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Biology

Preparación de ADN-poliacrilamida reticulada hidrogeles

Published: August 27, 2014 doi: 10.3791/51323
Automatic Translation
1, 2,3
1New Jersey Neuroscience Institute, JFK Medical Center, 2Department of Biomedical Engineering, Rutgers University, 3Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Rutgers University

Summary

Nuestro laboratorio ha desarrollado hidrogeles de poliacrilamida de ADN-reticulada, un sistema dinámico de hidrogel, para entender mejor los efectos de la modulación de la rigidez del tejido en función de la célula. Aquí, ofrecemos esquemas, descripciones y protocolos para preparar estos hidrogeles.

Abstract

Mecanobiología es un área científica emergente que aborda el papel fundamental de las señales físicas en la dirección de la morfología y la función celular. Por ejemplo, el efecto de la elasticidad de los tejidos en función de la célula es un área importante de la investigación mecanobiología porque la rigidez del tejido modula con la enfermedad, el desarrollo, y las lesiones. Materiales estáticos que imitan tejidos o materiales que no pueden alterar la rigidez una vez que se siembran las células, se utilizan principalmente para investigar los efectos de la rigidez del tejido en las funciones celulares. Si bien la información obtenida de los estudios estáticos es valiosa, estos estudios no son indicativos de la naturaleza dinámica del microambiente celular in vivo. Para abordar mejor los efectos de la rigidez dinámica en función de la célula, se desarrolló un sistema de hidrogel de poliacrilamida ADN reticulado (geles de ADN). A diferencia de otros sustratos dinámicos, geles de ADN tienen la capacidad de aumentar o disminuir la rigidez después de la fabricación y sin estímulos. Geles de ADN consisten en ADN crossltintas que se polimerizan en un esqueleto de poliacrilamida. Adición y eliminación de enlaces cruzados a través de la entrega de ADN de cadena sencilla permite temporal, espacial y de control reversible de la elasticidad del gel. Hemos demostrado en los informes anteriores que la modulación dinámica de la elasticidad del gel del ADN influye en el comportamiento de fibroblastos y la neurona. En el presente informe y el vídeo, ofrecemos un esquema que describe los mecanismos de reticulación de gel de ADN y las instrucciones paso a paso sobre los geles de ADN preparación.

Introduction

Sustratos estáticos y dinámicos son dos categorías de biomateriales que se desarrollaron para estudiar los efectos de la elasticidad de los tejidos o rigidez en la función celular. Sustratos estáticas son incapaces de cambiar sus propiedades físicas después de que se fabrican y / o una vez se siembran las células. Poliacrilamida (PA) geles fueron los primeros sustratos bidimensionales estáticas, que se sintetizaron las investigaciones mecanobiología 5,17. Geles de PA son fáciles de preparar, de bajo costo, versátil, y puede ser fabricado con una amplia gama de módulos elásticos. Aunque estas ventajas técnicas hacen PA geles un sustrato general aplicada, sustratos estáticas no son indicativos de la naturaleza dinámica de la matriz extracelular (MEC) y que rodea entorno celular in vivo. Por ejemplo, el ECM sufre alteraciones de rigidez como resultado de una lesión, el desarrollo, o la enfermedad. Por lo tanto sustratos dinámicos son favorecidos como los modelos de sustrato que imitan los tejidos en los estudios mecanobiología

Numerosos sintética, bidimensional biomateriales, tridimensionales, estáticas y dinámicas naturales se han desarrollado para imitar la rigidez del tejido 1,3,6,16,23,26. Algunos sustratos dinámicos requieren calor, UV, la corriente eléctrica, los iones, y los cambios de pH para alterar sus propiedades mecánicas 2,4,7,8,12,15,16, pero estos estímulos pueden restringir bio-aplicación del hidrogel. Hidrogeles de poliacrilamida reticulada de ADN-ADN (geles) son sustratos elásticos bidimensionales dinámicos. Entrecruzamientos de ADN permiten la modulación temporal, espacial, y reversible de la rigidez en gel de ADN mediante la adición de ADN de cadena sencilla (ssDNA) a los medios o tampón 9-11,13,14,18,21. A diferencia de los geles dinámicas mencionadas anteriormente donde se aplican los estímulos para la modulación de elasticidad, los geles de ADN se basan en la difusión de ssDNA aplicada para la alteración de la elasticidad. Por lo tanto, la superficie del gel superior, donde se cultivan las células, es la primera área modulada porque el o tasamodulación f elasticidad es dependiente del espesor de gel.

Geles de ADN son similares a sus homólogos de gel de PA en que tienen un esqueleto de poliacrilamida, sin embargo, las reticulaciones-bis acrilamida se reemplazan con reticulaciones compuestas de ADN (Figura 1). Dos ssDNAs (SA1 y SA2) se hibridan con una cadena reticulante (L2) para compensar los entrecruzamientos de ADN del gel. SA1 y SA2 tienen secuencias distintas que ambos contienen una modificación Acrydite en el extremo 5 'para su incorporación efectiva a la red PA. Para la preparación de los geles, SA1 y SA2 se polimerizan individualmente en una cadena principal de PA y, posteriormente, el SA1 SA2 polimerizado y se mezclan juntos. L2, el agente de reticulación, se añade a la SA1 y SA2 mezcla. La secuencia de bases es complementaria a L2 ambas secuencias SA1 y SA2 y L2 se hibrida con SA1 SA2 más para formar los entrecruzamientos de ADN. , Elasticidad del gel de ADN inicial es determinado por ambas concentraciones L2 y reticulación (Tablas 1 2). Geles de ADN que contienen cantidades estequiométricas iguales de L2, SA1, SA2 y son los geles más rígidas porque SA1 y SA2 son 100% reticulado por L2 (designado como 100% geles). Concentraciones más bajas de L2 resultado en un menor porcentaje de reticulación del ADN y, por tanto, geles más blandos de ADN. Geles tan bajas como 50% reticulado (designado como 50% en geles) se han construido 9-11.

Figura 1
Figura 1. reticulación de gel de ADN y uncrosslinking esquemática 9-11,13,14,18,21 Paso 1:. SA1 (rojo) y SA2 (azul) se polimerizan de forma individual en una columna vertebral de poliacrilamida (negro). Después de la polimerización, soluciones polimerizadas SA1 y SA2 se mezclan juntos. Paso 2: L2 (verde) se añade y se hibrida con SA1 SA2 más para formar los entrecruzamientos del gel. Paso 3: R2 hibrida con tél punto de apoyo de la L2. Paso 4: hibridación de punto de apoyo de R2 impulsa la descompresión de la L2 de SA1 y SA2.

A diferencia de los geles de PA, geles de ADN pueden endurecerse y suavizar después de la síntesis. Por esa razón, las células cultivadas en geles de ADN pueden ser sometidos a alteraciones de rigidez dinámica. Para endurecer geles de células adherente, L2 puede ser añadido al medio de cultivo de los geles porcentuales bajos para aumentar el porcentaje de reticulaciones. Para suavizar los geles de células adherente, L2 se puede quitar para disminuir el porcentaje de entrecruzamientos 10,13,21. L2 tiene una secuencia de punto de apoyo adicional en el extremo 3 'para permitir L2 para uncrosslink de SA1 y SA2 (Tabla 1). La eliminación de L2 se lleva a cabo mediante hibridación de una hebra de reversión llamado R2. R2 es complementaria a la longitud completa de L2 y se hibrida primero con el punto de apoyo L2. Hibridación propulsa el punto de apoyo de descompresión de L2 de SA1 y SA2, que elimina la reticulación y reduce la rigidez de gel.

En el presente informe yvideo, paso a paso las instrucciones se proporcionan para la preparación de rigidización y suavizar los geles de ADN. Si bien se describen preparaciones de gel 100% y 80%, este protocolo se puede adaptar para crear geles de ADN de otros porcentajes reticulados inicial y final. En general, 100% y 80% en geles se preparan, inmovilizan sobre cubreobjetos de vidrio, funcionalizados, y se sembraron con células. L2 se añade a los medios de 80% de geles y R2 se añade a los medios de comunicación de 100% geles, 48 ​​hr después de la siembra. La adición de L2 a los medios endurece 80% a 100% geles reticulados, mientras que la adición de R2 a los medios suaviza 100% en geles de 80% reticulado. Geles endurecidas se designan como 80 → 100% geles y geles ablandados se designan como 100 → 80% de geles en el texto. Para controlar o geles estáticas, ssDNA que consiste en Ts o Como se entrega a otro conjunto de 100% y 80% en geles. Después de un mínimo de dos días siguientes modulación de elasticidad, las células pueden ser procesados ​​y analizados.

Entrecruzamiento de ADN # De bases Secuencia (punto de apoyo) Modificación Temperatura de fusión (T m, ° C) Comentarios
5 '→ 3'
Diseño 1 SA1 10 GCA CCT TTG C 5 'Acrydite 34.9
SA2 10 GTC AGA ATG A 5 'Acrydite 23.6
L2 30 TCA TTC TGA C GC AAA GGT GC T CTA CAC TTG 56 Una secuencia de 10 pb punto de apoyo está incluido.
R2 30 CAA GTG TAG CGC ACC TTT GCG TCA GAA TGA R2 es complementaria a L2
Diseño 2 SA1 14 CGT GGC ATA GGA CT 5 'Acrydite 46.9
SA2 14 GTT TCC CAA TCA GA 5 'Acrydite 40.2
L2 40 TCT GAT TGG GAA AC A GTC CTA TGC CAC T GT TAC CTT CAT C 65.9 A 12 pb secuencia de punto de apoyo está incluido.
R2 40 GAT GAA GGT AAC CGT GGC ATA GGA CTG TTT CCC AAT CAG A 65.9 R2 es complementaria a L2
Design 3 SA1 20 ACG GAG GTG TAT GCA ATG TC 5 'Acrydite 55
SA2 20 CAT GCT TAG GGA CGA CTG GA 5 'Acrydite 56.6
L2 40 TCC AGT CGT CCC TAA GCA TG T ACA TTG CAT ACA CCT CCG T 68.8 Punto de apoyo no está incluido.
Control de Control de 20-40 AAA AAA (etc.) o
TTT TTT (etc.)

Cuadro 1 secuencias de base para ssDNA 9-11,13,14,18,21. Celular y estudios mecánicos han utilizados varios ddiseños de reticulación ifferent para generar geles de ADN con una gama de propiedades mecánicas estáticas y dinámicas. Los parámetros modulados en el diseño de reticulación son secuencia de bases y longitud de la secuencia o la longitud de reticulación. Negrita y cursiva ilustran base de sincronización entre SA1 y L2 y entre SA2 y L2, respectivamente.

Diseño
1 2 3
Concentración de acrilamida (%) 10 10 10 4
SA1 SA2 más hibridado con L2 (% reticulado) 50 80 100 50 80 100 100 100
<strong> Elasticidad (kPa, media ± SEM) 6,6 ± 0,6 17,1 ± 0,8 29,8 ± 2,5 5,85 ± 0,62 12.67 ± 1.33 22.88 ± 2.77 25,2 ± 0,5 10,4 ± 0,6

Tabla 2. módulo de Young (E) de geles de ADN. 9-11,13,14,18,21 concentración de acrilamida, el porcentaje de reticulación, y la longitud de reticulación puede ser modulada en geles de ADN. Diseños 1, 2 y 3 tienen 20, 28, y 40 pb longitudes de reticulación, respectivamente. 100% de geles para todos los diseños tienen módulos similares, indicando la longitud de reticulación no afecta a la elasticidad del gel. Sin embargo, las variaciones en la concentración de acrilamida alteran elasticidad del gel del ADN.

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Protocol

NOTA: Todo el protocolo de preparación de gel para el procesamiento de células tarda un mínimo de seis días. Tiempo estimado para la preparación del gel es de 8 horas, más un / incubación O N. Tiempo estimado para la inmovilización de gel e hibridación de ADN es de 8 horas, más una etapa O / N enjuague. Tiempo estimado para funcionalización gel es de 2 horas. Tiempo para la siembra y el crecimiento celular depende del tipo de cultivo y la aplicación, pero se requiere un mínimo de cuatro días.

1 Preparación de geles de ADN

NOTA: Preparar los geles de ADN en tres etapas distintas. En primer lugar, polimerizar individualmente SA1 y SA2 ssDNA en una columna vertebral PA. Estas soluciones se denominan SA1 SA2 polimerizado en solución y solución polimerizada, respectivamente (§ 1.1). En segundo lugar, disolver el agente de reticulación, cadena reversible, y ssDNAs de control. Disolver el liofilizado L2 ssDNA (reticulante). Esto se llama 100% de solución de L2 y se utiliza para la fabricación de 100% geles (§ 1.2). Diluir una alícuota de la solución de L2 100%al 80%. Esto se conoce como 80% de solución de L2 y se utiliza para fabricar 80% geles. Disolver liofilizado R2 (hebra reversible) y el control ssDNA para utilizar en §4. En tercer lugar, mezclar SA1 solución polimerizada, SA2 solución polimerizada, y 100% o solución de L2 80% en una proporción de 10: 10: 6 (SA1: SA2: L2) para formar 100% y 80% en geles, respectivamente. (§1.3).

1 Preparación de SA1 y SA2 Soluciones polimerizados

  1. Seleccionar y ordenar la SA1 apropiado, secuencias de bases SA2, L2 y R2 de las Tablas 1 y 2. Secuencias de bases y longitud de la secuencia se optimizaron en informes anteriores 9-11,13,14.
  2. Calcular todas las formulaciones en solución (Tablas 3-4). NOTA: los cálculos de documentos meticulosamente para solucionar problemas. Se recomienda Construcción de una plantilla de Excel y se puede utilizar varias veces para la preparación de gel de ADN. Por favor, consulte las Tablas 3 y 4 para un ejemplo de la tabulación de Diseño 2 (Tablas 1 y 2). Los volúmenes especificados en el Cuadro 4 se utilizarán a lo largo de este protocolo, pero los volúmenes varían con cada alícuota de ssDNA liofilizado.
Solución Stock concentración de la solución Porcentaje de solución madre en SA1 o SA2 Solución polimerizado (v / v) La concentración final de la solución en SA1 o SA2 Solución polimerizado
La acrilamida (No-Bisacrilamida) 40% 25 10%
Solución SA1 o SA2 100% 60 60%
Tampón TBE 10x 10 1x
TEMED 20% 2.5 0,50%
APS 2% 2.5 0,05%

Tabla 3. Porcentaje de soluciones para la fabricación de soluciones o SA1 SA2 polimerizadas. La primera columna muestra las soluciones para la formulación de los geles de ADN. La segunda columna muestra las concentraciones de valores de estas soluciones. La tercera columna muestra el porcentaje de las soluciones madre en SA1 SA2 o soluciones polimerizadas (v / v). La última columna refleja las concentraciones finales en soluciones SA1 y SA2.

soluciones ssDNA (§ 1.1) <tr>
Componentes de la solución
Solución Stock Concentración Concentración Solución Final Cálculo La cantidad a Añadir Comentarios
Solución SA1 320,7 nmol de liofilizado SA1 ssDNA 3,00 mM 320,7 nmol / 3,00 nmol l -1 = 107 mu l 107 l de tampón TE a liofilizada ssDNA SA1 solución es 60% de SA1 polimerizado en solución.
107 mu l / 0,600 = 178 l
178 l es el volumen total de la solución polimerizada SA1 (Tabla 3).
Solución SA2 324,4 nmol de liofilizado SA2 ssDNA 3,00 mM 324,4 nmol / l 3.00 nmol -1 = 108 mu l 108 l de tampón TE a liofilizada ssDNA SA2 solución es 60% de SA2 polimerizado en solución.
108 mu l / 0,600 = 180 l
180 l es el volumen total de la solución polimerizada SA2 (Tabla 3).
Solución de L2 100% 657,4 nmol de liofilizado L2 ssDNA 3,00 mM 657,4 nmol / l 3.00 nmol -1 = 219 mu l 219 l de tampón TE a liofilizada ssDNA Diluir una alícuota de 100% L2 a la solución L2 80%
Solución L2 80% 80 l de 100% L2 ssDNA 80% - 20 l de tampón TE a 80 l de solución de L2 100%
La solución de control 332,6 nmol de liofilizado poli T o A ssDNA 3,00 mM 332,6 nmol / l <3.00 nmolsup> -1 = 111 l 111 l de tampón TE a liofilizada ssDNA
Solución R2 193,8 nmol de liofilizado R2 ssDNA 3,00 mM 193,8 nmol / 3,00 nmol l -1 = 64,6 mu l 64,6 l de tampón TE a liofilizada ssDNA
Soluciones polimerizada (§ 1.2)
SA1 solución polimerizada 40% de acrilamida 10% 178 mu l x 0,25 l = 44,5 45 l Calcular la cantidad de acrilamida, TBE, APS y TEMED basado en un volumen total de 178 l (véase anteriormente y la Tabla 3).
TBE 10x 1x 178 mu l x 0,10 = 17,8 l 18 l
Solución SA1 100% 60% - 107 l SA1 solución es 60% de la solución polimerizada SA1 (véase más arriba y en la Tabla 3).
2% de APS 0,05% 178 mu l x 0,025 = 4,45 l 4,5 l Añadir y mezclar APS antes de añadir TEMED.
20% TEMED 0,50% 178 mu l x 0,025 = 4,45 l 4,5 l
SA2 solución polimerizada 40% de acrilamida 10% 180 l x 0,25 = 45 mu l 45 l Calcular la cantidad de acrilamida, TBE, APS y TEMED basado en un volumen total de 180 l (véase anteriormente y la Tabla 3).
TBE 10x 1x 180 l x 0,10 = 18 mu l 18 l
Solución SA2 100% 60% - 108 l SA2 solución es 60% de la solución polimerizada SA2 (véase más arriba y en la Tabla 3).
2% de APS 0,05% 180 mu l x 0,025 = 4,5 l 4,5 l Añadir y mezclar APS antes de añadir TEMED
20% TEMED 0,50% 180 mu l x 0,025 = 4,5 l 4,5 l
Soluciones de gel (§1.3)
Solución de gel 100% 100% SA1 solución polimerizada 10 piezas - 10 l Componer 100% en geles con la siguiente SA1: SA2: relación de L2, 10: 10: 6.
100% SA2 sol polimerizadoution 10 piezas - 10 l
Solución de L2 100% 6 piezas - 6 l
Solución de gel 80% 100% SA1 solución polimerizada 10 piezas - 10 l Componer el 80% geles con la siguiente SA1: SA2: relación L2, 10: 10: 6.
100% SA2 solución polimerizada 10 piezas - 10 l
Solución L2 80% 6 piezas - 6 l
Geles dinámicos (§3-4)
Gel 80 → 100% Gel de 80% 100% GEl Cálculo 1: 1 l de solución de L2 100% en medios de cultivo Los cálculos se basan en tener 20 l geles sobre cubreobjetos. En primer lugar, convertir las partes de solución de L2 100% en los 20 l de gel en l. En segundo lugar, calcular la cantidad (en l) de solución de L2 100% necesario para un 20% adicional de reticulación. Añadir esta cantidad de solución de L2 100% a gel.
(20 l / 26 partes) x 6 partes = 4,6 l
Cálculo 2:
5 l x 0.2 = 1 mu l
Gel 100 → 80% Gel de 100% Gel de 80% Cálculo 1: 1 l de solución 100% R2 en medios de cultivo Los cálculos se basan en tener 20 l geles sobre cubreobjetos. En primer lugar, convertir tél partes de solución de L2 100% en los 20 l de gel en l. En segundo lugar, calcular la cantidad (en l) de solución de L2 100% necesario para ser eliminado para componer un gel de 20%. Añadir esta cantidad de solución R2 con gel.
(20 l / 26 partes) x 6 partes = 4,6 l
Cálculo 2:
5 l x 0.2 = 1 mu l
100% de gel (Control) Gel de 100% Gel de 100% - 1 l de solución de control en medios de cultivo Cantidad de solución de control es equivalente a la cantidad de solución R2 añadió.
Gel de 80% (Control) Gel de 80% Gel de 80% - 1 l de solución de control en medios de cultivo Cantidad de solución de control es equivalente a la cantidad de 100% de solución L2 añadió.

Tabla 4 Ejemplo de cálculos para la preparación de gel de ADN. Mock números se proporcionan para ilustrar los cálculos para la preparación de 80%, 100%, 100 → 80%, y 80 → 100% geles. Geles de ADN son el diseño 2 en la Tabla 1.

  1. Centrifugar liofilizado SA1 ssDNA a 2000 xg durante 15 segundos para asegurar que todo el ssDNA es en la parte inferior del vial. NOTA: la concentración adecuada de solución SA1 es fundamental para la síntesis de ADN en gel.
  2. Preparar 3 mM de SA1 solución mediante la adición de 107 l de 1x Tris-EDTA, pH 8,0 tampón (tampón TE) al vial (Tablas 3-4).
  3. SA1 de calor en tampón TE a 70 ° C durante 5 min o hasta que ssDNA sedimento se disolvió completamente. NOTA: La temperatura de calentamiento debe ser de un mínimo de 5 ° C por encima de la temperatura de fusión (Tm) para garantizar el ADN está en un estado de una sola hebra.
  4. Preparar la solución de polimerización mediante la adición de SA1 40% de acrilamida y 1Tris-Borato 0x-EDTA (TBE) tampón a los porcentajes indicados (tabla 3). En este ejemplo, añadir 45 y 18 l, respectivamente, a 107 l de solución de SA1 (Tabla 4).
  5. Degas con gas nitrógeno durante 3 min para facilitar la mezcla. Introduzca la punta de p200 unido a una fuente de gas nitrógeno en la solución y lentamente permita que el gas de nitrógeno pase a través de la solución. Prueba de la velocidad de flujo de gas nitrógeno en el agua antes de la solución SA1 de desgasificación para evitar salpicaduras.
  6. Centrifugar durante 15 segundos a 2000 xg para reunir solución.
  7. Añadir 4,5 l de persulfato de amonio (APS 2%, Tablas 3-4) para iniciar la polimerización de gel.
  8. Invertir el tubo varias veces para mezclar.
  9. Centrifugar durante 15 segundos a 2000 xg para reunir solución para la polimerización homogénea.
  10. Añadir 4,5 l de 20% tetrametiletilendiamina (TEMED, Tablas 3-4) para catalizar la polimerización.
  11. Invierta el tubovarias veces para mezclar.
  12. Centrifugar durante 15 segundos a 2000 xg para reunir solución para la polimerización homogénea.
  13. Degas con gas nitrógeno durante 3-5 min para completar la polimerización y minimizar monómeros sin reaccionar.
  14. Incubar la solución durante 10 min a RT para completar la polimerización. NOTA: Esta solución se llama SA1 solución polimerizado.
  15. Repetir los pasos 1.1.3-1.1.16 con liofilizado SA2 ssDNA, pero agregar 45, 18, ​​4,5, y 4,5 l de acrilamida, TBE, APS y TEMED, respectivamente, a 108 l de solución de SA2 (Tablas 3-4). NOTA: SA1 y SA2 soluciones polimerizadas pueden almacenarse a 4 ° C durante un máximo de un mes.

2 Preparación de L2, R2, y soluciones de control

  1. Repetir los pasos 1.1.3-1.1.5 con liofilizado R2 ssDNA pero añadir 64,4 l de tampón TE (Tabla 4).
  2. Repita los pasos 1.1.3-1.1.5 con liofilizado ssDNA control, pero añadir 111 l de tampón TE (Tabla 4
  3. Repetir los pasos 1.1.3-1.1.5 con liofilizado L2 ssDNA pero añadir 219 l de tampón TE (Tabla 4). NOTA: Esta es la solución de L2 100%. Adición de solución de L2 100% de SA1 y SA2 soluciones polimerizadas (ver §1.3) formará un gel reticulado ADN 100% (100% de gel) porque SA1, SA2, y L2 será estequiométricamente equivalente.
  4. Diluir una alícuota de la solución de L2 100% a 80% mediante la adición de 20 l de tampón TE 1x a 80 l de solución de L2 100% (Tabla 4). NOTA: Esta solución es la solución L2 80%. Adición de solución L2 80% a SA1 y SA2 soluciones polimerizadas (ver §1.3) formará un gel de ADN reticulado 80% (gel de 80%) debido a que sólo 80% de SA1 y SA2 se reticula a L2. Las soluciones pueden ser almacenadas a 4 ° C durante un máximo de un mes.

3 Preparación de Soluciones de Gel

  1. SA1 calor y soluciones polimerizadas SA2 a 70 ° C hasta viscosidad de la solución se reduce (aproximadamente 1 min). Elevar la temperatura hasta 80 °C si la solución es aún demasiado viscoso para pipeta.
  2. Añadir 10 l o 10 partes de SA1 solución polimerizada a 10 l o 10 partes de solución de polimerizado SA2 (Tabla 4). NOTA: SA1 y SA2 soluciones polimerizadas son extremadamente viscosa y difícil de pipeta. Dado que las concentraciones son críticos para la formación de gel, utilizar una pipeta de desplazamiento positivo desde este punto hacia adelante o hacia véase la discusión para otras técnicas de manipulación. Además, la pipeta en múltiples pequeñas alícuotas (> 20 l) en lugar de una sola, de gran volumen.
  3. Soluciones polimerizadas Mix SA1 y SA2 juntos a través de la alternancia de calentamiento (durante 15 segundos a 70 ° C) y agitación (durante 15 s con una punta de pipeta) para un total de 1 min.
  4. Añadir 6 l o 6 partes de solución de L2 100% para formar un gel de 100% (Tabla 4).
  5. Mezclar alternando calentamiento y agitación como se describe en el paso 1.3.3.
  6. Gel de calor durante 1 hora a la temperatura óptima de recocido (35 ° C). Calcular unannealing temperatura restando 5 ° C de la secuencia de DNA de cadena simple con la temperatura de fusión más bajo (Tabla 1).
  7. Pipetear el gel 100% en una de 60 mm placa de Petri.
  8. Permitir entrecruzamientos de ADN que siga rehybridize incubando gel durante 4 horas a temperatura ambiente.
  9. Gel de la cubierta con PBS que contiene calcio y magnesio y se incuban O / N a temperatura ambiente. NOTA: Los geles se hinchará aproximadamente 3 veces su volumen inicial. Además, los geles se equilibrarán con tampón y el exceso de acrilamida se difundirse fuera de los geles. El calcio y el magnesio en el PBS estabilizan la hibridación de ADN y evitar la ruptura de gel (véase la discusión para toubleshooting estallido gel).
  10. Retire buffer restante de placa de Petri.
  11. Para fabricar 80% geles, repita los pasos 1.3.1-1.3.10 pero reemplazar solución L2 100% en el paso 1.3.4 con solución L2 80%. Almacene 100% y el 80% en geles a 4 ° C durante un máximo de un mes. NOTA: Las diferencias de rigidez entre 80% y 100% en geles son físicamente distinguibles.
    12. </ Ol>

    2. Gel Inmovilización sobre el vidrio

    NOTA: Inmovilizar alícuotas de 100% o el 80% geles sobre cubreobjetos de vidrio (Figura 2).

    1. Calentar gel de 100% a 70 ° C durante aproximadamente 30 segundos o hasta que el gel es menos viscoso para pipetear.
    2. Coloque la tapa de vidrio se desliza sobre un bloque de calor 70 ° C y deje que se caliente durante 1-2 min.
    3. Añadir una gota de adhesivo óptico para cada hoja de la cubierta de vidrio.
    4. Añadir 20 l de gel de 100% a cada cubreobjetos de vidrio (Tabla 4). NOTA: 10-30 l se puede dispensar en cada hoja de la cubierta.
    5. Permita gel se derrita y se extiende sobre cubreobjetos de vidrio. NOTA: Si la topología de gel no aparece incluso después de la fusión, aplanar gel con una hoja de cubierta de vidrio siliconado. Sin embargo, la inflamación adicional se producirá en pasos posteriores y contribuir a desnivel gel.
    6. Quitar el gel que contiene vidrio a partir del bloque de calor y el lugar en una placa de cultivo tisular de 24 pocillos.
    7. Repita los pasos 2.1-2.6 con 8 De gel 0%.
    8. Geles de calor durante 1 hora a la temperatura de recocido óptimo (35 ° C). NOTA: Es normal que los geles que se secan y esto se resolverá cuando los geles se incubaron en PBS.
    9. La exposicion placas que contienen 80% y el 100% en geles ultravioleta (UV, 365 nm) durante 15 min. NOTA: La exposición UV cura simultáneamente pegamento y esteriliza geles. Si una cámara de reticulación UV no está disponible, geles pueden ser colocados bajo una luz UV que está equipado en un gabinete de seguridad biológica. Después de la exposición UV, realice los pasos posteriores de este protocolo en una cabina de seguridad biológica para mantener la esterilidad de gel. Asimismo, el uso de soluciones estériles de aquí en adelante.
    10. Permitir entrecruzamientos de ADN para rehybridize a TA durante 4 h.
    11. Añadir PBS e incubar O / N a 4 ° C. NOTA: incubación enjuagues PBS, se equilibra, y se hincha geles de nuevo porque calentamiento repetido puede deshidratar los geles.

    51323 / 51323fig2highres.jpg "/>
    Figura 2. esquemática de inmovilización gel y funcionalización. Después se preparan geles de ADN (gris), geles están unidos a cubreobjetos de vidrio (blanco) por pegamento óptico (verde). Los geles se curan y se esterilizan por la luz UV al mismo tiempo. Después del hinchamiento, los geles son de aproximadamente 1 mm de espesor. A continuación, los geles están funcionalizados en un proceso de dos pasos (rojo recuadro de líneas). En primer lugar, sulfo-SANPAH se conjuga a la acrilamida en las superficies de gel por exposición a la luz UV. En segundo lugar, los geles se incuban con colágeno o poli-D-lisina, que se une al éster de sulfo-N-hidroxisuccinimida en sulfo-SANPAH. Esta cifra se ha modificado desde el 10.

    3. Gel funcionalización

    Se requiere funcionalización en gel de ADN para la adhesión celular desde geles de poliacrilamida son materiales inertes (Figura 2): NOTA. En esta sección, los geles se pueden funcionalizar en-dos pasos. Primero, N -Sulfosuccinimidyl-6-(4 y# 39; azido-2'-nitrofenilamino) hexanoato o sulfo-SANPAH se une covalentemente por fotólisis de grupo azida nitrofenil a la cadena principal de los geles de poliacrilamida de ADN. En segundo lugar, las aminas primarias en el colágeno o poli-D-lisina se adherirán a la sulfo éster de hidroxisuccinimida de N en sulfo-SANPAH para unir las proteínas a la superficie del gel.

    1. Retire búfer en pozos con una pipeta y tener cuidado de no aspirar el gel. NOTA: No realice la aspiración al vacío para reducir la probabilidad de aspirar el gel.
    2. Opcional) geles Lavar tres veces durante 15 min a temperatura ambiente para eliminar el exceso de monómero de acrilamida, TEMED, y APS.
    3. Añadir alrededor de 300 l de sulfo-SANPAH para cubrir cada gel.
    4. Exponer los geles a los rayos UV (365 nm) durante 5 min.
    5. Retire sulfo-SANPAH.
    6. Geles se lava una vez con PBS para eliminar el exceso de sulfo-SANPAH.
    7. Repita los pasos 3.3 a 3.6.
    8. Incubar geles en aproximadamente 300 l de 0,2 mg / ml de poli-D-lisina durante 1 hora a RT o O / N a 4 ° C. NOTA: Como alternativa, incubar geles con 0,2 mg / ml de colágeno tipo 1 O / N a 4 ° C.
    9. Lavar geles dos veces con PBS durante 5 min para eliminar el exceso de poli-D-lisina.
    10. Incubar geles en aproximadamente 300 l de los medios de comunicación durante 30 min para equilibrar geles.
    11. Retire el medio inmediatamente antes placas células.

    4. cultivo celular e Imagen

    NOTA: En esta sección, proporcionamos detalles sobre el ablandamiento o endurecimiento de geles después de la siembra celular. Un protocolo detallado de cultivo celular no se proporciona por varias razones. En primer lugar, numerosos tipos de células pueden adherirse en geles de ADN y cada tipo de célula requerirán ajustes específicos por el investigador para la siembra de células. En segundo lugar, las técnicas de cultivo de células y tejidos normales se utilizan para estos experimentos y se pueden encontrar en numerosos artículos originales, artículos técnicos y libros de referencia. Técnicas para Plating específicamente fibroblastos y neuronas en geles de ADN se pueden encontrar en Previsas publicaciones 9-11,19-21.

    1. Células de la placa. Para los protocolos respecto a la disección y / o cultivo de neuronas o fibroblastos mencionadas en este artículo, consulte una de las siguientes publicaciones 9-11,19-21.
    2. Después de un mínimo de 48 horas, modular la rigidez de gel pipeteando 1 l de control, solución de L2, o R2 cerca del gel (Tabla 4).
      1. Para endurecer geles de 80% a 100% reticulado (80 → 100% en geles), añadir el 20% restante de L2 a 80% en geles mediante la adición de 1 l de solución 100% L2 cerca del gel.
      2. Para suavizar los geles de 100% a 80% reticulado (100 → 80% en geles), añadir R2 para eliminar 20% de las reticulaciones de 100% en geles mediante la adición de 1 l de solución 100% R2 cerca del gel.
      3. Para los controles, añadir volúmenes iguales de la solución de control a un subconjunto de 100% y 80% en geles mediante la adición de 1 l de solución de control cerca de la gel.
    3. Realizar el análisis de procesamiento de células y datos deseado despuésun mínimo de 48 horas.

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Representative Results

Antes de nuestros estudios, se observaron las interacciones célula-ECM en biomateriales compatibles estáticas o en sustratos dinámicos irreversibles y unidireccionales. Estos sustratos no reflejan con exactitud la naturaleza dinámica del microambiente celular. Nuestro trabajo cambia los paradigmas técnicos existentes al proporcionar un modelo más fisiológico para el estudio de las interacciones célula-ECM de ablandamiento y endurecimiento biomateriales dinámicos. En estudios anteriores, se analizaron los efectos de sustratos dinámicos en células mediante el examen de diversas morfologías celulares y fenotipos en estos geles. En un ejemplo, se determinó el efecto de rigidez del sustrato en los fibroblastos mediante la evaluación de la morfología de los fibroblastos en geles de ADN dinámicos. Células L929, una línea celular de fibroblastos derivado de ratón, se sembraron en 80% y 100% en geles (Figura 3) 11. Dos días después de la siembra, 20% de solución L2 adicional esta en los medios de comunicación de 80% en geles para endurecer los geles a 100% reticulado (80 → 100%, el panel central). 100% geles y otro conjunto de 80% en geles de control recibieron ssDNA a permanecer estática (a la derecha y el panel de la izquierda, respectivamente). Imágenes de microscopía de luz fueron capturados dos días después de la entrega de ADN a los medios de comunicación. Borrosidad de imagen, como se ve en la Figura 3, se debió a la falta de uniformidad de la superficie y gel es típico e inevitable. Hinchazón y la contracción del gel, resultante de la adición de tampones y L2 18,21, contribuye a gelificar desnivel. Morfología se evaluó con el software ImageJ (NIH, Bethesda, MD) y se sirve como un indicador de la función. Los fibroblastos cultivados en geles de rigidización (80 → 100%) no presentaban alteraciones en la relación de aspecto, pero mostraron un área de proyección más grande que los fibroblastos cultivados en 100% en geles de 11. Curiosamente, la morfología de los fibroblastos cultivados en geles estáticas era diferente a la morfología de los fibroblastos cultivados en geles dinámicos. Los fibroblastos cultivados en 100% en geles tenían un área de proyección más pequeña y la relación de aspecto mayor que los fibroblastos cultivados en 80% de geles. Estas reresultados indican que el comportamiento de fibroblastos depende de la naturaleza dinámica del microambiente. En otro estudio, los efectos de ablandamiento del sustrato sobre las neuronas se determinó mediante el análisis de fenotipos neuronales incluyendo el número de dendritas, la longitud de las dendritas, y la longitud del axón (figura 4) 10. Neuronas de la médula espinal derivada de rata se cultivaron en 100% y 50% en geles. Cuatro días después de la siembra, 50% R2 se añadió a los medios de 100% geles para suavizar los geles a 50% reticulado (100 → 50%, paneles centrales). 50% geles y otro conjunto de 100% en geles recibieron el control ssDNA permanecer (paneles de la derecha e izquierda, respectivamente) estáticas. Después de tres días, las neuronas se fijaron y immunostained con un marcador dendríticas (MAP2, paneles superiores), un marcador axonal (Tau, paneles de media), y los núcleos (DAPI, paneles inferiores) para evaluar fenotipos. Las neuronas cultivadas en geles de ablandamiento (100 → 50%) no tuvieron diferencias en el número de dendritas primarias o longitud del axón, pero exhibieron dendritas primarias más cortas que las neuronas cultivadas o n 50% de geles. Como en estudios de fibroblastos, fenotipos neuronales en geles estáticas eran diferentes a fenotipos neuronales en geles dinámicos. Las neuronas cultivadas en 50% geles tenían un menor número de dendritas primarias y axones más largos que las neuronas cultivadas en gel de 100%. En conclusión, fibroblastos y neuronas imágenes demuestran que múltiples tipos de células se pueden estudiar en geles de ADN dinámicas y estáticas, desnivel gel de ADN provoca problemas de imagen, técnicas morfológicas y inmunotinción estándar son factibles, y lo más importante el comportamiento de las células depende de la dinámica del sustrato.

Figura 3
Figura 3. fibroblastos cultivados en geles de ADN estáticas y dinámicas. Representante imágenes de microscopía de luz de fibroblastos L929 cultivadas en 80% (panel izquierdo), 80 → 100% (panel central), y 100% de geles (panel derecho). La barra de escala es 100 m. Esta cifra se ha modificado desde el 11.href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51323/51323fig3large.jpg" target = "_blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. Las neuronas cultivadas en geles de ADN. Imágenes fluorescentes representativos de las neuronas de la médula espinal cultivadas en 100% (paneles de la izquierda), 100 → 50% (paneles centrales) y un 50% (paneles de la derecha) geles. Inmunotinción MAP2 indica dendritas (paneles superiores), Tau-1 inmunotinción indica axones (paneles de media), y DAPI indica núcleo (paneles inferiores). La barra de escala es 100 m. Esta cifra se ha modificado desde el 10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

La capacidad de los geles de ADN para suavizar o endurecer antes y después de la adhesión celular las hace un modelo ideal para estudiar el papel de la rigidez del tejido dinámico en función de la célula. Todos los tres diseños se han utilizado en estudios mecánicos y biológicos. Sin embargo, los tres diseños tienen elasticidades similares en diversos porcentajes de reticulación, lo que indica la longitud de reticulación no influye elasticidad del gel de ADN (Tabla 2). En contraste, la concentración de acrilamida afecta a la elasticidad. Estos diseños pueden diferir en la cinética de reticulación desde tendencias de ruptura gel, o la tendencia de los geles para disolver en medios o tampón, disminuye al aumentar la longitud de reticulación. Sin embargo la información cinética en geles de ADN es limitada, pero sí sabemos un 30% adicional de la reticulación se produce dos días después de la entrega L2 a 50% en geles de ADN 11. Sin embargo, la generación de fuerzas expansivas y contráctiles de ablandamiento de gel y de refuerzo, respectivamente, es inevitable y no puede ser desacoplado18,21. 100 → 70% geles generan alrededor de 0,5 Pa de estrés 21, mientras que el 50 → 100% geles sólo generan aproximadamente 0,04 Pa de estrés ya que se requiere más energía para formar enlaces entre los tres stands de ssDNA 18. Por lo tanto, la interpretación de los resultados requiere la consideración de estrés y la tensión generada por el endurecimiento y reblandecimiento de los geles.

Los desafíos técnicos pueden surgir durante la preparación de geles de ADN. El problema técnico más frecuente es la ruptura del gel. Gel de ruptura puede ocurrir durante varias etapas de la preparación de gel de ADN, incluyendo inflamación gel, almacenamiento, y el crecimiento celular. Ruptura del gel se debe a múltiples factores. En primer lugar, estallido gel puede ser un resultado de la composición de la solución incorrecta. Los errores comunes incluyen disolución insuficiente de ssDNA liofilizado y pipeteo inadecuado de los líquidos viscosos. Para evitar errores de pipeteo, elevar la temperatura de calentamiento para reducir la viscosidad del gel para facilitar el pipeteo de soluciones o la alícuota am requeridoporte de SA1 y SA2 polimerizado en solución antes de la segunda etapa de burbujeo de nitrógeno. Además, calentamiento repetido de las soluciones polimerizadas puede evaporarse parcialmente la solución y aumentar la viscosidad de la solución. La adición de unos pocos microlitros de tampón TE puede ayudar a reducir la viscosidad. En segundo lugar, gel de ruptura puede ser un resultado de la mala calidad del ADN. Informes de QA / QC deben ser revisados ​​con frecuencia. Si los informes de AC / CC son aceptables y explosión gel persiste, HPLC purificado ssDNA puede mejorar la calidad del ADN. En tercer lugar, estallido gel puede resultar de recocido ADN insuficiente. Hemos reducido la incidencia de la ruptura del gel mediante la inclusión de etapas de recocido y pasos rehibridación en el protocolo original (consultar los pasos 1.3.6 y 2.8; 1.3.8 y 2.10, respectivamente). Gel de ruptura podría ser prevenida mediante la extensión de recocido y los tiempos de enfriamiento. Sin embargo, la exposición adicional a calor puede evaporar el agua para provocar un aumento en el desprendimiento de gel de vidrio cuando los geles se vuelven a hincharon. Si el desprendimiento es excesivo para cualquier tiempo de recocido, la annpasos Ealing se pueden eliminar (1.3.6 y 2.8).

Otro problema técnico frecuente encontrado es la adhesión celular insuficiente. Los geles hinchados son más suaves que los geles sin hinchar la adhesión celular (Tabla 2) 18 la toma de difícil. Además, puesto que cada tipo de célula responde de manera diferente a la rigidez del tejido, algunos tipos de células pueden experimentar este dilema técnica mientras que otros tipos de células no lo hacen. Para resolver los problemas de adherencia algunas de las medidas de seguimiento se debe considerar: (1) usar una alta densidad de placas, (2) alternar las proteínas ECM conjugados con sulfo-SANPAH, (3) modular los parámetros de rigidez, (4) aumentar las proteínas ECM o concentración sulfo-SANPAH, y (5) aumentar los tiempos de incubación. Agentes tóxicos residuales, tales como monómero de acrilamida, APS y TEMED también podrían contribuir a la falta de adherencia y la muerte celular en geles. No hemos tenido este problema desde un amplio lavados incorporados en el protocolo han demostrado ser suficiente, pero le recomendamos performing Paso opcional 3.2, si se produce este problema.

Geles de ADN pueden ser utilizados para estudiar con más eficacia una variedad de funciones celulares bajo condiciones dinámicas o estáticas. Hemos demostrado que los fibroblastos y las neuronas cultivadas en geles de ADN se ven afectados por la modulación de la elasticidad del gel. Dado que las interacciones célula-matriz son típicamente interfaces de tres dimensiones, la información de los estudios de matriz dinámica tridimensionales ayudará a producir más biológicamente datos pertinentes. Por lo tanto, actualmente estamos traduciendo esta tecnología en un andamio tridimensional. Estamos desarrollando una técnica que sustituye a la columna vertebral de poliacrilamida con un material más biocompatible, manteniendo al mismo tiempo la tecnología de reticulación del ADN. Este nuevo andamio servirá como un modelo dinámico tridimensional y un andamiaje de ingeniería de tejidos. Su biocompatibilidad abrirá oportunidades para aplicaciones de dispositivos médicos.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores desean agradecer a: Dr. Frank Jiang, Dr. David Lin, el Dr. Bernard Yurke y el Dr. Uday Chippada por sus contribuciones en el desarrollo de la tecnología de gel de ADN; Norell Hadzimichalis, Smit Shah, Kimberly Peterman, Robert Arter por sus comentarios y ediciones de este manuscrito; fuentes de financiación, incluida la Comisión de Nueva Jersey en la médula espinal de Investigación (Grant # 07A-019-SCR1, NAL) y Nueva Jersey Instituto de Neurociencias (MLP); y editores de Ingeniería de Tejidos, Parte A para la autorización de reimprimir las figuras 2 y 4 y Biomateriales permiso para reimprimir la figura 3.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ssDNA Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa)
idtdna.com		 Do not vortex ssDNA. Gentle invert the vial and/or pipette solution to mix.
PBS with calcium and magnesium Any brand.
100x Tris-EDTA buffer (TE buffer) Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)
sigmaldrich.com		 T9285
10x Tris-Borate-EDTA buffer (TBE buffer) Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) 93290 TBE is a reproductive toxin.
40% Acrylamide solution Fisher Scientific (Pittsburg, PA) BP14021 Acrylamide is a toxin.
Ammonium persulfate (APS) Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) A3678 Prepare a 2% solution in TE buffer. APS is a toxin and irratant.
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) T9281 Prepare a 20% solution in TE buffer. TEMED is flammable, a corrosive, and a toxin.
12 mm diameter round coverglass Fisher Scientific (Pittsburg, PA)
fishersci.com		 12-545-82
Norland optical adhesive 72 Norland Products (Cranbury, NJ)
norlandprod.com		 NOA72
24-well tissue culture plate Any brand.
Microcentrifuge tubes Any brand.
Sulfo-SANPAH ProteoChem or Thermo Fisher, (Rockland, IL)
proteochem.com or thermofisher.com		 C111 or 22589 Prepare a 0.315 mg/ml solution in water immediately before use. Dissolve at 37 °C and filter sterilze. It is normal to observe undisolved sulfo-SANPAH in the filter. Sulfo-SANPAH is light sensitive and, therefore, the solution should be protect from light until UV exposure.
Poly-D-Lysine (PDL) Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) P6407 Prepare a 0.2 mg/ml solution in water and filter sterilize.
Collagen Type I Affymetrix (Santa Clara, CA)
affymetrix.com		 13813 Prepare a 0.2 mg/ml solution in 0.2 N acetic acid. Solution needs to remain cold at all times to avoid polymerization. Acetic acid is a flammable, toxic, and corrosive.
22 x 60 cover glass Fisher Scientific (Pittsburg, PA) 12-544-G
Positive-displacement pipette Gilson, Inc (Middletown, WI)
gilson.com		 F148504
Heat block Fisher Scientific (Pittsburg, PA) 11-718
UV light source Place gels as close as possible to the UV light. UV light can cause skin or eye injury.
Thermometer Any brand.
Nitrogen gas GTS-Welco (Flemington, NJ)
www.praxairmidatlantic.com/		 NI 5.0UH-R

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