Summary
Nanopodia bir hücrenin ön ön veya arka arka 100 mikron kadar uzanır ve hücresel ortamı anlamda ince ama kırılgan zar kanallardır. 37 ° C'de, hafif bir yıkama, ve etanol, metanol veya aseton gibi bir organik çözücü önlemeyi ve daha yüksek Triton X-100 konsantrasyonları doğrudan tespiti, bu hücresel yapılar gözlemlemek için gereklidir.
Abstract
Kültür yapışan hücreler hareketi ve hücreler arası etkileşimleri desteklemek için polarize durumunu korumak. Nanopodia, ince uzun, TM4SF1 (Transmembran-4-L-altı ailenin-1), imüno-lekeleme yoluyla görselleştirilebilir endotel ve kanser hücrelerinde büyük ölçüde F-aktin-negatif zar tahminleridir. 100-300 mikron çapında TMED de TM4SF1 kümeleri 14 kadar bireysel TM4SF1 moleküllere 3 ihtiva eden (TM 4SF1 e mikro d omains nriched). TMED 1 μ m 'başına TMED 3 ve sıkıca matrisine nanopodia çapa düzenli aralıklarla nanopodia boyunca aralıklı olarak düzenlenmiştir. Bu polarize endotel veya tümör hücrelerinin ön ön veya arka arkaya gelen daha 100 μ m uzatmak nanopodia sağlar ve MATR üzerinde geride olmak zar artıkları olurix hücre uzaklaşıyor zaman. TMED ve nanopodia nedeniyle aşırı kırılganlık ve sıcaklık hassasiyeti göz ardı edilmiştir. Rutin yıkama ve tespit yapısını bozabilir. Nanopodia lekelenme% 0.01 Triton X-100 kısa süreli maruz bırakma ve ardından, 37 ° C 'de paraformaldehit (PFA) doğrudan tespit ile korunur. Hücre biyolojisinde yeni ufuklar açmak Nanopodia: algılamak ve bir mesafede diğer hücreleri belirlemek, yakın temas sırasında hücreler arası etkileşimleri başlatabilir ve hareket, çoğalma dahil sinyal mekanizmaları, hücrelerin çevrelerini nasıl hissettiğinin anlayışımızı yeniden şekillendirmek ve hücre için söz veriyorum -hücre iletişimi. TM4SF1 türetilmiş nanopodia çalışmak için geliştirilen yöntemler, klasik tetraspanins, özellikle de her yerde bulunan bir ifade CD9, CD81 ve CD151 vasıtasıyla diğer hücre tiplerinde meydana nanopodia çalışmaları için yararlı olabilir.
Introduction
Hareket için polarizasyon esnasında, hayvan hücreleri filopodia, lamellipodia, geri çekme lifler ve fırfır 1 de dahil olmak üzere, yüzeyleri dinamik, membran uzantıların, çeşitli uzanır. Son zamanlarda bu listeye eklenir nanopodia, ince bir yeni tanınan tipi (çapı 100-300 mikron), gibi filopodia gibi F-aktin yapılarının uzatılması için membran kanalları sağlamak uzun (en fazla 50-100 mikron uzunluğunda) membran projeksiyon vardı geri çekme ve elyaf ve bu leke pozitif TM4SF1 (Transmembran-4-L-altı family-1) kültürlenmiş endotelyal ve tümör hücreleri içinde 2,3 ile.
TM4SF1 ilk molekül endotel hücre proliferasyonu ve göçünde 2,3 önemli bir rol oynayan bir endotelyal hücre biyolojik olan keşfinden önce, bir tümör hücresi antijenine 4 olarak bilinen tetraspanin benzeri topolojisi ile bir proteindir. Immünofloresan boyama TM4SF1 perinuc lokalize olduğunu ortaya çıkardılear veziküller ve plazma zarına ve TM 4SF1 e nriched mikro d omains (TMED) içinde zenginleştirilmiştir. TMED çapa Matris nanopodia ve nanopodia 1-3 TMED / um uzunlukta bir düzenli aralıklı bantlı desen mevcut. Nanopodia tipik olarak bir hücrenin gelen ön uzanan ve hareket için hücre polarizasyon esnasında arka arkaya. Nedeniyle TMED bir firma yapışık doğaya, nanopodia uzak hareket olarak hücre içine geri geri edemiyoruz; terk nanopodia artıkları böylece hücresel hareketinin yolunu iz. F-aktin uzatma ve geri çekme için membran kanalları sağlamak ve hücreler arası etkileşim ve iletişimin 2,3 sitelerdir Nanopodia. Bu özellikler hücresel kutuplaşma, çevre hücresel algılama, hücre hareket yolu ve yön tayini, ve hücreler arası etkileşimler sırasında F-aktin aksamını altında yatan mekanizmaları incelemek için eşsiz bir fırsat sağlayacak nanopodia anlamına birnd iletişimi.
Nedeniyle TMED oldukça hidrofobik doğa ve nanopodia ince ve kırılgan membranöz doğaya, özel bakım TMED ve nanopodia korumak için alınması gerekir. Nanopodia ve ortak laboratuvar yöntemlerle TMED çıkarılması yıkımı sadece altmış üç yayınlar 1986 1 yılında ilk keşif beri ve üzerine 100-300 mikron microdomains içinde TM4SF1 zenginleştirme bilgi eksikliği tamamlamak için TM4SF1 çıktı neden olası bir nedeni hücre yüzeyi, 2009 2, endotel hücrelerinde TM4SF1 raporu kadar.
Geleneksel immüno-lekeleme yöntemleri yaygın hücreleri düzeltmek ve hücreler 5 permeabilize% 0.1 veya daha yüksek bir Triton X-100 konsantrasyonu kullanmak için, etanol, metanol veya aseton gibi organik çözücüleri kullanırlar. (I) 37 ° C% 4 PFA kullanımı ve 37 hücreleri düzeltmek: Burada anlatılan çalışmalar TMED ve nanopodia ortaya çıkarmak için geleneksel yönteme üç büyük değişiklikler uygulanmıştır76, C kuluçka makinesi, (ii) oda sıcaklığında nazik bir PBS yıkama uygulanır, ve (iii) Triton X-100, Triton X-100,% 0.03 'den daha fazla özü gibi, primer antikor ilave edilmeden önce hücreler nüfuz edilebilir kılınması için sadece kısa bir süre için en az% 0.03 oranında kullanmak TM4SF1.
Tüm tetraspanins hücre zarı 6 mikro bölgesini oluşturur ve bazı endotelyal ve tümör hücrelerine 2,3 in TMED ile colocalize. CD9, CD81 ve CD151 gibi tetraspanins her yerde bulunan bir ifade olarak, burada açıklanan boyama protokolü nanopodia fonksiyonunun çalışmalar için TM4SF1 olmayan pek çok farklı hücre tipleri için uzatılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Kollajen Kaplamalı Camlar Diskte Hücre Kültürü
- Bir cam kavanoz (4 oz) ve diskler sterilize etmek otoklav içinde yer cam disk (çapı 12 mm).
- Bir 50 ml Falcon tüpü içinde 25 ml% 70 etanol koyun ve bir hücre kültürü kaputu yerleştirin. Çözeltinin seviyesi 20 ml düşene kadar bu çözelti, birden çok kez tekrar edilebilir.
- Cam disk kolu için kullanmadan önce, 5 dakika boyunca% 70 etanol içinde bir ekstra ince nokta ile keskin bir forseps yerleştirin.
- Dikkatlice tüp dışında forseps kaldırmak ve kapağını kapatın, daha sonra yavaşça 2 dakika boyunca hava ile kuruması için tüpün üstüne etanol tedavi forseps yerleştirin. Forseps ucu kaputu şey dokunmak izin vermeyin.
- Cam kavanoz dışında bir steril cam diski kapmak ve 24-yuvalı hücre kültürü plakasının bir kuyu içine yerleştirmek için steril forseps kullanın. Kuyu istenen sayıda diskler ile doldurulan kadar tekrarlayın.
- Bovine kolajen çözeltisi 500 ul (koyun50 ng / ml) bir cam disk içeren ve en az 30 dakika boyunca 37 ° C,% 5 CO2, hücre kültürü yetiştirme cihazı yerleştirmek her kuyuya. Daha uzun bir inkübasyon hiçbir zararı yoktur.
- Hasat HUVEC (insan göbek damar endothelial hücreleri) ya da daha önce PC3 tripsinizasyon ile 150 mm hücre kültürü plakasında yetişen ve tam kültür ortamı kullanılarak tripsin aktivitesini bloke edilmiştir (prostat tümör hücreleri). Bir 15 ml Falcon tüpü içine hücreleri toplamak.
- Hücre sayısını ve canlılığı% 90 daha büyük olduğundan emin olun.
- 4 ° C'de 10 dakika boyunca 200 x g santrifüj ile hücreler Pelet Süpernatant kaldırmak.
- 10 5 hücre / ml olacak şekilde seyreltmek hücreleri için kültür ortamı kullanın. Hücreleri buz üzerinde yerleştirin.
- Hücre kültürü kaputu kolajen ve yavaşça aspire cam diskler kolajen ile kaplanmış edildiği de her bir hücre süspansiyonu, 500 ul koyun. 24 oyuklu bir plaka içerisinde, 5 x 10 4 hücre / çukur% 60 conf verecekHUVEC ve PC3 hücreleri için% 30 akma luency. Not: yüksek hücre yoğunluğu için daha fazla hücre süspansiyonu ekleyin.
- Kültür, 37 ° C, 1 saat, 2 saat, 4 saat, 6 saat, ya da nanopodia faaliyetleri ve hücre geçişi izlemek için 24 saat boyunca% 5 CO2 inkübatörü içinde hücreler. Tipik olarak, hücreler ilk 30 dakika içinde cam disk eklemek, daha sonra Polarize ve ilk bir saat içinde göç başlar ve ilerleyen saatlerde arası etkileşimleri ve hücre bölünmesini gerçekleştirin.
2. Hücre Fixation
- Her iyi hücrelerini düzeltmek için 500 ul% 4 PFA (paraformaldehid) ihtiyacınız olacak. Ticari olarak üretilen ya da taze% 4 PFA kullanılabilir yapılmış ya. Hazırlanan kuyu sayısına göre gerekli PFA miktarını hesaplayın ve bir 15 ml Falcon tüpüne PFA yerleştirin. DİKKAT: paraformaldehıt bir kanserojen olabilir.
- 37 ° C inkübatör yerinde zaten bir strafor stand şahin tüp koymak. Savaş için 30 dakika boyunca inkübatör tüpü terk37 ° C'ye kadar PFA m
- Kültürü kaputu bir ısıtma pedi yerleştirin ve açın.
- 24-iyi hücre kültürü plakası ve kuluçka prewarmed PFA çıkarın ve ısıtma yastığı üstüne yerleştirin.
- Bir kuyudan orta aspire bir elinizi kullanın ve hemen sonra hafifçe iyi kenarı boyunca kuyuya 500 ul PFA slayt için diğer elinizi kullanın. Kolay aspirasyonu için, o açıyla istikrarlı olduğunu böylece Strafor standı dayayarak, yaklaşık 45 ° de kültür plaka eğin. Bu, aspirasyon ile kültür içinde hücreleri bozmadan oyuğuna PFA çözeltisi eklenerek kolaylaştıracaktır. Bu hücre faaliyetleri, orijinal hücre yapısını korumak için en önemli adımdır.
- Bir cam disk ile tüm kuyuları PFA almış kadar işlemi tekrarlayın. Not: kuyudan önceden varolan çözüm değiştirmek için gereken tüm adımlar aynı aspirasyon prosedürleri uygulayacaktır.
- 5 dakika boyunca 37 ° C 'de plaka koyun. Geri kültürü kaputu plaka almak ve adım 2.5 açıklandığı gibi Strafor karşı yatırın. Nazikçe bir toplama tüpüne kuyudan PFA aktarmak için bir elinizi kullanın; hemen sonra da en az 500 ul oda sıcaklığında PBS yerleştirmek için diğer elinizi kullanın. Tüm çukurlar yıkanıp sonra, geri ve de her bir kere daha PBS yıkama tekrarlayın. Tehlikeli atık kabı içine toplanır PFA boşaltın.
- PBS,% 2 fetal sığır serumu eklenerek ICC bloke tamponu hazırlayın. % 0.04 sodyum azid (% 20 stok çözeltisinden seyreltilmiş), bir koruyucu madde olarak ilave edilir. DİKKAT: Sodyum azid zehirli bir bileşiktir. Tampon bakteriyel kontaminasyon olmaksızın uzun bir süre için 4 ° C'de saklanabilir.
- Yine de her iyi PBS kaldırmak için aspire ve hemen sonrasında ICC engelleme tampon 500 ul ekleyerek aracılığıyla döngüsü bir kez, bir stand karşı eğik kültür plaka ile. Hücreler artık immunofloresan boyama için hazır bulunmaktadır. Gerekirse,Sabit hücre TM4SF1 proteinin önemli bir kayıp olmaksızın bir hafta boyunca 4 ° C'de buzdolabında saklanır.
3. Nanopodia arasında TM4SF1 İmmünofloresan boyanması
- Her bir oyuğa olarak, Triton X-100% 0.01 ihtiva eden yeni bir bloke edici tampon ile 500 ul bloke edici tampon ICC değiştirmek ve 1 saat boyunca oda sıcaklığında bekletin. Hücre zarlarından TM4SF1 kaldırmak gibi% 0.03 Triton X-100 daha yüksek kullanmayınız. Boyama hemen başlamak için hazır olup olmadığını PBS adım 2.10 ile yıkanmış hücrelerini doğrudan Triton içeren engelleme tampon taşınmış olabilir.
- ICC bloke etme tampon maddesi içinde 0.5 ug / ml anti-birincil TM4SF1 (ya da anti-CD9) antikoru seyreltin.
- Her bir oyuğa olarak, ICC/0.01% Triton tamponunu çıkarın ve anti-TM4SF1-antikor çözeltisi 300 ul ile değiştirin. Oda sıcaklığında 2 saat inkübe ya da 4 ° C'de bir gece bekletin
- En az 500 ul PBS ile daha iyi her yıkayın. 3x tekrarlayın; Her zaman le de vermekinkübasyon süresi ast 5 dak.
- Ikinci bir antikoru ve phalloidin çözelti hazırlayın ICC bir Alexa 488 etiketli eşek anti-fare ikincil antikoru (2 ug / ml nihai konsantrasyon) 1000 kat dilüsyonu ve Phalloidin 1000 x seyreltme (50 ng / ml nihai konsantrasyon) kullanılarak, blokaj tamponu.
- PBS çıkarın ve her bir oyuğa, ikincil antikor ve phalloidin çözeltisi 300 ul ilave edin ve 2 saat boyunca inkübe ya da 4 ° C'de bir gece bekletin
- Yıkama başına en az 5 dakika inkübasyon ile PBS yıkama adımları tekrarlayın. Son yıkamadan olarak, 1 saat boyunca PBS içinde de her bırakın.
- Bir cam slayt üzerinde anti-solmaya montaj medya tek bir damla (~ 10 ul) bırakın.
- Bend sert bir yüzeye hafifçe bastırarak şırınga iğnesi, 90 ° 19 G 1 ½ ucu. Bükülmüş iğne tutun ve yavaşça iyi bir cam diski yukarı kaldırın, ve keskin forseps kullanarak diski kavramak için diğer elinizi kullanın tek bir elinizi kullanın.
- Cam diski Turn &# 160; cam slayt hücre yan kişiyi montaj medya icar yüz aşağı. Yavaşça cam diski yerleştirin ve oda sıcaklığında karanlık bir yerde gece boyunca kurumaya bırakın.
- Görüntü immünofloresans lekeli nanopodia devam, ya da -20 ° C'de slayt kutuda saklayın slaytlar Slaytlar -20 ° C'de birkaç ay boyunca görüntülenebilir kalacaktır
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Adım 1 için:
(Örneğin HUVEC'e ve bu çalışmada kullanılan PC3 olarak) hücreler normal büyümek mümkün ise, hücreler numaralı seribaşı sonra, 30 dakika içinde kollajen kaplı disk takmak Polarize ve kısa bir süre sonra mobil olmak ve ileride kendi yolunu nanopodia uzatacak hareketin. Şekil 1A ve 1B, sırasıyla bir polarize ve çoğalan HUVEC. Şekil 2A, bir cep halinde polarize PC3 hücreleri sini göstermektedir.
Adım 2:
37 ° C'de% 4 PFA içinde ön ısıtma ile, 20 dakika ve oda sıcaklığında PBS ile yumuşak yıkama için 37 ° C'de hücreler sabitleme, hücre durumları iyi korunmuş olmalıdır. Genellikle, izole bireysel HUVEC (Şekil 1A, 1) ya da PC3 (Şekil 2A) hücreleri hücreler hücre bölünmesi durumunda olmadıkça, bir polarize morfoloji göstermektedir (Şekil 1B, 1). Olacak Hücreler arası etkileşimlerHücre bağlantı oluşumu (Şekil 1C, 1) 'den gelen, aynı zamanda yaygın olarak görülmektedir. Nanopodia hücre kenarına görünmelidir ve F-aktin genellikle hücreye nanopodia proksimal bölümleri de mevcut olacaktır. Soğuk, geri nanopodia zar kanallarının geride bırakarak hücre içine geri çekmek için F-aktin neden olur. Optimumun altında sıcaklık, 4 ° C PFA tespit ve soğuk PBS kullanılarak yıkama örneklerde gösterildiği gibi, (Şekil 1A, 2), çoğalan hücreleri (Şekil 1B, 2), ve yapay arası birleşme boşluklar üreten rahatsız ve polarize hücrelerde nanopodia yapı yok edecek (Şekil 1C, 2).
Adım 3 için:
TM4SF1 dahil olmak üzere birçok zara bağlı proteinler, Triton X-100 için çok hassastır ve% 0.03 'den daha yüksek konsantrasyonlarda 2,3 kullanıldığı takdirde, hücre yüzeyinden çıkarılır. Hücre yüzeyi TM4SF1, P çoğu korumak amacıylaFA sabit hücreleri sadece% 0.01 Triton X-100, Triton X-100 içeren bir normal bloke tamponu içinde seyreltilmiş olan anti-TM4SF1 birincil antikora geçmeden önce bir saat için, bloke etme tampon içeren tedavi edilmelidir. Nanopodia ince ve uzun membran projeksiyonlar ve TMED ile matris takmak gibi, TMED yoğunluk olasılıkla (Şekil nanopodia artıkları ile hücre hareket yolunu göstermek ve izlemek için Photoshop gibi görüntü işleme yazılımı parlaklık ve kontrast fonksiyonları ile gelişmiş olması gerekir 1, 2 takmalar).
Şekil 1. Endotelyal hücre hareketi, hücre bölünmesi, ve bağlantı oluşumu sırasında Nanopodia içermektedir. HUVEC 6 saat düşsel için taze kültürlendir kollajen kaplı cam diskte% 60 izdiham kaplama. Hücreler, hücreler PBS ile ön yıkama olmadan direkt olarak PFA, 37 ° C'de% 4, sabit ve 20 dakika tespit zaman, ya da (2) geleneksel bir boyama yöntemi sırasında 37 ° C inkübatör içine yerleştirildi (1) modifiye edilmiş bir yöntemi kullanarak tespit edildi Hücreler, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca% 4 PFA içinde iki kez oda sıcaklığında PBS ile yıkanmış ve sabit nerede. Nanopodia, TMED bir aralıklı, bantlı desen (beyaz oklar) ile işaretlenmiş ve sık sık hücreye yakın kısımlarında phalloidin boyanmış F-aktin (pembe oklar) içine olan ince ve uzun zar uzantıları, immünofloresans anti-TM4SF1 kullanılarak boyandı Ab. Üç temsil HUVEC görsel (A) polarizasyon, (B), hücre bölünmesi, ve (C) arası bağlantı oluşumu sırasında nanopodia görünümünü göstermek için ele geçirildi. Ankastre kutuları nanopodia yüksek büyütme göstermektedir. Sırasında (A) ya da polarize retracteyapıları, büyük ölçüde yıkanarak çıkarıldı ve oda sıcaklığında PBS ve PFA hücreleri tespit edilmiştir, oysa d hücre durumları (B, C), nanopodia çıkıntılar, doğrudan 37 ° C PFA hücreleri sabitleme korundu. (C) 37 ° C PFA sabitleme birleşme hücreler geri neden soğuk havalarda rahatsız oysa en F-aktin (pembe oklar) ihtiva eden bir nanopodia göre köprülü hücreler arasında bir boşluk oluşturarak, hücreler arası birleşme yerleriyle (beyaz oklar) koruyan ve bir (beyaz oklar) yok büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.
Şekil 2. PC3 tümör hücre hareket yönünü göstermektedir Nanopodia. (A)PC3 tümör hücreleri yeni kollajen kaplı cam disk üzerinde% 60 izdiham kaplama sonra 6 saat süre ile kültüre edildi. Hücreler, 37 ° C% 4 PFA içinde doğrudan sabit ve nanopodia korumak için 20 dakika için bir 37 ° C inkübatör içine yerleştirildi. Nanopodia (beyaz oklar) ve F-aktin (pembe oklar), sırasıyla, anti-TM4SF1 Ab ve Phalloidin kullanılarak boyandı immunofloresans idi. Içerlek kutusu yüksek büyütmede nanopodia gösterir. Bu temsili görüntü PC3 hücrelerinde TM4SF1 ifade heterojen olduğunu gösterir; Güçlü TM4SF1 boyama (sarı ok) ile bir PC3 hücre uzun nanopodia üretilir ve iki zayıf TM4SF1 lekeli PC3 hücreleri (kırmızı oklar) ile çevrilidir. Firar kenarında Nanopodia kalıntıları (ib) 6 saatlik hücre kültürü döneminde PC3 hücre hareketin yönünü gösterir. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Şekil 3,. Tetraspanin CD9 yoluyla nanopodia görselleştirilmesi. (A) HUVEC kollajen kaplı cam disk üzerinde% 60 confluency kaplama sonra 6 saat boyunca taze kültürlenmiştir. Hücreler 37 ° C% 4 PFA ve nanopodia (beyaz oklar), anti-CD9 Ab yoluyla açığa alındı tespit edildi. F-aktin (pembe oklar) Phalloidin kullanılarak boyandı. Bu temsili görüntü CD9 da nanopodia lokalize olduğunu göstermektedir. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nanopodia sıkıca TMED aracılığıyla Matris takmak ve ortamı duygusu ve hücreler arası etkileşimleri 2,3 aracılık için polarize mobil hücreden fazla 100 mikron uzatabilirsiniz ince hücresel membran kanalları vardır. Bu yüzden sıkıca kalıntıları uzak hücre hamle olarak geride kaldığını matrix uymak Nanopodia (Şekil 1 ve 2). Nanopodia böylece bizi hücrelerin çevrelerini nasıl hissettiğinin çalışma ve hücre hareketin yolunu belirlemek için, izin ve nasıl gen ifadesi ya da ilaç tedavisi değişiklikleri hareketi. Ancak, bu ince (100-300 mikron genişlik) membran yapıların kırılganlığı, dikkatli onları korumak için alınması gerekir.
Sadakatle nanopodia bozmadan hücresel aktiviteleri kaydetmek için, ve deneysel koşulları nanopodia faaliyetlerini ve hücre hareketin yolunu nasıl etkilediğini incelemek amacıyla, bir ilk hücreler purs önce tam bir ortamda etkin bir şekilde büyümek olduğunu doğrulamalısınızDenemeyi uing. Örneğin HUVEC gibi normal sağlıklı primer endotel hücreleri, taze EGM2-PD tam kültür ortamı içinde normal olarak kendi kültür içinde altı geçişleri büyüme kendi log fazı esnasında yaklaşık olarak her 18 saat böler. Bir yüksek geçiş numaraları kültüründe 7 yaşlanmış veya iki çekirdekli hücrelerin sayısının artması yol açacaktır ve Polarize ve nanopodia 2 üretme hücrelerinin yeteneğini etkileyecek gibi geçit-6 daha fazladır HUVEC kullanımını önlemek gerekir. PC3 prostat tümörü hücresi kültürlerinin (yayınlanmamış gözlem) daha stabil olan, ama yine de donmuş halde kendi kaldırma hücrelerin fazla on pasajlar kullanımını önlemek gerekir.
Bu tohumlanmış olan sağlıklı sonra yapışkan hücreler tipik olarak, ilk 30 dakika içinde kollajen kaplı diskler eklenecektir, hücre kutuplaşmadan kısa bir süre sonra takip etti. Böylece bir inkübasyon ilk saat sonunda bir polarize halde en endotel hücrelerini görmek için beklemek gerekir. Birendotel hücrelerinin çoğunluğu, (a) kollajen son kullanma tarihi geçmiş olup olmadığını kontrol, sonra cam yüzeyine bağlamak gerekmez (b) hücre hasat sırasında trypsinization çok sıkı idi, ya da (c) hücreler sağlıksız. PC3 hücreleri endotel hücrelerinin daha yavaş kutuplaştırırlar, ancak tohumlama sonra 2 saat içinde bir polarize morfoloji göstermelidir. Kirlenme kültürü oluşursa, o zaman cam diskler veya forseps düzgün sterilize edilip inceleyin. Alternatif olarak, bir odasının slaytlar kullanarak düşünebilirsiniz; Burada açıklanan protokol maliyet tasarrufu ve daha kolay örnekleri, çok sayıda işlemek için 24 oyuklu kültür plakaları içinde cam disklerin kullanımını önermektedir.
Konvansiyonel İmmünbüyanmanın yöntemleri, nanopodia gibi ince gözenekli yapıları rahatsız kolayca, oda sıcaklığı Fiksatif eklemeden önce hücreleri yıkayın ve boyama işlemi sırasında onları yok edecek PBS kullanımı. Bu aslında büyük ölçüde nedeniyle olduğunu hücre fixati sırasında sıcaklık dalgalanmaları gibi fiziksel streslerboyama işlemi veya titiz PBS yıkama sırasında parçalanması veya nanopodial yapıların kaldırılması başlıca nedenleridir. Üç basit metodolojik değişikliklerle - (i), tespit önce PBS ile yıkanarak hücre polarizasyon durumunu rahatsız yok (ii) PFA önceden ısıtılmış 37 ° C de, doğrudan hücreleri düzeltmek ve sabitleme esnasında 37 ° C'de inkübe hücreleri, ve (ii) yavaşça yıkayın , oda sıcaklığında PBS içinde hücreleri - nanopodia büyük ölçüde korunur PFA ve PBS sıcaklıklar kültürlü endotelyal hücrelerde nanopodia korunması nasıl etkilediğini gösterir Şekil 1, Şekil 2A TM4SF1 sentezleme PC3 hücrelerinde heterojendir ve güçlü TM4SF1 boyama ile hücreler uzun gösterdiğini göstermektedir. nanopodia. Sıcaklık F-aktin ve tubulin faaliyetleri bütünlüğünü 8,9 etkilediği bilinmektedir. Bu durumda, ((bu, burada tarif edilen protokol 37 ° C) hücreleri büyütüldü hangi aynı sıcaklıkta daha polarize hücre durumunu korumak için muhtemel hücreler sabitleme
PFA tespit kullanılan tek reaktif değildir; , metanol, etanol ve aseton gibi organik çözücüler de sık sık 10 immün hücre tespitte kullanılır.En iyi sabitleyici genellikle boyama (yayınlanmamış veriler) kullanılan özel bir antikorun epitop konumu tarafından belirlenir. TM4SF1 hücre dışı alanları tanıyan fare anti-insan TM4SF1 antikor için (Millipore, bu çalışmada kullanılan), PFA diğer organik çözücüler epitopu yok olduğunu belirten, immün-boyama in TMED ortaya tek sabitleyici olup. Bunun aksine olarak, epitop N-terminal bölgesine yakın on sekiz amino asitler bulunur Acris (veriler gösterilmemiştir), ikinci tavşan anti-insan poliklonal antikor, etanol TM4SF1 sabit hücreleri ile de çalışır. Bununla birlikte, antikor Acris N-terminal epitop kısmen epitopu kapsar sitosolik molekül (ler) i ile TM4SF1 etkileşimleri tarafından meşgul edilir, çünkü muhtemelen iyi TM4SF1 boyama ortaya koymamıştır.
Triton X-100, bir iyonik olmayan yüzey aktif madde ve genellikle hücre zarının nüfuz ve sulu çözeltiler 11,12 yüzey gerilimini azaltmak amacıyla immün boyama kullanılır. However, bu özelliği aynı zamanda membran proteinleri eritmek riskini getiriyor. TM4SF1 tamamen 0.05 ila% 2.3 'den daha fazla Triton X-100 konsantrasyonları ile hücre yüzeyinden çıkarılır. Bu nedenle, primer antikor ilave edilmeden önce% 0.01 Triton X-100 ile sadece 1 saatlik tedavi burada açıklanan yöntem kullanılır. Bu tedavi, hücre zarı üzerinde en TM4SF1 korurken, iyi antikorlar değerlendirilecektir peri-nükleer TM4SF1 sağlayacak kadar membran permeabilizes. % 0.01 Triton çalışmıyorsa çekirdeğinde bulunan proteinlerle TM4SF1 çift boyama için, Ön kuluçka safhasında% 0.03 Triton X-100 kullanımı. Bu, nükleer membran Triton X-100 delinmesini kolaylaştırır.
TM4SF1 endotel hücreleri ve tümör hücrelerine karşı son derece özeldir; Diğer birçok hücre tipleri TM4SF1 ifade ya da çok düşük bir seviyede 2,3 de bunu ifade etmemekte ya. Ancak, klasik tetraspanins - otuz üç üye includin kapsayan bir aileg CD9, CD81 ve CD151 - her yerde bulunan bir 6 olarak ifade edilmiştir ve aynı zamanda nanopodia 2,3 (Şekil 3A) membran etki bulunabilir. Bu nedenle, TM4SF1 için kullanılan aynı bağışıklık-lekeleme yöntemiyle klasik tetraspanins lekeleme TM4SF1 bildirilmemektedir hücre tiplerinde nanopodia çalışmalarını sağlayabilir. TM4SF1 ifade PC3 tümör hücreleri son derece zayıf TM4SF1 ifade PC3 hücreleri hareket açıkça tanımlanmış bir yönü (Şekil 2A ve yayınlanmamış veriler) yok ise, tek bir yönde sürekli hareket etme eğilimi. Tümör hücrelerinde TM4SF1 ekspresyon düzeyi metastatik potansiyel 13 ile ilişkili olduğu bilinen ve soruşturmalar halen TM4SF1 ifade ve metastatik potansiyeli nanopodia üretmeye devam bağlantı tümör hücrelerinin yeteneği vardır edilir.
Özetle, boyama nanopodia için etkili yöntemlerden ustalık nanopodia yeniden yoluyla hücre hareket yolunu izlemek için araştırmacılar sağlarolan serin ve teronin hücreler, hücre hareketi genin (aşın veya ilgi duyulan gen yok etme ya da) ekspresyon seviyelerinin değiştirilmesi ile modifiye edilir nasıl hareket için çevrelerini anlamda nasıl çalışma. Hücre kutuplaşma ve hücre hareketi soruşturma için yeni bir araç temsil Nanopodia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz 37 ° C PFA fiksasyon denemek için öneri içeren yararlı tartışmalar için Dr Harold Dvorak kabul. Bu çalışma NIH hibe P01 CA92644 tarafından ve Kanser Araştırmaları Ulusal Vakfı bir sözleşme ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass disks | Fisher Scientific | 12-545-82 | 12 mm diameter |
| Glass jar | Fisher Scientific | 02-912-310 | Certified Clean Clear Glass Straight-Sided Jars, 4 oz |
| Glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides |
| 50 ml Falcon tube | BD Falcon | 352070 | 50 ml high-clarity polypropylene conical centrifuge tube, 16,000 rcf rating. Sterile. |
| 15 ml Falcon tube with Styrofoam rack | Corning | 430790 | Corning 15 ml PP Centrifuge Tubes |
| Sharp forceps | Fisher Scientific | 13-812-42 | Dissecting Extra Fine Pointed Splinter Forceps |
| 24-well Cell culture plate | BD Bioscience | 353047 | 24-well Cell Culture Plate |
| 150 mm Cell culture plate | BD Bioscience | 353025 | 150 mm cell culture plate |
| 19 G 1 ½ Syringe needle | BD Bioscience | 309635 | 19 G 1 ½ |
| Ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2701 | Decon's Pure Ethanol 200 Proof |
| Collagen solution | BD Bioscience | 354249 | Collagen I, High Concentration, rat tail, 100 mg |
| Trypsin/EDTA | Cellgro | 25-053-CI | 0.25% Trypsin-EDTA 1x |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate |
| 10x PBS | Affymetrix | 75889 5 LT | PBS, 10x Solution, pH 7.4 |
| PFA (paraformaldehyde) | Affymetrix | 19943 1 LT | 4% in PBS |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135-500ML | Fetal Bovine Serum |
| EGM2-MV | Lonza | CC-3162 | EGM-2 BulletKit, EBM-2 Basal Medium 500 ml and EGM-2 SingleQuot Kit Supplement & Growth Factors |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002-25G | Solubilized in water. 4% stock solution and working concentration is 0.4%. |
| Mouse anti-human TM4SF1 antibody | Millipore | MAB3127 | Epitope is located in extracellular domain |
| Mouse anti-human CD9 antibody | BD Bioscience | 555370 | Epitope is located in extracellular domain |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouse 2nd antibody | Life Technologies | A-21202 | Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) |
| Phalloidin | Chemicon | 90324 | Rhodamine-conjugated Phalloidin |
| Anti-fade mounting media | Life Technologies | P-36931 | ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI |
| 70% Ethanol | 17.5 ml of ethanol (200 proof) 7.5 ml of double-deionized water |
||
| 10x PBS (make 200 ml) | 20 ml of 10x PBS 180 ml of double-deionized water |
||
| 20% Triton X-100 (make 20 ml) | 4 ml Triton X-100 16 ml double-deionized water |
||
| 4% NaN3 (make 25 ml) | 1 g of NaN3 25 ml of double-deionized water |
||
| 50 ng/ml Bovine collagen solution in PBS (make 5 ml) | Stock solution of 50 μg/ml (50 ml) 830 μl of Collagen I (3 mg) 50 ml PBS |
||
| ICC Blocking Buffer (50 ml) | 49 ml PBS 2% FBS (add 1 ml) 0.04% NaN3 (add 100 μl of 4% NaN3) |
||
| ICC Blocking Buffer/0.01% Triton X-100 (make 50 ml) | 50 ml of ICC Blocking Buffer 25 μl of 20% Triton X-100 |
||
| HUVEC | Lonza | C2517A | www.lonza.com |
| PC3 | ATCC | CRL-1435 | www.atcc.org |
| Cell culture hood | NuAIRE | Nu-425-600 | NU-425 (Series 60) Biological Safety Cabinet |
| 37 °C, 5% CO2 Cell culture incubator | CellStar | QWJ300DABA | Cellstar CO2 Water Jacketed Incubator |
| Heating pad | K&H Manufacturing | 1020 | K&H Lectro Kennel Heated Pad with Free Fleece Cover (www.amazon.com) |
| Centrifuge | Sorvall | T6000B | Sorvall T6000 (B) Benchtop Centrifuge |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemocytometer |
References
- Chhabra, E. S., Higgs, H. N. The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures. Nat. Cell Biol. 9, 1110-1121 (2007).
- Shih, S. C., et al. The L6 protein TM4SF1 is critical for endothelial cell function and tumor angiogenesis. Cancer Res. 69, 3272-3277 (2009).
- Zukauskas, A., et al. TM4SF1: a tetraspanin-like protein necessary for nanopodia formation and endothelial cell migration. Angiogenesis. 14, 345-354 (2011).
- Hellstrom, I., Beaumier, P. L., Hellstrom, K. E. Antitumor effects of L6, an IgG2a antibody that reacts with most human carcinomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 7059-7063 (1986).
- Jang, Y. Y., Ye, Z., Cheng, L. Molecular imaging and stem cell research. Mol. Imag. 10, 111-122 (2011).
- Hemler, M. E. Tetraspanin functions and associated microdomains. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 801-811 (2005).
- Vasile, E., Tomita, Y., Brown, L. F., Kocher, O., Dvorak, H. F. Differential expression of thymosin beta-10 by early passage and senescent vascular endothelium is modulated by VPF/VEGF: evidence for senescent endothelial cells in vivo at sites of atherosclerosis. FASEB. 15, 458-466 (2001).
- Itoh, T. J., Hotani, H. Microtubule dynamics and the regulation by microtubule-associated proteins (MAPs). Uchu Seibutsu Kagaku. 18, 116-117 (2004).
- Caplow, M., Shanks, J., Ruhlen, R. L. Temperature-jump studies of microtubule dynamic instability. J. Biol. Chem. 263, 10344-10352 (1988).
- Pollice, A. A., et al. Sequential paraformaldehyde and methanol fixation for simultaneous flow cytometric analysis of DNA, cell surface proteins, and intracellular proteins. Cytometry. 13, 432-444 (1992).
- Macarulla, J. M., et al. Membrane solubilization by the non-ionic detergent triton X-100. A comparative study including model and cell membranes. Revista Espanola de Fisiologia. 45 Suppl, 1-8 (1989).
- Koley, D., Bard, A. J. Triton X-100 concentration effects on membrane permeability of a single HeLa cell by scanning electrochemical microscopy (SECM). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16783-16787 (2010).
- Chang, Y. W., et al. CD13 (aminopeptidase N) can associate with tumor-associated antigen L6 and enhance the motility of human lung cancer cells. Int. J. Cancer. 116, 243-252 (2005).
