Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Framställning av DNA-tvärbundet Polyacrylamide Hydrogeler

Published: August 27, 2014 doi: 10.3791/51323
Automatic Translation
1, 2,3
1New Jersey Neuroscience Institute, JFK Medical Center, 2Department of Biomedical Engineering, Rutgers University, 3Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Rutgers University

Summary

Vårt laboratorium har utvecklat DNA-tvärbunden polyakrylamid hydrogeler, ett dynamiskt hydrogelsystem, för att bättre förstå effekterna av modulerande vävnad styvhet på cellfunktion. Här ger vi scheman, beskrivningar och protokoll för att förbereda dessa hydrogel.

Abstract

Mechanobiology är ett framväxande vetenskapsområde som behandlar den kritiska roll fysiska signaler för att styra cell morfologi och funktion. Till exempel är effekten av vävnad elasticitet på cellfunktionen ett större område i mechanobiology forskning eftersom vävnaden styvhet modulerar med sjukdomen, utveckling, och skadan. Statiska vävnadsliknande material eller material som inte kan förändra styvhet när celler är pläterade, övervägande används för att undersöka effekterna av vävnads styvhet på cellfunktioner. Även information som samlats in från statiska studier är värdefullt, dessa studier tyder inte på den dynamiska karaktären hos den cellulära mikromiljö in vivo. För att bättre hantera effekterna av dynamisk styvhet på cellfunktion, utvecklade vi ett DNA-tvärbunden polyakrylamid hydrogel systemet (DNA geler). Till skillnad från andra substrat, DNA-geler har möjlighet att minska eller öka i styvhet efter tillverkning utan stimuli. DNA-geler består av DNA crosslbläck som polymeriseras i en polyakrylamid ryggrad. Lägga till och ta bort tvärbindningar via leverans av enkelsträngat DNA möjliggör tidsmässiga, rumsliga och reversibel styrning av gel elasticitet. Vi har visat i tidigare rapporter som dynamisk modulering av DNA-gel elasticitet påverkar fibroblaster och neuron beteende. I den här rapporten och video, erbjuder vi ett schema som beskriver DNA gel tvärbindningsmekanismer och steg-för-steg-instruktioner om förberedelser DNA geler.

Introduction

Statiska och dynamiska substrat finns två kategorier av biomaterial som utvecklats för att studera effekterna av vävnadselasticitet eller stelhet på cellfunktion. Statiska substrat inte kan ändra sina fysiska egenskaper när de tillverkas och / eller en gång celler stryks. Polyakrylamid (PA) geler var de första tvådimensionella, statiska substrat som syntetiserades för mechanobiology utredningar 5,17. PA geler är lätt att förbereda, billig, mångsidig, och kan tillverkas med ett brett utbud av elastiska moduler. Även om dessa tekniska fördelar gör PA geler en allmänt vedertagen substrat, statiska substrat är inte ett tecken på den dynamiska karaktären av den extracellulära matrix (ECM) och omgivande cellmiljö in vivo. Exempelvis undergår ECM styvhets förändringar som ett resultat av skada, utveckling, eller sjukdom. Dynamiska substrat därför gynnas som vävnadsliknande substrat modeller i mechanobiology studier

Många syntetiska, har naturliga, två-dimensionell, tredimensionella, statiska och dynamiska biomaterial tagits fram för att efterlikna vävnads styvhet 1,3,6,16,23,26. Några dynamiska substrat kräver värme, UV, elektrisk ström, joner och pH-förändringar för att ändra deras mekaniska egenskaper 2,4,7,8,12,15,16, men dessa stimuli kan begränsa hydrogel bio-ansökan. DNA-tvärbunden polyakrylamid hydrogeler (DNA geler) är dynamiska tvådimensionella elastiska substrat. DNA tvärbindningar möjliggör tids, rumslig och reversibel modulering av DNA-gel styvhet genom tillsats av enkelsträngat DNA (ssDNA) till media eller buffert 9-11,13,14,18,21. Till skillnad från de tidigare nämnda dynamiska geler där stimuli tillämpas för modulering av elasticitet, DNA-geler förlitar sig på spridning av tillämpad ssDNA för ändring av elasticitet. Därför är den övre gelytan, där celler odlas, är det första området moduleras eftersom hastigheten of elasticitet modulering är beroende av den gel tjocklek.

DNA-geler liknar deras PA gel motsvarigheter i att de har en polyakrylamid ryggrad, men de bis-akrylamid tvärbindningar ersätts med tvärbindningar består av DNA (figur 1). Två ssDNA (SA1 och SA2) hybridiserar med en tvärbindnings sträng (L2) för att kompensera DNA tvärbindningar i gelen. SA1 och SA2 har olika sekvenser som både innehåller en Acrydite modifiering vid 5'slutet för effektiv inkorporering i PA-nätverket. För beredning av geler, SA1 och SA2 är individuellt polymeriseras till ett PA ryggrad och därefter är den polymeriserade SA1 och SA2 blandas. L2, tvärbind, läggs till i SA1 och SA2 blandning. L2 bassekvensen kompletterar både SA1 och SA2 sekvenser och L2 hybridiserar med SA1 plus SA2 för att bilda DNA-tvärbindningar. Initial, DNA gel elasticitet bestäms både L2 koncentrationer och tvärbindning (tabellerna 1 2). DNA-geler som innehåller lika stökiometriska mängder L2, SA1 och SA2 är de styvaste geler eftersom SA1 och SA2 är 100% tvärbunden med L2 (betecknad som 100% geler). Lägre koncentrationer av L2 resultat i en lägre andel av DNA tvärbindning och därför är mjukare DNA geler. Gel så låga som 50% tvärbunden (betecknad som 50% geler) har konstruerats 9-11.

Figur 1
Figur 1 DNA gel tvärbindning och uncrosslinking schema 9-11,13,14,18,21 Steg 1:. SA1 (röd) och SA2 (blå) är individuellt polymeriseras i en polyakrylamid ryggrad (svart). Efter polymerisation är SA1 och SA2 polymeriserade lösningar blandas. Steg 2: L2 (grön) tillsättes och hybridiserar med SA1 plus SA2 för att bilda de tvärbindningar i gelén. Steg 3: R2 hybridiserar med than toehold av L2. Steg 4: toehold hybridisering av R2 driver unzipping av L2 från SA1 och SA2.

Till skillnad från PA-geler, kan DNA-geler stelna och mjuka efter syntes. Därför kan celler odlas på DNA-geler utsättas för dynamiska styvhetsändringar. Att styva cell vidhäftande geler, kan L2 sättas till odlingsmedia låga procentuella geler för att öka andelen tvärbindningar. För att mjuka upp cell vidhäftande geler, kan L2 tas bort för att minska andelen tvärbindningar 10,13,21. L2 har en ytterligare toehold sekvens vid 3'-änden för att tillåta L2 till uncrosslink från SA1 och SA2 (tabell 1). Borttagning av L2 åstadkommes genom hybridisering av en återföring sträng heter R2. R2 är komplementär med den fulla längden av L2 och hybridiserar först med L2 toehold. Toehold hybridisering propels unzipping av L2 från SA1 och SA2, vilket eliminerar tvärbindning och minskar gel styvhet.

I denna rapport ochvideo, steg-för-steg-instruktioner finns för beredning av hårdnande och mjukgörande DNA geler. Medan 100% och 80% gel preparat beskrivs, kan detta protokoll anpassas för att skapa DNA-geler av andra ursprungliga och slutliga tvärbundna procentsatser. I allmänhet är 100% och 80% geler beredda, immobiliseras på täckglas, funktionaliserad, och ympades med celler. L2 sättes till mediet av 80% geler och R2 sätts till medierna av 100% geler, 48 h efter utstrykning. Tillsatsen av L2 till media stelnar 80% geler till 100% tvärbunden, medan tillägg av R2 till media mjuknar 100% geler till 80% tvärbunden. Förstyvade geler betecknas som 80 → 100% geler och mjuk geler betecknas som 100 → 80% geler i texten. För kontroll eller statiska geler, ssDNA bestående av Ts eller As levereras till en annan uppsättning av 100% och 80% geler. Efter minst två dagar efter elasticitet modulation kan celler bearbetas och analyseras.

DNA-tvärbindning # Av baser Sequence (toehold) Modifiering Smälttemperaturen (Tm, ° C) Kommentarer
5 '→ 3'
Design 1 SA1 10 GCA CCT TTG C 5 'Acrydite 34,9
SA2 10 GTC AGA ATG A 5 'Acrydite 23,6
L2 30 TCA TTC TGA C GC AAA GGT GC G CTA CAC TTG 56 En 10 bp toehold sekvensen ingår.
R2 30 CAA GTG TAG CGC ACC TTT GCG TCA GAA TGA R2 är komplementär till L2
Design 2 SA1 14 CGT GGC ATA GGA CT 5 'Acrydite 46,9
SA2 14 GTT TCC CAA TCA GA 5 'Acrydite 40,2
L2 40 TCT GAT TGG GAA AC A GTC CTA TGC CAC G GT TAC CTT CAT C 65,9 En 12 bp sekvens toehold ingår.
R2 40 GAT GAA GGT AAC CGT GGC ATA GGA CTG TTT CCC AAT CAG A 65,9 R2 är komplementär till L2
Design 3 SA1 20 ACG GAG GTG TAT GCA ATG TC 5 'Acrydite 55
SA2 20 CAT GCT TAG GGA CGA CTG GA 5 'Acrydite 56,6
L2 40 TCC AGT CGT CCC TAA GCA TG G ACA TTG CAT ACA CCT CCG T 68,8 Toehold ingår inte.
Kontroll Kontroll 20-40 AAA AAA (etc.) eller
TTT TTT (mm)

Tabell 1. bassekvenser för ssDNA 9-11,13,14,18,21. Cellulär och mekaniska studier har använt flera different tvärbindnings mönster för att skapa DNA-geler med en rad statiska och dynamiska mekaniska egenskaper. Parametrarna module i tvärbindnings designen är bassekvens och sekvenslängden eller cross längd. Fet och kursiverade teckensnitt illustrera baspaming mellan SA1 och L2 och mellan SA2 och L2.

Design
1 2 3
Akrylamid Koncentration (%) 10 10 10 4
SA1 plus SA2 hybridiserades till L2 (% tvärbunden) 50 80 100 50 80 100 100 100
<strong> Elasticitet (kPa, medelvärde ± SEM) 6,6 ± 0,6 17,1 ± 0,8 29,8 ± 2,5 5,85 ± 0,62 12,67 ± 1,33 22,88 ± 2,77 25,2 ± 0,5 10,4 ± 0,6

Tabell 2. Youngs modul (E) av DNA-geler 9-11,13,14,18,21. Akrylamid koncentration, tvärbindningsprocent och tvärbindningslängd kan moduleras i DNA-geler. Motiv 1, 2, och 3 har 20, 28, och 40 bp tvär längder, respektive. 100% geler för alla mönster har liknande moduler som anger tvärbindningslängden påverkar inte gel elasticitet. Men variationer i koncentration akrylamid förändrar DNA gel elasticitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OBS: Hela protokollet från gelpreparat till cellbearbetningen tar minst sex dagar. Beräknad tid för gelpreparat är 8 timmar plus ett O / N inkubation. Beräknad tid för gel immobilisering och DNA glödgning är 8 timmar plus ett O / N sköljsteg. Beräknad tid för gel funktion är 2 tim. Dags för cell plätering och tillväxt är beroende av kultur typ och applikation, men det krävs minst fyra dagar.

1 Beredning av DNA-Gel

OBS: Förbered DNA geler i tre distinkta steg. Först individuellt polymeriserar SA1 och SA2 ssDNA till ett PA ryggrad. Dessa lösningar kallas SA1 polymeriserade lösning och SA2 polymeriserade lösning, respektive (§1.1). För det andra, lös tvärbindaren, reversibel sträng, och kontroll ssDNA. Lös det frystorkade L2 ssDNA (tvärbindare). Detta kallas 100% L2-lösning och används för att tillverka 100% geler (§1.2). Späd en alikvot av 100% L2 lösningtill 80%. Detta kallas 80% L2-lösning och används för att tillverka 80% geler. Lös frystorkad R2 (reversibel sträng) och kontroll ssDNA att använda i § 4. Tredje, blanda SA1 polymeriserad lösning, SA2 polymeriserad lösning, och 100% eller 80% L2-lösning i ett förhållande av 10: 10: 6 (SA1: SA2: L2) för att bilda 100% och 80% geler, respektive. (§1.3).

1 Beredning av SA1 och SA2 Polymeriserade Solutions

  1. Välj och beställa rätt SA1, SA2, L2 och R2 bassekvenser från tabell 1 och 2. Base sekvenser och sekvenslängden optimerades i tidigare rapporter 9-11,13,14.
  2. Beräkna alla lösningsformuleringar (tabellerna 3-4). OBS: minutiöst dokument beräkningar för felsökning. Konstruktion av en Excel-mall som rekommenderas och kan användas flera gånger för DNA gelpreparat. Se tabell 3 och 4 för ett exempel på tabulering för design 2 (Tabellerna 1 och 2). De volymer som anges i tabell 4 kommer att användas i hela detta protokoll men volymerna varierar med varje portion av frystorkat ssDNA.
Lösning Stock Koncentration av lösning Andel av Stock Solution i SA1 eller SA2 Polymeriserad Solution (v / v) Slutlig koncentration av lösning i SA1 eller SA2 Polymeriserad Solution
Akrylamid (No-bisakrylamid) 40% 25 10%
SA1 eller SA2 lösning 100% 60 60%
TBE-buffert 10x 10 1x
TEMED 20% 2,5 0,50%
APS 2% 2,5 0,05%

Tabell 3. Andel av lösningar för tillverkning av SA1 och SA2 polymeriserade lösningar. Den första kolumnen visar lösningar för att formulera de DNA-geler. Den andra kolumnen visar aktiekoncentrationer av dessa lösningar. Den tredje kolumnen visar andelen stamlösningarna i SA1 eller SA2 polymeriserade lösningar (v / v). Den sista kolumnen visar de slutliga koncentrationerna i SA1 och SA2 lösningar.

ssDNA lösningar (§1.1) <tr>
Lösningskomponenter
Lösning Stock Koncentration Final Solution Koncentration Beräkning Belopp att lägga Kommentarer
SA1 lösning 320,7 nmol lyofiliserad SA1 ssDNA 3,00 mM 320,7 nmol / 3,00 nmol il -1 = 107 | il 107 pl TE buffert till frystorkad ssDNA SA1 lösning är 60% av SA1 polymeriserade lösning.
107 | il / 0,600 = 178 l
178 l är den totala volymen av SA1 polymeriserade lösning (tabell 3).
SA2 lösning 324,4 nmol lyofiliserad SA2 ssDNA 3,00 mM 324,4 nmol / 3,00 nmol il -1 = 108 | il 108 pl TE buffert till frystorkad ssDNA SA2 lösning är 60% av SA2 polymeriserade lösning.
108 | il / 0,600 = 180 l
180 l är den totala volymen av SA2 polymeriserade lösning (tabell 3).
100% L2 lösning 657,4 nmol lyofiliserad L2 ssDNA 3,00 mM 657,4 nmol / 3,00 nmol il -1 = 219 | il 219 pl TE buffert till frystorkad ssDNA Späd en alikvot av 100% L2 till 80% L2 lösning
80% L2 lösning 80 ^ 100% L2 ssDNA 80% - 20 pl TE-buffert till 80 ^ 100% L2-lösning
Kontroll lösning 332,6 nmol av frystorkad poly T eller A ssDNA 3,00 mM 332,6 nmol / 3,00 nmol il <sup> -1 = 111 l 111 pl TE buffert till frystorkad ssDNA
R2 lösning 193,8 nmol lyofiliserad R2 ssDNA 3,00 mM 193,8 nmol / 3,00 nmol l -1 = 64.6 il 64.6 il TE-buffert till frystorkad ssDNA
Polymeriserade lösningar (§1.2)
SA1 polymeriserad lösning 40% akrylamid 10% 178 pl x 0,25 = 44,5 l 45 | il Beräkna mängden akrylamid, TBE, APS och TEMED baserat på en total volym av 178 | il (se ovan och tabell 3).
10x TBE 1x 178 pl x 0.10 = 17,8 l 18 | il
100% SA1 lösning 60% - 107 | il SA1 lösning är 60% av SA1 polymeriserade lösningen (se ovan och tabell 3).
2% APS 0,05% 178 | il x 0,025 = 4,45 ^ il 4,5 ^ il Lägg och blanda APS innan du lägger TEMED.
20% TEMED 0,50% 178 | il x 0,025 = 4,45 ^ il 4,5 ^ il
SA2 polymeriserad lösning 40% akrylamid 10% 180 pl x 0,25 = 45 il 45 | il Beräkna mängden akrylamid, TBE, APS och TEMED baserat på en total volym av 180 | il (se ovan och tabell 3).
10x TBE 1x 180 pl x 0,10 = 18 | il 18 | il
100% SA2 lösning 60% - 108 | il SA2 lösning är 60% av SA2 polymeriserade lösningen (se ovan och tabell 3).
2% APS 0,05% 180 pl x 0,025 = 4,5 l 4,5 ^ il Lägg och blanda APS innan du lägger TEMED
20% TEMED 0,50% 180 pl x 0,025 = 4,5 l 4,5 ^ il
Gel lösningar (§1.3)
100% gel-lösning 100% SA1 polymeriserad lösning 10 delar - 10 | il Samman 100% geler med följande SA1: SA2: L2-förhållande, 10: 10: 6.
100% SA2 polymeriserad solmepannor 10 delar - 10 | il
100% L2 lösning 6 delar - 6 | il
80% gel lösning 100% SA1 polymeriserad lösning 10 delar - 10 | il Samman 80% geler med följande SA1: SA2: L2-förhållande, 10: 10: 6.
100% SA2 polymeriserad lösning 10 delar - 10 | il
80% L2 lösning 6 delar - 6 | il
Dynamiska geler (§3-4)
80 → 100% gel 80% gel 100% GEl Beräkning 1: 1 l av 100% L2-lösning till odlingsmedia Beräkningarna baseras på att ha 20 il geler på täckglas. Först konvertera delar av 100% L2-lösning i 20 pl gel i pl. För det andra, beräkna mängden (i l) av 100% L2-lösning som behövs för ytterligare 20% av tvärbindning. Lägg till detta belopp på 100% L2-lösning till gel.
(20 l / 26 delar) x 6 delar = 4.6 l
Beräkning 2:
5 ^ x 0,2 = 1 pl
100 → 80% gel 100% gel 80% gel Beräkning 1: 1 l av 100% R2-lösning till odlingsmedia Beräkningarna baseras på att ha 20 il geler på täckglas. Först konvertera than delar av 100% L2-lösning i 20 pl gel i pl. För det andra, beräkna mängden (i l) av 100% L2-lösning som behövs för att tas bort för att komponera en 20% gel. Lägg till denna mängd R2-lösning till gel.
(20 l / 26 delar) x 6 delar = 4.6 l
Beräkning 2:
5 ^ x 0,2 = 1 pl
100% gel (kontroll) 100% gel 100% gel - 1 l av kontrollösning till odlingsmedia Mängd kontrollösning är ekvivalent med mängden av R2-lösning tillsattes.
80% gel (kontroll) 80% gel 80% gel - 1 l av kontrollösning till odlingsmedia Mängd kontrollösning motsvarar det belopp på 100% L2-lösning.

Tabell 4 Exempel beräkningar för DNA gelpreparat. Mock siffror ges för att illustrera beräkningarna för beredning av 80%, 100%, 100 → 80%, och 80 → 100% geler. DNA-gel är Design 2 i tabell 1.

  1. Centrifugera lyofiliserad SA1 ssDNA vid 2000 xg under 15 sek för att säkerställa alla ssDNA är på botten av flaskan. OBS: Korrekt koncentration SA1 lösning är avgörande för DNA-gel syntes.
  2. Bered 3 mM av SA1 lösning genom tillsats av 107 | il 1x Tris-EDTA, pH 8,0-buffert (TE-buffert) till flaskan (tabellerna 3-4).
  3. Värme SA1 i TE-buffert vid 70 ° C under 5 min eller tills ssDNA pelleten är helt upplöst. OBS: Värme temperatur bör vara minst 5 ° C över smälttemperatur (Tm) för att säkerställa DNA är i ett enkelsträngat tillstånd.
  4. Bered SA1 polymerisation lösning genom tillsats av 40% akrylamid och 10x Tris-borat-EDTA (TBE)-buffert vid de angivna procentsatserna (tabell 3). I detta exempel, lägga till 45 och 18 | j, l, respektive, till 107 pl av SA1 lösning (tabell 4).
  5. Degas med kvävgas under 3 min för att underlätta blandning. Sätt i en p200 spets fäst vid en kvävgaskälla in i lösningen och långsamt tillåta kvävgas att passera genom lösningen. Testa flöde av kvävgas i vatten före avgasn SA1 lösning för att förhindra stänk.
  6. Centrifugera i 15 sekunder vid 2000 xg för att samla lösning.
  7. Lägg 4,5 l av 2% ammoniumpersulfat (APS, tabellerna 3-4) för att initiera gelpolymerisation.
  8. Vänd röret flera gånger för att blanda.
  9. Centrifugera i 15 sekunder vid 2000 xg för att samla lösning för homogen polymerisation.
  10. Lägg 4,5 l av 20% tetrametyletylendiamin (TEMED, tabellerna 3-4) för att katalysera polymerisation.
  11. Vänd röretflera gånger för att blanda.
  12. Centrifugera i 15 sekunder vid 2000 xg för att samla lösning för homogen polymerisation.
  13. Degas med kvävgas under 3-5 minuter för att fullborda polymerisationen och för att minimera oreagerad monomerer.
  14. Inkubera lösningen under 10 min vid RT för att fullborda polymerisationen. OBS: Denna lösning kallas SA1 polymeriserade lösning.
  15. Upprepa steg 1.1.3-1.1.16 med frystorkad SA2 ssDNA, men lägga 45, 18, ​​4,5, och 4,5 l av akrylamid, TBE, APS och TEMED, respektive till 108 l av SA2-lösning (tabellerna 3-4). OBS: SA1 och SA2 polymeriserade lösningar kan lagras vid 4 ° C i upp till en månad.

2 Beredning av L2, R2, och Control Solutions

  1. Upprepa steg 1.1.3-1.1.5 med frystorkad R2 ssDNA men lägga 64,4 pl TE-buffert (tabell 4).
  2. Upprepa steg 1.1.3-1.1.5 med lyofiliserad kontroll ssDNA men lägga 111 pl TE-buffert (tabell 4
  3. Upprepa steg 1.1.3-1.1.5 med frystorkad L2 ssDNA men lägga 219 pl TE-buffert (tabell 4). OBS: Detta är 100% L2-lösning. Lägga 100% L2 lösning på SA1 och SA2 polymeriserade lösningar (se §1.3) kommer att bilda en 100% tvärbunden DNA gel (100% gel) eftersom SA1, SA2 och L2 blir stökiometriskt likvärdiga.
  4. Späd en alikvot av 100% L2 lösning till 80% genom tillsats av 20 | il av 1 x TE-buffert till 80 ^ il 100% L2-lösning (Tabell 4). OBS: Denna lösning är 80% L2-lösning. Lägga till 80% L2 löser SA1 och SA2 polymeriserade lösningar (se §1.3) kommer att bilda en 80% tvärbunden DNA-gel (80% gel), eftersom endast 80% av SA1 och SA2 kommer att tvärbindas till L2. Lösningar kan förvaras vid 4 ° C i upp till en månad.

3 Beredning av Gel Solutions

  1. Värme SA1 och SA2 polymeriserade lösningar vid 70 ° C tills lösningen sänks viskositeten (ca 1 min). Höj temperaturen till 80 °C om lösningen fortfarande är för trögflytande för pipett.
  2. Lägg 10 l eller 10 delar SA1 polymeriserade lösning till 10 l eller 10 delar SA2 polymeriserade lösning (tabell 4). OBS: SA1 och SA2 polymeriserade lösningar är ytterst trögflytande och svår att pipett. Eftersom halterna är avgörande för gelbildning, använd en positiv förskjutning pipett från denna punkt framåt eller se diskussion för andra tekniker hantering. Även pipetten flera, små portioner (> 20 pl) snarare än en enda, stor volym.
  3. Mix SA1 och SA2 polymeriserade lösningar tillsammans via alternerande uppvärmning (till 15 sek vid 70 ° C) och omrörning (för 15 sek med en pipettspets) för totalt 1 min.
  4. Lägg 6 pl eller 6 delar av 100% L2-lösning för att bilda en 100% gel (tabell 4).
  5. Blanda genom omväxlande uppvärmning och omrörning som beskrivs i steg 1.3.3.
  6. Värme gel för en timme vid den optimala hybridiseringstemperaturen (35 ° C). Beräkna ennnealing temperatur genom att subtrahera 5 ° C från den ssDNA-sekvensen med den lägsta smälttemperaturen (tabell 1).
  7. Pipettera 100% gel i ett 60-mm petriskål.
  8. Tillåt DNA tvärbindningar för att fortsätta till rehybridisera genom att inkubera gelén i 4 h vid RT.
  9. Cover gel med PBS innehållande kalcium och magnesium och inkubera O / N vid RT. OBS: Geler sväller ca 3 gånger sin ursprungliga volym. Dessutom kommer geler jämvikt med buffert och överskott av akrylamid kommer att diffundera ut ur gelerna. Kalcium och magnesium i PBS stabiliserar DNA-hybridisering och förhindra gelen spricker (se diskussion för toubleshooting gel spricker).
  10. Ta bort återstående buffert från petriskål.
  11. För att tillverka 80% geler, upprepa steg 1.3.1-1.3.10 men byt 100% L2-lösning i steg 1.3.4 med 80% L2-lösning. Förvara 100% och 80% geler vid 4 ° C i upp till en månad. OBS: De styvhets skillnader mellan 80% och 100% geler är fysiskt särskiljbara.
    12. </ Ol>

    2. Gel immobilisering på glas

    OBSERVERA: Immobilisera alikvoter av 100% eller 80% geler på glas täckglas (Figur 2).

    1. Värm 100% gel vid 70 ° C i ca 30 sek eller tills gelen är mer lättflytande för pipettering.
    2. Placera täckglas på en 70 ° C värmeblock och låt värma i 1-2 minuter.
    3. Tillsätt en droppe av optiskt bindemedel på varje täckglas.
    4. Lägg 20 | il 100% gel på varje täckglas (tabell 4). OBS: 10-30 l kan fördelas på varje täckglas.
    5. Låt gelen att smälta och spridas över glastäckglas. OBS: Om gel topologi inte visas även efter smältning, platta gel med en silikonglastäckglas. Dock kommer ytterligare svullnad uppstå i efterföljande steg och bidrar till gel ojämnheter.
    6. Avlägsna glasinnehållande gelén från värmeblocket och placera in i en 24-brunnars vävnadsodlingsplatta.
    7. Upprepa steg från 2,1 till 2,6 med 8 0% gel.
    8. Värme geler under 1 h vid den optimala hybridiseringstemperaturen (35 ° C). OBS: Det är normalt att geler att bli torr och detta kommer att lösas när geler inkuberas i PBS.
    9. Exponera plattor innehållande 80% och 100% geler för ultraviolett (UV, 365 nm) ljus i 15 min. OBS: UV-exponering härdar samtidigt lim och steriliserar geler. Om en UV tvärbindningskammare inte är tillgänglig, kan geler placeras under en UV-ljus som är utrustad i ett biologiskt säkerhetsskåp. Efter UV-exponering, utför följande steg i detta protokoll under ett biologiskt säkerhetsskåp för att upprätthålla gel sterilitet. Använd även sterila lösningar från denna punkt framåt.
    10. Låt DNA-tvärbindningar för att rehybridisera vid RT under 4 timmar.
    11. Lägg PBS och inkubera O / N vid 4 ° C. OBS: PBS inkubation sköljer utjämnas och sväller geler igen eftersom upprepad uppvärmning kan torka gelerna.

    51323 / 51323fig2highres.jpg "/>
    Figur 2 Schematisk gel immobilisering och funktionalisering. Efter DNA-geler (grå) är beredda, är geler bifogas täckglas (vit) med optiska lim (grön). Geler samtidigt härdas och steriliseras genom UV-ljus. Efter svallning, geler är ungefär 1 mm tjockt. Därefter geler funktionaliserad i ett två-stegsförfarande (röd skiss ruta). Först sulfo-SANPAH konjugerad till akrylamid på gel ytor genom UV-ljusexponering. För det andra är geler inkuberas med kollagen eller poly-D-lysin, som fäster vid sulfo-N-hydroxisuccinimidester i sulfo-SANPAH. Denna siffra har ändrats från 10.

    3. Gel Funktionalisering

    OBS: DNA gel funktion krävs för celladhesion eftersom polyakrylamidgeler är inerta material (Figur 2). I detta avsnitt kommer geler funktionalis i två steg. Först N -Sulfosuccinimidyl-6-(4 &# 39; -azido-2'-nitrofenylamino) -hexanoat eller sulfo-SANPAH kommer bindas kovalent genom fotolys av nitrofenyl azidgrupp till polyakrylamid ryggraden i DNA-geler. För det andra kommer primära aminer i kollagen eller poly-D-lysin mäter sulfo- N-hydroxisuccinimidester i sulfo-SANPAH att fästa proteinerna till gelytan.

    1. Ta buffert i brunnarna med en pipett och vara noga med att inte aspirera gel. OBS: Utför inte vakuumaspiration för att minska sannolikheten för att aspirera gelén.
    2. Valfritt) Tvätta geler tre gånger under 15 min vid RT för att avlägsna överskott av akrylamidmonomer, TEMED och APS.
    3. Tillsätt ca 300 l av sulfo-SANPAH att täcka varje gel.
    4. Exponera geler för UV (365 nm) under 5 min.
    5. Ta sulfo-SANPAH.
    6. Skölj geler gång med PBS för att avlägsna överskott sulfo-SANPAH.
    7. Upprepa steg 3,3-3,6.
    8. Inkubera geler i ca 300 pl av 0,2 mg / ml av poly-D-lysin under 1 h vid RT eller O / N vid 4 ° C. OBS: Du kan också inkubera geler med 0,2 mg / ml kollagen typ 1 O / N vid 4 ° C.
    9. Tvätta gelerna två gånger med PBS under 5 min för att avlägsna överskott av poly-D-lysin.
    10. Inkubera geler i ca 300 | il medium för 30 min för att jämvikta geler.
    11. Ta bort media omedelbart före plätering celler.

    4 cellodling och Imaging

    OBS: I det här avsnittet ger vi information om den uppmjukning eller stelhet av geler efter cell plätering. En detaljerad cellodlings protokoll tillhandahålls inte av flera skäl. För det första kan många celltyper hålla sig på DNA-geler och varje celltyp kräver särskilda anpassningar av forskaren för cell plätering. För det andra är standardcellen och vävnadsodlingstekniker som användes för dessa experiment och kan hittas i ett flertal originalartiklar, tekniska artiklar, och referensböcker. Tekniker för att specifikt plätering fibroblaster och neuroner på DNA-geler kan hittas i PREVíka publikationer 9-11,19-21.

    1. Plate celler. För protokoll rörande dissektion och / eller odling av nervceller eller fibroblaster nämns i denna artikel, se en av följande publikationer 9-11,19-21.
    2. Efter minst 48 h, modulera gel styvhet genom att pipettera 1 pl av kontroll, L2 eller R2-lösning nära gelén (tabell 4).
      1. För att förstyva geler från 80% till 100% tvärbunden (80 → 100% geler), tillsätt de resterande 20% av L2 till 80% geler genom tillsats av 1 | il av 100% L2 lösning nära gelén.
      2. Att mjuka geler från 100% till 80% tvärbunden (100 → 80% geler), till R2 för att avlägsna 20% av de tvärbindningar från 100% geler genom tillsats av 1 | il av 100% R2 lösning nära gelén.
      3. För kontroller lägga lika stora volymer av kontroll-lösning till en delmängd av 100% och 80% geler genom tillsats av 1 pl av kontrollösning nära gelén.
    3. Utför den önskade cell bearbetning och analys av data efterett minimum av 48 tim.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Innan våra studier, var cell-ECM interaktioner observerats på statiska kompatibla biomaterial eller irreversibla och enkelriktade dynamiska substrat. Dessa substrat inte alltid motsvarar den dynamiska karaktären hos den cellulära mikromiljö. Vårt arbete skiftar befintliga tekniska paradigm genom att ge en mer fysiologisk modell för att studera cell ECM interaktioner på mjukgörande och hårdnande dynamiska biomaterial. I tidigare studier har vi analyserat effekterna av dynamiska substrat på celler genom att undersöka olika cell morfologier och fenotyper på dessa geler. I ett exempel, vi fastställt effekterna av substratstelhet på fibroblaster genom att utvärdera fibroblast morfologi på dynamiska DNA geler. L929-celler, en mus härrörande fibroblastcellinje, ströks ut på 80% och 100% geler (Figur 3) 11. Två dagar efter plätering, 20% extra L2 lösning sattes till media på 80% geler att stelna gelerna till 100% tvärbunden (80 → 100%, mittpanelen). 100% geler och en annan uppsättning av 80% geler fått kontroll ssDNA förbli statisk (höger och vänster panel, respektive). Ijusmikroskopi bilder fångades två dagar efter leverans av DNA till media. Bild suddighet, såsom framgår av fig 3, berodde på gelytan ojämnheter och är typiskt och oundvikliga. Gel svullnad och kontraktion, från tillsats av buffertar och L2 18,21, bidrar till gel ojämnheter. Morfologi utvärderades med ImageJ programvara (NIH, Bethesda, MD) och tjänstgjorde som en indikator på funktion. Fibroblaster odlas på hårdnande geler (80 → 100%) hade inga förändringar i proportionerna, men uppvisade en större projektionsyta än fibroblaster odlas på 100% geler 11. Interestingly morfologin hos fibroblaster odlade på statiska geler var olik morfologin hos fibroblaster odlade på dynamiska geler. Fibroblaster odlas på 100% geler hade en mindre projektionsyta och större bildformat än fibroblaster odlas på 80% geler. Dessa retat visar att fibroblast beteende är beroende av den dynamiska karaktären i mikromiljön. I en annan studie av effekterna av substrat mjukgörande på neuroner bestäms genom att analysera neuronala fenotyper inklusive Dendrite nummer, Dendrite längd och axon längd (Figur 4) 10. Rat härledda ryggmärgs neuroner odlades på 100% och 50% geler. Fyra dagar efter plätering, var 50% R2 läggas till media av 100% geler att mjuka gelerna till 50% tvärbunden (100 → 50%, speglarna). 50% geler och en annan uppsättning av 100% geler fått kontroll ssDNA förbli statisk (höger och vänster paneler, respektive). Efter tre dagar var neuroner fast och immun med dendritiska markör (MAP2, krönskivor), en axonal markör (Tau, mellanpaneler) och kärnor (DAPI, bottenplåtar) för att utvärdera fenotyper. Nervceller som odlas på mjukgörande geler (100 → 50%) hade inga skillnader i primär dendrit nummer eller axon längd, men uppvisade kortare primära dendriter än nervceller odlas o n 50% geler. Som i fibroblast studier, neurala fenotyper på statiska geler var olikt neurala fenotyper på dynamiska geler. Nervceller som odlas på 50% geler hade färre primära dendriter och längre axoner än nervceller som odlas på 100% gel. Sammanfattningsvis fibroblast och neuron bilder visar att flera celltyper kan studeras på dynamiska och statiska DNA geler, orsakar DNA gel ojämnheter imaging utmaningar, standard morfologiska och immunfärgning tekniker är genomförbara, och viktigast cellers beteende är beroende av substrat dynamik.

Figur 3
Figur 3. fibroblaster odlas på statiska och dynamiska DNA geler. Representant ljusmikroskopiska bilder på L929 fibroblaster odlas på 80% (till vänster), 80 → 100% (center panel), och 100% geler (höger panel). Skala bar är 100 pm. Denna siffra har ändrats från den 11.href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51323/51323fig3large.jpg" target = "_blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4
Figur 4. Nervceller som odlas på DNA-geler. Representativa fluorescerande bilder av ryggmärgs nervceller som odlas på 100% (vänster paneler), 100 → 50% (mitten paneler) och 50% (höger sida) geler. MAP2 immunfärgning indikerar dendrites (övre panelerna), indikerar Tau-1 immun axoner (mittpaneler) och DAPI färgning visar kärnan (bottenpaneler). Skala bar är 100 pm. Denna siffra har ändrats från 10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Förmågan av DNA-geler för att mjuka upp eller stelna före och efter celladhesion gör dem till en idealisk modell för att studera betydelsen av dynamiska vävnad styvhet på cellfunktion. Samtliga tre konstruktioner har använts i mekaniska och biologiska studier. Men alla tre motiv har liknande elasticiteter vid olika tvär procenttal, vilket indikerar tvärbindningslängden påverkar inte DNA-gel elasticitet (tabell 2). Däremot påverkar koncentrations akrylamid elasticitet. Dessa mönster kan skilja sig i tvärbindnings kinetik eftersom gel spräng tendenser, eller tendens geler lösas upp i media eller buffert, minskar med ökande tvärbindningslängd. Men kinetisk information om DNA-geler är begränsad, men vi vet ytterligare 30% av tvärbindning sker två dagar efter L2 leverans till 50% DNA-geler 11. Ändå generering av expansiva och kontraktila krafter från gel mjukgörande och hårdnande respektive är oundvikligt och kan inte frikopplas18,21. 100 → 70% geler genererar ca 0,5 Pa stress 21, medan 50 → 100% geler endast genererar cirka 0,04 Pa stress eftersom mer energi krävs för att bilda bindningar mellan de tre bestånd av ssDNA 18. Därför tolkningen av resultaten måste behandlingen av stress och påfrestningar som genereras av den hårdnande och uppmjukning av geler.

Tekniska problem kan uppstå när du förbereder DNA geler. Den vanligaste tekniska frågan är gel spricker. Gel sprängning kan ske under flera stadier av DNA gelpreparat inklusive gel svullnad, lagring och celltillväxt. Gel sprängning orsakas av flera faktorer. För det första kan gelen spricker vara ett resultat av felaktig lösning sammansättning. Vanliga fel inkluderar otillräcklig upplösning av frystorkat ssDNA och felaktig pipettering av viskösa vätskor. För att undvika pipetteringsfel, höja uppvärmningstemperaturen för att minska gel viskositet för enklare pipettering av lösningar eller delprovet erforderlig amount av SA1 och SA2 polymeriserade lösning före den andra kvävebubbling steg. Dessutom kan upprepad uppvärmning av polymeriserade lösningarna delvis avdunsta lösningen och öka lösningens viskositet. Lägga till några mikroliter av TE-buffert kan hjälpa till att reducera viskositeten. För det andra, kan gelen spricker vara ett resultat av dålig DNA-kvalitet. QA / QC rapporter måste ses ofta. Om QA / QC rapporter är acceptabla och gel spricker kvarstår, kan HPLC renat ssDNA förbättra DNA-kvalitet. För det tredje kan gelen spricker bero på otillräcklig DNA glödgning. Vi har minskat förekomsten av gelen spricker genom att inkludera glödgningssteg och återhybridisering steg i det ursprungliga protokollet (se steg 1.3.6 och 2.8, 1.3.8 och 2,10, respektive). Gel spricker kan förhindras genom att utvidga glödgning och kylningstider. Men för att ytterligare exponering för värme kan avdunsta vatten orsaka en ökning av gel lossnar från glaset när geler åter svällde. Om lossnar är för stor för någon glödgning tid, annEaling steg kan elimineras (1.3.6 och 2.8).

Ett annat frekvent tekniskt problem är otillräcklig celladhesion. De svällda geler är mjukare än de osvällda geler (tabell 2) 18 andet celladhesion svårt. Eftersom varje celltyp reagerar olika på vävnaden styvhet kan vissa celltyper uppleva denna tekniska dilemma medan andra celltyper inte. Lös vidhäftnings frågor några av de enligt steg bör övervägas: (1) använda en hög plätering densitet, (2) alternera ECM-proteiner konjugerade till sulfo-SANPAH, (3) modulera styvhetsparametrarna, (4) öka ECM protein eller sulfo-SANPAH koncentration och (5) ökar inkubationstider. Rest toxiska medel såsom akrylamidmonomer, APS och TEMED kan också bidra till bristande friktion och celldöd på geler. Vi har inte upplevt den här frågan, eftersom omfattande tvättar införas i protokollet har visat tillräckligt, men vi rekommenderar performing Valfritt steg 3.2 om detta problem uppstår.

DNA-geler kan användas för att på ett effektivare sätt studera en mängd olika cellfunktioner under dynamiska eller statiska förhållanden. Vi har visat att fibroblaster och nervceller som odlas på DNA-geler påverkas av modulering av gel elasticitet. Eftersom cell-matrix interaktioner är vanligtvis tredimensionella gränssnitt, information från tredimensionella dynamisk matris studier kommer att bidra till att producera mer biologiskt relevanta uppgifter. Därför är vi nu översätta denna teknik i en tredimensionell byggnadsställning. Vi utvecklar en teknik som ersätter polyakrylamid ryggraden med en mer biokompatibelt material, medan DNA tvärbindningsteknologi underhålla. Denna nya byggnadsställning kommer att fungera som en tredimensionell, dynamisk modell och ett vävnadsteknik schavotten. Dess biokompatibilitet öppnar möjligheter för medicintekniska tillämpningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Författarna vill tacka: Dr Frank Jiang, Dr David Lin, Dr Bernard Yurke och Dr Uday Chippada för deras bidrag om utveckling av DNA-gel-teknik; Dr Norell Hadzimichalis, Smit Shah, Kimberly Peterman, Robert Arter för deras kommentarer och ändringar av detta manuskript; finansieringskällor, inklusive New Jersey kommissionen om Spinal Cord Research (Grant # 07A-019-SCR1, NAL) och New Jersey Neuroscience Institute (MLP); och utgivare av Tissue Engineering, del A för tillstånd att återge figurerna 2 och 4 och biomaterial för tillstånd att återge Figur 3.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ssDNA Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa)
idtdna.com		 Do not vortex ssDNA. Gentle invert the vial and/or pipette solution to mix.
PBS with calcium and magnesium Any brand.
100x Tris-EDTA buffer (TE buffer) Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)
sigmaldrich.com		 T9285
10x Tris-Borate-EDTA buffer (TBE buffer) Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) 93290 TBE is a reproductive toxin.
40% Acrylamide solution Fisher Scientific (Pittsburg, PA) BP14021 Acrylamide is a toxin.
Ammonium persulfate (APS) Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) A3678 Prepare a 2% solution in TE buffer. APS is a toxin and irratant.
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) T9281 Prepare a 20% solution in TE buffer. TEMED is flammable, a corrosive, and a toxin.
12 mm diameter round coverglass Fisher Scientific (Pittsburg, PA)
fishersci.com		 12-545-82
Norland optical adhesive 72 Norland Products (Cranbury, NJ)
norlandprod.com		 NOA72
24-well tissue culture plate Any brand.
Microcentrifuge tubes Any brand.
Sulfo-SANPAH ProteoChem or Thermo Fisher, (Rockland, IL)
proteochem.com or thermofisher.com		 C111 or 22589 Prepare a 0.315 mg/ml solution in water immediately before use. Dissolve at 37 °C and filter sterilze. It is normal to observe undisolved sulfo-SANPAH in the filter. Sulfo-SANPAH is light sensitive and, therefore, the solution should be protect from light until UV exposure.
Poly-D-Lysine (PDL) Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) P6407 Prepare a 0.2 mg/ml solution in water and filter sterilize.
Collagen Type I Affymetrix (Santa Clara, CA)
affymetrix.com		 13813 Prepare a 0.2 mg/ml solution in 0.2 N acetic acid. Solution needs to remain cold at all times to avoid polymerization. Acetic acid is a flammable, toxic, and corrosive.
22 x 60 cover glass Fisher Scientific (Pittsburg, PA) 12-544-G
Positive-displacement pipette Gilson, Inc (Middletown, WI)
gilson.com		 F148504
Heat block Fisher Scientific (Pittsburg, PA) 11-718
UV light source Place gels as close as possible to the UV light. UV light can cause skin or eye injury.
Thermometer Any brand.
Nitrogen gas GTS-Welco (Flemington, NJ)
www.praxairmidatlantic.com/		 NI 5.0UH-R

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Balaban, N. Q., et al. Force and focal adhesion assembly A close relationship studied using elastic micropatterned substrates. Nat Cell Biol. 3 (5), 466-472 (2001).
  2. Peppas Brannon-Peppas, L., Peppas, N. A. Dynamic and equilibrium swelling behaviour of ph-sensitive hydrogels containing 2-hydroxyethyl methacrylate. Biomaterials. 11 (9), 635-644 (1990).
  3. Charati, M. B., Ifkovits, J. L., Burdick, J. A., Linhardt, J. G., Kiick, K. L. Hydrophilic elastomeric biomaterials based on resilin-like polypeptides. Soft Matter. 5 (18), 3412-3416 (2009).
  4. Davis, K. A., Burke, K. A., Mather, P. T., Henderson, J. H. Dynamic cell behavior on shape memory polymer substrates. Biomaterials. 32 (9), 2285-2293 (2011).
  5. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophys J. 76 (4), 2307-2316 (1999).
  6. Gray, D. S., Tien, J., Chen, C. S. Repositioning of cells by mechanotaxis on surfaces with micropatterned youngs modulus. J Biomed Mater Res A. 66 (3), 605-614 (2003).
  7. Homma, M., Seida, Y., Nakano, Y. Effect of ions on the dynamic behavior of an electrodriven ionic polymer hydrogel membrane. Journal of applied Polymer Science. 82 (1), 76-80 (2001).
  8. Horkay, F., Tasaki, I., Basser, P. J. Osmotic swelling of polyacrylate hydrogels in physiological salt solutions. Biomacromolecules. 1 (1), 84-90 (2000).
  9. Jiang, F. X., Yurke, B., Firestein, B. L., Langrana, N. A. Neurite outgrowth on a DNA crosslinked hydrogel with tunable stiffnesses. Ann Biomed Eng. 36 (9), 1565-1579 (2008).
  10. Jiang, F. X., Yurke, B., Schloss, R. S., Firestein, B. L., Langrana, N. A. Effect of dynamic stiffness of the substrates on neurite outgrowth by using a DNA-crosslinked hydrogel. Tissue Engineering Part A. 16 (6), 1873-1889 (2010).
  11. Jiang, F. X., Yurke, B., Schloss, R. S., Firestein, B. L., Langrana, N. A. The relationship between fibroblast growth and the dynamic stiffnesses of a DNA crosslinked hydrogel. Biomaterials. 31 (6), 1199-1212 (2010).
  12. Kloxin, A. M., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Synthesis of photodegradable hydrogels as dynamically tunable cell culture platforms. Nat Protoc. 5 (12), 1867-1887 (2010).
  13. Lin, D. C., Yurke, B., Langrana, N. A. Mechanical properties of a reversible, DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogel. J Biomech Eng. 126 (1), 104-110 (2004).
  14. Lin, D. C., Yurke, B., Langrana, N. A. Use of rigid spherical inclusions in young's moduli determination: Application to DNA-crosslinked gels. J Biomech Eng. 127 (4), 571-579 (2005).
  15. Luo, Y., Shoichet, M. S. Light-activated immobilization of biomolecules to agarose hydrogels for controlled cellular response. Biomacromolecules. 5 (6), 2315-2323 (2004).
  16. Marklein, R. A., Burdick, J. A. Spatially controlled hydrogel mechanics to modulate stem cell interactions. Soft Matter. 6 (1), 136-143 (2010).
  17. Pelham Jr, R. J., Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13661-13665 (1997).
  18. Previtera, M. L., Chippada, U., Schloss, R. S., Yurke, B., Langrana, N. A. Mechanical properties of DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogels with increasing crosslinker density. BioResearch Open Access. 1 (5), 256-259 (2012).
  19. Previtera, M. L., Langhammer, C. G., Firestein, B. L. Effects of substrate stiffness and cell density on primary hippocampal cultures. J Biosci Bioeng. 110 (4), 459-470 (2010).
  20. Previtera, M. L., Langhammer, C. G., Langrana, N. A., Firestein, B. L. Regulation of dendrite arborization by substrate stiffness is mediated by glutamate receptors. Ann Biomed Eng. 38 (12), 3733-3743 (2010).
  21. Previtera, M. L., Trout, K. L., Verma, D., Chippada, U., Schloss, R. S., Langrana, N. A. Fibroblast morphology on dynamic softening of hydrogels. Ann Biomed Eng. 40 (5), 1061-1072 (2012).
  22. Saxena, T., Gilbert, J., Stelzner, D., Hasenwinkel, J. Mechanical characterization of the injured spinal cord after lateral spinal hemisection injury in the rat. J Neurotrauma. 29 (9), 1747-1757 (2012).
  23. Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. Neurite growth in 3d collagen gels with gradients of mechanical properties. Biotechnol Bioeng. 102 (2), 632-643 (2009).
  24. Wozniak, M. A., Chen, C. S. Mechanotransduction in development A growing role for contractility. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (1), 34-43 (2009).
  25. Wuerfel, J., et al. Mr-elastography reveals degradation of tissue integrity in multiple sclerosis. Neuroimage. 49 (3), 2520-2525 (2012).
  26. Zaari, N., Rajagopalan, P., Kim, S. K., Engler, A. J., Wong, J. Y. Photopolymerization in microfluidic gradient generators Microscale control of substrate compliance to manipulate cell response. Adv Mater. 16 (23-24), 2133-2137 (2004).

Tags

Bioteknik bioteknik (allmänt) Elastic viskoelastiska bis-akrylamid substrat stelhet dynamisk statisk neuron fibroblast efterlevnad ECM mechanobiology avstämbara
Framställning av DNA-tvärbundet Polyacrylamide Hydrogeler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Previtera, M. L., Langrana, N. A.… More

Previtera, M. L., Langrana, N. A. Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels. J. Vis. Exp. (90), e51323, doi:10.3791/51323 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter