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Biology

Preparação de ADN de poliacrilamida reticulada-hidrogéis

Published: August 27, 2014 doi: 10.3791/51323
Automatic Translation
1, 2,3
1New Jersey Neuroscience Institute, JFK Medical Center, 2Department of Biomedical Engineering, Rutgers University, 3Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Rutgers University

Summary

O nosso laboratório desenvolveu hidrogéis de poliacrilamida reticulada-ADN, um sistema dinâmico de hidrogel, para compreender melhor os efeitos da modulação da rigidez do tecido sobre a função das células. Aqui, nós fornecemos esquemas, descrições e protocolos para preparar estes hidrogéis.

Abstract

Mechanobiology é uma área científica emergente que aborda o papel crítico de pistas físicas em dirigir a morfologia ea função das células. Por exemplo, o efeito da elasticidade do tecido em função celular é uma importante área de pesquisa por causa da rigidez do tecido mechanobiology modula com a doença, o desenvolvimento, e a lesão. Materiais imitando tecido-estática, ou materiais que não podem alterar a rigidez vez células são banhados, são predominantemente utilizados para investigar os efeitos da rigidez do tecido sobre as funções celulares. Embora as informações recolhidas a partir de estudos estáticos é valiosa, esses estudos não são indicativos da natureza dinâmica do microambiente celular in vivo. Para melhor enfrentar os efeitos da rigidez dinâmica em função das células, foi desenvolvido um sistema de poliacrilamida hidrogel reticulado-DNA (géis de DNA). Ao contrário de outros substratos dinâmicos, géis de DNA tem a capacidade de aumentar ou diminuir a rigidez após a fabricação, sem estímulos. Geles de ADN consistem de ADN crosslAs tintas que são polimerizados em uma espinha dorsal de poliacrilamida. Adição e remoção de ligações cruzadas através da entrega de DNA de fita simples permite temporais, espaciais e controle reversível da elasticidade gel. Temos demonstrado em relatórios anteriores que a modulação de elasticidade dinâmico gel DNA influencia o comportamento de fibroblastos e neurônio. Neste relatório e vídeo, nós fornecemos um esquema que descreve os mecanismos de reticulação do gel de DNA e instruções passo-a-passo sobre os géis de preparação de DNA.

Introduction

Substratos estáticos e dinâmicos são duas categorias de biomateriais que foram desenvolvidas para estudar os efeitos de elasticidade do tecido, ou em função da rigidez das células. Substratos estáticos são incapazes de alterar as suas propriedades físicas depois de serem fabricadas e / ou uma vez as células são banhados. Poliacrilamida (PA) foram os primeiros géis bidimensionais substratos, estáticas que foram sintetizadas para investigações mechanobiology 5,17. Geles PA são fáceis de preparar, barato, versátil e pode ser fabricado com uma ampla gama de módulos elásticos. Embora essas vantagens técnicas fazem PA géis um substrato comumente aplicado, substratos estáticas não são indicativos da natureza dinâmica da matriz extracelular (MEC) e ao ambiente circundante celular in vivo. Por exemplo, a rigidez ECM sofre alterações em resultado de ferimento, de desenvolvimento, ou doença. Substratos dinâmicos são, portanto, preferidas como substratos modelo mimetizando a tecidos em estudos mechanobiology

Numerosos sintético, Bidimensional biomateriais, tridimensionais, estáticos e dinâmicos naturais têm sido desenvolvidos para imitar rigidez tecidual 1,3,6,16,23,26. Alguns substratos dinâmicas exigem calor, UV, corrente elétrica, os íons, e mudanças de pH de alterar as suas propriedades mecânicas 2,4,7,8,12,15,16, mas esses estímulos podem restringir bio-aplicação do hidrogel. Hidrogeles de poliacrilamida reticulada-DNA (DNA) são géis elásticos substratos bidimensionais dinâmicas. Ligações cruzadas de DNA permitem a modulação temporais, espaciais, e reversível da rigidez gel DNA pela adição de DNA de fita simples (ssDNA) para mídia ou buffer 9-11,13,14,18,21. Ao contrário dos géis dinâmicas acima mencionados, onde são aplicados estímulos para modulação de elasticidade, os géis de DNA contam com a difusão de ADNcs aplicada para a alteração da elasticidade. Por conseguinte, a superfície superior de gel, em que as células são cultivadas, é a primeira área modulada, porque a taxa de omodulação f elasticidade está dependente da espessura do gel.

Geles de DNA são semelhantes aos seus homólogos gel PA na medida em que têm uma espinha dorsal de poliacrilamida, no entanto, as ligações cruzadas de bis-acrilamida substituída com ligações cruzadas são compostos por ADN (Figura 1). Dois ssDNAs (SA1 e SA2) hibridar com uma cadeia reticulador (L2) para compensar as ligações cruzadas de DNA do gel. SA1 e SA2 têm seqüências distintas que ambos contêm uma modificação Acrydite no final 5 'para a incorporação efetiva na rede PA. Para a preparação do gel, SA1 e SA2 são polimerizados, individualmente, em uma espinha dorsal PA e, subsequentemente, o SA1 polimerizada e SA2 são misturados em conjunto. L2, o agente de reticulação, é adicionado à mistura de SA1 e SA2. A sequência de bases é complementar a L2 ambas as sequências SA1 e SA2 e L2 hibrida com SA1 mais SA2 para formar as ligações cruzadas de DNA. Inicial, a elasticidade de gel de ADN é determinada por ambas as concentrações de L2 e de reticulação (Tabelas 1 2). Geles de ADN que contenham quantidades estequiométricas iguais de L2, AE1, AE2 e os géis são mais duras, porque SA1 e SA2 são 100% reticulado por L2 (designado como 100% de gel). Baixas concentrações do resultado L2 em uma menor percentagem de reticulação DNA e, portanto, géis de DNA mais suave. Géis tão baixas como 50% reticulado (designado como 50% de gel) 9-11 foram construídas.

Figura 1
A Figura 1 de reticulação de gel do DNA e uncrosslinking esquemática 9-11,13,14,18,21 Etapa 1:. SA1 (vermelho) e SA2 (azul) são polimerizados, individualmente, em uma espinha dorsal de poliacrilamida (preto). Após a polimerização, as soluções polimerizados SA1 e SA2 são misturados em conjunto. Passo 2: L2 (verde) é adicionado e hibrida com SA1 mais SA2 para formar as ligações cruzadas do gel. Passo 3: R2 hibrida com tele toehold de L2. Passo 4: hibridização toehold de R2 impulsiona a descompactação de L2 de SA1 e SA2.

Ao contrário dos géis PA, géis de DNA pode endurecer e amaciar após a síntese. Por essa razão, as células cultivadas em géis de ADN pode ser submetido a alterações de rigidez dinâmica. Para endurecer géis de células aderentes, L2 pode ser adicionado ao meio de cultura de baixo géis percentuais, para aumentar a percentagem de ligações cruzadas. Para suavizar a géis de células aderentes, L2 podem ser removidas para reduzir a percentagem de ligações cruzadas 10,13,21. L2 tem uma sequência de ponto de apoio adicional na extremidade 3 'para permitir a L2 uncrosslink de SA1 e SA2 (Tabela 1). Remoção de L2 é realizado através de hibridação de um fio chamado inversão R2. R2 é complementar ao comprimento total de L2 e hibrida com o primeiro ponto de apoio L2. Toehold hibridação impulsiona a descompactação de L2 de SA1 e SA2, que elimina a ligação transversal e reduz a rigidez do gel.

Neste relatório evídeo, passo-a-passo as instruções são fornecidas para a preparação de endurecimento e amolecimento géis de DNA. Embora 100% e de 80% as preparações de gel são descritas, este protocolo pode ser adaptada para criar ADN de géis reticulados outras percentagens iniciais e finais. Em geral, 100% e 80% de gel são preparadas, imobilizada em lamelas de vidro, funcionalizada, e semeadas com células. L2 é adicionado à media de 80% de gel e R2 é adicionado aos meios de comunicação de 100% de gel, 48 horas após o plaqueamento. A adição de meios de L2 para endurece 80% de gel de ligação cruzada a 100%, ao passo que a adição de R2 a mídia amolece a 100% de gel de 80% de ligações cruzadas. Geles endurecidos são designados como 80 → 100% de gel e geles suavizados são designados como 100 → 80% de gel no texto. Para o controlo ou géis estáticos, ADNcs ou consistindo em Ts Como é entregue a outro conjunto de 100% e 80% de gel. Depois de um mínimo de dois dias seguintes modulação elasticidade, as células podem ser processados ​​e analisados.

Reticulação DNA # De bases Sequence (ponto de apoio) Modificação A temperatura de fusão (T m, ° C) Comentários
5 '→ 3'
Projeto 1 SA1 10 GCA CCT TTG C 5 'Acrydite 34,9
SA2 10 GTC AGA ATG A 5 'Acrydite 23,6
L2 30 TCA TTC TGA C GC AAA GGT GC G CTA CAC TTG 56 Uma sequência de 10 pb toehold está incluído.
R2 30 CAA GTG TAG CGC ACC TTT GCG TCA GAA TGA R2 é complementar a L2
Projeto 2 SA1 14 CGT GGC ATA GGA CT 5 'Acrydite 46.9
SA2 14 GTT TCC CAA TCA GA 5 'Acrydite 40,2
L2 40 TCT GAT TGG GAA AC A GTC CTA TGC CAC G GT TAC CTT CAT C 65.9 A seqüência toehold 12 bp está incluído.
R2 40 GAT GAA GGT AAC CGT GGC ATA GGA CTG TTT CCC AAT CAG A 65.9 R2 é complementar a L2
Design 3 SA1 20 ACG GAG GTG TAT GCA ATG TC 5 'Acrydite 55
SA2 20 CAT GCT TAG GGA CGA CTG GA 5 'Acrydite 56.6
L2 40 TCC AGT CGT CCC TAA GCA TG G ACA TTG CAT ACA CCT CCG T 68.8 Ponto de apoio não está incluído.
Controle Controle 20-40 AAA AAA (etc.) ou
TTT TTT (etc.)

Tabela 1. seqüências de bases para ssDNA 9-11,13,14,18,21. Celular e estudos mecânicos têm utilizado vários dmodelos de reticulação iferentes para gerar géis de ADN com uma variedade de propriedades mecânicas estáticas e dinâmicas. Os parâmetros modulados em design de reticulação são sequência de bases de comprimento e sequência ou comprimento de reticulação. Fontes em negrito e itálico ilustrar o pareamento de bases entre SA1 e L2 e entre SA2 e L2, respectivamente.

Projeto
1 2 3
Concentração de acrilamida (%) 10 10 10 4
SA1 mais SA2 hibridado com L2 (% reticulado) 50 80 100 50 80 100 100 100
<strong> Elasticidade (kPa, média ± SEM) 6,6 ± 0,6 17,1 ± 0,8 29,8 ± 2,5 5,85 ± 0,62 12,67 ± 1,33 22,88 ± 2,77 25,2 ± 0,5 10,4 ± 0,6

Tabela 2 o módulo de Young (E) de geles de ADN. 9-11,13,14,18,21 concentração de acrilamida, percentagem de ligações cruzadas, e comprimento de ligação transversal pode ser modulada em geles de ADN. Designs 1, 2 e 3 têm 20, 28 e 40 pb comprimentos de ligação transversal, respectivamente. 100% de gel para todos os projetos têm módulos semelhantes indicando comprimento reticulação não afeta a elasticidade gel. No entanto, as variações na concentração de acrilamida alterar a elasticidade em gel de ADN.

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Protocol

NOTA: O protocolo inteira de preparação gel para processamento de células tem um mínimo de seis dias. Tempo estimado para preparo do gel é de 8 horas, mais um O / N incubação. Tempo estimado para imobilização gel e recozimento DNA é de 8 horas, mais uma etapa O / N enxaguar. Tempo estimado para a funcionalização gel é de 2 horas. Tempo para a galvanização e crescimento das células é dependente do tipo de cultura e de aplicação, mas é necessário um mínimo de quatro dias.

1 Preparação do Gel de DNA

Nota: Preparar géis de DNA em três etapas distintas. Primeiro, polimerizar individualmente SA1 e SA2 ssDNA em um backbone PA. Estas soluções são chamados solução polimerizada SA1 e solução polimerizada SA2, respectivamente (§1.1). Em segundo lugar, dissolve-se o agente de reticulação, cadeia reversível, e ssDNAs controlo. Dissolve-se o liofilizado L2 ADNcs (agente de reticulação). Isto é chamado de 100% de solução de L2 e é utilizado para o fabrico de 100% de gel (§1.2). Dilui-se uma alíquota de solução de 100% de L2a 80%. Isto é chamado de 80% de solução de L2 e é utilizado para o fabrico de 80% de gel. Dissolver liofilizado R2 (vertente reversível) e controle ssDNA para usar em § 4. Em terceiro lugar, misturam SA1 solução polimerizada, solução polimerizada SA2, e 100% ou uma solução de 80% de L2, em uma proporção de 10: 10: 6 (AE1: AE2: L2) de modo a formar 100% e 80% de gel, respectivamente. (§1.3).

1 Preparação de SA1 e SA2 Solutions polimerizado

  1. Selecione e condenar a SA1 adequado, seqüências de bases SA2, L2 e R2 a partir das Tabelas 1 e 2. Seqüências de bases e comprimento seqüência foram otimizados em relatórios anteriores 9-11,13,14.
  2. Calcular todas as formulações de solução (Tabelas 3-4). Nota: Os cálculos de documentos meticulosamente para fins de solução de problemas. Construção de um modelo do Excel é recomendado e pode ser utilizada repetidamente para a preparação de gel de ADN. Por favor, consulte as Tabelas 3 e 4 para um exemplo do apuramento para o Projeto 2 (As Tabelas 1 e 2). Os volumes indicados na Tabela 4 serão usados ​​ao longo deste protocolo, mas os volumes podem variar com cada alíquota de ADNcs liofilizada.
Solução Concentração da solução de Percentual de Banco de Soluções em SA1 ou SA2 Solution Polymerized (v / v) Concentração final da solução em SA1 ou SA2 Solution Polymerized
A acrilamida (No-bisacrilamida) 40% 25 10%
Solução SA1 ou SA2 100% 60 60%
Tampão TBE 10x 10 1x
Temed 20% 2,5 0,50%
APS 2% 2,5 0,05%

Tabela 3. Percentagem de soluções para a fabricação de soluções de SA1 ou polimerizados SA2. A primeira coluna mostra as soluções para a formulação de géis de ADN. A segunda coluna mostra as concentrações de ações destas soluções. A terceira coluna mostra o percentual das soluções estoque em SA1 ou SA2 soluções polimerizados (v / v). A última coluna reflecte as concentrações finais em soluções SA1 e SA2.

soluções ssDNA (§1.1) <tr>
Componentes da solução
Solução Da Concentração Concentração Solução Final Cálculo Valor a Adicionar Comentários
Solução SA1 320,7 nmol de liofilizado SA1 ADNcs 3,00 mM 320,7 nmol / 3,00 nmol ul -1 = 107 ul 107 ul de tampão TE para liofilizada ADNcs Solução SA1 é de 60% de solução polimerizado SA1.
107 ul / 0,600 = 178 ul
178 mL é o volume total da solução de polimerizado SA1 (Tabela 3).
Solução SA2 324,4 nmol de liofilizado SA2 ADNcs 3,00 mM 324,4 nmol / 3,00 nmol ul -1 = 108 ul 108 ul de tampão TE para liofilizada ADNcs Solução SA2 é de 60% de solução polimerizado SA2.
108 ul / 0,600 = 180 ul
180 mL é o volume total da solução de polimerizado SA2 (Tabela 3).
L2 solução 100% 657,4 nmol de liofilizado L2 ADNcs 3,00 mM 657,4 nmol / 3,00 nmol ul -1 = 219 ul 219 ul de tampão TE para liofilizada ADNcs Dilui-se uma alíquota de 100% de L2 para solução L2 80%
Solução L2 80% 80 ul de 100% L2 ADNcs 80% - 20 ul de tampão TE para 80 ul de solução de 100% de L2
A solução de controlo 332,6 nmol de liofilizado de poli T ou A ADNcs 3,00 mM 332,6 nmol / l 3,00 nmol <sup> -1 = 111 mL 111 ul de tampão TE para liofilizada ADNcs
Solução R2 193,8 nmol de liofilizado R2 ADNcs 3,00 mM 193,8 nmol / 3,00 nmol ul -1 = 64,6 ul 64,6 ul de tampão TE para liofilizada ADNcs
Soluções polimerizada (§1.2)
Solução polimerizado SA1 40% de acrilamida 10% 178 ul x 0,25 = 44,5 ul 45 mL Calcula-se a quantidade de acrilamida, TBE, APS, e TEMED com base num volume total de 178 ul (ver acima e na Tabela 3).
10x TBE 1x 178 ul x 0,10 = 17,8 l 18 mL
Solução SA1 100% 60% - 107 mL SA1 solução é de 60% ​​da solução de polimerizado SA1 (ver acima e na Tabela 3).
2% APS 0,05% 178 ul x 0,025 = 4,45 ul 4,5 l Adicione e misture APS antes de adicionar Temed.
20% TEMED 0,50% 178 ul x 0,025 = 4,45 ul 4,5 l
Solução polimerizado SA2 40% de acrilamida 10% 180 mL x 0,25 = 45 ul 45 mL Calcula-se a quantidade de acrilamida, TBE, APS, e TEMED com base num volume total de 180 ul (ver acima e na Tabela 3).
10x TBE 1x 180 mL x 0,10 = 18 ul 18 mL
Solução 100% SA2 60% - 108 mL SA2 solução é de 60% ​​da solução de polimerizado SA2 (ver acima e na Tabela 3).
2% APS 0,05% 180 ul x 0,025 = 4,5 ul 4,5 l Adicione e misture APS antes de adicionar Temed
20% TEMED 0,50% 180 ul x 0,025 = 4,5 ul 4,5 l
Soluções em gel (§1.3)
Solução de gel 100% 100% solução polimerizado SA1 10 partes - 10 ul Compor 100% de gel com a seguinte SA1: AE2: relação L2, 10: 10: 6.
100% SA2 sol polimerizadoution 10 partes - 10 ul
L2 solução 100% 6 partes - 6 l
Solução de gel de 80% 100% solução polimerizado SA1 10 partes - 10 ul Compor 80% de gel com a seguinte SA1: AE2: proporção L2, 10: 10: 6.
100% de solução polimerizada SA2 10 partes - 10 ul
Solução L2 80% 6 partes - 6 l
Géis dinâmicas (§3-4)
80 → 100% de gel 80% de gel 100% gel Cálculo 1: 1 ul de uma solução 100% de L2 em meios de cultura Os cálculos são baseados em ter 20 géis ul em lamelas. Em primeiro lugar, converter as partes de uma solução de 100% de L2 em 20 ul de gel em ul. Em segundo lugar, calcular a quantidade (em L) de solução 100% L2 necessário para um adicional de 20% de ligações cruzadas. Adicione esta quantidade de solução de L2 de 100% para gel.
(20 mL / 26 partes 6 partes) x = 4,6 ul
Cálculo 2:
5 ul de 0,2 x = 1 ul
100 → 80% de gel 100% de gel 80% de gel Cálculo 1: 1 ul de uma solução 100% R2 em meios de cultura Os cálculos são baseados em ter 20 géis ul em lamelas. Em primeiro lugar, converter the partes de solução de 100% de L2 em 20 ul de gel em ul. Em segundo lugar, calcular a quantidade (em mL) de solução de 100% L2 precisava de ser removido para compor um gel de 20%. Adicionar esta quantidade de solução R2 com gel.
(20 mL / 26 partes 6 partes) x = 4,6 ul
Cálculo 2:
5 ul de 0,2 x = 1 ul
100% de gel (Controlo) 100% de gel 100% de gel - 1 ml de solução de controle para meios de cultura Quantidade de solução de controlo é equivalente à quantidade de solução R2 adicionado.
80% de gel (Controlo) 80% de gel 80% de gel - 1 ml de solução de controle para meios de cultura Quantidade de solução de controlo é equivalente ao valor de 100% de solução L2 adicionado.

Tabela 4 número de cálculos de exemplo para a preparação de gel de ADN. Mock são fornecidos para ilustrar os cálculos para a preparação de 80%, 100%, 100 → 80%, e 80% de gel → 100. Géis de DNA são design 2 na Tabela 1.

  1. Centrífuga liofilizado SA1 ADNcs a 2.000 x g durante 15 segundos para garantir que todos ADNcs é na parte inferior do frasco. NOTA: A concentração de solução adequada SA1 é crítica para a síntese de ADN em gel.
  2. Preparar 3 mM de SA1 solução pela adição de 107 ul de 1x tampão Tris-EDTA, pH 8,0 (tampão TE) para o frasco (Tabelas 3-4).
  3. SA1 calor em tampão TE a 70 ° C durante 5 min ou até que ADNcs pelete estar completamente dissolvido. NOTA: A temperatura de aquecimento deve ser, no mínimo de 5 ° C acima da temperatura de fusão (Tm) para assegurar o ADN está num estado de cadeia simples.
  4. Preparar a solução de polimerização SA1 adicionando 40% de acrilamida e 10x Tris-Borato-EDTA-tampão (TBE), nas percentagens indicadas (Quadro 3). Neste exemplo, adicionar 45 e 18 ul, respectivamente, a 107 ul de solução de SA1 (Tabela 4).
  5. Desgaseificação com azoto gasoso durante 3 minutos para facilitar a mistura. Inserir uma ponta p200 ligada a uma fonte de azoto gasoso na solução e, lentamente, permitir que o gás de azoto para passar através da solução. Testar o fluxo de azoto gasoso na água antes de solução SA1 desgaseificação para evitar ondular.
  6. Centrifugar por 15 segundos a 2.000 xg para reunir solução.
  7. Adicionar 4,5 mL de 2% de persulfato de amônio (APS, Tabelas 3-4) para iniciar a polimerização de gel.
  8. Inverter o tubo várias vezes para misturar.
  9. Centrifugar por 15 segundos a 2.000 xg para reunir solução para a polimerização homogênea.
  10. Adicionar 4,5 mL de 20% tetrametiletilenodiamina (TEMED, Tabelas 3-4) para catalisar a polimerização.
  11. Inverter o tubovárias vezes para misturar.
  12. Centrifugar por 15 segundos a 2.000 xg para reunir solução para a polimerização homogênea.
  13. Degas com gás nitrogênio para 3-5 min para completar a polimerização e minimizar monômeros reagiram-un.
  14. Incubar solução durante 10 minutos à temperatura ambiente para completar a polimerização. NOTA: Esta solução é chamada solução SA1 polimerizado.
  15. Repita os passos 1.1.3-1.1.16 com liofilizado SA2 ssDNA, mas adicionar 45, 18, ​​4,5, e 4,5 mL de acrilamida, TBE, APS, e Temed, respectivamente, a 108 ml de solução SA2 (Tabelas 3-4). NOTA: SA1 e SA2 polimerizados soluções podem ser armazenadas a 4 ° C, durante até um mês.

2 Preparação de L2, R2, e Soluções de Controle

  1. Repetir passos 1.1.3-1.1.5 com liofilizado R2 ADNcs mas adicionar 64,4 mL de tampão de TE (Tabela 4).
  2. Repetir passos 1.1.3-1.1.5 com ADNcs controlo liofilizado mas adicionar 111 ul de tampão TE (Tabela 4
  3. Repetir passos 1.1.3-1.1.5 com liofilizado L2 ADNcs mas adicionar 219 ul de tampão TE (Tabela 4). NOTA: Este é solução L2 de 100%. Adição de solução de 100% de L2 para SA1 e soluções polimerizados SA2 (ver §1.3) irá formar um gel de 100% de ligações cruzadas de DNA (100% de gel) porque AE1, AE2, e L2 será estequiometricamente equivalente.
  4. Dilui-se uma alíquota de solução de L2 de 100% a 80% por adição de 20 ul de tampão 1x TE para 80 ul de solução de L2 de 100% (Tabela 4). NOTA: Esta solução é solução L2 80%. Adição de solução de 80% de L2 para SA1 e soluções polimerizados SA2 (ver §1.3) irá formar um gel de ADN de ligação cruzada de 80% (80% de gel) por apenas 80% de SA1 e SA2 vai ser reticulados para L2. As soluções podem ser armazenadas a 4 ° C, durante até um mês.

3 Preparação de soluções de gel

  1. SA1 calor e soluções SA2 polimerizados a 70 ° C, até a viscosidade da solução é reduzida (cerca de 1 minuto). Elevar a temperatura até 80 °C se a solução ainda é muito viscosa a pipeta.
  2. Adicionar 10 ul ou 10 partes de uma solução polimerizada SA1 a 10 uL ou 10 partes de uma solução polimerizada SA2 (Tabela 4). NOTA: SA1 e SA2 soluções polimerizados são extremamente viscoso e difícil de pipeta. Como as concentrações são fundamentais para a formação do gel, use uma pipeta de deslocamento positivo a partir deste ponto para frente ou para ver a discussão para outras técnicas de manejo. Além disso, pipeta em múltiplas, pequenas alíquotas (> 20 l) ao invés de um único volume, grande.
  3. Soluções polimerizados mistura SA1 e SA2 juntos através de aquecimento alternada (durante 15 segundos a 70 ° C) e agitação (durante 15 s com uma ponta de pipeta) para um total de 1 min.
  4. Adicionar 6 uL ou 6 partes de solução de 100% de L2 para formar um gel de 100% (Tabela 4).
  5. Misturar alternando aquecimento e agitação, conforme descrito no passo 1.3.3.
  6. Gel de calor durante 1 hora a uma temperatura óptima de recozimento (35 ° C). Calcule umnnealing subtraindo temperatura de 5 ° C a partir da sequência de ADNcs com a temperatura de fusão mais baixa (Tabela 1).
  7. Pipetar a 100% em gel de 60 mm numa caixa de Petri.
  8. Permitir ligações cruzadas de DNA para continuar a rehybridize gel por incubação durante 4 horas à temperatura ambiente.
  9. Capa de gel com PBS contendo cálcio e magnésio e incubar O / N à temperatura ambiente. NOTA: Gel inchará cerca de três vezes o seu volume inicial. Além disso, geles irá equilibrar-se com tampão e o excesso de acrilamida irá difundir para fora do gel. O cálcio eo magnésio na PBS estabilizar hibridização de DNA e prevenir gel estourando (ver discussão para estourar gel toubleshooting).
  10. Remover tampão restante da placa de Petri.
  11. Para fabricar 80% de gel, repita os passos 1.3.1-1.3.10 mas substitua solução L2 de 100% na etapa 1.3.4 com solução L2 80%. Armazenar 100% e 80% de gel a 4 ° C durante até um mês. NOTA: As diferenças de rigidez entre 80% e 100% de gel são fisicamente distinguíveis.
    12. </ Ol>

    2. Gel Imobilização em Vidro

    NOTA: Imobilizar alíquotas de 100% ou 80% de gel em lamelas de vidro (Figura 2).

    1. Aquecer 100% de gel a 70 ° C durante cerca de 30 segundos ou até o gel é menos viscosa para a pipetagem.
    2. Tampa de vidro lugar desliza para um bloco C calor de 70 ° e deixe aquecer por 1-2 min.
    3. Adicionar uma gota de cola óptica para cada lamínula de vidro.
    4. Adicionam-se 20 ul de 100% de gel de cada lamela de vidro (Tabela 4). NOTA: 10-30 ul pode ser dispensada em cada lamela.
    5. Permitir gel para derreter e espalhar sobre a tampa de vidro deslizante. NOTA: Se topologia gel não aparecer mesmo após fusão, alise com um gel siliconado deslizamento tampa de vidro. No entanto, ocorrerá inchaço adicional nos passos subsequentes e contribuir para a irregularidade de gel.
    6. Remover o gel contendo vidro de bloco de aquecimento e colocar em um prato de 24 poços de cultura de tecidos.
    7. Repita os passos de 2,1-2,6 com 8 0% de gel.
    8. Geles de calor durante 1 hora à temperatura de recozimento óptima (35 ° C). NOTA: É normal que os géis para se tornar seco e isso vai ser resolvido quando géis são incubadas em PBS.
    9. Expor placas contendo 80% e 100% de gel a luz ultravioleta (UV, 365 nm), luz, durante 15 min. NOTA: A exposição UV cura simultaneamente cola e esteriliza géis. Se uma câmara de reticulação UV não está disponível, géis podem ser colocados sob uma luz UV que está equipado em uma cabine de segurança biológica. Após a exposição UV, execute os passos seguintes do presente protocolo no âmbito de um gabinete de segurança biológica para manter a esterilidade gel. Além disso, use soluções estéreis a partir deste ponto em diante.
    10. Permitir ligações cruzadas de DNA para rehybridize à TA durante 4 h.
    11. Adicionar PBS e incubar O / N a 4 ° C. NOTA: PBS incubação lavagens, equilibra e incha géis de novo porque o aquecimento repetido pode desidratar os géis.

    51323 / 51323fig2highres.jpg "/>
    Figura 2 Esquema de imobilização de gel e funcionalização. Após géis de ADN (cinzento) são preparados, os géis estão ligados para lamelas de vidro (branco) por cola óptica (verde). Os géis são, simultaneamente, curados e esterilizado por radiação UV. Após inchação, géis são aproximadamente 1 mm de espessura. Em seguida, os géis são funcionalizados num processo em duas etapas (a caixa vermelha descrito). Primeiro, sulfo-SANPAH é conjugado com acrilamida nas superfícies de gel por exposição à luz UV. Em segundo lugar, os geles são incubados com colagénio ou poli-D-lisina, que se liga ao éster de sulfo-N-hidroxissuccinimida em sulfo-SANPAH. Este valor foi modificado a partir do 10.

    3. Gel funcionalização

    NOTA: gel de funcionalização do ADN é necessária para a adesão das células, uma vez géis de poliacrilamida são materiais inertes (Figura 2). Nesta secção, irá ser funcionalizada géis em solução em duas etapas. Em primeiro lugar, N -Sulfosuccinimidyl-6 (4 &# 39; azido-2'-nitrofenilamino) hexanoato ou sulfo-SANPAH será covalentemente ligado por fotólise do grupo nitrofenilo azida para o backbone de poliacrilamida dos geles de ADN. Em segundo lugar, as aminas primárias em colagénio ou poli-D-lisina vai anexar o éster de N-hidroxissuccinimida em sulfo sulfo-SANPAH para fixar as proteínas de superfície do gel.

    1. Remover tampão em poços com uma pipeta e tome cuidado para não aspirar o gel. NOTA: Não realizar a aspiração a vácuo para reduzir a probabilidade de aspiração do gel.
    2. Opcional) géis Lavar três vezes durante 15 min à temperatura ambiente para remover o excesso de monómero de acrilamida, de TEMED, e APS.
    3. Adicionam-se cerca de 300 ul de sulfo-SANPAH a cobrir cada gel.
    4. Expor géis de UV (365 nm), durante 5 min.
    5. Remover sulfo-SANPAH.
    6. Geles de enxaguamento uma vez com PBS, para remover o excesso de sulfo-SANPAH.
    7. Repita os passos de 3,3-3,6.
    8. Incubar géis em cerca de 300 ul de 0,2 mg / ml de poli-D-lisina durante 1 hora a RT ou O / N a 4 ° C. NOTA: Como alternativa, incubar geles com 0,2 mg / ml de colagénio tipo 1 O / N a 4 ° C.
    9. Lavar géis duas vezes com PBS durante 5 minutos para remover o excesso de poli-D-lisina.
    10. Incubar géis em cerca de 300 ul de meio durante 30 minutos para equilibrar géis.
    11. Remova a mídia imediatamente antes do plaqueamento das células.

    4. cultura de células e imagem

    NOTA: Nesta seção, nós fornecemos detalhes sobre o amaciamento ou endurecimento de géis após o plaqueamento celular. Um protocolo de cultura de células detalhada não é fornecido por várias razões. Em primeiro lugar, numerosos tipos de células podem aderir para géis de DNA e de cada tipo de célula exigirá adaptações específicas por parte do pesquisador para revestimento celular. Em segundo lugar, as técnicas de cultura de células e tecidos normais são usadas para estas experiências e podem ser encontrados em muitos artigos originais, artigos técnicos e livros de referência. As técnicas para o plaqueamento especificamente fibroblastos e neurónios em geles de ADN pode ser encontrada em previpublicações ous 9-11,19-21.

    1. Células da placa. Para os protocolos relativos a dissecção e / ou a cultura de neurónios ou fibroblastos mencionadas neste artigo, referem-se a uma das seguintes publicações 9-11,19-21.
    2. Após um período mínimo de 48 horas, modular a rigidez de gel pipetando 1 mL de controlo, solução de L2, ou R2 perto do gel (Tabela 4).
      1. Para endurecer géis de 80% a 100% reticulado (80 → 100% de gel), adicionar os restantes 20% de L2 a 80% de gel por adição de 1 mL de solução 100% de L2 perto do gel.
      2. Para suavizar a géis de 100% a 80% de ligações cruzadas (100 → 80% de gel), adicionar R2 para remover 20% de ligações cruzadas a partir de 100% de gel por adição de 1 mL de solução 100% R2 perto do gel.
      3. Para os controlos, adicionar volumes iguais de solução de controlo de um subconjunto de 100% e 80% de gel através da adição de 1 ml de solução de controlo ao fim do gel.
    3. Realizar a análise de dados e processamento de células desejada, apósum mínimo de 48 hr.

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Representative Results

Antes de nossos estudos, interações célula-ECM foram observados em biomateriais compatíveis estáticas ou dinâmicas em substratos irreversíveis e unidirecionais. Estes substratos não refletem com precisão a natureza dinâmica do microambiente celular. Nosso trabalho muda os paradigmas técnicos existentes, fornecendo um modelo mais fisiológico para estudar as interações célula-ECM no amolecimento e endurecimento biomateriais dinâmicos. Em estudos anteriores, foram analisados ​​os efeitos de substratos dinâmicos em células examinando várias morfologias celulares e fenótipos nesses géis. Num exemplo, foram determinados os efeitos de endurecimento sobre substrato de fibroblastos através da avaliação da morfologia de fibroblastos em géis de ADN dinâmicas. As células L929, uma linha de células de fibroblastos derivados do rato, foram semeadas em 80% e 100% de gel (Figura 3) 11. Dois dias após o plaqueamento, 20% de solução de L2 adicional foi adicionado aos meios de 80% de gel para endurecer os géis para 100% reticulado (80 → 100%, de painel central). 100% de gel e um outro conjunto de 80% de gel de controlo recebeu ADNcs de permanecer estático (direito e painel esquerdo, respectivamente). As imagens de microscopia de luz foram capturados dois dias após a entrega de DNA para a mídia. Desfocagem da imagem, como pode ser visto na Figura 3, foi devido a irregularidade da superfície de gel e é típica e inevitável. Inchaço Gel e contração, resultante da adição de tampões e L2 18,21, contribui para gel irregularidade. Morfologia foi avaliada com o software ImageJ (NIH, Bethesda, MD) e serviram como um indicador da função. Os fibroblastos cultivados em enrijecimento géis (80 → 100%) não apresentaram alterações na relação de aspecto, mas exibiu uma área de projeção maior do que os fibroblastos cultivados em 100% gel 11. Curiosamente, a morfologia de fibroblastos cultivados em géis estáticos era muito diferente da morfologia de fibroblastos cultivados em géis dinâmicas. Fibroblastos cultivados em 100% de gel tinha uma área de projecção menor e maior proporção do que os fibroblastos cultivados em 80% de gel. Estas resultados indicam que o comportamento dos fibroblastos é dependente da natureza dinâmica do microambiente. Em outro estudo, os efeitos de amolecimento do substrato em neurónios foi determinado por análise de fenótipos neuronais, incluindo o número de dendrite, comprimento dendrítico, e comprimento de axónio (Figura 4) 10. Neurónios da medula espinal derivadas de rato foram cultivadas em 100% e 50% de gel. Quatro dias após o plaqueamento, 50% R2 foi adicionado ao meio de 100% de gel para amaciar os géis de 50% de ligações cruzadas (100 → 50%, painéis centrais). 50% de gel e um outro conjunto de 100% de gel recebeu controle ssDNA permanecer (painéis direito e esquerdo, respectivamente) estáticos. Depois de três dias, os neurônios foram fixados ea imunohistoquímica com um marcador dendríticas (MAPA 2, painéis superiores), um marcador axonal (Tau, painéis de média) e núcleos (DAPI, painéis de fundo) para avaliar os fenótipos. Os neurônios cultivados em géis de amolecimento (100 → 50%) não apresentaram diferenças no número dendrito primário ou comprimento do axônio, mas exibiu dendritos primários menores que neurônios cultivados o n 50% de gel. Tal como nos estudos de fibroblastos, fenótipos neurais em géis estáticos eram diferentes fenótipos neurais em géis dinâmicas. Os neurónios cultivados em 50% de gel teve menos axónios e dendrites principais mais longas do que os neurónios cultivados em 100% de gel. Em conclusão, fibroblastos e neuronais imagens demonstram que vários tipos de células podem ser estudadas em géis de DNA dinâmicos e estáticos, desníveis gel DNA provoca desafios de imagem, técnicas morfológicas e imunocoloração padrão são viáveis, e, sobretudo, o comportamento das células é dependente da dinâmica do substrato.

Figura 3
Figura 3. fibroblastos cultivados em géis de ADN estáticos e dinâmicos. Imagens de microscopia de luz representativas de fibroblastos L929 crescido em 80% (painel da esquerda), 80 → 100% (painel central), e 100% de gel (painel da direita). A barra de escala é 100 um. Este valor foi modificado a partir do 11.href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51323/51323fig3large.jpg" target = "_blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. neurónios cultivados em geles de ADN. Imagens fluorescentes representativos de neurónios da espinal medula cultivados em 100% (painéis da esquerda), 100 → 50% (painéis do centro) e 50% (painéis da direita) géis. MAPA 2 imunomarcação indica dendritos (painéis superiores), Tau-1 imuno indica axônios (painéis do meio) e DAPI indica núcleo (painéis inferiores). A barra de escala é 100 um. Este valor foi modificado a partir do 10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

A capacidade dos geles de ADN para amolecer ou endurecer antes e após a adesão das células torna-os um modelo ideal para estudar o papel da rigidez do tecido dinâmico em função da célula. Todos os três modelos têm sido utilizados em estudos biológicos e mecânicos. No entanto, todos os três modelos têm elasticidade semelhantes em várias percentagens de reticulação, que indica o comprimento de reticulação não influenciar a elasticidade de gel do DNA (Tabela 2). Em contraste, a concentração de acrilamida afecta elasticidade. Estes projetos podem ser diferentes na cinética de reticulação desde tendências de ruptura do gel, ou a tendência de géis para dissolver na mídia ou buffer, diminui com o aumento do comprimento de ligações cruzadas. No entanto a informação cinética em géis de DNA é limitado, mas sabemos mais 30% de reticulação ocorre dois dias após a entrega L2 a 50% de gel de DNA 11. No entanto, a geração de forças expansivas e contrácteis de amolecimento de gel e de endurecimento, respectivamente, é inevitável, e não pode ser dissociado18,21. 100 → 70% géis gerar cerca de 0,5 Pa de estresse 21, enquanto 50 → 100% géis apenas gerar cerca de 0,04 Pa de estresse já que é necessária mais energia para formar ligações entre os três estandes de ssDNA 18. Portanto, a interpretação dos resultados requer a consideração de estresse e tensão gerado pelo endurecimento e amolecimento dos géis.

Desafios técnicos podem surgir quando se prepara géis de DNA. A questão técnica mais freqüente é o rebentamento de gel. Gel de rebentamento pode ocorrer durante várias fases da preparação do gel do ADN, incluindo o inchaço em gel, o armazenamento, e o crescimento celular. Gel explosão é causada por múltiplos fatores. Primeiro, gel de rebentamento pode ser um resultado de composição de solução inadequada. Erros comuns incluem a dissolução insuficiente de ssDNA liofilizado e pipetagem indevido dos líquidos viscosos. Para evitar erros de pipetagem, elevar a temperatura de aquecimento para reduzir a viscosidade do gel para facilitar a pipetagem das soluções ou Alíquota da am exigidoontante de SA1 e SA2 solução polimerizada antes do segundo passo de borbulhamento de azoto. Além disso, o aquecimento repetido de soluções polimerizados podem evaporar-se parcialmente a solução e aumentar a viscosidade da solução. Adicionando alguns microlitros de tampão TE pode ajudar a reduzir a viscosidade. Em segundo lugar, rebentamento de gel pode ser um resultado da má qualidade do DNA. Relatórios de QA / QC deve ser revista com freqüência. Se os relatórios de QA / QC são aceitáveis ​​e rebentamento de gel ainda ocorre, HPLC purificada ssDNA pode melhorar a qualidade do DNA. Em terceiro lugar, rebentamento gel pode resultar de recozimento ADN insuficiente. Nós reduzimos a incidência de estouro gel, incluindo etapas de recozimento e etapas rehybridization no protocolo original (ver passos 1.3.6 e 2.8; 1.3.8 e 2.10, respectivamente). Gel de rebentamento pode ser prevenida através da extensão do recozimento e arrefecimento vezes. No entanto, a exposição ao calor adicional pode evaporar água para causar um aumento na separação em gel a partir de vidro, quando os geles são re-inchado. Se desapego é excessivo para qualquer tempo de recozimento, o annEaling passos pode ser eliminado (1.3.6 e 2.8).

Outro problema técnico é frequente encontrado adesão celular insuficiente. Os géis inchadas são mais suaves do que os geles não inchado adesão celular (Tabela 2) 18 tomada difícil. Além disso, uma vez que cada tipo de célula reage de maneira diferente a rigidez dos tecidos, alguns tipos de células pode enfrentar esse dilema técnico, enquanto outros tipos de células não. Para resolver problemas de aderência alguns dos seguintes passos devem ser considerados: (1) usar uma alta densidade de cultivo, (2) alternar as proteínas da MEC conjugado com sulfo-SANPAH, (3) modular os parâmetros de rigidez, (4) aumentar a proteína ECM ou concentração sulfo-SANPAH, e (5) aumentar o tempo de incubação. Agentes tóxicos residuais tais como monômero acrilamida, APS, e Temed também poderia contribuir para a falta de adesão e morte celular em géis. Nós ainda não experimentou esta questão desde lavagens extensas incorporadas ao protocolo revelaram ser insuficientes, mas recomendamos performing Etapa opcional 3.2 Se esse problema ocorrer.

Geles de ADN pode ser utilizada para estudar mais eficazmente uma variedade de funções das células em condições estáticas ou dinâmicas. Demonstrámos que os fibroblastos e os neurónios cultivados em géis de DNA são afectados pela modulação de elasticidade do gel. Desde as interações célula-matriz são tipicamente as interfaces tridimensionais, informações de estudos de matriz dinâmica tridimensional vai ajudar a produzir mais biologicamente dados relevantes. Portanto, estamos neste momento a traduzir esta tecnologia em um andaime tridimensional. Estamos a desenvolver uma técnica que substitui a espinha dorsal de poliacrilamida com um material mais biocompatível, enquanto se mantém a tecnologia de reticulação do ADN. Este novo andaime vai servir como um modelo tridimensional dinâmica e um andaime de engenharia de tecidos. Sua biocompatibilidade vai abrir oportunidades para aplicações de dispositivos médicos.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Os autores gostariam de agradecer: Dr. Frank Jiang, Dr. David Lin, Dr. Bernard Yurke e Dr. Uday Chippada por suas contribuições sobre o desenvolvimento da tecnologia do gel de DNA; Dr. Norell Hadzimichalis, Smit Shah, Kimberly Peterman, Robert Arter pelos seus comentários e edições deste manuscrito; fontes de financiamento, incluindo a Comissão Jersey New on Spinal Cord Research (Grant # 07A-019-SCR1, NAL) e New Jersey Institute Neuroscience (MLP); e editores de Engenharia de Tecidos, Parte A permissão para reimprimir Figuras 2 e 4 e Biomateriais permissão para reimprimir figura 3.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ssDNA Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa)
idtdna.com		 Do not vortex ssDNA. Gentle invert the vial and/or pipette solution to mix.
PBS with calcium and magnesium Any brand.
100x Tris-EDTA buffer (TE buffer) Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)
sigmaldrich.com		 T9285
10x Tris-Borate-EDTA buffer (TBE buffer) Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) 93290 TBE is a reproductive toxin.
40% Acrylamide solution Fisher Scientific (Pittsburg, PA) BP14021 Acrylamide is a toxin.
Ammonium persulfate (APS) Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) A3678 Prepare a 2% solution in TE buffer. APS is a toxin and irratant.
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) T9281 Prepare a 20% solution in TE buffer. TEMED is flammable, a corrosive, and a toxin.
12 mm diameter round coverglass Fisher Scientific (Pittsburg, PA)
fishersci.com		 12-545-82
Norland optical adhesive 72 Norland Products (Cranbury, NJ)
norlandprod.com		 NOA72
24-well tissue culture plate Any brand.
Microcentrifuge tubes Any brand.
Sulfo-SANPAH ProteoChem or Thermo Fisher, (Rockland, IL)
proteochem.com or thermofisher.com		 C111 or 22589 Prepare a 0.315 mg/ml solution in water immediately before use. Dissolve at 37 °C and filter sterilze. It is normal to observe undisolved sulfo-SANPAH in the filter. Sulfo-SANPAH is light sensitive and, therefore, the solution should be protect from light until UV exposure.
Poly-D-Lysine (PDL) Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) P6407 Prepare a 0.2 mg/ml solution in water and filter sterilize.
Collagen Type I Affymetrix (Santa Clara, CA)
affymetrix.com		 13813 Prepare a 0.2 mg/ml solution in 0.2 N acetic acid. Solution needs to remain cold at all times to avoid polymerization. Acetic acid is a flammable, toxic, and corrosive.
22 x 60 cover glass Fisher Scientific (Pittsburg, PA) 12-544-G
Positive-displacement pipette Gilson, Inc (Middletown, WI)
gilson.com		 F148504
Heat block Fisher Scientific (Pittsburg, PA) 11-718
UV light source Place gels as close as possible to the UV light. UV light can cause skin or eye injury.
Thermometer Any brand.
Nitrogen gas GTS-Welco (Flemington, NJ)
www.praxairmidatlantic.com/		 NI 5.0UH-R

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