Summary
Nanopodia são canais de membrana fina, mas frágeis, que se estendem até 100 mm de líder frente ou à direita traseira de um celular e sentir o ambiente celular. Fixação directa a 37 ° C, lavagem suave, e evitar os solventes orgânicos como o etanol, metanol, ou de acetona e de Triton X-100 a concentrações mais elevadas são necessárias para observar estas estruturas celulares.
Abstract
As células aderentes em cultura manter um estado polarizado para apoiar o movimento e interações intercelulares. Nanopodia são finas, alongadas, em grande parte de actina F-negativo-projeções de membrana em células endoteliais e de câncer que podem ser visualizadas através de TM4SF1 (Transmembrane-4-L-seis-família-1) técnica de imunofluorescência. Cachos TM4SF1 em 100-300 diâmetro mM TMED (TM 4SF1 e nriched micro d omains) contendo 3 a até 14 individuais TM4SF1 moléculas. TMED estão dispostas de forma intermitente ao longo nanopodia com um espaçamento regular de 1 a 3 TMED por μ m e ancorar firmemente nanopodia a matriz. Isso permite nanopodia estender mais de 100 μ m do líder frente ou à direita traseira de células endoteliais ou tumorais polarizadas, e faz com que os resíduos de membrana para ser deixado para trás em matrix quando a célula move-se para longe. TMED e nanopodia ter sido ignorado por causa de sua extrema fragilidade e sensibilidade à temperatura. Lavagem de rotina e fixação romper a estrutura. Nanopodia são preservadas por meio da fixação directa de paraformaldeído (PFA) a 37 ° C, seguida por uma breve exposição a 0,01% de Triton X-100 antes da coloração. Nanopodia abrir novas perspectivas na biologia de células: eles prometem para reformular a nossa compreensão de como as células perceber seu ambiente, detectar e identificar outras células à distância, iniciar interações intercelulares em contacto estreito, e dos mecanismos de sinalização envolvidos no movimento, proliferação e celular -celulares comunicações. Os métodos que são desenvolvidos para estudar nanopodia TM4SF1 derivados podem ser úteis para estudos de nanopodia que se formam em outros tipos de células através da agência de tetraspanins clássicos, nomeadamente a CD9 onipresente expressa, CD81 e CD151.
Introduction
Durante a polarização para o movimento, as células animais estender uma variedade de dinâmicas, saliências da membrana de suas superfícies, incluindo filopodia, lamellipodia, fibras de retração, e babados 1. Recentemente adicionado a esta lista foram nanopodia, um tipo recém-reconhecido de fina (100-300 m de diâmetro), a projeção da membrana alongada (até 50-100 mM de comprimento) que oferecem canais de membrana para a extensão das estruturas de F-actina como filopodia e fibra de retracção, e que coraram positivamente com TM4SF1 (Transmembrana-4-L e seis-família-1) em células endoteliais e de tumor de células cultivadas 2,3.
TM4SF1 é uma proteína com topologia tetraspaninas semelhante que foi originalmente conhecido como um antigénio das células tumorais antes de 4 a descoberta de que a molécula é um biomarcador de células endoteliais, que desempenha um papel essencial na proliferação de células endoteliais e migração de 2,3. Imunofluorescência revelou que TM4SF1 está localizada a perinucvesículas Lear e para a membrana plasmática, e é enriquecido em TM 4SF1 e nriched micro omains d (TMED). TMED âncora nanopodia à matriz e presente em um padrão em faixas regularmente espaçadas de 1-3 comprimento TMED / mM de nanopodia. Nanopodia normalmente se estendem desde principal frente de uma célula e à direita traseira durante a polarização celular para o movimento. Devido à natureza aderente firme de TMED, nanopodia são incapazes de retrair de volta para dentro da célula, uma vez que se move para longe; resíduos nanopodia abandonados traçar, assim, o caminho do movimento celular. Nanopodia fornecer canais de membrana para a extensão F-actina e retração, e são locais de interações intercelulares e comunicações 2,3. Essas características significam que nanopodia proporcionar uma oportunidade única de estudar os mecanismos subjacentes a montagem F-actina durante a polarização celular, sensor de celular do ambiente, a determinação do caminho e direção do movimento celular e interações intercelulares umnd comunicações.
Devido à natureza altamente hidrofóbico de TMED ea natureza membranoso fina e frágil de nanopodia, um cuidado especial deve ser tomado a fim de preservar TMED e nanopodia. A destruição de nanopodia e remoção de TMED por métodos comuns de laboratório é uma possível razão para que apenas sessenta e três publicações apareceram na TM4SF1 desde a sua primeira descoberta, em 1986, 1 e para a total falta de conhecimento de TM4SF1 enriquecimento em 100-300 mM microdomínios em superfície das células até que o relatório de TM4SF1 em células endoteliais em 2009 2.
Métodos convencionais vulgarmente imunocoloração utilizar solventes orgânicos como o etanol, metanol, acetona ou para fixar as células e utilizar de 0,1% ou mais elevada a concentração de Triton X-100 a permeabilizar as células 5. Estudos descritos aqui implementados três grandes mudanças para o método convencional para revelar TMED e nanopodia: (i) usar 37 ° C PFA 4% e corrigir as células em um 3776; incubadora C, (ii) aplicar suave temperatura ambiente de lavagem PBS, e (iii) utilizar a menos de 0,03% de Triton X-100 apenas brevemente para permeabilizar as células antes da adição do anticorpo primário, tal como Triton X-100 0,03% maior do que irá extrair TM4SF1.
Todos tetraspanins formar microdomínios sobre a membrana da célula 6 e alguns colocalize com TMED em endoteliais e células tumorais 2,3. Como tetraspanins como CD9, CD81, CD151 e são ubiquamente expressas, o protocolo de coloração descrito aqui pode ser estendida a muitos tipos de células diferentes que carecem TM4SF1 para os estudos de função nanopodia.
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Protocol
1. Cultura de Células em colágeno revestido Disk Vidro
- Coloque os discos de vidro (12 mm de diâmetro) em uma jarra de vidro (4 oz) e autoclave para esterilizar os discos.
- Colocar 25 ml de etanol a 70% em um tubo Falcon de 50 ml e coloca-se numa capa de cultura de células. Esta solução pode ser reutilizada várias vezes até que o nível da solução baixa para 20 ml.
- Coloque uma pinça afiada com um ponto extra fino no etanol 70% por 5 minutos antes de usá-lo para lidar com o disco de vidro.
- Cuidadosamente remover a pinça para fora do tubo e fechar a tampa, em seguida, colocar gentilmente a pinça de etanol tratada na parte superior do tubo de ar seco, durante 2 min. Não permita que a ponta da pinça para tocar qualquer coisa no capô.
- Use as pinças esterilizadas para pegar um disco de vidro estéril fora da jarra de vidro e coloque-o em um poço da placa de 24 poços de cultura de células. Repita até que o número desejado de poços foi preenchido com discos.
- Coloque 500 mL de solução de colágeno bovino (50 ng / mL) em cada cavidade que contém um disco de vidro e coloque-a num banho a 37 ° C, 5% de CO 2 célula incubadora de cultura durante pelo menos 30 min. Não há mal nenhum em um período de incubação mais longo.
- Colheita (HUVEC Células Endoteliais da Veia Umbilical Humana) ou PC3 (células de tumor da próstata) que já foram cultivadas em placa de 150 mm de cultura de células por meio de tripsinizao e bloqueiam a actividade da tripsina utilizando o seu meio de cultura completo. Recolher as células para um tubo Falcon de 15 ml.
- Conte o número de celular e certifique-se a viabilidade é superior a 90%.
- Agregar as células por centrifugação a 200 xg durante 10 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante.
- Utilizar o meio de cultura para diluir as células a 10 5 células / ml. Coloque as células no gelo.
- Aspirar o colagénio no capuz de cultura de células e colocar suavemente a 500 ul de suspensão celular a cada cavidade em que os discos de vidro foram pré-revestidos com colagénio. 5 x 10 4 células / cavidade da placa de 24 poços, vai dar 60% confluency para HUVEC e 30% de confluência de células PC3. Nota: adicionar mais suspensão de células para uma maior densidade de células.
- Cultura as células em um 37 ° C, 5% CO 2 incubadora de 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, ou 24 horas para rastrear as atividades nanopodia e passagem celular. Normalmente, as células irá anexar ao disco de vidro nos primeiros 30 min, em seguida, começar a se polarizar e migrar na primeira hora, e realizar interações intercelulares e divisão celular nas horas seguintes.
2. A fixação celular
- Cada poço terá 500 mL de 4% PFA (paraformaldeído) para fixar as células. Quer comercialmente ou fabricado feito recentemente PFA a 4% pode ser usado. Calcular a quantidade de PFA necessário com base no número de poços preparados, e colocar PFA num tubo Falcon de 15 ml. CUIDADO: paraformaldeído é um cancerígeno.
- Coloque o tubo de falcon em um estande de isopor que já estava em vigor em 37 ° C incubadora. Deixe o tubo na incubadora por 30 min para a guerram até o PFA para 37 ° C.
- Coloque uma almofada de aquecimento na capa de cultura e ligá-lo.
- Retire a placa de cultura de células de 24 poços ea PFA pré-aquecido para fora da incubadora e coloque-o em cima da almofada de aquecimento.
- Use uma mão para aspirar o meio de um poço, e imediatamente depois use a outra mão para deslizar suavemente 500 mL PFA no poço através da borda também. Para facilitar a aspiração, inclinar a placa de cultura a cerca de 45 °, encostando-o suporte de isopor de modo que é estável a este ângulo. Isto irá facilitar a aspiração e adição de solução de PFA para o bem, sem perturbar as células na cultura. Este é o passo mais importante para preservar a estrutura celular inicial de actividades celulares.
- Repita o processo até que todos os poços com um disco de vidro receberam PFA. Nota: todas as etapas que precisam mudar de solução pré-existente do poço vai aplicar procedimentos mesma aspiração.
- Colocar a placa de 37 ° C durante 5 min. Pegue a placa de volta para a capa de cultura e incline contra isopor como descrito no passo 2.5. Use uma mão para transferir suavemente a PFA do poço em um tubo de coleta; use a outra mão para colocar logo em seguida, pelo menos, 500 temperatura ambiente mL PBS no poço. Depois de todos os poços foram lavados, voltar e repetir a lavagem PBS mais uma vez em todos os poços. Esvazie o PFA coletado em um recipiente de resíduos perigosos.
- Preparar tampão de bloqueio TPI por adição de 2% de soro fetal bovino para PBS. Azida de sódio a 0,04% (diluído a partir de solução-mãe de 20%) é adicionado como conservante. AVISO: A azida de sódio é um composto tóxico. O tampão pode ser armazenado em 4 ° C, durante um longo período de tempo sem a contaminação bacteriana.
- Com a placa de cultura ainda inclinado contra um suporte, uma vez por cada ciclo de aspiração bem para remover PBS e imediatamente depois adição de 500 ul de tampão de bloqueio de ICC. As células estão prontas para a coloração de imunofluorescência. Se necessário, océlulas fixadas podem ser armazenados num refrigerador 4 ° C durante uma semana sem perda significativa da proteína TM4SF1.
3. TM4SF1 Imunofluorescência Coloração de Nanopodia
- Em cada poço, a substituição de 500 ul de tampão de bloqueio do TPI com um novo tampão de bloqueio contendo 0,01% de Triton X-100 e deixar repousar à temperatura ambiente durante 1 hora. Não utilizar mais elevado do que 0,03% de Triton X-100, uma vez que irá remover TM4SF1 a partir de membranas celulares. PBS células lavadas do passo 2.10 pode ser directamente transferida para o tampão de bloqueio contendo Triton se a coloração está pronto para ser iniciado imediatamente.
- Dilui-se o anticorpo primário anti-TM4SF1 (ou anti-CD9) a 0,5 ug / ml em tampão de bloqueio de ICC.
- Em cada poço, remover o tampão de Triton ICC/0.01% e substituí-la com 300 ml da solução de anti-TM4SF1-anticorpo. Incubar 2 horas à temperatura ambiente ou deixar durante a noite a 4 ° C.
- Lavar cada poço com não menos do que 500 ul de PBS. Repita 3x; cada vez dar a least 5 min do tempo de incubação.
- Prepara-se uma solução de anticorpo secundário e faloidina em ICC tampão de bloqueio, usando uma diluição de 1000 vezes de Alexa 488 anticorpo secundário marcado de burro anti-ratinho (2 ug / ml de concentração final) e 1.000 x diluição de faloidina (50 ng / mL de concentração final).
- Remover PBS e adicionar 300 ul da solução de anticorpo secundário e faloidina a cada poço e incubar durante 2 horas ou deixá-lo durante a noite a 4 ° C.
- Repita os passos de lavagem PBS com pelo menos 5 minutos de incubação por lavagem. Na última lavagem, deixar cada poço em PBS, durante 1 hora.
- Largar uma única gota (~ 10 mL) de montagem anti-fade mídia sobre uma lâmina de vidro.
- Dobre a ponta de um 19 G 1 ½ na agulha da seringa de 90 ° pressionando suavemente sobre uma superfície dura. Use uma mão para segurar a agulha dobrado e gentilmente levante um disco de vidro do bem e utilize a outra mão para segurar o disco usando a pinça afiadas.
- Vire o disco de vidro e# 160; viradas para baixo deixando o contato célula lado os meios de comunicação de montagem na lâmina de vidro. Delicadamente, coloque o disco de vidro e deixe-a secar durante a noite em um lugar escuro à temperatura ambiente.
- Prossiga para a imagem da imunofluorescência manchado nanopodia, ou armazenar os slides em uma caixa de lâminas a -20 ° C. Os slides permanecerá visível por alguns meses em -20 ° C.
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Representative Results
Para o Passo 1:
Se as células (como HUVEC e PC3 utilizado neste estudo) são capazes de crescer normalmente, as células irá anexar o disco revestido de colágeno dentro de 30 minutos depois que eles são semeadas, polarizar e tornar-se móvel logo depois, e estender nanopodia à frente do seu caminho de movimento. Figuras 1A e 1B mostram, respectivamente, um polarizado e em proliferação de HUVEC. Figura 2A mostra células PC3 polarizado num estado móvel.
Para o Passo 2:
Com pré-aquecimento do PFA a 4% a 37 ° C, que fixa as células a 37 ° C durante 20 min e lavagem suave com PBS temperatura ambiente, estados celulares devem ser bem preservada. Geralmente, isolado individualmente HUVEC (Figura 1A, 1) ou PC3 (Figura 2A), as células que apresentam uma morfologia polarizada, a menos que as células estão no estado de divisão celular (Figura 1B, 1). Interações intercelulareslevando à formação de junção celular (Figura 1C, 1) também são comumente observados. Nanopodia deve aparecer na periferia das células, e F-actina, muitas vezes, estar presentes em porções de extremidade proximal nanopodia para a célula. Baixas temperaturas causam F-actina para retrair volta para as células, deixando para trás os canais de membrana nanopodia. Temperatura abaixo do ideal, como indicado nos exemplos, utilizando 4 ° C PFA fixação e de lavagem de PBS frio, e vai perturbar a destruir a estrutura nanopodia em células polarizadas (Figura 1A, 2), células de proliferação (Figura 1B, 2), e produzir artificialmente lacunas nas junções intercelulares (Figura 1C, 2).
Para o Passo 3:
Muitas proteínas ligadas à membrana incluindo TM4SF1 são muito sensíveis a Triton X-100 e serão removidas da superfície da célula, se as concentrações mais elevadas do que 0,03% são utilizados 2,3. A fim de preservar a maioria dos TM4SF1 superfície celular, PCélulas FA fixa só deve ser tratada com 0,01% de Triton X-100, contendo tampão de bloqueio durante uma hora antes de mudar para o anti-TM4SF1 anticorpo primário que foi diluída num tampão de bloqueio regular que não contém o Triton X-100. Como nanopodia são projeções da membrana finas e longas e anexar a matriz através TMED, TMED intensidade provavelmente precisará ser reforçada através de funções de brilho e contraste em software de processamento de imagem como o Photoshop, a fim de revelar e rastrear o caminho do movimento de células através de resíduos nanopodia (Figura 1, 2 inserções).
Figura 1. Nanopodia projecções durante o movimento das células endoteliais, a divisão celular, e a formação da junção. HUVEC foram recentemente cultivadas durante 6 h after chapeamento a 60% de confluência em disco de vidro revestidas com colagénio. As células foram fixadas com (1) o método modificado, no qual as células foram fixadas em 37 ° C 4% PFA directamente, sem pré-lavagem em PBS, e colocado numa incubadora a 37 ° C durante o tempo de fixação 20 min, ou (2) um método de coloração convencional onde as células foram lavadas com PBS, duas vezes à temperatura ambiente e fixados em 4% de PFA durante 20 minutos à temperatura ambiente. Nanopodia, extensões de membranas finas e longas que são marcadas por um padrão intermitente, em faixas de TMED (setas brancas), e que muitas vezes encerram manchado de phalloidin F-actina (setas rosa) em porções proximal para a célula, foram coradas utilizando imunofluorescência anti-TM4SF1 Ab. Três imagens representativas HUVEC foram capturadas para mostrar o aspecto de nanopodia durante (A) de polarização, a divisão celular (B), e (C) de formação da junção intercelular. Caixas Inset mostrar ampliações de nanopodia. Durante polarizada (A) ou retracted estados celulares (B, C), as projecções nanopodia foram preservados por fixação directa de células em 37 ° C PFA, enquanto que as estruturas estavam em grande parte removido por lavagem e a fixação das células em PBS temperatura ambiente e PFA. (C) 37 ° C PFA fixação preserva junções intercelulares (setas azuis), ao passo que as junções são perturbados por temperaturas mais frias que causam as células para retrair, criando uma lacuna entre as células em ponte por nanopodia de que a maioria contém F-actina (setas rosa) e alguns não (setas brancas) Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 2. Nanopodia demonstrar a direcção do movimento de células tumorais PC3. (A)Células tumorais PC3 foram recentemente cultivadas durante 6 horas após o plaqueamento a 60% de confluência em disco de vidro revestidas por colagénio. As células foram fixadas directamente em 37 ° C 4% de PFA e colocado numa incubadora a 37 ° C durante 20 min para preservar nanopodia. Nanopodia (setas brancas) e F-actina (setas rosa) foram coradas utilizando imunofluorescência anti-TM4SF1 Ab e faloidina, respectivamente. A caixa de inserção mostra nanopodia em maior ampliação. Esta imagem representativa mostra que a expressão TM4SF1 em células PC3 é heterogênea; uma célula PC3 com forte coloração TM4SF1 (seta amarela) produzida longo nanopodia e está rodeado por duas células PC3 fracamente TM4SF1 corados (setas vermelhas). Resíduos Nanopodia no bordo de fuga (ib) indicam a direção do movimento de células PC3 durante o período de cultura de células de 6 horas. Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 3. Visualização de nanopodia através tetraspanina CD9. (A) HUVEC foram recentemente cultivadas durante 6 horas após o plaqueamento a 60% de confluência num disco de vidro revestidas por colagénio. As células foram fixadas em 37 ° C 4% de PFA e nanopodia (setas brancas) foram revelados por meio de anti-CD9 Ab. F-actina (setas rosa) foi manchada usando phalloidin. Esta imagem representativa mostra que CD9 também localiza a nanopodia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Nanopodia são finos canais de membrana celular que ligam firmemente à matriz através TMED e pode se estender mais do que 100 mm a partir de uma célula móvel polarizada para sentir o ambiente e mediar interações intercelulares 2,3. Nanopodia aderir à matriz tão firmemente que os resíduos são deixados para trás, como os movimentos de células de distância (Figuras 1 e 2). Nanopodia assim nos permitem estudar como as células sentir seu ambiente e determinar o caminho do movimento celular, e como as mudanças de expressão gênica ou drogas tratamento movimento. No entanto, devido à fragilidade dessas finas (100-300 largura mM) estruturas de membrana, o cuidado deve ser tomado a fim de preservá-los.
A fim de registrar fielmente as atividades celulares sem perturbar nanopodia, e estudar como condições experimentais afetar as atividades nanopodia eo caminho de movimento celular, deve-se primeiro verificar se as células crescem de forma eficaz em meio completo antes pursuing o experimento. Células endoteliais normais saudáveis primários, como HUVEC, em fresco EGM2-MV meio de cultura completo, normalmente, dividir aproximadamente a cada 18 horas durante a fase log de crescimento dentro de seis passagens de sua cultura. Deve-se evitar o uso de HUVEC que são maiores do que a passagem-6 como números mais altos de passagem vai levar a aumento do número de células senescentes ou binucleares na cultura 7 e vai afetar a capacidade das células para polarizar e produzir nanopodia 2. Células tumorais da próstata PC3 são mais estáveis às culturas (observação não publicada), mas deve-se ainda evitar o uso de células mais de dez passagens de sua remoção do estado congelado.
Células aderentes saudáveis normalmente anexar discos revestidos de colágeno dentro dos primeiros 30 minutos após eles são semeadas, seguido logo depois por polarização celular. Assim, deve-se esperar para ver a maioria das células endoteliais no estado polarizado no fim da primeira hora de incubação. Se ummaioria das células endoteliais não anexar a superfície de vidro, em seguida, verificar se (a) colágeno passou da data de validade, (b) tripsinização durante a colheita de células era muito rigoroso, ou (c) as células são insalubres. Células PC3 polarizar mais lento do que as células endoteliais, mas deve demonstrar a morfologia polarizada dentro de 2 horas após a semeadura. Se a contaminação ocorre na cultura, em seguida, examinar se os discos de vidro ou fórceps foram devidamente esterilizados. Como alternativa, pode-se considerar o uso de lâminas de câmara; o protocolo descrito aqui sugere a utilização de discos de vidro em placas de cultura de 24 poços a fim de poupar o custo e para manipular mais facilmente um grande número de amostras.
Métodos convencionais de positividade, o uso de PBS para lavar as células antes de adicionar temperatura ambiente fixador, facilmente perturbar estruturas celulares finos como nanopodia e irá destruí-los durante o processo de coloração. Isto é principalmente devido ao fato de que as tensões físicas, como flutuações de temperatura durante FIXAÇÃO celularesem PBS ou lavagem rigorosa durante o processo de coloração são as principais causas da fragmentação ou remoção de estruturas nanopodial. Com três mudanças metodológicas simples - (i) não perturbe estado de polarização celular por lavagem com PBS, antes da fixação, (ii) a fixar as células directamente em 37 ° C pré-aquecido PFA e incubar as células a 37 ° C durante a fixação, e (ii) lavar suavemente células em PBS temperatura ambiente - nanopodia são largamente preservada Figura 1 mostra como as temperaturas do PFA e PBS afectar preservação de nanopodia em células endoteliais cultivadas, a Figura 2A mostra que a expressão TM4SF1 é heterogénea em células PC3, e que as células com a coloração mais forte TM4SF1 exibir o mais longo. nanopodia. Temperatura é conhecido por afetar as atividades de F-actina e tubulina integridade 8,9. Assim, as células de fixação à mesma temperatura, em que as células foram cultivadas (isto é 37 ° C, no protocolo descrito aqui) é susceptível de melhor preservar o estado celular polarizada (
PFA não é o único reagente utilizado na fixação; solventes orgânicos, como metanol, etanol e acetona também são freqüentemente utilizados na fixação das células para a imunocoloração 10.O fixador é muitas vezes melhor decidida pelo local epitopo de um anticorpo específico utilizado na marcação (dados não publicados). Para o anticorpo anti-humano TM4SF1 rato que reconhece os domínios extracelulares do TM4SF1 (Millipore; utilizada neste estudo), PFA é o único fixador, que revela TMED em mancha imune, indicando que outros solventes orgânicos destruir o epitopo. Em contraste, anticorpo de coelho anti-humano policlonal de anticorpos TM4SF1 Acris (dados não mostrados), cujo epitopo se localiza em dezoito aminoácidos próximos da região N-terminal, também trabalha com células fixas de etanol. No entanto, o anticorpo Acris não produz uma boa coloração TM4SF1, provavelmente porque o epitopo N-terminal está preocupado por interacções com TM4SF1 molécula citosólica (s) que cobrem parcialmente o epitopo.
Triton X-100 é um surfactante não iónico e é muitas vezes utilizado na mancha imunológica com o objectivo de permeabilização de membranas da célula e reduzir a tensão superficial de soluções aquosas 11,12. However, essa capacidade também traz o risco de solubilizar as proteínas da membrana. TM4SF1 é completamente removida da superfície da célula por Triton X-100 a concentrações superiores a 0,05% 2,3. Por esse motivo, apenas um tratamento de 1 h com 0,01% de Triton X-100 antes da adição do anticorpo primário é usado no método descrito aqui. Este tratamento permeabiliza a membrana suficiente para permitir TM4SF1 peri-nuclear a ser bem avaliada pelos anticorpos, preservando ao mesmo tempo a maioria TM4SF1 sobre a membrana celular. Para a coloração de dupla TM4SF1 com proteínas localizadas no núcleo, utilizar 0,03% de Triton X-100 na etapa de pré-incubação se 0,01% de Triton não funciona. Isto irá facilitar o Triton X-100 de perfuração da membrana nuclear.
TM4SF1 é altamente específica para células endoteliais e células tumorais; a maioria dos outros tipos de células, ou não expressar TM4SF1 ou expressá-lo em um nível muito baixo de 2,3. No entanto, tetraspanins clássicos - uma família que engloba trinta e três membros including CD9, CD81, CD151 e - são ubiquamente expressa 6, e também pode ser encontrado em domínios de membrana em nanopodia 2,3 (Figura 3A). Assim, a coloração tetraspanins clássicos através do mesmo método de coloração imunológica utilizados para TM4SF1 pode permitir que os estudos de nanopodia em tipos de células que não expressam TM4SF1. Células tumorais PC3 que expressam TM4SF1 altamente tendem a mover-se continuamente num sentido único, enquanto que as células PC3, que expressam fracamente TM4SF1 não têm uma direcção claramente definida de movimento (Figura 2A e dados não publicados). Nível de expressão TM4SF1 em células tumorais é conhecida por estar correlacionada com o seu potencial metastático, 13, e as investigações estão actualmente a capacidade das células tumorais de ligação em curso 'para expressar e produzir TM4SF1 nanopodia ao seu potencial metastático.
Em resumo, o domínio de métodos eficazes para a coloração nanopodia permite investigadores para rastrear o caminho do movimento celular através nanopodia residues, estudar como as células sentir seu ambiente para o movimento, como o movimento da célula é modificado pela alteração dos níveis de genes (ou superexpressão ou knockdown de genes de interesse) de expressão. Nanopodia representam uma nova ferramenta para a investigação de polarização celular e movimento celular.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Reconhecemos Dr. Harold Dvorak para discussões úteis, incluindo a sugestão de tentar fixação em 37 ° C PFA. Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder P01 CA92644 e por um contrato da Fundação Nacional para Pesquisa do Câncer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass disks | Fisher Scientific | 12-545-82 | 12 mm diameter |
| Glass jar | Fisher Scientific | 02-912-310 | Certified Clean Clear Glass Straight-Sided Jars, 4 oz |
| Glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides |
| 50 ml Falcon tube | BD Falcon | 352070 | 50 ml high-clarity polypropylene conical centrifuge tube, 16,000 rcf rating. Sterile. |
| 15 ml Falcon tube with Styrofoam rack | Corning | 430790 | Corning 15 ml PP Centrifuge Tubes |
| Sharp forceps | Fisher Scientific | 13-812-42 | Dissecting Extra Fine Pointed Splinter Forceps |
| 24-well Cell culture plate | BD Bioscience | 353047 | 24-well Cell Culture Plate |
| 150 mm Cell culture plate | BD Bioscience | 353025 | 150 mm cell culture plate |
| 19 G 1 ½ Syringe needle | BD Bioscience | 309635 | 19 G 1 ½ |
| Ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2701 | Decon's Pure Ethanol 200 Proof |
| Collagen solution | BD Bioscience | 354249 | Collagen I, High Concentration, rat tail, 100 mg |
| Trypsin/EDTA | Cellgro | 25-053-CI | 0.25% Trypsin-EDTA 1x |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate |
| 10x PBS | Affymetrix | 75889 5 LT | PBS, 10x Solution, pH 7.4 |
| PFA (paraformaldehyde) | Affymetrix | 19943 1 LT | 4% in PBS |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135-500ML | Fetal Bovine Serum |
| EGM2-MV | Lonza | CC-3162 | EGM-2 BulletKit, EBM-2 Basal Medium 500 ml and EGM-2 SingleQuot Kit Supplement & Growth Factors |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002-25G | Solubilized in water. 4% stock solution and working concentration is 0.4%. |
| Mouse anti-human TM4SF1 antibody | Millipore | MAB3127 | Epitope is located in extracellular domain |
| Mouse anti-human CD9 antibody | BD Bioscience | 555370 | Epitope is located in extracellular domain |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouse 2nd antibody | Life Technologies | A-21202 | Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) |
| Phalloidin | Chemicon | 90324 | Rhodamine-conjugated Phalloidin |
| Anti-fade mounting media | Life Technologies | P-36931 | ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI |
| 70% Ethanol | 17.5 ml of ethanol (200 proof) 7.5 ml of double-deionized water |
||
| 10x PBS (make 200 ml) | 20 ml of 10x PBS 180 ml of double-deionized water |
||
| 20% Triton X-100 (make 20 ml) | 4 ml Triton X-100 16 ml double-deionized water |
||
| 4% NaN3 (make 25 ml) | 1 g of NaN3 25 ml of double-deionized water |
||
| 50 ng/ml Bovine collagen solution in PBS (make 5 ml) | Stock solution of 50 μg/ml (50 ml) 830 μl of Collagen I (3 mg) 50 ml PBS |
||
| ICC Blocking Buffer (50 ml) | 49 ml PBS 2% FBS (add 1 ml) 0.04% NaN3 (add 100 μl of 4% NaN3) |
||
| ICC Blocking Buffer/0.01% Triton X-100 (make 50 ml) | 50 ml of ICC Blocking Buffer 25 μl of 20% Triton X-100 |
||
| HUVEC | Lonza | C2517A | www.lonza.com |
| PC3 | ATCC | CRL-1435 | www.atcc.org |
| Cell culture hood | NuAIRE | Nu-425-600 | NU-425 (Series 60) Biological Safety Cabinet |
| 37 °C, 5% CO2 Cell culture incubator | CellStar | QWJ300DABA | Cellstar CO2 Water Jacketed Incubator |
| Heating pad | K&H Manufacturing | 1020 | K&H Lectro Kennel Heated Pad with Free Fleece Cover (www.amazon.com) |
| Centrifuge | Sorvall | T6000B | Sorvall T6000 (B) Benchtop Centrifuge |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemocytometer |
References
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