Summary
Nanopodia er tynne, men skjøre membrankanaler som strekker seg opp til 100 mikrometer fra en celle ledende foran eller etterfølgende bak og forstand mobil miljø. Direkte fiksering ved 37 ° C, forsiktig vasking, og unngåelse av organiske oppløsningsmidler som etanol, metanol eller aceton og av høyere Triton X-100-konsentrasjoner er nødvendig for å observere disse cellulære strukturer.
Abstract
Adherente celler i kulturopprettholde en polarisert tilstand for å støtte bevegelsen og intercellulære interaksjoner. Nanopodia er tynne, avlange, i stor grad F-aktin-negative membran anslagene i endotelceller og kreftceller som kan visualiseres gjennom TM4SF1 (Transmembrane-4-L-seks-familie-1) immunfluorescens farging. TM4SF1 klynger i 100-300 mikrometer diameter TMED (TM 4SF1 e nriched mikro d omains) inneholder tre til så mange som 14 individuelle TM4SF1 molekyler. TMED er ordnet midlertidig sammen nanopodia på en vanlig avstand på 1 til 3 TMED per μ m og fast anker nanopodia til matrise. Dette gjør nanopodia å utvide mer enn 100 μ m fra den ledende foran eller etterfølgende bak polarisert endotelceller eller tumorceller, og fører rester membran å bli akterutseilt på matrix når cellen fjerner seg. TMED og nanopodia ha blitt oversett på grunn av deres ekstreme skjørhet og følsomhet for temperatur. Rutinemessig vasking og fiksering forstyrre strukturen. Nanopodia blir bevart ved direkte festing i paraformaldehyd (PFA) ved 37 ° C, etterfulgt av kort eksponering til 0,01% Triton X-100 før farging. Nanopodia åpner nye utsikter i cellebiologi: de lover å omforme vår forståelse av hvordan cellene sanse omgivelsene, oppdage og identifisere andre celler på avstand, initiere inter interaksjoner ved nær kontakt, og de signal mekanismene som er involvert i bevegelse, spredning, og celle -cellekommunikasjon. Metodene som er utviklet for å studere TM4SF1-avledet nanopodia kan være nyttig for studier av nanopodia som dannes i andre celletyper gjennom byrået av klassiske tetraspanins, særlig ubiquitously uttrykt CD9, CD81, og CD151.
Introduction
Under polarisering for bevegelse, dyreceller forlenge en rekke dynamiske, membran utstikkere fra deres overflater, inkludert filopodia, lamellipodia, hevefibre, og volanger en. Nylig lagt til denne listen var nanopodia, en nyoppdaget type tynn (100-300 mikrometer i diameter), avlang (opp til 50-100 mikrometer lange) membran projeksjon som gir membrankanaler for utvidelse av F-aktin strukturer som filopodia og tilbaketrekning fiber, og at flekken positivt med TM4SF1 (Transmembrane-4-L-seks par-1) i dyrkede endotelceller og tumorceller 2,3.
TM4SF1 er et protein med tetraspanin-lignende topologi som opprinnelig var kjent som et tumorcelleantigenet 4 før oppdagelsen at molekylet er et endotelcelle biomarkør som spiller en viktig rolle i endotelial celleproliferasjon og migrasjon 2,3. Immunfluorescens flekker avdekket at TM4SF1 er lokalisert til perinucLear vesikler og til plasma membranen, og er beriket i TM 4SF1 e nriched mikro d omains (TMED). TMED anker nanopodia til matrise og til stede i en regelmessig avstand båndmønster på 1-3 TMED / um lengde nanopodia. Nanopodia vanligvis strekker seg fra en celle ledende foran og etterfølgende bak under celle polarisering for bevegelse. På grunn av den fast heftende karakter av TMED, nanopodia er ute av stand til å trekke tilbake inn i cellen når den beveger seg; forlatte nanopodia rester dermed spore ut banen til mobilnettet bevegelse. Nanopodia gi membrankanaler for F-aktin kjøres ut og inn, og er områder av intercellulær samhandling og kommunikasjon 2,3. Disse egenskapene gjør at nanopodia gir en unik mulighet til å studere mekanismene bak F-aktin montering under mobilnettet polarisering, cellular sensing av miljøet, fastsettelse av banen og retning av celle bevegelse, og inter interaksjoner ennd kommunikasjon.
På grunn av den svært hydrofobe natur TMED og den tynne og skjøre membranous natur nanopodia, trenger spesiell omsorg for å bli tatt for å bevare TMED og nanopodia. Ødeleggelsen av nanopodia og fjerning av TMED av vanlige laboratoriemetoder er en mulig grunn til at bare sekstitre publikasjoner har dukket opp på TM4SF1 siden sitt første funn i 1986 1 og for fullstendig mangel på kunnskap om TM4SF1 berikelse i 100-300 mikrometer microdomains på celleoverflaten før rapporten fra TM4SF1 i endotelceller i 2009 2.
Konvensjonelle metoder for farging som vanligvis bruke organiske oppløsningsmidler som etanol, metanol eller aceton for å løse celler og bruke 0,1% eller høyere Triton X-100 konsentrasjonen til permeabilize celler 5. Studier som er beskrevet her gjennomført tre store endringer til den konvensjonelle metoden for å avsløre TMED og nanopodia: (i) bruke 37 ° C 4% PFA og fikse celler i en 3776, C inkubator, (ii) anvende milde romtemperatur PBS-vasking, og (iii) å bruke mindre enn 0,03% Triton X-100 bare kort å permeabilize celler før tilsetning av primært antistoff, som Triton X-100 er høyere enn 0,03% vil trekke TM4SF1.
Alle tetraspanins danne microdomains på cellemembranen 6 og noen colocalize med TMED i endotelceller og kreftceller 2,3. Som tetraspanins som CD9, CD81, og CD151 er overalt uttrykt, kan flekker protokollen beskrevet her bli utvidet til mange forskjellige celletyper som mangler TM4SF1 for studier av nanopodia funksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Cell Culture på Kollagen Coated Glass Disk
- Plasser glassdisker (12 mm i diameter) i en glasskrukke (4 oz) og autoklav å sterilisere plater.
- Sett 25 ml 70% etanol i en 50 ml Falcon rør og legg den i en cellekultur hette. Denne løsningen kan brukes om igjen flere ganger inntil nivået av oppløsningen faller til 20 ml.
- Plasser en skarp pinsett med en ekstra fin spiss på 70% etanol for 5 min før du bruker den til å håndtere glass disk.
- Fjern forsiktig pinsett ut av røret og lukker lokket, og deretter forsiktig plassere etanol behandlet tang på toppen av røret for å lufttørkes i 2 min. Ikke la tuppen av pinsett til å røre noe i panseret.
- Bruk steril tang for å hente en steril glassdisken ut av glasskrukke og legg den i en brønn på 24-brønnen cellekultur plate. Gjenta til ønsket antall brønner har vært befolket med plater.
- Sett 500 mL av Bovine kollagen løsning (50 ng / ml) i hver brønn som inneholder en glassdisken og plassere den i en 37 ° C, 5% CO 2 cellekultur inkubator for minst 30 min. Det er ingen skade i en lengre inkubasjon.
- Harvest-HUVEC (Menneskelig Umbilical Vein endotelceller) eller PC3 (prostata kreftceller) som allerede var dyrket i 150 mm cellekultur plate gjennom trypsinering og blokkerer trypsinaktivitet bruke sitt fullstendig kultur medium. Samle cellene inn i en 15 ml Falcon rør.
- Telle celle nummer og sørg for levedyktigheten er større enn 90%.
- Pellet cellene ved sentrifugering ved 200 xg i 10 min ved 4 ° C. Fjern supernatanten.
- Bruk kulturmediet for å fortynne cellene til 10 5 celler / ml. Plasser cellene på is.
- Aspirer kollagen i hetten cellekultur og forsiktig plassere 500 pl cellesuspensjon til hver brønn i hvilken glass-plater ble-belagt med kollagen. 5 x 10 4 celler / brønn i 24-brønners plate vil gi 60% confluency for HUVEC og 30% confluency for PC3 celler. Merk: legge mer cellesuspensjon for høyere celletetthet.
- Kultur cellene i et 37 ° C, 5% CO2 inkubator i 1 time, 2 timer, 4 timer, 6 timer, eller 24 timer for å spore nanopodia aktivitet og cellepassasje. Vanligvis vil cellene fester seg til glasset disk i den første 30 min, deretter begynne å polarisere og migrere i den første timen, og utføre inter interaksjoner og celledeling i følgende timer.
2. Cell Fixation
- Hver brønn vil trenge 500 mL 4% PFA (paraformaldehyde) for å fikse cellene. Enten kommersielt produsert eller rykende 4% PFA kan brukes. Beregne mengden av PFA nødvendig basert på antall brønner forberedt, og plassere PFA i en 15-ml falk tube. FORSIKTIG: paraformaldehyde er en mistenkt kreftfremkallende.
- Sett falken tube i en isopor stativ som allerede var på plass i en 37 ° C inkubator. La røret i inkubatoren i 30 min til krigsm opp PFA til 37 ° C.
- Legg en varmepute i panseret kultur og slå den på.
- Ta ut den 24-brønnen cellekultur plate og prewarmed PFA ut av inkubatoren og plassere den på toppen av varmeputen.
- Bruk en hånd til å suge mediet fra en brønn, og umiddelbart etter bruk den andre hånden til å forsiktig skyve 500 mL PFA i brønnen gjennom godt kanten. For enklere aspirasjon, vipp kultur plate på ca 45 °, lene den mot Styrofoam stativ slik at den er stabil på den vinkelen. Dette vil lette aspirasjon og legge PFA-løsning til brønnen uten å forstyrre cellene i kultur. Dette er den mest avgjørende skritt for å bevare den opprinnelige cellestruktur av celleaktiviteter.
- Gjenta prosessen til alle brønner med et glass disk har fått PFA. Merk: alle tiltak som må endre pre-eksisterende løsning fra brønnen vil gjelde samme prosedyrer aspirasjon.
- Sett platen i 37 ° C i 5 min. Ta platen tilbake til hetten kultur og vippe mot Styrofoam som beskrevet i trinn 2.5. Bruk en hånd til å forsiktig overføre PFA fra brønnen til en samling rør; bruker den andre hånden til umiddelbart etterpå plassere minst 500 mL romtemperatur PBS i brønnen. Etter at alle brønnene har blitt vasket, gå tilbake og gjenta PBS vask en gang i hver godt. Tøm samlet PFA opp i farlige avfallsbeholder.
- Forbered ICC blokkeringsbuffer ved tilsetning av 2% kalvefosterserum i PBS. 0,04% natrium-azid (fortynnet fra 20% stamløsning) ble tilsatt som et konserveringsmiddel. FORSIKTIG: natriumazid er et giftig stoff. Bufferen kan lagres i 4 ° C i en lang periode uten bakteriell forurensning.
- Med kulturplaten fremdeles på skrå mot et stativ, en gang gå gjennom hver brønn aspirere å fjerne PBS og umiddelbart etterpå å legge 500 pl av ICC blokkeringsbuffer. Cellene er nå klar for immunfluorescens farging. Hvis nødvendig,faste celler kan lagres i et 4 ° C kjøleskap i en uke uten betydelig tap av TM4SF1 protein.
Tre. TM4SF1 Immunfluorescens Farging av Nanopodia
- I hver brønn, erstatte 500 mL ICC blokkeringsbuffer med en ny blokkeringsbuffer inneholdende 0,01% Triton X-100 og la det stå ved romtemperatur i 1 time. Bruk ikke høyere enn 0,03% Triton X-100 som det vil fjerne TM4SF1 fra cellemembraner. PBS-vaskede celler fra trinn 2.10 direkte kan flyttes til den blokkerende buffer inneholdende Triton hvis farging er klar til å tas i bruk med en gang.
- Fortynn primære anti-TM4SF1 (eller anti-CD9)-antistoff til 0,5 mikrogram / ml i ICC blokkerende buffer.
- I hver brønn, fjerne ICC/0.01% Triton buffer og erstatte det med 300 mL av anti-TM4SF1-antistoff løsning. Inkuber i 2 timer ved værelsestemperatur, eller la over natten ved 4 ° C.
- Vask hver brønn med ikke mindre enn 500 mL PBS. Gjenta 3x; hver gang gi på least 5 min av inkubasjonstiden.
- Tilbered en sekundær antistoff og phalloidin løsning i ICC blokkeringsbuffer, ved hjelp av en 1000 ganger fortynning av Alexa 488-merket esel-anti-mus sekundært antistoff (2 mg / ml sluttkonsentrasjon) og 1000 x fortynning av phalloidin (50 ng / ml sluttkonsentrasjon).
- Fjern PBS og tilsett 300 ul av det sekundære antistoff og phalloidin løsning til hver brønn og inkuberes i 2 timer og lar den stå over natten ved 4 ° C.
- Gjenta PBS vasketrinn med minst en 5 min inkubasjon per vask. I siste vask, la hver brønn i PBS i 1 time.
- Drop en eneste dråpe (~ 10 mL) av anti-fade montering media på et glass lysbilde.
- Bend spissen av en 19 G 1 ½ i sprøytenål 90 ° ved å trykke forsiktig på en hard overflate. Bruk en hånd til å holde bøyd nål og forsiktig løfte opp en glassdisken fra brønnen, og bruk den andre hånden til å ta tak i plate ved hjelp av skarpe tang.
- Drei glassdisken &# 160; ansiktet ned la cellen side kontakt monterings media på glass-slide. Forsiktig plassere glassdisken og la det tørke over natten på et mørkt sted i romtemperatur.
- Fortsett å avbilde immunfluorescens farget nanopodia, eller lagre bildene i en lysbilde boks ved -20 ° C. Lysbildene vil forbli synlig for et par måneder i -20 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For Trinn 1:
Dersom celler (slik som HUVEC og PC3 brukt i denne studien) er i stand til å vokse normalt, vil cellene fester seg til kollagen-belagte plate i 30 min etter at de er foret, å polarisere og bli mobil snart etterpå, og forlenge nanopodia forkant av sin bane bevegelse. fig 1A og 1B henholdsvis viser et polarisert og prolifererende HUVEC. Figur 2A viser polarisert PC3-celler i en mobil tilstand.
For Trinn 2:
Med prewarming på 4% PFA til 37 ° C, feste celler ved 37 ° C i 20 min, og skånsom vasking med romtemperatur PBS, cellulære tilstander bør være godt bevart. Vanligvis isoleres individuelle HUVEC (figur 1A, 1) eller PC3 (figur 2A) celler viser en polarisert morfologi, hvis cellene er i tilstand av celledeling (figur 1B, 1). Intercellulær interaksjonerfører til celle veikryss dannelse (figur 1C, 1) er også ofte observert. Nanopodia skal vises på cellens periferi, og F-aktin vil ofte være til stede i partier av nanopodia proksimalt til cellen. Kalde temperaturer føre til F-aktin å trekke tilbake i cellene later nanopodia membrankanaler. Suboptimal temperatur, slik det er vist i eksemplene ved anvendelse av 4 ° C PFA fiksering og kald PBS-vasking, vil forstyrre og ødelegge nanopodia strukturen i polariserte celler (figur 1A, 2), prolifererende celler (figur 1B, 2), og en kunstig fremfuge mot intercellulære knutepunkter (figur 1C, 2).
For Trinn 3:
Mange membranbundne proteiner inkludert TM4SF1 er svært følsomme for Triton X-100, og vil bli fjernet fra celleoverflaten hvis konsentrasjon er høyere enn 0,03%, er benyttet 2,3. For å bevare de fleste av celleoverflate TM4SF1, PFA faste celler skal bare behandles med 0,01% Triton X-100 som inneholder blokkerende buffer i en time før bytte til anti-TM4SF1 primære antistoff som er blitt fortynnet i et vanlig blokkeringsbuffer som ikke inneholder Triton X-100. Som nanopodia er tynne og lange membran anslag og legge til matrise gjennom TMED, vil TMED intensitet sannsynlig trenger å bli styrket gjennom lysstyrke og kontrast funksjoner i bildebehandlingsprogram som Photoshop for å avdekke og følge stien av celle bevegelse gjennom nanopodia rester (Figur 1, 2 innfellinger).
Figur 1. Nanopodia anslag under endotelceller bevegelse, celledeling, og krysset formasjon. HUVEC var fersk dyrket i 6 hr after plating på 60% samløpet på kollagen-belagt glassdisken. Cellene ble fiksert ved hjelp av (1) den modifiserte metode hvor cellene ble fiksert i 37 ° C i 4% PFA direkte uten forvask i PBS og plassert i en 37 ° C inkubator i løpet av 20 min fiksering tid, eller (2) en konvensjonell fargemetoden hvor cellene ble vasket med PBS to ganger romtemperatur og fiksert i 4% PFA i 20 min ved romtemperatur. Nanopodia, tynne og lange membran utvidelser som er merket med en intermitterende, banded mønster av TMED (hvite piler) og som ofte omslutter phalloidin-farget F-aktin (rosa piler) i porsjoner proksimale til cellen, ble immunfluorescens farget med anti-TM4SF1 Ab. Tre representative HUVEC bilder ble tatt for å vise utseende av nanopodia under (A) polarisering, (B) celledeling, og (C) intercellulære junction formasjonen. Innfelte bokser viser høyere forstørrelser av nanopodia. Under polarisert (A) eller retracted cellulære tilstander (B, C), ble nanopodia anslag bevart ved direkte å feste celler in 37 ° C PFA, mens strukturene ble stort sett fjernet ved vasking og feste cellene i romtemperatur PBS og PFA. (C) 37 ° C PFA fiksering bevarer inter veikryss (blå piler), mens veikryss blir forstyrret av kaldere temperaturer som forårsaker celler til å trekke tilbake, og skaper et gap mellom cellene bro ved nanopodia hvorav de fleste inneholder F-aktin (rosa piler) og noen ikke (hvite piler) Klikk her for å se større bilde.
Figur 2. Nanopodia viser retningen av PC3 tumorcellebevegelse. (A)PC3 kreftceller var fersk dyrket for 6 timer etter plating på 60% samløpet på kollagen-belagt glassdisken. Celler ble løst direkte i 37 ° C 4% PFA og plassert i en 37 ° C inkubator i 20 min for å bevare nanopodia. Nanopodia (hvite piler) og F-aktin (rosa piler) var immunfluorescens farget med anti-TM4SF1 Ab og phalloidin, henholdsvis. Det innfelte boksen viser nanopodia ved høyere forstørrelse. Denne representanten bildet viser at TM4SF1 uttrykk i PC3 celler er heterogen; ett PC3 celle med sterk TM4SF1 farging (gul pil) produsert lang nanopodia og er omgitt av to svakt TM4SF1-farget PC3 celler (røde piler). Nanopodia rester på bakkanten (ib) viser retningen PC3 celle bevegelse i løpet av seks timers cellekultur periode. Klikk her for å se større bilde.
Figur 3. Visualisering av nanopodia gjennom tetraspanin CD9. (A) HUVEC var fersk dyrket i seks timer etter plating på 60% konfluens på en kollagen-belagt glassdisken. Celler ble løst i 37 ° C 4% PFA og nanopodia (hvite piler) ble avslørt gjennom anti-CD9 Ab. F-aktin (rosa piler) ble farget med phalloidin. Denne representanten bildet viser at CD9 lokaliserer også til nanopodia. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nanopodia er tynne cellemembrankanaler som fast fester til matrise gjennom TMED og kan utvide mer enn 100 mikrometer fra en polarisert mobil celle til å oppfatte omgivelsene og megle inter interaksjoner 2,3. Nanopodia holder seg til matrise så fast at rester blir liggende igjen som celle beveger seg unna (figur 1 og 2). Nanopodia dermed tillate oss å studere hvordan cellene sanse omgivelsene og bestemme banen til celle bevegelse, og hvordan genuttrykk eller narkotikabehandling endringer bevegelse. Men på grunn av skjørhet av disse tynne (100-300 mikrometer bredde) membran struktur, må forsiktighet for å bli tatt for å bevare dem.
For å trofast registrere cellulære aktiviteter uten å forstyrre nanopodia, og å studere hvordan eksperimentelle forhold påvirker nanopodia aktiviteter og banen til celle bevegelse, bør man først kontrollere at celler vokser effektivt i fullstendig medium før pursuing eksperimentet. Normale friske primære endotelceller, som HUVEC, vil i frisk EGM2-MV komplett kultur medium normalt dele ca hver 18 time under deres log fase av vekst innen seks avsnitt av deres kultur. Man bør unngå bruk av HUVEC som er større enn passasje-6 som høyere passasje tallene vil føre til økt antall senescent eller binuclear celler i kultur 7 og vil påvirke cellenes evne til å polarisere og produsere nanopodia to. PC3 prostata tumor celler er mer stabile overfor kulturer (upublisert observasjon), men man bør likevel unngå bruk av cellene mer enn ti ganger fra deres fjerning fra den frosne tilstand.
Sunn heftende celler vil typisk feste til kollagen-belagt skive innen den første 30 minutter etter at de er seeded, fulgte snart etterpå etter celle polarisering. Derfor bør man forvente å se de endoteliale celler i en polarisert tilstand ved slutten av den første time med inkubasjon. Hvis enFlertallet av endotelceller ikke fester seg til glassflaten, deretter sjekke om (a) kollagen har passert utløpsdatoen, (b) trypsinization under celleinnhøstningsutstyr var for strenge, eller (c) celler er usunn. PC3 celler polariserer tregere enn endotelceller, men bør vise en polarisert morfologi innen to timer etter seeding. Hvis forurensning oppstår i kultur, deretter undersøke om glassdisker eller tang ble skikkelig sterilisert. Alternativt kan man vurdere å bruke kammer lysbilder; protokollen beskrevet her, antyder bruken av glass-plater i 24-brønners kulturplater for å spare kostnader og til lettere å håndtere et stort antall prøver.
Konvensjonelle farging metoder, bruk av PBS å vaske cellene før du legger romtemperatur fiksativ, lett forstyrre fin cellulære strukturer som nanopodia og vil ødelegge dem under farging prosessen. Dette skyldes i stor grad det faktum at fysiske påkjenninger som temperatursvingninger i løpet av celle fixatipå eller streng PBS vask under farging prosessen er de viktigste årsakene til fragmentering eller fjerning av nanopodial strukturer. Med tre enkle metodiske forandringer - (i) ikke forstyrrer celle polarisasjonstilstand ved vasking med PBS før fiksering, (ii) løse cellene direkte i 37 ° C forvarmet PFA og inkuberes cellene ved 37 ° C i løpet av fikseringen, og (ii) forsiktig vaske celler i romtemperatur PBS - nanopodia er i stor grad bevart Figur 1 viser hvordan PFA og PBS temperaturer påvirker bevaring av nanopodia i dyrkede endotelceller, figur 2A viser at TM4SF1 uttrykk er heterogen i PC3 celler og at celler med den sterkeste TM4SF1 flekker vise den lengste. nanopodia. Temperatur er kjent for å påvirke F-aktin aktiviteter og tubulin integritet 8,9. Således feste celler ved den samme temperatur i hvilken cellene ble dyrket (dette er 37 ° C i protokollen som er beskrevet her) er sannsynlig for bedre å bevare den polariserte celletilstand (
PFA er ikke den eneste reagens som anvendes i fiksering; organiske oppløsningsmidler som metanol, etanol og aceton er også ofte brukt i cellefiksering for farging 10..Den beste fiksativ blir ofte bestemt av epitopen plasseringen av et spesifikt antistoff som brukes i farging (upubliserte data). For mus anti-human TM4SF1 antistoff som gjenkjenner ekstracellulære domener av TM4SF1 (Millipore; brukt i denne studien) er PFA det eneste bindemiddel som avslører TMED i immun-farging, noe som indikerer at andre organiske løsningsmidler ødelegger epitopen. I motsetning til dette arbeider kanin anti-humant TM4SF1 polyklonalt antistoff fra Acris (data ikke vist), hvis epitop er lokalisert i atten aminosyrer i nærheten av den N-terminale region, også med etanol faste celler. Imidlertid ikke Acris antistoff ikke gi god TM4SF1 farging, sannsynligvis fordi den N-terminale epitopen er opptatt av TM4SF1 interaksjoner med cytosoliske molekyl (er) som delvis dekker epitopen.
Triton X-100 er en ikke-ionisk overflateaktivt middel, og er ofte brukt i immun-farging med sikte på permeabilizing cellemembranen og redusere overflatespenningen av vandige oppløsninger 11,12. However, denne evnen bringer også risikoen for å oppløseliggjøre membranproteiner. TM4SF1 er fullstendig fjernet fra celleoverflaten av Triton X-100 konsentrasjon som er større enn 0,05% 2,3. Av denne grunn er bare en 1-timers behandling med 0,01% Triton X-100 før tilsetning av det primære antistoff som brukes i fremgangsmåten beskrevet her. Denne behandlingen permeabilizes membranen nok til å muliggjøre peri-nukleær TM4SF1 å være godt vurderes av antistoffene, og samtidig bevare de fleste TM4SF1 på cellemembranen. For dobbelt farging av TM4SF1 med proteiner lokalisert i kjernen, bruk 0,03% Triton X-100 i preinkubering stadium dersom 0,01% Triton ikke fungerer. Dette vil lette Triton X-100 punktering av kjernemembranen.
TM4SF1 er meget spesifikk for endoteliale celler og tumorceller; fleste andre celletyper, enten ikke uttrykker TM4SF1 eller uttrykke det på et meget lavt nivå 2,3. Men, klassiske tetraspanins - en familie som omfatter trettitre medlemmer including CD9, CD81, og CD151 - er overalt uttrykt 6, og kan også bli funnet i membrandomener i nanopodia 2,3 (figur 3A). Således kan farging klassiske tetraspanins gjennom samme immun-fargemetoden som brukes for TM4SF1 muliggjøre studier av nanopodia i celletyper som ikke uttrykker TM4SF1. PC3 tumorceller som uttrykker TM4SF1 sterkt tendens til å bevege seg kontinuerlig i en enkel retning, mens PC3-celler som uttrykker svakt TM4SF1 ikke har et klart definert bevegelsesretning (fig. 2A og upubliserte data). TM4SF1 uttrykk nivået i kreftceller er kjent for å være korrelert med deres metastatisk potensial 13, og undersøkelser pågår for tiden linking kreftcellenes evne til å uttrykke TM4SF1 og produsere nanopodia til deres metastatisk potensial.
I sammendraget, mestring av effektive metoder for farging nanopodia gjør at etterforskerne å spore banen av celle bevegelse gjennom nanopodia residues, studere hvordan cellene sanse omgivelsene for bevegelse, hvordan cellebevegelse er endret etter endring av uttrykket nivåer av gener (enten høyekspresjonsystemer eller knockdown av gener av interesse). Nanopodia representerer et nytt verktøy for undersøkelse av celle polarisering og cellebevegelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi erkjenner Dr. Harold Dvorak for nyttige diskusjoner, inkludert forslag om å prøve fiksering i 37 ° C PFA. Dette arbeidet ble støttet av NIH stipend P01 CA92644 og med en kontrakt fra Utsmykkingsfondet for Cancer Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass disks | Fisher Scientific | 12-545-82 | 12 mm diameter |
| Glass jar | Fisher Scientific | 02-912-310 | Certified Clean Clear Glass Straight-Sided Jars, 4 oz |
| Glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides |
| 50 ml Falcon tube | BD Falcon | 352070 | 50 ml high-clarity polypropylene conical centrifuge tube, 16,000 rcf rating. Sterile. |
| 15 ml Falcon tube with Styrofoam rack | Corning | 430790 | Corning 15 ml PP Centrifuge Tubes |
| Sharp forceps | Fisher Scientific | 13-812-42 | Dissecting Extra Fine Pointed Splinter Forceps |
| 24-well Cell culture plate | BD Bioscience | 353047 | 24-well Cell Culture Plate |
| 150 mm Cell culture plate | BD Bioscience | 353025 | 150 mm cell culture plate |
| 19 G 1 ½ Syringe needle | BD Bioscience | 309635 | 19 G 1 ½ |
| Ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2701 | Decon's Pure Ethanol 200 Proof |
| Collagen solution | BD Bioscience | 354249 | Collagen I, High Concentration, rat tail, 100 mg |
| Trypsin/EDTA | Cellgro | 25-053-CI | 0.25% Trypsin-EDTA 1x |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate |
| 10x PBS | Affymetrix | 75889 5 LT | PBS, 10x Solution, pH 7.4 |
| PFA (paraformaldehyde) | Affymetrix | 19943 1 LT | 4% in PBS |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135-500ML | Fetal Bovine Serum |
| EGM2-MV | Lonza | CC-3162 | EGM-2 BulletKit, EBM-2 Basal Medium 500 ml and EGM-2 SingleQuot Kit Supplement & Growth Factors |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002-25G | Solubilized in water. 4% stock solution and working concentration is 0.4%. |
| Mouse anti-human TM4SF1 antibody | Millipore | MAB3127 | Epitope is located in extracellular domain |
| Mouse anti-human CD9 antibody | BD Bioscience | 555370 | Epitope is located in extracellular domain |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouse 2nd antibody | Life Technologies | A-21202 | Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) |
| Phalloidin | Chemicon | 90324 | Rhodamine-conjugated Phalloidin |
| Anti-fade mounting media | Life Technologies | P-36931 | ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI |
| 70% Ethanol | 17.5 ml of ethanol (200 proof) 7.5 ml of double-deionized water |
||
| 10x PBS (make 200 ml) | 20 ml of 10x PBS 180 ml of double-deionized water |
||
| 20% Triton X-100 (make 20 ml) | 4 ml Triton X-100 16 ml double-deionized water |
||
| 4% NaN3 (make 25 ml) | 1 g of NaN3 25 ml of double-deionized water |
||
| 50 ng/ml Bovine collagen solution in PBS (make 5 ml) | Stock solution of 50 μg/ml (50 ml) 830 μl of Collagen I (3 mg) 50 ml PBS |
||
| ICC Blocking Buffer (50 ml) | 49 ml PBS 2% FBS (add 1 ml) 0.04% NaN3 (add 100 μl of 4% NaN3) |
||
| ICC Blocking Buffer/0.01% Triton X-100 (make 50 ml) | 50 ml of ICC Blocking Buffer 25 μl of 20% Triton X-100 |
||
| HUVEC | Lonza | C2517A | www.lonza.com |
| PC3 | ATCC | CRL-1435 | www.atcc.org |
| Cell culture hood | NuAIRE | Nu-425-600 | NU-425 (Series 60) Biological Safety Cabinet |
| 37 °C, 5% CO2 Cell culture incubator | CellStar | QWJ300DABA | Cellstar CO2 Water Jacketed Incubator |
| Heating pad | K&H Manufacturing | 1020 | K&H Lectro Kennel Heated Pad with Free Fleece Cover (www.amazon.com) |
| Centrifuge | Sorvall | T6000B | Sorvall T6000 (B) Benchtop Centrifuge |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemocytometer |
References
- Chhabra, E. S., Higgs, H. N. The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures. Nat. Cell Biol. 9, 1110-1121 (2007).
- Shih, S. C., et al. The L6 protein TM4SF1 is critical for endothelial cell function and tumor angiogenesis. Cancer Res. 69, 3272-3277 (2009).
- Zukauskas, A., et al. TM4SF1: a tetraspanin-like protein necessary for nanopodia formation and endothelial cell migration. Angiogenesis. 14, 345-354 (2011).
- Hellstrom, I., Beaumier, P. L., Hellstrom, K. E. Antitumor effects of L6, an IgG2a antibody that reacts with most human carcinomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 7059-7063 (1986).
- Jang, Y. Y., Ye, Z., Cheng, L. Molecular imaging and stem cell research. Mol. Imag. 10, 111-122 (2011).
- Hemler, M. E. Tetraspanin functions and associated microdomains. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 801-811 (2005).
- Vasile, E., Tomita, Y., Brown, L. F., Kocher, O., Dvorak, H. F. Differential expression of thymosin beta-10 by early passage and senescent vascular endothelium is modulated by VPF/VEGF: evidence for senescent endothelial cells in vivo at sites of atherosclerosis. FASEB. 15, 458-466 (2001).
- Itoh, T. J., Hotani, H. Microtubule dynamics and the regulation by microtubule-associated proteins (MAPs). Uchu Seibutsu Kagaku. 18, 116-117 (2004).
- Caplow, M., Shanks, J., Ruhlen, R. L. Temperature-jump studies of microtubule dynamic instability. J. Biol. Chem. 263, 10344-10352 (1988).
- Pollice, A. A., et al. Sequential paraformaldehyde and methanol fixation for simultaneous flow cytometric analysis of DNA, cell surface proteins, and intracellular proteins. Cytometry. 13, 432-444 (1992).
- Macarulla, J. M., et al. Membrane solubilization by the non-ionic detergent triton X-100. A comparative study including model and cell membranes. Revista Espanola de Fisiologia. 45 Suppl, 1-8 (1989).
- Koley, D., Bard, A. J. Triton X-100 concentration effects on membrane permeability of a single HeLa cell by scanning electrochemical microscopy (SECM). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16783-16787 (2010).
- Chang, Y. W., et al. CD13 (aminopeptidase N) can associate with tumor-associated antigen L6 and enhance the motility of human lung cancer cells. Int. J. Cancer. 116, 243-252 (2005).
