Summary
抗坏血酸发挥许多重要作用的细胞代谢，其中许多只明朗化的趋势。这里，我们描述一个介质通量，为在细胞培养物内和细胞外抗坏血酸的确定具体且廉价微孔板检测。
Abstract
维生素C（抗坏血酸）在细胞代谢许多重要的角色，其中许多只明朗化的趋势。例如，在大脑中，抗坏血酸的作用在神经保护和神经调节的方式，涉及神经元和星形胶质细胞的邻位之间抗坏血酸循环 - 这似乎是脑抗坏血酸动态平衡至关重要的关系。此外，新的证据有力地表明，抗坏血酸具有调节细胞及全身铁代谢比公认的经典大大扩展作用。人们日益认识到的抗坏血酸在正常和失调的细胞和有机体的生理不可或缺的作用要求的范围内，可无需非常昂贵的专门设备来执行介质通量和高灵敏度的分析技术。在这里，我们提供了一个中等吞吐量明确的指示，为博的决心具体和相对便宜的微孔板检测届内和细胞外抗坏血酸在细胞培养。
Introduction
抗坏血酸（维生素C），而其作为长期追求的“抗坏血病因子”，由阿尔伯特森特- Györgyi和其他人识别的化学性质在公布的1928年至1934年1论文的发现是在历史上具有里程碑意义的事件生物化学。事实上，这些发现有助于森特 - Györgyi被授予诺贝尔生理学或医学，1937年。角色的不断扩展套件，用于抗坏血酸在动物和植物生理学，以及人体健康，继续积极科学的学科调查和争议。
L-抗坏血酸是一种丰富的生理还原剂和在哺乳动物系统中的酶的辅因子，并有助于涉及胶原羟基化，肉碱和去甲肾上腺素的生物合成，酪氨酸代谢和肽激素酰胺2众多良好定义的酶促反应。有趣的是，安装evide考表明抗坏血酸在刺激其他铁依赖性双加氧酶，例如参与羟化脯氨酰和天冬酰胺酰羟化酶和缺氧诱导因子（HIFs）1α和2α3靶向作用。最近的一份报告表明，通过抗坏血酸通过其在刺激核羟化酶，十文字C（JmjC结构）结构域蛋白活性影响染色质甲基化起着T细胞成熟的作用;后者似乎需要对抗坏血酸充分活动4。实际上，这种酶通过抗坏血酸的刺激出现通过类似的机制由HIF和胶原羟化酶抗坏血酸发生的刺激。除其他经典效应，抗坏血酸显著蜂窝抗氧化作为水溶性链破自由基清除剂和5至质膜的再循环有利于α-生育酚通过的α-生育酚自由基06瓦特的减少（维生素E）HICH是防止膜脂过氧化7重要。重要的是，虽然大多数哺乳动物是能够由D-葡萄糖抗坏血酸从头肝脏合成的，高等灵长类动物，豚鼠和一些蝙蝠依赖于维生素8的膳食来源。这是由于在古罗基因失活，其中在未受影响的哺乳动物的同源基因编码的酶，γ-古洛糖酸内酯氧化酶9-13。这种酶是必需的从葡萄糖13中抗坏血酸的生物合成的最终反应。
以下从在人类肠腔转运介导吸收，抗坏血酸是由循环系统分布于整个身体。维生素通常位于其还原形式在毫摩尔浓度细胞内（与红细胞中的浓度通常类似于当时血药浓度的显着的例外），并且在微摩尔浓度entrations（ 如 50-200微米），在大多数细胞外液14,15。
在生理条件下，抗坏血酸盐通常发生可逆单电子氧化的抗坏血酸自由基（AFR，也称为monodehydroascorbate或semidehydroascorbate）。而AFR是一个相对稳定的自由基16，在没有它的快速单电子酶促还原回抗坏血酸，2别生育率可以进一步dismutate到1的抗坏血酸和脱氢抗坏血酸1（DHA）9,13,17。内的细胞内部，抗坏血酸盐，DHA的双电子氧化的产品，可以迅速地通过谷胱甘肽-和NAD（P）H依赖性酶和非酶反应13还原成抗坏血酸。
虽然人们公认的经典，在铁代谢抗坏血酸的唯一显著作用是刺激非血红素铁18饮食吸收，我们和其他人提供的证据strongly表明抗坏血酸在这种金属的代谢中起着很大的作用扩大。首先，抗坏血酸盐，释放由抗坏血酸充满细胞似乎在由细胞19,20调制非转铁蛋白结合的铁的吸收中发挥重要作用，并且非常最近的证据表明，抗坏血酸还调制转铁蛋白-结合的铁的摄取由细胞21，其中后者对应于主要生理铁摄取途径22。
抗坏血酸是用于在哺乳动物23,24正常中枢神经系统的功能是必不可少的。再加上肾上腺皮质，脑垂体，胸腺，视网膜和黄体，大脑中含有高浓度相对于其他身体组织23,25-27抗坏血酸。此外，这两种星形细胞28,29和神经元样细胞30至谷氨酸的曝光是已知的引发抗坏血酸释放到细胞外空间，其中ascorbate的认为有助于保护神经元对谷氨酸诱导的神经元功能障碍31。而从星形胶质细胞谷氨酸诱导的抗坏血酸释放的确切机制尚不清楚，我们最近提供的证据表明细胞肿胀造成摄取谷氨酸的星形胶质细胞谷氨酸和天门冬氨酸转运体（GLAST的参与，也称为兴奋性氨基酸转运蛋白亚型1 [EAAT1在人类中）和体积敏感的渗压剂和阴离子通道（VSOACs）是可渗透的，以小的有机阴离子，如抗坏血酸32后续活化。参与VSOAC形成质膜导管的分子身份有待鉴定33,34。
虽然许多实验已经开发了用于抗坏血酸的生物样品，包括分光光度法，荧光法和层析测定法35,36中的判断，存在特异性，敏感性，干涉的多变性E按化学污染物，有效的线性范围和端点分析物的稳定性。此外，影响测定的选择其它显著因素是快速，易用性和获得相对专业的设备，如高效液相色谱（HPLC）装置。
这里我们提出了细胞内抗坏血酸在培养细胞中的确定，以及对抗坏血酸流出，从培养的细胞中测定的单独测定法的简单和高度特异性的比色微量测定法。后者测定法的目的，以规避从细胞中释放抗坏血酸低估的问题，是由于由钠依赖性抗坏血酸转运体（SVCTs）快速再摄取释放抗坏血酸。虽然这两种方法都出现了一些我们以前的出版物19,20,32,37,38的，该原稿提供了一个明确的指令集，以及用于它们的有效执行的准则。
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Protocol
1，确定细胞内抗坏血酸在培养细胞
- 细胞培养和收获
- 使用标准培养过程19-21,32,38增长悬挂（如人红白血病，K562）或贴壁细胞（ 如原代星形胶质）。注：为确保细胞中含有抗坏血酸，装入培养细胞与抗坏血酸无论是作为抗坏血酸或DHA 33,39。
- 创建一个含有抗坏血酸细胞提取物
- 孵育磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤悬浮或贴壁细胞用450微升冰冷的细胞透化缓冲液[CPB适当数量; 0.1％（重量/体积）皂苷的PBS; 4°C]。注意：确定要测定的线性范围内获得吸光度值所需的细胞数量（参见下文）根据经验由最终用户。注：组织提取物也可使用（见讨论进一步的细节）。
- 激越TE细胞于冰上10分钟，以确保彻底的细胞裂解。
- 由粗裂解物离心以16,000×g离心5分钟在冷冻离心（4℃）除去细胞碎片创建一个澄清的含有抗坏血酸胞提取物。
- 小心地从每个样品中取出4×100μl的等分试样，并加入到孔中的一个水平序列中的96孔平底板中，包含任一25微升/孔PBS中只或25微升/孔的45.5 U（“-AO”） / ml的L-抗坏血酸氧化酶（AO）的PBS（“+ AO”）的原液。注意：这应与该标准的制剂并行的进行（见下文）。
- 抗坏血酸标准曲线施工（必须重新构建每个检测）
- 制备10mM的抗坏血酸在冰冷的PBS中的储备液。注：验证抗坏血酸的浓度用分光光度计的石英比色皿用1厘米路径长度在265 nm处（消光系数= 14.5毫米-1厘米-1）40。
- 精心准备了一系列的0和20微米之间的抗坏血酸标准。
- 在步骤1.2.4平行，小心地从每个标准除去4×100μl的等分试样，并添加至孔中，在96孔平底板，其中包含的PBS（“-AO”）或25微升/孔的水平序列45.5 U / ml的储备液AO在PBS（“+ AO”）的。注：100微升的上述抗坏血酸标准将包含0-2纳摩尔抗坏血酸。请注意，该AO的目的是，以控制的非抗坏血酸还原剂以铁氰化钾还原的贡献。
- 确定细胞内抗坏血酸-第1步：选择删除抗坏血酸和定量氧化抗坏血酸与铁氰化钾
- 在550转通过覆盖板中铜箔轨道式混合96孔板中于室温下放置5分钟，在黑暗中。注：T他的第一步应该氧化抗坏血酸所有在“+ AO”井成DHA。该“-AO”井应该不会受到影响。
- 加入50微升的3.5mM的铁氰化钾（在本文中称为“铁氰化钾”）的PBS至所有孔中。最后的[铁氰化钾] = 1毫米。注：使用multipipettor。
- 在550转轨道式混合的板在室温下搅拌另外5分钟在黑暗中。注意：该步骤应导致铁氰化物的还原由抗坏血酸中的2分子的铁氰化物的每1分子的抗坏血酸的氧化还原的化学计量比，以氰亚铁。
- 立即加入25微升含有50％（V / V）乙酸和30％（重量/体积）三氯乙酸（TCA）新鲜构成的溶液。注：使用multipipettor。
- 确定细胞内抗坏血酸-步骤2：定量的亚铁氰化物的量形成37
- 加入100微升的亚铁决心解决37至EACH很好。注：工作液应临用前进行：1毫升的3M醋酸钠（pH值6.0）; 0.5毫升冰醋酸（17.4〜2M乙酸）的;将2ml 0.2M的柠檬酸;将2ml 3.3毫米的FeCl 3在0.1M乙酸;将1ml的30mM ferene-S。此工作溶液的最终体积应7.5毫升。
- 在550转轨道式混合板在黑暗中30分钟，在室温下进行。
- 读取各孔的吸光度值在593纳米（ 即最大吸收的铁（II）（ferene-S）3络合物）。
- ' - AO'井对每个样品，然后从抗坏血酸标准曲线内插（见步骤1.3通过最初减去从相应的“+ AO'井在A 593 nm的数值计算细胞内抗坏血酸为每百万个细胞纳摩尔抗坏血酸的量）。对ascorb量每个标准在构建标准曲线，画出这个“差值”每口井吃。
2，从培养细胞中抗坏血酸的测定，外排
- 细胞培养和收获
- 长暂停或贴壁细胞上文（见步骤1.1）。注：进行下面的检测与悬挂和贴壁细胞以获得最佳效果24孔平台格式。
- 重悬的细胞悬浮液，或覆盖贴壁细胞，用400μl预热的HEPES缓冲生理盐水溶液，有或没有钙和镁，以及含有5mM D-葡萄糖;在井（HBS / D的pH 7.3，37℃）的24孔板。添加HBS / D相同体积的，在每个24孔板中进行检查指定的无细胞的孔中。注意：后者将作为基线反应无细胞对照组（见下文）。
3，确定维生素C的释放量
- 下面的储备液，应事先准备：120U / ml的AO在HBS / D（准备好新鲜）; 2.4毫米Ferene-S在HBS / D; 120微米的FeCl 3和600μm的柠檬酸钠在HBS / D（立即从比较集中的原液准备）。
- 要启动ferrireduction反应（每孔终体积应为600微升），加试剂已经含有400μLHBS / D的单井以下几卷：
- 加入50微升的AO（120 U / ml）或哈佛商学院/ D的配对井一式三份。最终AO浓度应为10单位/毫升。注意：标号配对孔为“ - AO”和“+ AO”。
- 混合轻轻轨道混合5分钟的板在37°C
- 加入50微升2.4毫米ferene-S的所有井。最后ferene-S浓度应为200微米。混合板如上述5分钟，在37℃下
- 加入50微升新鲜制备120微米柠檬酸铁的。最终铁和柠檬酸浓度应为10μM铁和50μM的柠檬酸盐。拌匀。
- 三一式三份对照孔，吸上覆介质，并加入600μLHBS /含0.1％皂苷D。注：这些将作为“100％的细胞裂解”控制的乳酸脱氢酶（LDH）释放法，以同步进行（见下文）。
- 孵育在黑暗中60分钟，在37℃下
- 在抗坏血酸流出测定法结束时，迅速吸出500μl的各孔，并加入24孔板中，以适当标记的孔中。注意：对于悬浮细胞，首先通过离心在4℃下除去细胞
- 加的上清液300μl的等分试样到96孔培养板，然后读取在593纳米。
4，外测定抗坏血酸
- 读取各孔的吸光度值在593纳米。
- 计算细胞外抗坏血酸的量为每毫克蛋白（或每百万个细胞）纳摩尔抗坏血酸所描述的细胞内抗坏血酸的测定在步骤1.5.4。注意：在最终用户应该优化条件，使抗坏血酸释放不被细胞内抗坏血酸的限制。
5，测定LDH释放的
- 与剩余的200微升的各样品的细胞外溶液进行LDH释放测定32,41，以确定细胞裂解的程度。注：计算总可释放的LDH的百分比。从分别用0.1％皂素处理的样品确定释放的LDH。
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Representative Results
在悬浮培养细胞内抗坏血酸的测定
在第一试验（ 图1），细胞内抗坏血酸被确定时，以下的抗坏血酸特异性（ 即 AO-敏感）铁氰化钾还原到铁氰化物，使用高灵敏度的测定亚铁氰化物的由先前公布的程序37。抗坏血酸的检测是基于由抗坏血酸依赖性降低铁氰化钾对铁氰化物，随后三价铁的亚铁氰化钾被还原生成二价铁的比色螯合。由于超生理浓度的某些二价金属离子（ 如铜离子 ，CO 2 +和Zn 2 +）能干扰，想必与亚铁螯合由ferene-S竞争，适当的预防措施应该这样的条件37下服用。
数字图2示出了一组标准的抗坏血酸0-20微米的典型的标准曲线（或每对96孔板的井0-2纳摩尔抗坏血酸;看到，在“协议”步骤6.5）。虽然在该图中未示出，线性度被保持到每孔8纳摩尔抗坏血酸（ 即净〜1.6的593纳米 ），其对应于约80微米的样品的抗坏血酸的浓度。该测定可用于成功地检测下每孔0.25纳摩尔抗坏血酸（2.5μM的样品的抗坏血酸浓度）抗坏血酸的水平。
K562细胞迅速积累的细胞内抗坏血酸从细胞外DHA，但不抗坏血酸（ 见图3;转载自巷和Lawen 2008 19的许可）。在这个代表性的实验中，PBS洗涤K562细胞（4×10 6细胞/ ml）培养在PBS中以500μM的任抗坏血酸（ASC），DHA，DHA +50μM的细胞松弛素B（DHA + CB），ASC + 5 mM的铁氰化钾（ASC / FIC）或ASC + 50 U / ml的AO（ASC / AO）为30分钟，在37°C。细胞内抗坏血酸如在“协议”中所述确定。
DHA的摄取K562细胞发生了促进葡萄糖转运体（GLUT）介导的转运（ 见图4;转载自巷和Lawen 2009 42的许可）。以评估的DHA的摄取在此代表性实验生产过剩的介入，K562细胞与递增浓度的细胞松弛素B（CB）或dihydrocytochalasin B（H 2 CB）溶解在含有0.5％的乙醇中15分钟，在37℃下的MBS前到孵化与400μMDHA为30分钟，在37℃，在相同的培养基中（ 图4A）。然后洗涤细胞三次，在100倍体积的冰冷的MBS和在“议定书”中描述其细胞内抗坏血酸确定。要注意的是很重要的，而CB和H 2 CB抑制能动的过程在微摩尔浓度（1-100微米），只有CB，它通过单双键的存在不同于H 2 CB，抑制GLUT-依赖的交通在低微摩尔浓度（1-10微米）43。因此，DHA的摄取可抑制由可换股债券，其IC 50 <2.5微米，但并不可抑制由H 2 CB，DHA的摄取可能发生由GLUT-介导的运输38。可替代地，在图4B中 ，洗涤细胞暴露于的GLUT-运输的，但不可代谢葡萄糖类似物3浓度的增加- O-甲基-D-葡萄糖（3 - OMG）或非GLUT-葡萄糖运输立体异构L -孵化前的DHA在面板A.葡萄糖同样的结果表明GLUT参与DHA进口作为抑制细胞内抗坏血酸积累只发生在GLUT-运输的葡萄糖类似物的存在。
Determina的从贴壁细胞化抗坏血酸，外排
在第二个试验中，抗坏血酸流出的从培养细胞中的速率可以被确定。这个特定测定法是重要的，因为抗坏血酸从细胞中释放似乎是对非转铁蛋白结合的铁的细胞19,20抗坏血酸调节的细胞摄取是至关重要的。非转铁蛋白结合的铁的吸收被认为是有关的铁过载失调如hemochromatoses 22，以及在哺乳动物脑22的星形胶质细胞-神经元铁交换和体内平衡的病理生理学。事实上，我们最近表明，主要的兴奋性神经递质，L-谷氨酸，触发器抗坏血酸从星形胶质细胞释放以依赖于L-谷氨酸由GLAST和触发抗坏血酸由推定VSOACs 32释放以后的细胞肿胀摄取的方式。在类比，抗坏血酸Řelease从抗坏血酸加载星形细胞可以由兴奋性氨基酸，L-天冬氨酸盐，但不是非兴奋性氨基酸的L-谷氨酰胺的刺激。这种效应在图5中所描绘（再现从里及Lawen 2012 32的许可），它显示了剂量-反应曲线为抗坏血酸的刺激（AA）由天门冬氨酸（实心圆）的释放和谷氨酰胺（空心圆）从原代培养抗坏血酸加载鼠标星形胶质细胞。
它讨论如何抗坏血酸流出测定不同于提供了细胞内抗坏血酸的测定的测定是很重要的。主要的不同之处在于以下事实：抗坏血酸盐留在溶液中的电平不被在给定时间点的结束进行的，为的是对细胞内抗坏血酸测定方法的情况下的化学反应来确定。相反，“还原性签名”被积累期内该抗坏血酸是从细胞中释放出来。此还原性签名被捕获在的抗坏血酸依赖性降低细胞外柠檬酸铁的后面的二价铁的快速螯合作为一个大的细胞外和膜透性的形式的[Fe（II）（ferene-S）3] 4 -螯合物。 Ferene-S可以被认为是类似的膜透性在测定的时间短路线。此显色络合物的水平可以被确定为一个端点的测量。作为本螯合物只有AO-敏感级别被确定，该测定提供了高程度的特异性测定细胞外的L-抗坏血酸。
图1。流程图显示在协议的关键步骤细胞内抗坏血酸的测定。
图2为一组抗坏血酸标准0-20μM一个典型的标准曲线。。（或每对96孔板的井0-2纳摩尔抗坏血酸;看到，在“协议”步骤6.5）误差棒均没有显示为它们用符号占据的范围内。
图3。K562细胞迅速积累的细胞内抗坏血酸从细胞外的DHA，但不是抗坏血酸。的PBS洗涤过 的K562细胞（4×10 6个细胞/ ml）培养在PBS中以500μMöf无论是抗坏血酸（ASC），DHA，DHA + 50微米细胞松弛素B（DHA + CB），ASC + 5 mM的铁氰化钾（ASC / FIC）或ASC + 50 U / ml的AO（ASC / AO）为30分钟，在37° C.细胞内抗坏血酸如在“协议”中所述确定。显示的结果是三个独立实验（+ SD）的装置。 *细胞内抗坏血酸浓度使用预先确定细胞内水分的空间K562细胞（ 即 〜1.6μl/106细胞）19,20估计。这个数字已被复制与巷和Lawen 2008 19的许可。
图4。DHA的摄取K562细胞发生由促进葡萄糖转运体（GLUT）介导的转运。已被生长至在RPMI 6-8×10 6细胞/ ml + 10％（K562细胞体积/体积），在37℃的胎牛血清，5％CO 2和95％空气的最初洗涤三次MBS。然后洗涤细胞暴露于增加细胞松弛素B的浓度（CB; Sigma公司）或dihydrocytochalasin B（H 2 CB）溶解在拖把缓冲盐水（MBS; 137 mM氯化钠，2.7 mM的氯化钾，15mM的MOPS的钠离子，pH值7.3 ）含0.5％乙醇孵化前用400微米的DHA为30分钟，在37°C（A）。然后洗涤细胞三次，在100倍体积的冷的MBS和在“议定书”中描述其细胞内抗坏血酸确定。由于DHA的摄取可抑制由可换股债券，但不是H 2 CB，DHA的摄取发生了GLUT-介导的运输。或者，在（B）中，洗涤细胞暴露于浓度渐增的GLUT-运输的，但不可代谢葡萄糖类似物3 - O-甲基-D-葡萄糖（3-OMG）或非GLUT-葡萄糖运输的立体异构体
从抗坏血酸加载星形图5。抗坏血酸释放是由兴奋性氨基酸的L-天门冬氨酸刺激的，但不是非兴奋性氨基酸的L-谷氨酰胺 ，此图显示了剂量-反应曲线为抗坏血酸的刺激（AA）释放由从天门冬氨酸的抗坏血酸加载鼠星形胶质细胞的原代培养物（实心圆）和谷氨酰胺（空心圆）。所示的数据是三次实验的平均值（±SD），P <0.001 对比在'基础'的条件。这个数字已被复制与巷和Lawen 2012 32的许可。
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Discussion
在本文中，我们提出了两种快速，特异，灵敏的相对比色微孔板检测抗坏血酸为从培养细胞内和细胞外车厢派生的决心。该测定法可以与访问标准的实验室设备和试剂完成。所需检测的只有适度昂贵的试剂是AO，这是必要的，因为它赋予了高程度的分析物特异性对L-抗坏血酸。的测定是非常适合于任一悬浮细胞（ 如 K562），或贴壁细胞（ 如 HepG2细胞或啮齿动物的初级星形胶质细胞），并使用这种细胞19,20,32,37,38已被成功地应用在以前的出版物。应避免使用其它抗坏血酸的氧化剂（ 如 TEMPOL）代替AO的，因为它们是不足够具体为L-抗坏血酸。另外，使用化合物如TEMPOL在抗坏血酸释放实验将TEMPOL的穿越细胞膜和细胞内氧化抗坏血酸44的能力羞愧。 AO是本质上的膜透性在使用的时程。
我们已经进行了与上述的比色测 定抗坏血酸和Vislisel和同事36的荧光抗坏血酸测定获得的结果的直接比较。我们发现，这两个测定法给出相同的结果为细胞内抗坏血酸测定测定（数据未显示）。有趣的是，上述的抗坏血酸释放测定法对抗坏血酸流出的表观速率比用荧光端点测定了显著更高的值。这表明，本文中描述的抗坏血酸流出测定允许表观“抗坏血酸流出”，也就是不那么容易通过抗坏血酸再被细胞吸收的可能性混淆的确定;这个过程可能涉及到复数阿斯玛膜SVCTs。这样的再摄取往往会导致抗坏血酸，如果一个端点抗坏血酸测量采取一定时期内被释放的实际水平的低估。但应注意的是，如果组织样品（ 例如肌肉，肺或脑）将被用来代替培养细胞的细胞内抗坏血酸测定法，然后组织匀浆应该使用冰冷的CPB和某种形式的机械破碎的（构造例如，DOUNCE匀浆，探针尖端超声处理，法国压机等 ）。细胞碎片应该通过离心被删除，用户在进行步骤1.2.4之前，应考虑是否有需要样品除蛋白和/或加入蛋白酶抑制剂。
我们还报道细胞松弛素B（<10微米）以前低微摩尔浓度不抑制抗坏血酸外排了由该法32确定的表观速率19主要地减少， 20,38。
有这些协议的几个关键步骤。首先，本文所描述的测定法关键取决于AO对成对样品中选择性地且迅速地除去抗坏血酸的能力。如果AO的制剂的比活性明显高于标称并假定活动较少，有可能不是所有的在含AO S中的抗坏血酸的amples将被删除。这可能导致抗坏血酸的量的未知样品中的低估，如果使用“直接法”来计算的抗坏血酸的量。然而，如果使用“标准曲线法”，这是建议，AO的低活性制剂只会导致检测灵敏度的损失。我们已经发现，良好的结果是通过使用AO的制剂构成稳定地得到通过在1ml PBS或MBS，然后将其划分成被存储在-80℃下不超过其100微升等分试样的溶解AO 1000Ú一个月。另外，作为AO的是，可以通过细胞裂解物进行蛋白水解降解的蛋白质，蛋白酶抑制剂可以加入到裂解物中的含AO井之前加入到细胞裂解物。这可能是一个有用的修改使用的细胞或组织裂解液中含有丰富的蛋白酶活性时要考虑的。
此外，该测定法的灵敏度记载的波夫在很大程度上取决于所用的显色双齿的Fe（Ⅱ） - 螯合剂，Ferene-S的。这样的螯合剂可以由化学相似的螯合剂如ferrozine试剂和红菲绕啉二磺酸取代，但具有降低的灵敏度对应于它们的Fe（Ⅱ）的消光系数螯合37。此外，应注意使用红菲咯啉二磺酸的时候，因为它似乎导致明显的催化ferrireduction中的柠檬酸铁复合物的存在比Ferene-S或ferrozine试剂37,45更高的速率服用。这是一个有关关注的抗坏血酸释放测定法的情况下，作为铁的非抗坏血酸盐依赖性外观（Ⅱ）螯合物将降低测定的灵敏度。
而细胞内抗坏血酸测定测定是用粘附细胞相容，细胞裂解之前这些细胞脱离应通过机械刮擦，而非胰蛋白酶/ EDTA进行。胰蛋白酶是蛋白酶它会产生不利的抗坏血酸耗尽步骤与AO，其中后者是一种蛋白质可能干扰。此外，EDTA将有可能与同ferene-S 37竞争螯合铁的FOC确定步骤干扰。应该避免这样的试剂。最后，抗坏血酸盐释放试验可以很容易地适应于悬浮液中的细胞。代替吸移离上覆的Fe（Ⅱ）（ferene-S）3 -含螯合物在测定结束时，细胞应尽快通过离心沉淀作为细胞内抗坏血酸测定法。在上清液中的593 nm处的吸光度然后应确定。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
我们感谢博士斯蒂芬·罗宾逊和女士哈尼亚Czerwinska（莫纳什大学）星形胶质细胞培养的慷慨供应。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nunc 96-well flat-bottom plates | Thermo | 269620 | Any flat-bottom 96-well plate can be used |
| Refrigerated benchtop microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | A non-refrigerated microcentrifuge that has been equilibrated to temperature in a cold room can also be used |
| Refrigerated bench-top centrifuge | Eppendorf | 5810R | Swing-bucket |
| Bio-Rad Benchmark Plus Microplate Spectrophotometer | Bio-Rad | Any microplate spectrophotometer capable of reading at 593 nm can be used and is recommended. If a filter-based plate reader is used, choose the closest wavelength possible and use the standard-curve method. | |
| Ependorf MixMate (microplate orbital mixer) | Eppendorf | This is a very versatile and reliable microplate mixer and works very well for these assays | |
| General-purpose buffers | |||
| Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4 | |||
| MOPS-buffered saline (MBS); 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 15 mM MOPS-Na+, pH 7.3 | |||
| MBS + 5 mM D-glucose (MBS/D) | |||
| HEPES-buffered saline + 5 mM D-glucose (HBS/D); 137 mM NaCl, 5.2 mM KCl, 1.8 mM CaCl2•2 H2O, 0.8 mM MgSO4•7 H2O, 5 mM D-glucose, 20 mM HEPES-Na+, pH 7.3) | |||
| Cell permeabilisation buffer (CPB; 0.1% saponin in PBS) | |||
| General chemicals | |||
| L-ascorbic acid or sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | Highest purity preparations should be obtained | |
| Dehydro-L-ascorbic acid (DHA) dimer | Sigma-Aldrich | 30790 | Aqueous solutions theoretically yield 2 moles of DHA monomer per mole of DHA dimer |
| Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | C6762 | Stock solutions prepared in DMSO or ethanol |
| Ascorbate oxidase (AO) | Sigma-Aldrich | A0157 | Stock solutions (120 U/ml) can be prepared in PBS or MBS and then frozen in aliquots |
| Potassium ferricyanide (FIC) | Sigma-Aldrich | 455989 | Trihydrate |
| Ferene-S (3-(2-Pyridyl)-5,6-di(2-furyl)-1,2,4-triazine-5′,5′′-disulfonic acid disodium salt) | Sigma-Aldrich | 92940 | |
| Sodium L-glutamate | Sigma-Aldrich | ||
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | ||
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | Prepare a 0.1% stock solution |
| Stock solutions for intracellular ascorbate determination assay | |||
| 3 M sodium acetate (pH 6.0) | |||
| Glacial acetic acid | |||
| 0.2 M citric acid | |||
| 3.3 mM FeCl3 in 0.1 M acetic acid | |||
| 30 mM ferene-S | |||
| 50% (v/v) acetic acid + 30% (w/v) trichloroacetic acid (TCA) | |||
| Stock solutions for ascorbate-efflux assay | |||
| AO (120 U/ml) | |||
| 2.4 mM ferene-S | |||
| 0.12 mM FeCl3 in 0.6 mM sodium-citrate |
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