Summary
组织工程化的成纤维细胞衍生的天然基质是一种新兴的工具来生成支持上皮细胞增殖和分化的基质衬底。这里应用此方法，以评估不同的基质细胞类型的肿瘤细胞生物学的影响的协议被提出。
Abstract
上皮细胞上嵌有间充质细胞的基质三维器官型培养物广泛用于研究上皮细胞分化和侵入。鼠尾I型胶原蛋白和/或基质从Engelbreth-的Holm-群小鼠肉瘤细胞衍生传统上被用作底物的模型矩阵或基质微环境在其中间充质细胞（通常是成纤维细胞）来填充。虽然使用这种矩阵实验是非常丰富的，可以说，由于一个蛋白质（如I型胶原）或基底膜成分和生长因子（如矩阵来自小鼠含量高的压倒一切的存在肉瘤细胞），这些基材都不最好的反映基质组成的基质细胞本身所作出的贡献。学习由初级真皮成纤维细胞分离自患者的肿瘤易发生，遗传起泡症（隐性营养不良产生的原生矩阵大疱性表皮松解），我们已经适应了现有的本地矩阵协议，研究肿瘤细胞的侵袭。成纤维细胞诱导产生自身的矩阵是长期的文化。这个天然基质，然后从培养皿中脱落细胞和上皮细胞被接种到它之前的整个共培养升至空气 - 液体界面。细胞分化和/或侵入然后可以评估随着时间的推移。这种技术提供了评估在3D设置的上皮 - 间充质细胞相互作用而不需要合成的或外国矩阵的唯一缺点是时间的长期需要产生的天然基质的能力。这里我们描述了该技术的应用来评估单个分子的由成纤维细胞所表达的能力，VII型胶原蛋白，来抑制肿瘤细胞的侵袭。
Introduction
在三维组织培养中使用的生物材料，使研究人员在生理条件更类似于体内环境比1概括的2D粘附和塑料衬底的下研究细胞行为在实验室中。特别是，阔步前行已与采用三维培养方法在气-液界面1-4建模层上皮。这种技术忠实地模仿角质形成细胞分化和肿瘤细胞的侵袭实现更高的灵活性和保真度的研究人员在研究这些过程。生物材料基板的选择模仿基质环境主要涉及使用I型胶原，Engelbreth - 霍尔姆 - 群小鼠肉瘤矩阵和去epidermized真皮。例如，癌相关成纤维细胞已经显示出通过间质上皮相互作用6,7朝向癌侵袭5，起始，和无进展促进磨片Ñ生长在这样的基底。
的金标准模仿基质环境中的肌肤，使用这种技术的最大和最广泛研究的分层上皮细胞，被视为被撤销epidermized人真皮（DED）。 DED的制备涉及经胰蛋白酶消化或物理结社从人类尸体皮肤3,4去除表皮。然而，进入这样的皮肤是非常困难的与临床相关机构实验室和患病真皮几乎是不可能获得的。作为替代方案，实验室经常使用的类型的组合I型胶原（从大鼠尾隔离）和/或Engelbreth - 霍尔姆 - 群小鼠肉瘤矩阵。
后发现在1927年由Nageotte 8，胶原蛋白可以很容易地用醋酸和盐沉淀中分离出来，其应用组织培养是由Huzel随后首创LA和他的同事9。胶原蛋白涂层被证明是优于玻璃为29株和组织外植体作为审问埃尔曼和Gey中9细胞培养。目前，胶原蛋白在组织培养中所使用的主要类型是从鼠尾腱中分离，并通常从商业来源购买。然而，其缺点为忠实基板概括的是，鼠尾胶原是不相同的人类胶原或人类真皮，其中I型和III型胶原蛋白是存在作为主要成分，并分离的大鼠尾胶原必然是分散。
Engelbreth -霍尔姆-群小鼠肉瘤矩阵是一种胶状蛋白质混合物通过培养Engelbreth -霍尔姆-群小鼠肉瘤细胞分泌的10。的主要成分是层粘连蛋白，IV型胶原蛋白，硫酸肝素蛋白多糖，巢蛋白和巢蛋白和这些蛋白质的精确比例将随每一批。除了结构上的亲teins，该矩阵也包含显著的生长因子如转化生长因子β，表皮生长因子，胰岛素样生长因子1，牛成纤维细胞生长因子，血小板衍生的生长因子，它会改变细胞行为11,12的水平。指向Engelbreth -霍尔姆-群小鼠肉瘤矩阵的庞大的复杂性，共有1,851蛋白质被确定在最近的蛋白质组学研究13。鉴于此矩阵的丰富性和复杂性，谨慎已经解释，并与它的使用11比较不同实验时，被告知。
我们的实验室有遗传性皮肤疾病，尤其是那些有倾向发展皮肤鳞状细胞癌（CSCC）14出浓厚的兴趣。在隐性营养不良型大疱性表皮松解（RDEB），严重的水泡病种系突变的COL7A1基因的情况下
在本文中用来概括的皮肤肿瘤基质微环境（原生基质）中的步骤，直接从体外初级基质细胞衍生的描述18。本地矩阵p由成纤维细胞的长期培养roduced被用作皮肤相当于测定为CSCC细胞侵袭。我们使用无论是从细胞外基质由RDEB成纤维细胞（短少在Ⅶ型胶原（C7）），或从RDEB成纤维细胞逆转录病毒转导与Ⅶ型胶原表达构建和展示对肿瘤单胶原蛋白的深刻影响分泌而得本地矩阵显示数据细胞的侵袭。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
这项研究是根据赫尔辛基原则宣言进行，批准了相应的伦理委员会。
1。媒体和试剂的制备
- 的L-抗坏血酸-2 - 磷酸的库存200x中制备
- 溶解29毫克每5ml的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）溶液中L-抗坏血酸-2 - 磷酸，并通过0.22μm的膜过滤器进行过滤。存储在-20℃下0.25毫升无菌分装
- 加0.25 ml等分试样的200倍的L-抗坏血酸-2 - 磷酸的库存，以每50毫升成纤维细胞培养基（DMEM，1％L-谷氨酰胺和10％胎牛血清）中所要求的天，对于0.1毫米L的终浓度-抗坏血酸2 - 磷酸酯。
- 角质细胞生长培养基的制备
- 隔离初级SCC角质形成细胞和文化先前已经21所述。角质形成细胞生长培养基的制备描述其中为好。
- 简单地说，准备介质如下：
300毫升的DMEM和100ml Ham氏F-12补充有10％FBS的
0.4毫克/毫升氢化可的松
5毫克/毫升的胰岛素
10纳克/毫升的EGF
5毫克/毫升的转铁蛋白
8.4纳克/毫升霍乱毒素
13纳克/毫升三碘甲状腺氨酸
1X青霉素 - 链霉素溶液
（2） 在成纤维细胞来源的原生矩阵中的L-抗坏血酸-2 -磷酸补充培养基体外构建
- 每孔种200000的成纤维细胞在6孔板中在补充有L-抗坏血酸-2 -磷酸的成纤维细胞培养基（20000个细胞/ cm 2）。 REFEED每2-3天用2-5毫升媒体。 （注：再投喂频率和音量可调节，以适应不同的单元格的个性化需求，请参见“讨论”）。
- 一厚层细胞嵌入在细胞外基质的形成将在6周后，可见以肉眼（端
- 让本机矩阵float和改造了5天，不断变化的媒体每2-3天。由于拉伸强度和内矩阵固有重塑，基质将收缩急剧而成为降低到一个较小的，但是更厚的天然基质，并且准备好被用于入侵检测。
3。入侵检测与肿瘤鳞状细胞癌角质形成细胞
- 拿起钝钳本地矩阵轻轻地转移到尼龙网。一旦上了尼龙网，传播矩阵轻轻地用1毫升微量说谎尽可能平坦尖而钝钳。
- 通过涂抹在一端有少量无菌凡士林准备无菌克隆缸。
- 将克隆缸上的天然基质，用凡士林面朝下。这是为了确保本机矩阵和克隆环之间的密封。
- 添加CSCC细胞克隆缸（250,000细胞在100μl角质细胞生长介质）。
- 6小时后取出克隆气瓶时，CSCC细胞已落户在本机矩阵。
- 提起尼龙网与本地矩阵和宫颈鳞癌细胞对气 - 液界面上弯曲的不锈钢丝网的支持。
- 添加补充有抗坏血酸的角质细胞生长直到介质电平触发的天然基质的底部。
- 更换介质每2-3天收获7和14天后播种CSCC细胞。
4。三维培养收获和组织学准备
- 修正了在4％看齐aformaldehyde在室温下过夜。
- 平分在蜡样品和嵌入于福尔马林固定的石蜡包埋块，与切割表面朝外。
- 另外，嵌入平分样本OCT和液氮冷冻的组织块单元立即冻结。
- 切4微米的部分上切片脱蜡和（如有必要）。染色使用标准的苏木精和曙红。以可视化的CSCC细胞，对角蛋白14鼠单克隆抗体（LL001，内部），可在免疫组化染色中使用。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
这种技术开辟了探讨，并根据不同的三维基质环境比较肿瘤细胞的侵入行为（在这种情况下CSCC）的可能性。使用这种技术，可以产生不仅如此概括的RDEB真皮环境的C7-缺陷型原生的矩阵，但也已被基因工程化以过表达C7 18附加的矩阵。就像在图2中 ，入侵RDEB CSCC角质形成细胞是显著滞后于C7-过表达的天然基质相比，C7-缺陷RDEB控制。这个侵入是通过标准组织学方法，其中所述凝胶是固定的，石蜡包埋块，然后切片，进行免疫染色可视化。用于染色建议抗体是抗角蛋白14（LL001）为CSCC细胞和抗波形蛋白（V9）的成纤维细胞。
p_upload/51321/51321fig1highres.jpg“宽度=”500“/>
图1。工作流生成成纤维细胞来源的原生基质和肿瘤侵袭实验的 。 点击这里查看大图。
图2。在CSCC入侵到从控制RDEB C7中缺乏纤维母细胞产生的天然基质的角蛋白14（LL001）染色（AI＆BI），或在RDEB成纤维细胞中过表达全长C7表达（AII和BII），清楚地表明，重新表达C7的细胞外基质能延缓CSCC角质细胞浸润。细胞核用DAPI染色（蓝色）和BI和BII与波形蛋白（绿色），成纤维细胞。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
由于本实验的性质，所需的完成的总时间可长达两个月。在这段时间里，悉心照顾和无菌组织培养的做法必须被用来防止微生物污染。
除了 其作为羟脯氨酸和胶原蛋白的羟赖氨酸的合成辅助因子的作用，维生素C能刺激成纤维细胞中特定的22胶原mRNA表达。抗坏血酸选择这里是更稳定的L-抗坏血酸-2 -磷酸23。投喂建议每周三次，但会总是依赖于所研究的细胞。最初的纤维母细胞会消耗更多的营养物质为周通，和更频繁的投喂较大的介质卷可能是明智的。要温柔时，应采取改变媒体和护理，以尽量减少干扰的细胞层原生基质生产过程中是非常重要的。
矩阵应该成为可见通常2周后，特别是在井的周围。偶尔，矩阵将释放本身没有任何机械破坏。这是其中的基质和拉伸强度，其中拉基质向内内在重塑的反映，但也可以是一个标志，原生基质的圆周已于介质变化的干扰。
当释放并从板上释放基质细胞层，我们必须要小心，不要通过矩阵万佛洞。小钝细胞刮刀也可以代替为1毫升微量移液器尖端使用。所释放的天然基质放置到一个尼龙第一啮合（即一定要铺设的天然基质平面）使得更容易处理和随后的起吊到空气 - 液体界面。
这个协议是第一次描述使用原生的成纤维细胞基质作为真皮基质的微环境进行建模在肿瘤细胞试验，以获得更精确和生理学相关的数据。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
APS是由黛布拉国际和英国皮肤基金会的支持。邓迪合作伙伴博士课程的大学 - YZN由A * STAR的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | |
| DMEM with L-glutamine, 4,500 mg/L D-glucose, 110 mg/L sodium pyruvate | Life Technologies | 11995-073 | |
| 100x Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15070 | |
| Vaseline | VWR | PROL28908.290 | |
| Clonal cylinders | Sigma | Z370789 | |
| Nylon Net Filter Disc Hydrophilic 100 μm 25 μm diameter 100/pk | Millipore | NY1H02500 | |
| Bent stainless steel wire mesh support | Made in house | Dimensions were made so that the mesh would fit into 6-well plates |
References
- Bell, E., Ehrlich, H. P., Buttle, D. J., Nakatsuji, T. Living tissue formed in vitro and accepted as skin-equivalent tissue of full thickness. Science. 211 (4486), 1052-1054 (1981).
- Asselineau, D., Bernhard, B., Bailly, C., Darmon, M. Epidermal morphogenesis and induction of the 67 kD keratin polypeptide by culture of human keratinocytes at the liquid-air interface. Exp. Cell Res. 159 (2), 536-539 (1985).
- Pruniéras, M. M., Régnier, M. M., Woodley, D. D. Methods for Cultivation of Keratinocytes with an Air-Liquid Interface. J. Invest. Dermatol. 81 (1 Suppl), 28-33 (1983).
- Prunieras, M., Régnier, M. New procedure for culturing human epidermal cells on allogenic or xenogenic skin: preparation of recombined grafts. Ann. Chir. Plast. 24 (4), 357-362 (1979).
- Gaggioli, C. Fibroblast-led collective invasion of carcinoma cells with differing roles for RhoGTPases in leading and following cells. Nature. 9 (12), 1392-1400 (2007).
- Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432 (7015), 332-337 (2004).
- Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-κB-Dependent. Manner. Cancer Cell. 17 (2), 135-147 (2010).
- Harkness, R. D., Marko, A. M., Muir, H. M., Neuberger, A. The metabolism of collagen and other proteins of the skin of rabbits. Biochem. J. 56 (4), 558-569 (1954).
- Ehrmann, R. L., Gey, G. O. The growth of cells on a transparent gel of reconstituted rat-tail collagen. J. Natl. Cancer Inst. 16 (6), 1375-1403 (1956).
- Kleinman, H. K. Basement membrane complexes with biological activity. Biochemistry. 25 (2), 312-318 (1986).
- Vukicevic, S., Kleinman, H. K., Luyten, F. P., Roberts, A. B., Roche, N. S., Reddi, A. H. Identification of multiple active growth factors in basement membrane Matrigel suggests caution in interpretation of cellular activity related to extracellular matrix components. Exp. Cell Res. 202 (1), 1-8 (1992).
- BD Biosciences - Discover Labware. SPC-356230 Rev 5.0 at Rev 5.0. , Available from: http://SPC-356230 Rev 5.0 Forthcoming.
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Ng, Y. Z., Dayal, J. H., South, A. P. Genetic Predisposition to Cutaneous Squamous Cell Carcinoma. , Forthcoming.
- Christiano, A. M. A., Greenspan, D. S. D., Lee, S. S., Uitto, J. J. Cloning of human type VII collagen. Complete primary sequence of the alpha 1(VII) chain and identification of intragenic polymorphisms. J. Biol. Chem. 269 (32), 20256-20262 (1994).
- Hovnanian, A. A. Genetic linkage of recessive dystrophic epidermolysis bullosa to the type VII collagen gene. J. Clin. Invest. 90 (3), 1032-1036 (1992).
- Ryynänen, M. M., Ryynänen, J. J., Sollberg, S. S., Iozzo, R. V. R., Knowlton, R. G. R., Uitto, J. J. Genetic linkage of type VII collagen (COL7A1) to dominant dystrophic epidermolysis bullosa in families with abnormal anchoring fibrils. J. Clin. Invest. 89 (3), 974-980 (1992).
- Ng, Y. Z. Fibroblast-derived dermal matrix drives development of aggressive cutaneous squamous cell carcinoma in patients with recessive dystrophic epidermolysis bullosa. Cancer Res. 72 (14), 3522-3534 (2012).
- Larouche, D., Paquet, C., Fradette, J., Carrier, P., Auger, F. A., Germain, L. Chapter 15. Methods Mol. Biol. 482, 233-256 (2009).
- Pouliot, R. R. Reconstructed human skin produced in vitro and grafted on athymic mice). Transplantation. 73 (11), 1751-1757 (2002).
- Purdie, K. J., Pourreyron, C., South, A. P. Isolation and culture of squamous cell carcinoma lines. Methods Biol. 731, 151-159 (2011).
- Pinnell, S. R. Regulation of collagen biosynthesis by ascorbic acid: a review. Yale J. Biol. Med. 58 (6), 553-559 (1985).
- Hata, R., Senoo, H. L-ascorbic acid 2-phosphate stimulates collagen accumulation, cell proliferation, and formation of a three-dimensional tissuelike substance by skin fibroblasts. J. Cell. Physiol. 138 (1), 8-16 (1988).
