTriton X-100のみ、1時間の処理は、ここで記載した方法において使用される。この処理は、細胞膜上のほとんどTM4SF1を維持しながら、ウェルの抗体によって評価されるように核周囲TM4SF1を可能にするのに十分な膜透過化。 0.01％トリトンが動作しない場合は核に局在するタンパク質とTM4SF1の二重染色のために、プレインキュベーション段階で0.03％トリトンX-100を使用しています。これは、核膜のトリトンX-100のパンクチャリングを容易にする。
TM4SF1は、内皮細胞および腫瘍細胞に高度に特異的であり;ほとんどの他の細胞型TM4SF1を発現するか、または非常に低レベル2,3でそれを発現しないのいずれか。しかし、古典的なテトラスパニン - includin三〇から三人を含む家族G CD9、CD81、およびCD151は-普遍的に6を表明しており、またnanopodia 2,3（ 図3A）で膜ドメインにあります。このように、TM4SF1に使用したのと同じ免疫染色法によって古典テトラスパニンを染色することはTM4SF1を発現しない細胞型でnanopodiaの研究を可能にすることができます。 TM4SF1を表現PC3腫瘍細胞は非常に弱くTM4SF1を表現PC3細胞は、運動の明確に定義された方向（ 図2Aおよび未発表データ）がないのに対し、一つの方向に連続的に移動する傾向がある。腫瘍細胞におけるTM4SF1の発現レベルは、13彼らの転移能と相関することが知られており、調査は、現在TM4SF1を発現し、それらの転移能にnanopodiaを生成するために進行中の連結腫瘍細胞の能力であるれる。
要約すると、染色nanopodiaのための効果的な方法の習得はnanopodia REを介して細胞移動経路を追跡するために研究者を可能にしますsidues、細胞が細胞移動が遺伝子（過剰発現または目的の遺伝子のノックダウンのいずれか）の発現レベルの変化によって修飾されるか移動のために自分の環境を感知する方法を研究する。細胞極性と細胞運動の研究のための新しいツールを表すNanopodia。
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Disclosures
利害の対立が宣言されていません。
Acknowledgments
私たちは、37℃、PFAで固定をしようとする提案など、有用な議論のために博士ハロルドドヴォルザークを認める。この作品は、NIHの助成金P01のCA92644によっておよび癌研究のための国立財団からの契約によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass disks | Fisher Scientific | 12-545-82 | 12 mm diameter |
| Glass jar | Fisher Scientific | 02-912-310 | Certified Clean Clear Glass Straight-Sided Jars, 4 oz |
| Glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides |
| 50 ml Falcon tube | BD Falcon | 352070 | 50 ml high-clarity polypropylene conical centrifuge tube, 16,000 rcf rating. Sterile. |
| 15 ml Falcon tube with Styrofoam rack | Corning | 430790 | Corning 15 ml PP Centrifuge Tubes |
| Sharp forceps | Fisher Scientific | 13-812-42 | Dissecting Extra Fine Pointed Splinter Forceps |
| 24-well Cell culture plate | BD Bioscience | 353047 | 24-well Cell Culture Plate |
| 150 mm Cell culture plate | BD Bioscience | 353025 | 150 mm cell culture plate |
| 19 G 1 ½ Syringe needle | BD Bioscience | 309635 | 19 G 1 ½ |
| Ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2701 | Decon's Pure Ethanol 200 Proof |
| Collagen solution | BD Bioscience | 354249 | Collagen I, High Concentration, rat tail, 100 mg |
| Trypsin/EDTA | Cellgro | 25-053-CI | 0.25% Trypsin-EDTA 1x |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate |
| 10x PBS | Affymetrix | 75889 5 LT | PBS, 10x Solution, pH 7.4 |
| PFA (paraformaldehyde) | Affymetrix | 19943 1 LT | 4% in PBS |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135-500ML | Fetal Bovine Serum |
| EGM2-MV | Lonza | CC-3162 | EGM-2 BulletKit, EBM-2 Basal Medium 500 ml and EGM-2 SingleQuot Kit Supplement & Growth Factors |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002-25G | Solubilized in water. 4% stock solution and working concentration is 0.4%. |
| Mouse anti-human TM4SF1 antibody | Millipore | MAB3127 | Epitope is located in extracellular domain |
| Mouse anti-human CD9 antibody | BD Bioscience | 555370 | Epitope is located in extracellular domain |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouse 2nd antibody | Life Technologies | A-21202 | Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) |
| Phalloidin | Chemicon | 90324 | Rhodamine-conjugated Phalloidin |
| Anti-fade mounting media | Life Technologies | P-36931 | ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI |
| 70% Ethanol | 17.5 ml of ethanol (200 proof) 7.5 ml of double-deionized water |
||
| 10x PBS (make 200 ml) | 20 ml of 10x PBS 180 ml of double-deionized water |
||
| 20% Triton X-100 (make 20 ml) | 4 ml Triton X-100 16 ml double-deionized water |
||
| 4% NaN3 (make 25 ml) | 1 g of NaN3 25 ml of double-deionized water |
||
| 50 ng/ml Bovine collagen solution in PBS (make 5 ml) | Stock solution of 50 μg/ml (50 ml) 830 μl of Collagen I (3 mg) 50 ml PBS |
||
| ICC Blocking Buffer (50 ml) | 49 ml PBS 2% FBS (add 1 ml) 0.04% NaN3 (add 100 μl of 4% NaN3) |
||
| ICC Blocking Buffer/0.01% Triton X-100 (make 50 ml) | 50 ml of ICC Blocking Buffer 25 μl of 20% Triton X-100 |
||
| HUVEC | Lonza | C2517A | www.lonza.com |
| PC3 | ATCC | CRL-1435 | www.atcc.org |
| Cell culture hood | NuAIRE | Nu-425-600 | NU-425 (Series 60) Biological Safety Cabinet |
| 37 °C, 5% CO2 Cell culture incubator | CellStar | QWJ300DABA | Cellstar CO2 Water Jacketed Incubator |
| Heating pad | K&H Manufacturing | 1020 | K&H Lectro Kennel Heated Pad with Free Fleece Cover (www.amazon.com) |
| Centrifuge | Sorvall | T6000B | Sorvall T6000 (B) Benchtop Centrifuge |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemocytometer |
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