Summary
組織操作された線維芽細胞由来の天然のマトリックスは、上皮細胞の増殖および分化を支持する間質基質を生成するための新興のツールである。ここでは、腫瘍細胞の生物学上の異なる間質細胞タイプの影響を評価するためにこの方法を適用するプロトコルが提示される。
Abstract
間葉系細胞が埋め込まれたマトリクス上の上皮細胞の3次元器官型培養物は、広く上皮細胞分化および浸潤を研究するために使用される。 Engelbreth-Holm-Swarmマウス肉腫細胞由来のラット尾I型コラーゲンおよび/またはマトリックスは、伝統的に、間葉細胞（通常、線維芽細胞）が移入されその中にマトリックスまたは間質微小環境をモデル化するために基板として用いられてきた。このようなマトリックスを用いた実験は非常に有益ですが、それはその原因なマウス由来の行列のように、単一のタンパク質（たとえば、I型コラーゲンのように）か、基底膜成分と成長因子の含有量が高い（最優先の存在に主張することができます肉腫細胞）、これらの基板は、最高の間質細胞自身によって行われたマトリックス組成への貢献度を反映していない。腫瘍を起こしやすい、遺伝水疱性障害（劣性ジストロフィーの患者から単離された初代皮膚線維芽細胞によって産生さネイティブ行列を研究するために、表皮水疱症）、我々は、腫瘍細胞の浸潤を研究するために、既存のネイティブ行列プロトコルを適応している。線維芽細胞は、培養中の長期間独自のマトリックスを産生するように誘導される。この天然のマトリックスは次いで、培養皿から剥離され、全体の共培養は、空気 - 液体界面まで上昇させる前に、上皮細胞はその上に播種する。細胞分化および/または浸潤、次いで経時的に評価することができる。この技術は、唯一の欠点は、天然のマトリックスを生成するために必要な長期間である、合成または外来マトリックスを必要とせずに、3次元設定における上皮 - 間葉細胞の相互作用を評価する能力を提供する。ここでは、腫瘍細胞浸潤を阻害するために、VII型コラーゲン、線維芽細胞によって発現される単一分子の能力を評価するためにこの技術の適用を記載している。
Introduction
三次元組織培養における生体材料の使用は、2D接着性プラスチック基板とで要約のものよりインビボ環境により類似の生理学的条件下で、実験室における細胞の挙動を研究する研究者を有効にしている。特に、長足の進歩が前方気液界面1-4における3次元培養法を採用することで重層上皮のモデル化がなされている。このような技術は忠実にケラチノサイトの分化およびこれらのプロセスを研究する研究者のための柔軟性と忠実度を可能にする腫瘍細胞の浸潤を模倣する。間質環境を模倣する生体材料の基板の選択は、主にI型コラーゲン、Engelbreth-Holm-Swarmマウス肉腫行列およびデepidermized真皮の使用を伴っています。例えば、癌関連線維芽細胞が癌の浸潤5に寄与することが示されている、開始、および進行間質上皮相互作用を介して、6,7 WHENこのような基板で栽培。
皮膚内の間質環境を模倣するためのゴールドスタンダードは、このような技術を用いて、最大かつ最も広く研究されている重層上皮は、人間の真皮（DED）を解除epidermizedされるように考えられている。 DEDの調製は、人間の死体皮膚3,4からトリプシン処理または物理的解離を介した表皮の除去を含む。しかしながら、このような皮膚へのアクセスは、医療機関に関連付けられていない研究室のために非常に困難であることができ、病気の真皮を得ることが近くに不可能である。別の方法として、研究室は頻繁にI型コラーゲン（ラット尾から分離）および/またはEngelbreth-Holm-Swarmマウス肉腫マトリックスタイプを組み合わせて使用します。
コラーゲンは容易酢酸および塩沈殿を用いて単離することができることNageotte 8 1927年の発見後、組織培養への適用は、その後Huzelによって開拓されたLAや同僚9。コラーゲンコーティングはアマンとをゲイ9によって問い合わせなど29株および組織外植片の細胞培養用のガラスよりも優れていることが判明した。現在、組織培養に用いられるコラーゲンの主要なタイプは、ラット尾の腱から単離され、通常の商業的供給源から購入される。しかし、忠実な基板要約のための欠点は、ラット尾部コラーゲンI型およびIII型コラーゲンは、主要な成分として存在し、単離されたラット尾部コラーゲンは、常に断片化されたヒトコラーゲン、またはヒト真皮、同一ではないということである。
エンゲルブレス-ホルム-スウォームマウス肉腫マトリックスは、培養されたエンゲルブレス-ホルム-スウォームマウス肉腫細胞から分泌される10ゼラチン状のタンパク質混合物である。主要成分は、ラミニン、IV型コラーゲン、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、エンタクチンおよびニドゲンであり、これらのタンパク質の正確な比率は、バッチからバッチに変化します。さておき、構造プロからteins、このマトリックスはまた、増殖因子β、上皮成長因子、インスリン様成長因子1、ウシ線維芽細胞成長因子、および細胞挙動11,12を変化させるであろう血小板由来成長因子の形質転換のような成長因子の有意なレベルを含有する。エンゲルブレス-ホルム-スウォームマウス肉腫行列の複雑性の方を向いて、1851のタンパク質の総量は、最近のプロテオミクス研究13で同定された。解釈し、その11を利用して様々な実験を比較するとき、この行列の豊かで複雑 な性質に照らして、十分に注意が知らされていた。
私たちの研究室では、遺伝性皮膚疾患、皮膚扁平上皮癌（CSCC）14を発症する素因を持つ特に強い関心を持っている。 COL7A1遺伝子に劣性栄養障害性表皮水疱症（RDEB）、生殖細胞変異を伴う重度の水疱性疾患の場合
本研究では、皮膚の腫瘍間質微小環境（ネイティブ行列）反復するために使用する手順は、in vitroでの一次間質性線維芽細胞に直接由来は18に記載されている。ネイティブの行列をP線維芽細胞の長期培養によりroducedはCSCC細胞浸潤についてアッセイするために真皮同等物として使用した。私たちは、RDEB線維芽細胞（VII型コラーゲン（C7）が欠損した）が分泌する細胞外マトリックスのいずれかから、またはレトロウイルス腫瘍上の単一のコラーゲンの絶大な効果を構築し、実証する表現VII型コラーゲンを用いて形質導入RDEB線維芽細胞から誘導されたネイティブの行列を使用してデータを提示細胞浸潤。
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Protocol
本研究は、ヘルシンキ原則宣言に従って実施し、適切な倫理委員会によって承認された。
1。培地および試薬の調製
- L-アスコルビン酸2 - リン酸原液の200倍の調製
- ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）溶液5mlあたりL-アスコルビン酸2 - リン酸を29mg溶解し、0.22μmのメンブランフィルターを通して濾過する。ストア-20℃の中0.25ミリリットルの滅菌アリコートとして
- Lの0.1 mMの最終濃度のために、必要な日には、線維芽細胞培地（1％L-グルタミンおよび10％ウシ胎児血清を含むDMEM）毎に50mlに200倍のL-アスコルビン酸-2 - リン酸原液0.25mlのアリコートを追加-アスコルビン酸2 - リン酸。
- ケラチノサイト増殖培地の調製
- 原発SCCケラチノサイトの単離および培養は、以前に21に記載されている。ケラチノサイト増殖培地の調製が記載されているそこにも。
- 以下のように簡単に説明すると、メディアを準備します。
300mlのDMEMおよび10％FBSを補充したHamのF-12を100ml
0.4 mg / mlのヒドロコルチゾン
5 mg / mlのインスリン
10 ng / mlのEGF
5 mg / mlのトランスフェリン
8.4 ng / mlのコレラ毒素
13 ng / mlのチロニン
1×ペニシリン - ストレプトマイシン溶液
2。L-アスコルビン酸2リン酸添加培地での線維芽細胞由来のネイティブマトリックスのインビトロ建設に
- L-アスコルビン酸2 -リン酸を補充した線維芽細胞培地中の種子6ウェルプレート中のウェル200,000線維芽細胞（20,000細胞/ cm 2）。メディア2-5 mlで2〜3日ごとに再給。 （注：再給頻度とボリュームは、異なるセルの個々のニーズに合わせて調整することができる「ディスカッション」を参照してください）。
- 細胞外マトリックスに埋め込まれた細胞の厚い層は、（肉眼で見える、6週間の終わりに形成する
- ネイティブ行列フロートを聞かせて2〜3日ごとにメディアを変更し、5日間、改造。による引張強度及びマトリクス内の内因性リモデリングは、マトリックスは急激に収縮し、より小さな、より厚い天然のマトリックスに還元なり、浸潤アッセイのために利用される準備ができているであろう。
3。腫瘍SCCケラチノサイトと浸潤アッセイ
- 鈍ピンセットでそっとネイティブ行列をピックアップし、ナイロンネットに転送します。一度ナイロンネット上で、1ミリリットルマイクロピペットを用いて可能な限り平坦に位置するように優しく行列を広げる先端と鈍鉗子。
- 一端に無菌ワセリンを少量塗りつけによって無菌クローン性シリンダーを準備します。
- ワセリン側を下にして、ネイティブのマトリックス上に、クローンシリンダーを配置します。これは、ネイティブの行列と、クローンリング間の緊密なシールを確保することである。
- クローン性シリンダー（ケラチノサイト増殖培地100μl中250,000細胞）にCSCCセルを追加します。
- CSCC細胞が本来のマトリックス上に落ち着いたときに6時間後に、クローンシリンダーを取り外します。
- 曲がったステンレス製のワイヤメッシュ支持体上に気液界面へのネイティブ行列とCSCC細胞とナイロンネットを持ち上げます。
- メディアレベルは、天然のマトリックスの底部に接触するまでのアスコルビン酸を補充したケラチノサイト増殖培地を加える。
- CSCC細胞の播種後7日および14日に2〜3日ごとに、収穫のメディアを変更します。
4。 3D培養物の収穫と組織学のための準備
- 4％のパーで修正室温で一晩aformaldehyde。
- サンプルを二等分し、切断面が外側に向けた状態で、ホルマリン固定パラフィン包埋ブロックのためのワックスに埋め込む。
- 代わりに、10月に二等分サンプルを埋め込み、スナップ凍結を直ちに液体窒素中で新鮮凍結組織ブロックのために。
- ミクロトームと脱ワックス（必要な場合）に4μmの切片を切った。標準ヘマトキシリンおよびエオシンを使用して染色する。 CSCC細胞を可視化するために、ケラチン14に対するマウスモノクローナル抗体（インハウスLL001は）免疫組織染色に使用することができる。
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Representative Results
この技術は、異なる次元間質環境下で腫瘍細胞（この場合はCSCC）の侵襲的挙動を調べ、比較する可能性を開く。この技術を使用して、RDEBの皮膚環境をで要約C7-欠損ネイティブ行列だけではなく、生成するだけでなく、遺伝的に過剰発現するC 7 18ように操作された追加的な行列することができます。 図2に見られるように、CSCC RDEBケラチノサイトの浸潤は、C7-欠損RDEB対照と比較して過剰発現するC7-ネイティブマトリックス中に有意に遅らせた。この侵攻は、ゲルは、固定パラフィンブロックに包埋した後、切断して免疫染色した標準的な組織学的な方法を介して可視化される。染色のために使用することが示唆抗体がCSCC細胞と線維芽細胞のための抗ビメンチン（V9）のための抗ケラチン14（LL001）である。
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図1。線維芽細胞由来のネイティブマトリックスと腫瘍の浸潤アッセイの世代のワークフロー 。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図2。 C7の中の線維芽細胞を欠損制御RDEBから派生したネイティブマトリックスへのCSCC侵入のケラチン14（LL001）染色（AI＆BI）、またはRDEB線維芽細胞で過剰発現する完全長のC7式（AII及びBII）を、明確に実証する再発現C7の細胞外マトリックスにCSCCケラチノサイト侵入を遅らせることができます。核BiとBII中（緑色）ビメンチンと（青）DAPIおよび線維芽細胞を用いて染色した。
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Discussion
これにより、実験の性質のために、完了のために必要な総時間は2ヶ月までとすることができる。この時間を通して、細心の注意と、無菌組織培養の実践は、微生物汚染を防止するために使用しなければならない。
脇コラーゲンのヒドロキシプロリンとヒドロキシリシンの合成における補因子としての役割から、アスコルビン酸は、線維芽細胞22のコラーゲン特異的なmRNA発現を刺激する。ここで選択されたアスコルビン酸はより安定なL-アスコルビン酸2 -リン酸23である。再給紙は、週に三回をお勧めしますが、これは常に研究された細胞に依存することになる。週間通過する初期の線維芽細胞培養は、より多くの栄養素を消費して、より大きなメディアボリュームとより頻繁に再給紙が賢明であるかもしれません。それは、変化するメディアやケアはネイティブのマトリックス産生の間に細胞層への障害を最小限に抑えるよう注意する必要があるとき、穏やかなことが重要です。
行列は、特によくの周囲に、通常は2週間後に目に見えるようになるはずです。まれに、行列は任意の機械的破壊せずに自分自身を解放します。これは内側に行列を引っ張るマトリックス、引張強さの本質的な改造を反映したものであるだけでなく、ネイティブの行列の周囲は、メディアの変更の際に邪魔されたこと徴候である可能性があります。
解放し、プレートからマトリックスセル層を解放すると、1はマトリックスを通して穴を突くしないように注意しなければなりません。小鈍細胞スクレーパーを1mlマイクロピペットチップの代わりにも使用することができる。ナイロン上に放出ネイティブ行列の配置（フラットネイティブ行列を築くために確認してから）最初のメッシュがはるかに容易に取り扱いや気液界面の後に持ち上げることができます。
このプロトコルは、最初に記載しているより正確かつ生理学的に関連するデータを得るために、腫瘍細胞アッセイにおいて微小環境をモデル化する真皮基質として天然繊維芽細胞マトリックスの使用。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
APSは、デブラ·インターナショナルと英国のスキン財団によってサポートされています。ダンディーパートナーシップ博士号プログラムの大学 - YZNはA * STARはサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | |
| DMEM with L-glutamine, 4,500 mg/L D-glucose, 110 mg/L sodium pyruvate | Life Technologies | 11995-073 | |
| 100x Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15070 | |
| Vaseline | VWR | PROL28908.290 | |
| Clonal cylinders | Sigma | Z370789 | |
| Nylon Net Filter Disc Hydrophilic 100 μm 25 μm diameter 100/pk | Millipore | NY1H02500 | |
| Bent stainless steel wire mesh support | Made in house | Dimensions were made so that the mesh would fit into 6-well plates |
References
- Bell, E., Ehrlich, H. P., Buttle, D. J., Nakatsuji, T. Living tissue formed in vitro and accepted as skin-equivalent tissue of full thickness. Science. 211 (4486), 1052-1054 (1981).
- Asselineau, D., Bernhard, B., Bailly, C., Darmon, M. Epidermal morphogenesis and induction of the 67 kD keratin polypeptide by culture of human keratinocytes at the liquid-air interface. Exp. Cell Res. 159 (2), 536-539 (1985).
- Pruniéras, M. M., Régnier, M. M., Woodley, D. D. Methods for Cultivation of Keratinocytes with an Air-Liquid Interface. J. Invest. Dermatol. 81 (1 Suppl), 28-33 (1983).
- Prunieras, M., Régnier, M. New procedure for culturing human epidermal cells on allogenic or xenogenic skin: preparation of recombined grafts. Ann. Chir. Plast. 24 (4), 357-362 (1979).
- Gaggioli, C. Fibroblast-led collective invasion of carcinoma cells with differing roles for RhoGTPases in leading and following cells. Nature. 9 (12), 1392-1400 (2007).
- Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432 (7015), 332-337 (2004).
- Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-κB-Dependent. Manner. Cancer Cell. 17 (2), 135-147 (2010).
- Harkness, R. D., Marko, A. M., Muir, H. M., Neuberger, A. The metabolism of collagen and other proteins of the skin of rabbits. Biochem. J. 56 (4), 558-569 (1954).
- Ehrmann, R. L., Gey, G. O. The growth of cells on a transparent gel of reconstituted rat-tail collagen. J. Natl. Cancer Inst. 16 (6), 1375-1403 (1956).
- Kleinman, H. K. Basement membrane complexes with biological activity. Biochemistry. 25 (2), 312-318 (1986).
- Vukicevic, S., Kleinman, H. K., Luyten, F. P., Roberts, A. B., Roche, N. S., Reddi, A. H. Identification of multiple active growth factors in basement membrane Matrigel suggests caution in interpretation of cellular activity related to extracellular matrix components. Exp. Cell Res. 202 (1), 1-8 (1992).
- BD Biosciences - Discover Labware. SPC-356230 Rev 5.0 at Rev 5.0. , Available from: http://SPC-356230 Rev 5.0 Forthcoming.
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Ng, Y. Z., Dayal, J. H., South, A. P. Genetic Predisposition to Cutaneous Squamous Cell Carcinoma. , Forthcoming.
- Christiano, A. M. A., Greenspan, D. S. D., Lee, S. S., Uitto, J. J. Cloning of human type VII collagen. Complete primary sequence of the alpha 1(VII) chain and identification of intragenic polymorphisms. J. Biol. Chem. 269 (32), 20256-20262 (1994).
- Hovnanian, A. A. Genetic linkage of recessive dystrophic epidermolysis bullosa to the type VII collagen gene. J. Clin. Invest. 90 (3), 1032-1036 (1992).
- Ryynänen, M. M., Ryynänen, J. J., Sollberg, S. S., Iozzo, R. V. R., Knowlton, R. G. R., Uitto, J. J. Genetic linkage of type VII collagen (COL7A1) to dominant dystrophic epidermolysis bullosa in families with abnormal anchoring fibrils. J. Clin. Invest. 89 (3), 974-980 (1992).
- Ng, Y. Z. Fibroblast-derived dermal matrix drives development of aggressive cutaneous squamous cell carcinoma in patients with recessive dystrophic epidermolysis bullosa. Cancer Res. 72 (14), 3522-3534 (2012).
- Larouche, D., Paquet, C., Fradette, J., Carrier, P., Auger, F. A., Germain, L. Chapter 15. Methods Mol. Biol. 482, 233-256 (2009).
- Pouliot, R. R. Reconstructed human skin produced in vitro and grafted on athymic mice). Transplantation. 73 (11), 1751-1757 (2002).
- Purdie, K. J., Pourreyron, C., South, A. P. Isolation and culture of squamous cell carcinoma lines. Methods Biol. 731, 151-159 (2011).
- Pinnell, S. R. Regulation of collagen biosynthesis by ascorbic acid: a review. Yale J. Biol. Med. 58 (6), 553-559 (1985).
- Hata, R., Senoo, H. L-ascorbic acid 2-phosphate stimulates collagen accumulation, cell proliferation, and formation of a three-dimensional tissuelike substance by skin fibroblasts. J. Cell. Physiol. 138 (1), 8-16 (1988).
