Summary
当研究室では、より良い細胞機能に組織の硬さを調節する効果を理解するためにDNA架橋ポリアクリルアミドハイドロゲル、動的なヒドロゲル系を開発しました。ここでは、これらのヒドロゲルを調製するための回路図、説明、およびプロトコルを提供する。
Abstract
メカノは、細胞の形態と機能を向ける内の物理的な手がかりの重要な役割に対処する新たな科学的な領域です。組織の剛性は、疾患、発達、および傷害に調節するため、例えば、細胞機能に対する組織の弾性の影響は、メカノ研究の主要な領域である。細胞がプレーティングされると剛性を変えることができない静的な組織模倣物質、または物質は、主に細胞の機能上の組織の剛性の影響を調査するために使用される。静的試験から収集した情報は貴重であるが、これらの研究は、 生体内での細胞の微小環境の動的な性質を示すものではありません。より良い細胞機能に対する動的剛性の影響に対処するために、DNA架橋ポリアクリルアミドヒドロゲルシステム（DNAゲル）を開発した。他の動的基質とは異なり、DNAゲルは、減少または刺激することなく、製造後に剛性が増加する能力を持っている。 DNAゲルは、DNAのcrosslから成りポリアクリルアミドバックボーンに重合されるインク。追加および一本鎖DNAの送達を介して架橋を除去することは、時間、空間、およびゲル弾性の可逆的制御を可能にする。私たちは、DNAゲルの弾力性の動的調節が線維芽細胞と神経細胞の挙動に影響を与えることがこれまでの報告に示されている。本報告書やビデオでは、準備のDNAゲル上でDNAゲルの架橋メカニズムと、ステップ·バイ·ステップの手順を説明する模式図を提供する。
Introduction
静的および動的な基板は、細胞機能に対する組織弾性または剛性の効果を研究するために開発された生体材料の二つのカテゴリーである。静的基板は、それらが製造された後、および/または細胞がプレーティングされれば、それらの物理的特性を変更することはできません。ポリアクリルアミド（PA）ゲルはメカノ調査5,17ために合成した第1の2次元、静的な基質であった。 PAゲルは、調製が容易で、安価で、多用途であり、弾性率の広い範囲で製造できる。これらの技術的利点は、PAが一般的に適用される基板をゲル化することが、静的な基質は、細胞外マトリックス（ECM）の動的な性質を示すものではないし、インビボで細胞環境を取り囲む。例えば、ECMは、傷害、開発、または疾患の結果としての剛性の変化を受ける。ダイナミック基板は、したがって、メカノ研究における組織模倣基質モデルとして好まれる 多数の合成は、天然の、二次元、三次元の、静的および動的な生体材料は、組織1,3,6,16,23,26剛性を模倣するために開発されている。いくつかの動的な基板は、それらの機械的特性2,4,7,8,12,15,16を変更するために、熱、紫外線、電流、イオン、pH変化が必要ですが、これらの刺激は、ヒドロゲルのバイオアプリケーションを制限することができます。 DNA架橋ポリアクリルアミドヒドロゲル（DNAゲル）は、動的二次元弾性基質である。 DNAの架橋は、メディアへの一本鎖DNA（ssDNA）の添加によってDNAゲルの剛性の時間的、空間的、可逆変調のために許可または9-11,13,14,18,21バッファ 。刺激は弾力性の調節のために適用され、上記の動的なゲルとは異なり、DNAゲルは、弾力性の変化のために適用された一本鎖DNAの拡散に依存している。したがって、細胞を増殖さ上部ゲル表面は、レートoをので、変調された第1の領域であるF弾性変調はゲルの厚さに依存している。 DNAゲルは、しかしながら、ビス-アクリルアミド架橋はDNA（ 図1）からなる架橋で置き換えられ、それらはポリアクリルアミド骨格を有するという点で、それらのPAゲル対応物に類似している。二つのssDNA（SA1とSA2）は、ゲルのDNA架橋を補うために、架橋剤ストランド（L2）とハイブリダイズ。 SA1とSA2は、両方のPAネットワークへの効果的な取り込みのために、5 '端にアクリダイト修正が含まれている明確な配列を有する。ゲル、SA1およびSA2の調製のために個別にPA主鎖に重合されると、その後、重合されたSA1およびSA2を一緒に混合する。 L2、架橋剤は、SA1およびSA2混合物に添加される。 L2の塩基配列は、両方SA1およびSA2配列に相補的であり、L2は、DNA架橋を形成するSA1プラスSA2とハイブリダイズする。初期、DNAゲルの弾性は、L2濃度および架橋（ 表1の両方によって決定される2）。 SA1およびSA2は、（100％ゲルと呼ぶ）L2 100質量％架橋されているため、L2、SA1およびSA2の等しい化学量論量を含むDNAゲルは、硬いゲルである。 DNA架橋の低い割合でのL2結果のより低い濃度であり、したがって、よりソフトなDNAゲル。 （50％ゲルと呼ぶ）50％架橋された程度の低いゲルは9-11構築されている。 PAゲルとは異なり、DNAゲルは、合成後に硬くかつ柔らかくすることができます。そのため、DNAのゲル上で増殖した細胞は、動剛性の変化に供することができる。細胞接着性ゲルを補強するために、L2は、架橋の割合を増加させるために低いパーセンテージのゲルの培養培地に添加することができる。細胞接着性ゲルを柔らかくするために、L2は、架橋10,13,21の割合を減少させるために除去することができる。 L2は、L2は、SA1およびSA2（ 表1）からuncrosslinkできるように、3 '端に付加的な足掛かり配列を有する。 L2の除去は、R2と呼ばれる反転鎖のハイブリダイゼーションによって達成される。 R2はL2の全長に相補的であり、L2の足掛かりを最初にハイブリダイズする。足掛かりハイブリダイゼーションは架橋を排除し、ゲル剛性を減少させSA1とSA2からL2の解凍を推進する。 本報告ではとビデオは、段階的な手順は、DNAゲルを補強し、軟化させるの調製のために設けられている。 100％および80％ゲル製剤が記載されているが、このプロトコルは、他の初期および最終の架橋割合のDNAゲルを作成するために調整することができる。一般に、100％および80％ゲルを用意し、ガラスカバースリップ上に固定化、官能化、および細胞を播種。 L2は、80％ゲルの培地に添加され、R2は、100％のゲル、メッキの48時間後の培地に添加する。メディアへのR2の添加が80％架橋、100％ゲルを柔らかくし、一方メディアにL2の添加は、架橋された100％、80％ゲルを硬くする。剛化ゲルを80→100％ゲル軟化ゲルとして指定されているテキストで100→80％のゲルとして指定されている。制御または静的ゲル、ssDNAのためにTsとから成るかのように、100％および80％ゲルの別のセットに配信される。弾性変調次の二日間の最小限の後、細胞を処理し、分析することができる。 セルラーと機械の研究をd、いくつか利用している。のssDNA 9-11,13,14,18,21表1に塩基配列ifferent架橋設計は、静的および動的機械的特性の範囲を有するDNAゲルを生成する。架橋設計において変調パラメータは、塩基配列と、配列の長さまたは架橋の長さである。太字やイタリック体のフォントは、SA1とL2との間にそれぞれSA2とL2の間の塩基対形成を示している。 DNAゲルの表2ヤング率（E）9-11,13,14,18,21。アクリルアミド濃度、架橋の割合、および架橋の長さはDNAゲルに変調することができる。設計1,2、及び3は、それぞれ、20,28、および40 bpの架橋長さを有する。すべてのデザインのための100％のゲルは、ゲル弾性に影響を与えない架橋長さを示す類似の弾性率を持っている。しかし、アクリルアミド濃度のばらつきはDNAゲルの弾性を変化させる。 
図1：DNAゲル架橋およびuncrosslinking概略図9-11,13,14,18,21手順1：SA1（赤）とSA2（青）を個別にポリアクリルアミドバックボーン（黒）に重合される。重合後、SA1およびSA2重合溶液が一緒に混合される。ステップ2：L2（緑）を添加し、ゲルの架橋を形成するSA1プラスSA2とハイブリダイズされる。ステップ3：R2がtとハイブリダイズ彼は、L2の足掛かり。ステップ4：R2の足掛かりハイブリダイゼーションは、SA1とSA2からL2の解凍を推進。 DNAクロスリンク 塩基の数 シーケンス（ 足掛かり ） 修飾 融解温度（T mは 、°C） コメント 5 '→3' デザイン1 SA1 10 GCA CCT TTG C 5 'アクリダイト 34.9 SA2 10 GTC AGA ATG A 5 'アクリダイト 23.6 L2 30 TCA TTC TGA C GC AAA GGT GC G CTA CAC TTG 56 10 bpの足掛かりシーケンスが含まれています。 R2 30 CAA GTGタグCGC ACC TTT GCG TCA GAA TGA R2はL2に相補的である デザイン2 SA1 14 CGT GGC ATA GGA CT 5 'アクリダイト 46.9 SA2 14 GTT TCC CAA TCA GA 5 'アクリダイト 40.2 L2 40 TCT GAT TGG GAA AC A GTC CTA TGC CAC G GT TAC CTT CAT C 65.9 12 bpの配列の足掛かりは含まれています。 R2 40 GAT GAA GGT AAC CGT GGC ATA GGA CTG TTT CCC AAT CAG A 65.9 R2はL2に相補的である 療nは3 SA1 20 ACG GAG GTG TAT GCA ATG TC 5 'アクリダイト 55 SA2 20 CAT GCTタグGGA CGA CTG GA 5 'アクリダイト 56.6 L2 40 TCC AGT CGT CCC TAA GCA TG G ACA TTG CAT ACA CCT CCG T 68.8 足掛かりは含まれていません。 コントロール コントロール 20-40 AAA AAA（ など ）や TTT TTT（ その他 ） デザイン 1 2 3 アクリルアミド濃度（％） 10 10 10 4 SA1プラスL2にハイブリダイズSA2（％架橋） 50 80 100 50 80 100 100 100 <強い>弾力性（キロパスカル、平均±SEM） 6.6±0.6 17.1±0.8 29.8±2.5 5.85±0.62 12.67±1.33 22.88±2.77 25.2±0.5 10.4±0.6
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Protocol
注：ゲル製剤からの細胞の処理にプロトコル全体は、6日以上かかります。ゲル調製のための推定時間は8時間プラスO / Nインキュベーションである。ゲル固定化し、DNAアニーリングの推定時間は8時間プラスO / Nがすすぎ工程である。ゲル官能化のための推定時間は2時間である。細胞播種と成長のための時間は、培養の種類やアプリケーションに依存しているが、4日以上が必要となります。
DNAのゲルの調製
注：三つの異なる段階でのDNAのゲルを準備します。まず、個別のPAバックボーンにSA1とSA2のssDNAを重合する。これらのソリューションは、（§1.1）は、それぞれ、SA1、重合液およびSA2重合したソリューションと呼ばれます。第二に、架橋剤は、可逆的鎖と、制御たssDNAを溶解する。凍結乾燥されたL2のssDNA（架橋剤）を溶解する。これは、100％L2溶液と呼ばれ、100％のゲル（§1.2）を作製するために使用される。 100％のL2溶液のアリコートを希釈し80％。これは、80％L2溶液と呼ばれ、80％のゲルを製造するために使用される。 §4で使用する凍結乾燥されたR2（可逆ストランド）と制御のssDNAに溶解する。それぞれ、100％および80％ゲルを形成する10：6（L2 SA1：SA2）第三に、10の比でSA1重合溶液、SA2重合溶液および100％または80％L2の溶液を混合する。 （§1.3）。
SA1とSA2重合した溶液の調製
- 表1及び表2から、適切なSA1、SA2、L2およびR2の塩基配列を選択し、注文する。塩基配列および配列長は、以前の報告9-11,13,14に最適化した。
- すべての溶液製剤（ 表3-4）を計算します。注：トラブルシューティングのために細心の注意を払った文書の計算。 Excelテンプレートの構築が推奨され、DNAゲル調製のために繰り返し使用することができる。 （デザイン2用集計の例については、 表3および4を参照してください表1および2）。表4に指定されたボリュームは、このプロトコル全体で使用されますが、ボリュームは凍結乾燥された一本鎖DNAの各分量に応じて変化する。
| ソリューション | ソリューションのストック濃度 | SA1やSA2溶液重合における原液の割合（V / V） | SA1やSA2重合した中の溶液の最終濃度 |
| アクリルアミド（なし - ビスアクリルアミド） | 40％ | 25 | 10％ |
| SA1やSA2ソリューション | 100％ | 60 | 60％ |
| TBEバッファー | 10倍 | 10 | 1倍 |
| TEMED | 20％ | 2.5 | 0.50％ |
| APS | 2％ | 2.5 | 0.05％ |
表3。SA1やSA2重合したソリューションを製造するためのソリューションの割合。最初の列は、DNAゲルを調合するためのソリューションを示しています。 2番目の列には、これらのソリューションのストック濃度を示している。 3列目SA1またはSA2重合溶液中のストック溶液のパーセンテージを示す（v / v）である。最後の列は、SA1とSA2ソリューションにおける最終濃度を反映している。
| ソリューションコンポーネント | |||||||
| ソリューション | ストック濃度 | 最終的な溶液濃度 | 計算 | 追加金額 | コメント | ||
| SA1ソリューション | 凍結乾燥されたSA1のssDNAの320.7ナノモル | 3.00 mMの | 320.7ナノモル/ 3.00ナノモルμlの-1 = 107μlの | 凍結乾燥された一本鎖DNAへのTE緩衝液107μlを | SA1溶液は、SA1、重合溶液の60％である。 | ||
| 107μL/ 0.600 = 178μlの | |||||||
| 178μlのSA1、重合溶液（ 表3）の全容積である。 | |||||||
| SA2ソリューション | 凍結乾燥したSA2のssDNAの324.4ナノモル | 3.00 mMの | 324.4ナノモル/ 3.00ナノモルμlの-1 = 108μlの | 凍結乾燥された一本鎖DNAへのTE緩衝液108μlを | SA2溶液は、SA2、重合溶液の60％である。 | ||
| 108μL/ 0.600 = 180μlの | |||||||
| 180μlをSA2、重合溶液（ 表3）の総容量である。 | |||||||
| 100％のL2ソリューション | 凍結乾燥されたL2のssDNAの657.4ナノモル | 3.00 mMの | 657.4ナノモル/ 3.00ナノモルμlの-1 = 219μlの | 凍結乾燥された一本鎖DNAへのTE緩衝液219μlを | 80％L2溶液に100％L2のアリコートを希釈 | ||
| 80％のL2ソリューション | 100％のL2のssDNAを80μl | 80％ | - | 100％のL2ソリューションを80μlにTE緩衝液20μl | |||
| 対照溶液 | 凍結乾燥されたの332.6ナノモルのポリTまたは一本鎖DNA | 3.00 mMの | 332.6ナノモル/ 3.00ナノモルμlの<SUP> -1 = 111μlの | 凍結乾燥された一本鎖DNAへのTE緩衝液111μlを | |||
| R2ソリューション | 凍結乾燥したR2のssDNAの193.8ナノモル | 3.00 mMの | 193.8ナノモル/ 3.00ナノモルμlの-1 = 64.6μlの | 凍結乾燥された一本鎖DNAへのTE緩衝液64.6μlの | |||
| 重合しソリューション（§1.2） | |||||||
| SA1重合したソリューション | 40％のアクリルアミド | 10％ | 178μlのX 0.25 = 44.5μlの | 45μlの | （上記の表3参照）178μlの総容量に基づいて、アクリルアミド、TBE、APSおよびTEMEDの量を計算します。 | ||
| 10×TBE | 1倍 | 178μlのX 0.10 = 17.8μlの | 18μlの | 100％SA1溶液 | 60％ | - | 107μlの | SA1溶液（上記表3参照）SA1重合溶液の60％である。 |
| 2％APS | 0.05％ | 178μlのX 0.025 = 4.45μlの | 4.5μlの | TEMEDを追加する前に、APSを加え、混合する。 | |||
| 20％TEMED | 0.50％ | 178μlのX 0.025 = 4.45μlの | 4.5μlの | ||||
| SA2重合したソリューション | 40％のアクリルアミド | 10％ | 180μlのX 0.25 = 45μlの | 45μlの | （上記の表3参照）を180μlの全体積を基準にしてアクリルアミド、TBE、APSおよびTEMEDの量を計算します。 | ||
| 10×TBE | 1倍 | 180μlのX 0.10 = 18μlの | 18μlの | ||||
| 100％SA2溶液 | 60％ | - | 108μlの | SA2溶液（上記表3参照）SA2重合溶液の60％である。 | |||
| 2％APS | 0.05％ | 180μlのX 0.025 = 4.5μlの | 4.5μlの | TEMEDを追加する前に、APSを加え、混合する | |||
| 20％TEMED | 0.50％ | 180μlのX 0.025 = 4.5μlの | 4.5μlの | ||||
| ゲル溶液（§1.3） | |||||||
| 100％のゲル溶液 | 100％SA1重合化ソリューション | 10部 | - | 10μlの | 以下SA1 100％ゲルを構成する：SA2：L2比10：10：6。 | ||
| 100％SA2の重合ゾルution | 10部 | - | 10μlの | ||||
| 100％のL2ソリューション | 6部 | - | 6μlの | ||||
| 80％のゲル溶液 | 100％SA1重合化ソリューション | 10部 | - | 10μlの | 以下SA1 80％ゲルを構成する：SA2：L2比10：10：6。 | ||
| 100％SA2重合化ソリューション | 10部 | - | 10μlの | ||||
| 80％のL2ソリューション | 6部 | - | 6μlの | ||||
| ダイナミックゲル（§3-4） | |||||||
| 80→100％ゲル | 80％ゲル | 100％GEL | 計算1： | 培養培地への100％のL2溶液1μl | 計算は、カバースリップ上に20μlのゲルを有することに基づいている。まず、μlの中にゲルの20μlの100％のL2ソリューションの一部を変換します。第二に、架橋の追加の20％のために必要な100％のL2液（μlの）量を算出する。ゲルに100％のL2液のこの量を追加します。 | ||
| （20μL/ 26部）6部= 4.6μlのX | |||||||
| 計算2： | |||||||
| 5μlのX 0.2 = 1μlの | |||||||
| 100→80％ゲル | 100％ゲル | 80％ゲル | 計算1： | 培養培地への100％のR2溶液1μl | 計算は、カバースリップ上に20μlのゲルを有することに基づいている。まず、Tに変換μlの中にゲルの20μlの100％のL2ソリューションの彼の部分。第二に、20％ゲルを構成するために除去する必要が100％L2溶液（μlの中で）の量を計算する。ゲルにR2液のこの量を追加します。 | ||
| （20μL/ 26部）6部= 4.6μlのX | |||||||
| 計算2： | |||||||
| 5μlのX 0.2 = 1μlの | |||||||
| 100％ゲル（コントロール） | 100％ゲル | 100％ゲル | - | 培養培地への制御溶液1μl | 対照溶液の量は、溶液を添加R2の量に相当する。 | ||
| 80％ゲル（コントロール） | 80％ゲル | 80％ゲル | - | 培養培地への制御溶液1μl | 対照溶液の量は、L2溶液を添加し、100％の量に相当する。 | ||
DNAゲルを調製するための表4の例の計算。モック数字は80％、100％、100→80％、80→100％ゲルを調製するための計算を説明するために提供される。 DNAゲルは、 表1のデザイン2である。
- すべてのssDNAを確保するために15秒2000×gで遠心分離し、凍結乾燥SA1のssDNAは、バイアルの底にある。注：SA1液の適切な濃度は、DNAゲル合成のために重要である。
- バイアル（ 表3-4）に1×トリス-EDTA、pH8.0緩衝液（TE緩衝液）の107 を添加することにより、SA1液の3mMのを準備します。
- 5分間または一本鎖DNAペレットが完全に溶解するまで70℃のTE緩衝液中の熱SA1。 NOTE：加熱温度はDNAが一本鎖状態であることを確認するために融解温度（T m）より5°Cの最小であるべきである。
- 40％のアクリルアミドを添加することによりSA1重合溶液を調製し、10xのトリス-ホウ酸-EDTA示さ割合で（TBE）バッファー（ 表3）。この例では、SA1溶液（ 表4）の107μlに、それぞれ、45および18μlを添加する。
- 3分間窒素ガスで脱気混合を容易にする。溶液中に窒素ガス源に取り付けP200先端を挿入し、ゆっくりと窒素ガスを溶液に通過させる。スプラッタを防止するために、前脱気SA1溶液に、水中の窒素ガスの流量を試験する。
- 解決策を収集するために、2000×gで15秒間遠心します。
- ゲル重合を開始するために、2％過硫酸アンモニウム4.5μlの（APS、 表3-4）を加える。
- 混合するチューブを数回転倒。
- 均質な重合のためのソリューションを収集するために、2000×gで15秒間遠心する。
- 重合を触媒するために20％のテトラメチルエチレンジアミン（TEMED、 表3-4）の4.5を添加する。
- チューブを反転ミックスを数回。
- 均質な重合のためのソリューションを収集するために、2000×gで15秒間遠心する。
- 3〜5分間窒素ガスで脱気し、重合を完了し、未反応モノマーを最小限にする。
- 重合を完了し、RTで10分間溶液をインキュベートする。注：このソリューションは、SA1、重合ソリューションと呼ばれています。
- 繰り返しますが、凍結乾燥SA2のssDNAと1.1.3-1.1.16を繰り返したが、アクリルアミドの45、18、4.5、および4.5μLを追加し、TBE、APSおよびTEMED、SA2溶液（ 表3-4）のそれぞれに108μlの。 NOTE：SA1およびSA2重合溶液は、1ヶ月まで4℃で保存することができる。
L2、R2、および制御ソリューションの調製
- 凍結乾燥されたR2のssDNAとの手順を繰り返しますが、1.1.3-1.1.5 TEバッファー（ 表4）の64.4μlを添加する。
- TE緩衝液111μlを（ 表4を凍結乾燥されたコントロールのssDNAと1.1.3-1.1.5の手順を繰り返しますが、追加
- 凍結乾燥されたL2のssDNAと1.1.3-1.1.5の手順を繰り返しますが、TEバッファー（ 表4）の219μlを添加する。注：これは100％のL2ソリューションです。 SA1、SA2、およびL2は、化学量論的に等価になるので（§1.3参照）SA1およびSA2重合ソリューション100％L2溶液を添加すると、100％架橋したDNAゲル（100％ゲル）を形成する。
- 100％L2溶液を80μl（ 表4）に1×TE緩衝液20μlを添加することにより80％、100％L2溶液のアリコートを希釈する。注：このソリューションは、80％のL2ソリューションです。 SA1およびSA2のわずか80％がL2に架橋されるため（§1.3参照）SA1およびSA2重合溶液への80％L2溶液を添加すると、80％の架橋されたDNAゲル（80％ゲル）を形成する。ソリューションは、1ヶ月まで4℃で保存することができる。
ゲル溶液の調製
- 溶液粘度が低下するまで70℃で加熱SA1およびSA2重合の溶液（約1分）。 80℃までの温度を上げる解決策はまだピペットにあまりにも粘性であれば、C。
- SA2の重合溶液（ 表4）を10μlまたは10部に10μlあるいはSA1重合した溶液を10部を追加します。注：SA1とSA2重合したソリューションは、ピペットに非常に粘性が困難である。濃度はゲル形成に重要であるため、これ以降の容積式ピペットを使用したり、その他の取り扱い技術のための説明を参照してください。また、複数の、少量のアリコート（>20μL）のではなく、単一の大きなボリューム内のピペット。
- （70℃で15秒間）加熱を交互に1分間の合計（ピペットチップで15秒間）しながら介して一緒SA1とSA2重合した溶液を混合。
- 100％ゲル（ 表4）を形成するために6μlの100％L2水溶液6部を加える。
- 加熱を交互にステップ1.3.3で説明したように撹拌することにより混合する。
- 最適なアニーリング温度（35℃）で1時間熱ゲル。計算最低溶融温度（ 表1）のssDNA配列から5°Cを減算することにより温度をnnealing。
- 60mmのペトリ皿に100％のゲルをピペットで。
- DNA架橋は、室温で4時間ゲルをインキュベートすることによりrehybridizeし続けることができるようにします。
- PBSをカルシウム及びマグネシウムを含有し、室温でO / Nインキュベートしてゲルをカバー。注：ゲルは約3倍の初期体積を膨張します。また、ゲルは、ゲルの外に拡散し、バッファと過剰アクリルアミドと平衡します。 PBS中のカルシウムとマグネシウムは、（ゲルバーストをtoubleshootingためのディスカッションを参照）DNAハイブリダイゼーションを安定化させ、ゲル破裂を防ぐ。
- ペトリ皿からの残りのバッファを削除します。
- 80％のゲルを製造するために、繰り返し1.3.1-1.3.10を繰り返したが80％のL2溶液とステップ1.3.4で100％のL2ソリューションを交換してください。 1ヶ月まで4℃で100％および80％ゲルを保管してください。注：80％〜100％ゲル剛性の違いは、物理的に区別可能である。 </オール>
- 約30秒間、またはゲルがピペッティングのために低粘度になるまで、70℃で100％のゲルを加熱する。
- 置きガラスカバーは、70℃のヒートブロック上に滑って1〜2分間加熱することができます。
- 各ガラスカバースリップへの光学接着剤の液滴を追加します。
- 各ガラスカバースリップ（ 表4）100％ゲル20μlのを追加します。注：10〜30μlを各カバースリップ上に分配することができます。
- ゲルが溶融し、ガラスカバースリップに広がるようにします。注：ゲル·トポロジーにも溶融後、シリコン処理ガラスカバースリップでゲルを平らに表示されない場合。しかし、追加の腫れがその後の工程で発生し、ゲルムラに貢献していきます。
- 24ウェル組織培養皿にヒートブロックと場所からガラス含有ゲルを取り外します。
- 8で、手順2.1から2.6を繰り返します 0％ゲル。
- 最適なアニーリング温度（35°C）で1時間熱ゲル。注：ゲルが乾燥することは正常であり、ゲルは、PBS中でインキュベートされたとき、これが解決されます。
- 15分間紫外線（UV 365 nm）の光に対して80％を含有するプレート100％ゲルを露出させる。注：UV露光が同時に接着剤を硬化し、ゲルを滅菌する。 UV架橋室が利用できない場合、ゲルは、生物学的安全キャビネットに搭載され、UV光下に置くことができる。 UV露光した後、ゲル無菌性を維持するために、生物学的安全キャビネットの下で、このプロトコルのその後の手順を実行します。また、これ以降の無菌溶液を使用しています。
- のDNA架橋が4時間、室温でrehybridizeできるようにします。
- PBSを加え、4℃でO / Nインキュベートする。注：PBSのインキュベーションは、リンス平衡、その繰り返しの加熱ゲルを脱水することができるので、再びゲルを膨潤する。
- ピペットでウェル中のバッファを削除し、ゲルを吸引しないように注意してください。注：ゲルを吸引する確率を減らすために真空吸引を行わないでください。
- オプション）ウォッシュゲルは、三度、室温で15分間過剰アクリルアミドモノマー、TEMEDおよびAPSを削除します。
- 各ゲルをカバーするためにスルホ - SANPAHの約300を添加する。
- 5分間のUV（365 nm）にゲルを公開します。
- スルホ - SANPAHを削除します。
- 過剰スルホSANPAHを除去するためにPBSで一回ゲルを洗浄します。
- 繰り返します3.3から3.6を繰り返します。
- RTで1時間、ポリ-D-リジン0.2 mg / mlでの約300μlのまたはO / Nで4℃でゲルをインキュベートする。注：別の方法として、コラーゲン1型、O / N、4℃での0.2 mg / mlのでゲルをインキュベートする。
- 過剰のポリ-D-リジンを除去するために5分間のPBSで2回ゲルを洗浄する。
- ゲルを平衡化し、30分間のメディア約300μlの中でゲルをインキュベートする。
- すぐに細胞を播種する前に、メディアを取り出します。
- プレート細胞。解剖および/ またはこの資料に記載された神経細胞や線維芽細胞の培養に関するプロトコルの場合、以下の出版9-11,19-21のいずれかを参照。
- 48時間の最小値後、ゲル（ 表4）に近い制御、L2、またはR2溶液1μlをピペッティングすることによって、ゲルの剛性を調節する。
- （80→100％ゲル）、架橋80％から100％までのゲルを補強するために、ゲルに近い100％のL2溶液1μlを添加することにより、80％のゲルにL2の残りの20％を加算。
- 架橋の80％（100→80％ゲル）を100％からゲルを柔らかくするために、R2がゲルに100％に近いR2溶液1μlを添加することにより、100％のゲルからの架橋の20％を除去するために追加する。
- コントロールの場合、ゲルに近い対照溶液1μlを添加することにより、100％および80％ゲルのサブセットにコントロール溶液の等容量を追加します。
- 後に所望の細胞処理及びデータ分析を実行48時間の最小値。
ガラス上の2。ゲルの固定化
注：ガラスカバースリップ上に100％または80％ゲルのアリコートを固定化する（ 図2）。
51323 / 51323fig2highres.jpg "/>
ゲル固定化および官能化の図2の回路図 （灰色）DNAゲルを調製した後、ゲルを、光学接着剤（緑）でガラスカバースリップ（白）に取り付けられている。ゲルは、同時に硬化させ、UV光により滅菌される。膨潤後、ゲルは、約1mmの厚さである。次に、ゲルは、二段階プロセス（赤概説ボックス）で官能化される。まず、スルホ-SANPAH、UV光照射によってゲル表面にアクリルアミドに結合される。第二に、ゲルはコラーゲンまたはスルホ-SANPAHでスルホ-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルに付着したポリ-D-リジン、と共にインキュベートする。この図は、10から変更されている。
3ジェル機能化
NOTE：ポリアクリルアミドゲルは、不活性材料（ 図2）であるので、DNAゲル官能化は、細胞接着に必要とされる。このセクションでは、ゲルは、二段階で官能化される。まず、N -Sulfosuccinimidyl -6-（4 -＃39; - アジド2'-ニトロフェニルアミノ）ヘキサン酸またはスルホ-SANPAHが共有結合するDNAゲルのポリアクリルアミドバックボーンにニトロフェニルアジド基の光分解によってリンクされます。第二に、コラーゲンまたはポリ-D-リジンでの第一級アミンは、ゲル表面にタンパク質を付着させるスルホ- SANPAHにおけるスルホNヒドロキシスクエステルに添付します。
4。細胞培養およびイメージング
注：このセクションでは、細胞播種後のゲルの軟化または補強に関する詳細を提供する。詳細な細胞培養プロトコルは、いくつかの理由のために設けられていない。まず、多数の細胞型は、DNAゲルに付着することができ、各細胞型は、細胞播種のために研究者によって特定の調整を必要とする。第二に、標準的な細胞および組織培養技術は、これらの実験のために使用され、数多くのオリジナルの記事、技術資料、および参考書に記載されています。特に、DNAゲルに線維芽細胞と神経細胞をメッキするための技術はpreviに記載されていますOUの出版物9-11,19-21。
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Representative Results
本発明者らの研究に先立って、細胞 - ECM相互作用は、静的に準拠生体材料上または不可逆一方向動的基板上に観察された。これらの基板は、正確な細胞の微小環境の動的な性質を反映していない。私たちの仕事は、動的な生体材料を軟化し、補強に細胞-ECM相互作用を研究するための、より生理的なモデルを提供することで、既存の技術上のパラダイムをシフトする。以前の研究では、これらのゲル上のさまざまな細胞形態及び表現型を調べることによって、細胞上のダイナミック基質の効果を分析した。一例では、動的なDNAのゲル上で線維芽細胞形態を評価することにより、線維芽細胞上の基板補強の効果を決定した。 L929細胞は、マウス由来の線維芽細胞株は、80％および100％ゲル（ 図3）11上にプレーティングした。二日めっき後、20％の追加L2溶液は、架橋された100％（80→100％、中央パネルにゲルを硬くするために、80％ゲルの培地に添加した）。 100％のゲルおよび80％のゲルの別のセット（それぞれ右および左のパネル）、静的なままに制御たssDNAを受けた。光学顕微鏡画像は二日間の媒体へのDNAの送達後に捕捉した。画像のぼけは、 図3に示すように、ゲル表面の凹凸に起因した、典型的な及び不可避である。ゲルの膨潤と収縮は、バッファとL2 18,21が付加した、凹凸をゲル化に貢献します。形態は、ImageJソフトウェア（NIH、ベセスダ、MD）を用いて評価し、機能の指標として用いた。補剛ゲル（80→100％）上で増殖させた線維芽細胞は、アスペクト比には変化を及ぼさなかったが、100％のゲル11上に成長させた線維芽細胞よりも大きな投影面積を示した。興味深いことに、静的なゲル上で増殖させた線維芽細胞の形態は、動的なゲル上で増殖させた線維芽細胞の形態学に似ていないでした。 100％のゲル上で成長させた線維芽細胞を80％ゲル上で増殖させた線維芽細胞よりも小さな投影面積より大きなアスペクト比を有した。これらの再sultsは、線維芽細胞の挙動は、微小環境の動的な性質に依存していることを示している。別の研究では、ニューロンに軟化材の効果は、樹状突起の数は、樹状突起の長さ、および軸索の長さ（ 図4）10を含むニューロン表現型を分析することによって決定した。ラット由来の脊髄ニューロンの100％および50％ゲル上で成長させた。四日間プレーティング後、50％R2は、架橋の50％（100→50％、中央パネル）にゲルを柔らかくするために、100％のゲルの培地に添加した。 50％ゲル、100％ゲルの別のセット（それぞれ右および左のパネル）、静的なままに制御たssDNAを受けた。 3日後、神経細胞を固定し、樹状突起のマーカー（MAP2、上パネル）、軸索マーカー（タウ、中央のパネル）で免疫染色し、核（DAPI、下のパネル）は、表現型を評価すること。軟化ゲル（100→50％）上で成長した神経細胞は、一次デンドライト番号または軸索の長さに差がなかったが、oを成長したニューロンよりも短く、一次樹状突起を示した nは、50％ゲル。線維芽細胞の研究と同様に、静的なゲル上の神経表現型は、動的なゲル上の神経表現型に似ていないでした。 50％ゲル上で成長したニューロンは、より少ない一次デンドライト100％ゲル上で成長したニューロンよりも長い軸索を有していた。結論として、線維芽細胞及びニューロンの画像がDNAゲルムラが画像化の課題が発生し、標準的な形態学的および免疫染色技術は実現可能であり、そして最も重要な細胞の挙動は、基板のダイナミクスに依存する、複数の細胞型は、動的および静的なDNAのゲル上で試験することができることを示している。
静的および動的なDNAのゲル上で成長させ、図3芽細胞。L929線維芽細胞の代表的な光学顕微鏡画像は、80％（左パネル）、80→100％（中央パネル）、および100％ゲル（右パネル）上に成長させた。スケールバーは100μmである。この図は、11から変更されている。のhref = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51323/51323fig3large.jpg"ターゲット= "_ブランク」>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
DNAのゲル上で成長させた図4のニューロン100％（左パネル）上に成長した脊髄ニューロンの代表的な蛍光画像、100→50％（中央パネル）、および50％（右パネル）のゲル。 MAP2の免疫染色は、タウ-1免疫染色は軸索（中央のパネル）を示す樹状突起（上部パネル）を示し、DAPI染色は核（下部パネル）を示している。スケールバーは100μmである。この図は、10から変更されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
細胞接着は、それらの細胞機能に対する動的な組織の剛性の役割を研究するための理想的なモデルとなる前と後の軟化または硬くするDNAゲルの能力。すべての3つの設計では、機械的および生物学的研究に使用されている。しかし、すべての3つのデザインは、架橋の長さはDNAゲル弾性（ 表2）影響を与えないことを示す、さまざまな架橋の割合で同様弾力性を持っている。これとは対照的に、アクリルアミド濃度は、弾力性に影響を与えます。これらの設計は、ゲル破裂傾向ので、架橋反応速度が異なっていてもよい、またはゲルの傾向がメディアやバッファに溶解するために、架橋長さの増加と共に減少する。しかし、DNAのゲル上の動態情報は限られているが、私たちは、架橋のさらに30％が二日、50％のDNAのゲルへのL2配信11の後に発生を知っていますか。それにもかかわらず、ゲルの軟化や補強から広大と収縮力の発生は、それぞれ、避けられないと切り離すことができません18,21。より多くのエネルギーがssDNAの18の三スタンド間で結合を形成する必要があるため50→100％ゲルは、わずか約0.04の応力Paとを生成しながら、100→70％のゲルは、応力21の約0.5Paとを生成する。そのため、結果の解釈には、補強およびゲルの軟化による応力とひずみの考慮を必要とします。
DNAゲルを調製する際に技術的な課題が発生することがあります。最も頻繁に技術的な問題は、ゲルバーストです。ゲルバーストは、ゲルの膨潤、ストレージ、および細胞増殖を含むDNAのゲル製剤のいくつかの段階の間に起こり得る。ゲルバーストは、複数の要因によって引き起こされます。まず、ゲルバーストは、不適切な溶液組成の結果であり得る。一般的なエラーは、凍結乾燥のssDNAと粘性液体の不適切なピペッティングの不十分な溶解が含まれています。ピペット操作エラーを回避するために、溶液のより容易なピペット操作のためのゲルの粘度を減少させるかまたは必要な時をアリコートに加熱温度を上昇させるSA1と第二窒素バブリング段階の前SA2、重合液のount。また、重合溶液の繰り返し加熱は部分的に溶液を蒸発させ、溶液粘度を増加させることができる。 TEバッファーの数マイクロリットルを追加すると、粘度を低減するのを助けることができる。第二に、ゲルバーストが悪いDNAの質の結果であり得る。 QA / QCレポートが頻繁に見直す必要があります。 QA / QCレポートは許容可能であり、ゲル破裂が発生する場合、HPLC精製された一本鎖DNAは、DNAの品質を向上させることができます。第三に、ゲルバーストが不十分なDNAアニーリングから生じ得る。私たちは（; 1.3.8および2.10、それぞれステップ1.3.6および2.8を参照）、元のプロトコルにおけるアニーリング工程および再ハイブリダイゼーションステップを含めることで、ゲルバーストの発生率が減少している。ゲルバーストは、アニールおよび冷却時間を延長することによって防止されることがあります。しかし、熱に追加の曝露は、ゲルを再膨潤された場合、ガラスからのゲルの剥離の増加を引き起こすために水を蒸発させることができる。剥離は、任意のアニール時間のために過剰である場合には、アンイーリングのステップは（1.3.6及び2.8）を排除することができる。
直面する別の頻繁な技術的問題は、不十分な細胞接着である。膨潤したゲルは、細胞接着が困難膨潤ゲル（ 表2）18 よりも柔らかい。各細胞型、組織剛性に対して異なる応答するので、他の細胞型にはないながらさらに、いくつかの細胞型は、この技術的なジレンマが発生することがあります。以下のステップのいくつか考慮すべき接着の問題を解決するには、次の（1）、（3）剛性パラメータを調節する、（2）スルホ-SANPAHをコンジュゲートECMタンパク質を交互に、高い播種密度を使用する（4）ECMタンパク質を増やすかスルホ-SANPAH濃度、および（5）インキュベーション時間を増大させる。そのようなアクリルアミドモノマー、APSおよびTEMEDなどの残留毒性剤はまた、ゲル上の接着および細胞死の欠如に寄与し得る。プロトコルに組み込まれた徹底的な洗浄が十分であることが証明されているので、私たちは、この問題を経験していないが、私たちはPERFをお勧めしますこの問題が発生した場合、オプションの手順3.2 orming。
DNAゲルは、より効果的に動的または静的条件下で細胞のさまざまな機能を研究するために利用することができる。私たちは、DNAのゲル上で成長させた線維芽細胞およびニューロンがゲル弾性の調節により影響されることが示されている。細胞 - マトリックス相互作用は、典型的には、三次元のインターフェースであるため、三次元の動的マトリックス研究からの情報をより生物学的に関連するデータを生成するために役立つ。そこで、現在、三次元骨格にこの技術を翻訳している。私たちは、DNA架橋技術を維持しながら、より多くの生体適合性材料でポリアクリルアミドバックボーンを置き換える技術を開発している。この新しい足場は、三次元、動的モデル及び組織工学足場として機能する。その生体適合性は、医療用デバイス用途のための機会を開く。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もない。
Acknowledgments
作者は感謝したいと思います：博士フランク·江、デビッド·リン博士バーナードYurke博士ウダイChippadaをDNAゲル技術の開発に貢献するために、博士ノレルHadzimichalis、スミット·シャー、キンバリーピーターマン、ロバートArterこの原稿の彼らのコメントや編集をするため;脊髄研究に関するニュージャージー委員会（助成＃07A-019-SCR1、NAL）とニュージャージー神経科学研究所（MLP）を含む資金調達源; 図3を転載する許可を図2と図4およびバイオマテリアルを転載する許可のための組織工学のパブリッシャー、パートA。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ssDNA | Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) idtdna.com |
Do not vortex ssDNA. Gentle invert the vial and/or pipette solution to mix. | |
| PBS with calcium and magnesium | Any brand. | ||
| 100x Tris-EDTA buffer (TE buffer) | Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) sigmaldrich.com |
T9285 | |
| 10x Tris-Borate-EDTA buffer (TBE buffer) | Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) | 93290 | TBE is a reproductive toxin. |
| 40% Acrylamide solution | Fisher Scientific (Pittsburg, PA) | BP14021 | Acrylamide is a toxin. |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) | A3678 | Prepare a 2% solution in TE buffer. APS is a toxin and irratant. |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) | T9281 | Prepare a 20% solution in TE buffer. TEMED is flammable, a corrosive, and a toxin. |
| 12 mm diameter round coverglass | Fisher Scientific (Pittsburg, PA) fishersci.com |
12-545-82 | |
| Norland optical adhesive 72 | Norland Products (Cranbury, NJ) norlandprod.com |
NOA72 | |
| 24-well tissue culture plate | Any brand. | ||
| Microcentrifuge tubes | Any brand. | ||
| Sulfo-SANPAH | ProteoChem or Thermo Fisher, (Rockland, IL) proteochem.com or thermofisher.com |
C111 or 22589 | Prepare a 0.315 mg/ml solution in water immediately before use. Dissolve at 37 °C and filter sterilze. It is normal to observe undisolved sulfo-SANPAH in the filter. Sulfo-SANPAH is light sensitive and, therefore, the solution should be protect from light until UV exposure. |
| Poly-D-Lysine (PDL) | Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) | P6407 | Prepare a 0.2 mg/ml solution in water and filter sterilize. |
| Collagen Type I | Affymetrix (Santa Clara, CA) affymetrix.com |
13813 | Prepare a 0.2 mg/ml solution in 0.2 N acetic acid. Solution needs to remain cold at all times to avoid polymerization. Acetic acid is a flammable, toxic, and corrosive. |
| 22 x 60 cover glass | Fisher Scientific (Pittsburg, PA) | 12-544-G | |
| Positive-displacement pipette | Gilson, Inc (Middletown, WI) gilson.com |
F148504 | |
| Heat block | Fisher Scientific (Pittsburg, PA) | 11-718 | |
| UV light source | Place gels as close as possible to the UV light. UV light can cause skin or eye injury. | ||
| Thermometer | Any brand. | ||
| Nitrogen gas | GTS-Welco (Flemington, NJ) www.praxairmidatlantic.com/ |
NI 5.0UH-R |
References
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