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Biology

Preparazione di DNA-reticolato poliacrilammide idrogel

doi: 10.3791/51323 Published: August 27, 2014

Summary

Il nostro laboratorio ha sviluppato idrogel di poliacrilamide DNA-reticolato, un sistema dinamico di idrogel, per comprendere meglio gli effetti di modulazione rigidità dei tessuti sulla funzione delle cellule. Qui, forniamo schemi, descrizioni e protocolli per preparare questi idrogel.

Abstract

Mechanobiology è un settore scientifico emergente che affronta il ruolo critico di segnali fisici nel dirigere la morfologia e la funzione delle cellule. Ad esempio, l'effetto di elasticità dei tessuti sulla funzione delle cellule è un importante area di ricerca mechanobiology perché la rigidità del tessuto modula con la malattia, lo sviluppo, e lesioni. Materiali tessuto-mimando statiche, o materiali che non possono alterare la rigidezza volta che le cellule sono placcati, vengono prevalentemente utilizzati per studiare gli effetti della rigidità dei tessuti sulle funzioni cellulari. Mentre le informazioni raccolte da studi statici è prezioso, questi studi non sono indicativi della natura dinamica del microambiente cellulare in vivo. Per affrontare meglio gli effetti della rigidità dinamica sulla funzione delle cellule, abbiamo sviluppato un sistema di poliacrilammide idrogel DNA-reticolato (gel di DNA). A differenza di altri supporti dinamici, gel di DNA hanno la capacità di aumentare o diminuire la rigidità dopo la fabbricazione, senza stimoli. Gel di DNA sono costituiti da DNA crosslinchiostri che vengono polimerizzate in una spina dorsale di poliacrilamide. Aggiunta e rimozione di legami crociati con la consegna di DNA a singolo filamento permette temporale, spaziale, e il controllo reversibile di elasticità del gel. Abbiamo dimostrato in precedenti relazioni che la modulazione dinamica di elasticità del gel DNA influenza dei fibroblasti e neuroni comportamento. In questo rapporto e video, forniamo uno schema che descrive i meccanismi di reticolazione gel del DNA e passo-passo le istruzioni su gel di preparazione del DNA.

Introduction

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Supporti statici e dinamici sono due categorie di biomateriali che sono stati sviluppati per studiare gli effetti di elasticità dei tessuti o di rigidità sulla funzione cellulare. Supporti statici sono in grado di cambiare le loro proprietà fisiche dopo che sono stati fabbricati e / o una volta che le cellule sono placcati. Poliacrilammide (PA) gel sono stati i primi bidimensionali, supporti statici che sono stati sintetizzati per le indagini mechanobiology 5,17. Gel PA sono facili da preparare, economico, versatile e può essere fabbricato con una vasta gamma di moduli elastici. Anche se questi vantaggi tecnici rendono PA gelifica un substrato comunemente applicato, supporti statici non sono indicativi della natura dinamica della matrice extracellulare (ECM) e di ambiente cellulare circostante in vivo. Ad esempio, l'ECM subisce alterazioni rigidità come risultato di lesioni, sviluppo, o malattia. Supporti dinamici sono quindi favoriti come modelli substrato di tessuto-mimando negli studi mechanobiology

Numerosi sintetico, bidimensionale biomateriali, tridimensionali, statiche e dinamiche naturali sono stati sviluppati per imitare il tessuto rigidità 1,3,6,16,23,26. Alcuni supporti dinamici richiedono calore, ai raggi UV, corrente elettrica, gli ioni, e variazioni di pH per alterare le loro proprietà meccaniche 2,4,7,8,12,15,16, ma questi stimoli possono limitare bio-applicazione del idrogel. Idrogel di poliacrilamide DNA-reticolato (gel di DNA) sono substrati elastici bidimensionali dinamici. Legami crociati DNA permettono la modulazione temporale, spaziale, e reversibile di gel DNA rigidità con l'aggiunta di DNA a singola elica (ssDNA) a supporto o tampone 9-11,13,14,18,21. A differenza dei gel dinamici suddetti in cui si applicano stimoli per la modulazione di elasticità, i gel di DNA basano sulla diffusione di ssDNA applicata per la modifica di elasticità. Pertanto, la superficie del gel superiore, dove si coltivano cellule, è la prima zona modulato perché il tasso omodulazione elasticità f dipende dallo spessore del gel.

Gel di DNA sono simili alle loro controparti gel PA dal fatto che essi hanno un backbone poliacrilammide, tuttavia i legami crociati bis-acrilamide vengono sostituiti con legami crociati costituite da DNA (Figura 1). Due ssDNAs (SA1 e SA2) ibridano con un filamento reticolante (L2) per compensare i legami crociati DNA del gel. SA1 e SA2 hanno sequenze distinte che contengono sia una modifica Acrydite alla fine 5'per incorporazione efficace nella rete PA. Per la preparazione del gel, SA1 e SA2 sono individualmente polimerizzati in una spina dorsale PA e, in seguito, la SA1 e SA2 polimerizzato sono mescolati insieme. L2, il reticolante, viene aggiunto alla miscela SA1 e SA2. La sequenza di basi L2 è complementare ad entrambe le sequenze SA1 e SA2 e L2 si ibrida con SA1 SA2 più per formare i legami crociati DNA. , Elasticità del gel DNA iniziale è determinato da entrambe le concentrazioni L2 e reticolazione (tabelle 1 2). Gel di DNA contenenti uguali quantità stechiometriche di L2, SA1, SA2 e sono i gel più rigide perché SA1 e SA2 sono reticolati al 100% da L2 (designato come 100% gel). Concentrazioni minori di risulta L2 in una percentuale inferiore di reticolazione DNA e, quindi, più morbide gel di DNA. Gel a partire da 50% reticolato (designato come il 50% gel) sono stati costruiti 9-11.

Figura 1
Figura 1 gel DNA reticolazione e uncrosslinking schematica 9-11,13,14,18,21 Passo 1:. SA1 (rosso) e SA2 (blu) sono individualmente polimerizzati in una spina dorsale poliacrilammide (nero). Dopo la polimerizzazione, soluzioni polimerizzati SA1 e SA2 sono mescolati insieme. Fase 2: L2 (verde) si aggiunge e si ibrida con SA1 SA2 più per formare i legami crociati del gel. Fase 3: R2 ibrida con tegli toehold di L2. Fase 4: ibridazione Toehold R2 spinge la decompressione di L2 da SA1 e SA2.

A differenza dei gel PA, gel DNA possono irrigidirsi e ammorbidire dopo la sintesi. Per questo motivo, le cellule coltivate su gel di DNA possono essere sottoposti a modifiche di rigidità dinamica. Per irrigidire gel cellule aderenti, L2 può essere aggiunto al mezzo di coltura di gel basse percentuali di aumentare la percentuale di legami crociati. Per ammorbidire gel cellule aderenti, L2 può essere rimosso per diminuire la percentuale di legami crociati 10,13,21. L2 ha una sequenza appiglio supplementare al fine di consentire 3'L2 a uncrosslink da SA1 e SA2 (Tabella 1). Rimozione di L2 è compiuta mediante ibridazione di un filamento inversione chiamato R2. R2 è complementare alla lunghezza della L2 e si ibrida con il primo appiglio L2. Toehold ibridazione spinge la decompressione di L2 da SA1 e SA2, che elimina la reticolazione e riduce la rigidità gel.

In questa relazione evideo, passo-passo le istruzioni sono fornite per la preparazione di irrigidimento e ammorbidire gel di DNA. Mentre 100% e 80% preparazioni gel sono descritti, questo protocollo può essere adattato per creare gel di DNA di altre percentuali reticolato iniziali e finali. In generale, 100% e 80% gel vengono preparati, immobilizzati su vetrini di vetro, funzionalizzati, e seminati con cellule. L2 viene aggiunto ai media di 80% gel e R2 si aggiunge ai media di 100% gel, 48 ore dopo la placcatura. L'aggiunta di L2 ai media irrigidisce 80% gel 100% reticolato, mentre l'aggiunta di R2 ai media ammorbidisce 100% gel al 80% reticolato. Gel irrigiditi sono designati come 80 → 100% gel e gel ammorbiditi sono designati come 100 → 80% gel nel testo. Per il controllo o gel statici, ssDNA composto da Ts o AS è consegnato ad un altro gruppo di 100% e 80% gel. Dopo un minimo di due giorni modulazione elasticità, le cellule possono essere elaborati ed analizzati.

Reticolazione DNA # Di basi Sequence (Toehold) Modifica Temperatura di fusione (T m, ° C) Commenti
5 '→ 3'
Disegno 1 SA1 10 GCA CCT TTG C 5 'Acrydite 34.9
SA2 10 GTC AGA ATG A 5 'Acrydite 23.6
L2 30 TCA TTC TGA C GC AAA GGT GC G CTA CAC TTG 56 Una sequenza toehold 10 bp è incluso.
R2 30 CAA GTG TAG CGC ACC TTT GCG TCA GAA TGA R2 è complementare a L2
Design 2 SA1 14 CGT GGC ATA GGA CT 5 'Acrydite 46.9
SA2 14 GTT TCC CAA TCA GA 5 'Acrydite 40.2
L2 40 TCT GAT TGG GAA AC A GTC CTA TGC CAC G GT TAC CTT CAT C 65.9 A 12 bp sequenza appiglio è incluso.
R2 40 GAT GAA GGT AAC CGT GGC ATA GGA CTG TTT CCC AAT CAG A 65.9 R2 è complementare a L2
Design 3 SA1 20 ACG GAG GTG TAT GCA ATG TC 5 'Acrydite 55
SA2 20 CAT GCT TAG GGA CGA CTG GA 5 'Acrydite 56.6
L2 40 TCC AGT CGT CCC TAA GCA TG G ACA TTG CAT ACA CCT CCG T 68.8 Toehold non è incluso.
Controllo Controllo 20-40 AAA AAA (ecc) o
TTT TTT (etc.)

Tabella 1. sequenze di base per ssDNA 9-11,13,14,18,21. Cellulare e studi meccanici hanno utilizzato diversi ddisegni di reticolazione ifferent per generare gel di DNA con una gamma di statici e dinamici proprietà meccaniche. I parametri modulati nel design di reticolazione sono sequenza di basi e lunghezza della sequenza o la lunghezza di reticolazione. Caratteri in grassetto e in corsivo illustrano appaiamento delle basi tra SA1 e L2 e tra SA2 e L2 rispettivamente.

Design
1 2 3
Acrilamide Concentrazione (%) 10 10 10 4
SA1 SA2 più ibridato a L2 (% reticolato) 50 80 100 50 80 100 100 100
<strong> Elasticità (kPa, media ± SEM) 6.6 ± 0.6 17.1 ± 0.8 29.8 ± 2.5 5.85 ± 0.62 12.67 ± 1.33 22.88 ± 2.77 25.2 ± 0.5 10.4 ± 0.6

Tabella 2 Modulo di Young (E) del gel del DNA 9-11,13,14,18,21. Concentrazione di acrilamide, percentuale di reticolazione, e la lunghezza di reticolazione può essere modulata in gel di DNA. Designs 1, 2, e 3 hanno 20, 28, e 40 bp lunghezze di reticolazione, rispettivamente. 100% gel per tutti i disegni hanno moduli simili indicante la lunghezza di reticolazione non influenza l'elasticità del gel. Tuttavia, le variazioni della concentrazione di acrilamide alterano l'elasticità del gel del DNA.

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Protocol

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NOTA: L'intero protocollo di preparazione del gel di trasformazione cellulare richiede un minimo di sei giorni. Tempo stimato per la preparazione del gel è di 8 ore, più un O / N di incubazione. Tempo stimato per il gel immobilizzazione e ricottura del DNA è di 8 ore, più un passo O / N risciacquo. Tempo stimato per il gel funzionalizzazione è di 2 ore. Tempo per la placcatura e la crescita delle cellule dipende dal tipo di cultura e di applicazione, ma è richiesto un minimo di quattro giorni.

1 Preparazione di gel di DNA

NOTA: Preparare gel di DNA in tre fasi distinte. In primo luogo, polimerizzare individualmente SA1 e SA2 ssDNA in una spina dorsale PA. Queste soluzioni sono chiamati soluzione polimerizzato SA1 e SA2 soluzione polimerizzato, rispettivamente, (§1.1). In secondo luogo, sciogliere il reticolante, filo reversibili, e ssDNAs controllo. Sciogliere il liofilizzato L2 ssDNA (reticolante). Questo è chiamato il 100% di soluzione L2 e viene utilizzato per fabbricare 100% gel (paragrafo 1.2). Diluire un'aliquota del 100% soluzione L2al 80%. Questo è chiamato 80% soluzione L2 e viene utilizzato per fabbricare 80% gel. Sciogliere liofilizzato R2 (strand reversibile) e il controllo ssDNA da utilizzare in § 4. Terzo, mescolare SA1 soluzione polimerizzata, soluzione polimerizzata SA2, e il 100% o 80% di soluzione L2 in un rapporto di 10: 10: 6 (SA1: SA2: L2) per formare il 100% e 80% gel, rispettivamente. (§1.3).

1 Preparazione di SA1 e SA2 polimerizzati Solutions

  1. Selezionare e ordinare il SA1 appropriato, sequenze di basi SA2, L2, R2 e dalle tabelle 1 e 2. Sequenze di base e lunghezza della sequenza sono stati ottimizzati nelle precedenti relazioni 9-11,13,14.
  2. Calcola tutti formulazioni in soluzione (tabelle 3-4). NOTA: i calcoli di documenti meticolosamente per la risoluzione dei problemi. Costruzione di un modello di Excel è consigliato e può essere utilizzato più volte per la preparazione del gel del DNA. Si prega di consultare le tabelle 3 e 4 per un esempio di tabulazione per Design 2 (Le tabelle 1 e 2). I volumi indicati nella tabella 4 vengono usati in tutto il protocollo, ma i volumi variano con ogni aliquota di ssDNA liofilizzato.
Soluzione Archivio concentrazione della soluzione Percentuale di soluzione madre in SA1 o SA2 Solution polimerizzato (v / v) La concentrazione finale della soluzione in SA1 e SA2 Solution polimerizzato
Acrilamide (No-bisacrilammide) 40% 25 10%
SA1 o SA2 soluzione 100% 60 60%
Tampone TBE 10x 10 1x
TEMED 20% 2.5 0,50%
APS 2% 2.5 0,05%

Tabella 3. Percentuale di soluzioni per fabbricare SA1 e SA2 soluzioni polimerizzati. La prima colonna mostra le soluzioni per formulare i gel di DNA. La seconda colonna mostra le concentrazioni di stock di queste soluzioni. La terza colonna mostra la percentuale delle soluzioni madre in SA1 e SA2 soluzioni polimerizzati (v / v). L'ultima colonna riflette le concentrazioni finali delle soluzioni SA1 e SA2.

soluzioni ssDNA (§1.1) <tr>
Componenti della soluzione
Soluzione Archivio Concentrazione Soluzione Finale Concentrazione Calcolo Importo Aggiungi Commenti
Soluzione SA1 320,7 nmol di liofilizzato SA1 ssDNA 3.00 mM 320,7 nmol / 3,00 nmol ml -1 = 107 microlitri 107 ml di tampone TE di liofilizzato ssDNA Soluzione SA1 è il 60% di soluzione polimerizzato SA1.
107 microlitri / 0,600 = 178 ml
178 microlitri è il volume totale di soluzione polimerizzata SA1 (Tabella 3).
Soluzione SA2 324,4 nmol di liofilizzato SA2 ssDNA 3.00 mM 324,4 nmol / 3,00 nmol ml -1 = 108 microlitri 108 ml di tampone TE di liofilizzato ssDNA Soluzione SA2 è il 60% di soluzione polimerizzato SA2.
108 microlitri / 0,600 = 180 ml
180 microlitri è il volume totale di soluzione polimerizzata SA2 (Tabella 3).
100% soluzione L2 657,4 nmol di liofilizzato L2 ssDNA 3.00 mM 657,4 nmol / 3,00 nmol ml -1 = 219 microlitri 219 ml di tampone TE di liofilizzato ssDNA Diluire un'aliquota del 100% L2 al 80% soluzione L2
80% soluzione L2 80 ml di 100% L2 ssDNA 80% - 20 ml di tampone TE a 80 ml di 100% soluzione L2
Soluzione di controllo 332,6 nmol di liofilizzato poly T o A ssDNA 3.00 mM 332,6 nmol / ml 3.00 nmol <sup> -1 = 111 ml 111 ml di tampone TE di liofilizzato ssDNA
Soluzione R2 193,8 nmol di liofilizzato R2 ssDNA 3.00 mM 193,8 nmol / 3,00 nmol ml -1 = 64,6 microlitri 64,6 ml di tampone TE di liofilizzato ssDNA
Le soluzioni polimerizzati (paragrafo 1.2)
Soluzione polimerizzato SA1 40% acrilamide 10% 178 microlitri x 0,25 = 44,5 ml 45 microlitri Calcolare la quantità di acrilamide, TBE, APS, e TEMED basato su un volume totale di 178 microlitri (vedi sopra e Tabella 3).
10x TBE 1x 178 microlitri x 0,10 = 17,8 ml 18 microlitri
Soluzione SA1 100% 60% - 107 ml Soluzione SA1 è 60% della soluzione polimerizzata SA1 (vedi sopra e Tabella 3).
2% APS 0,05% 178 microlitri x 0,025 = 4,45 ml 4,5 microlitri Aggiungere e mescolare APS prima di aggiungere TEMED.
20% TEMED 0,50% 178 microlitri x 0,025 = 4,45 ml 4,5 microlitri
Soluzione polimerizzato SA2 40% acrilamide 10% 180 ml x 0,25 = 45 microlitri 45 microlitri Calcolare la quantità di acrilamide, TBE, APS, e TEMED basato su un volume totale di 180 microlitri (vedi sopra e Tabella 3).
10x TBE 1x 180 ml x 0,10 = 18 microlitri 18 microlitri
Soluzione SA2 100% 60% - 108 ml Soluzione SA2 è 60% della soluzione polimerizzata SA2 (vedi sopra e Tabella 3).
2% APS 0,05% 180 microlitri x 0.025 = 4,5 ml 4,5 microlitri Aggiungere e mescolare APS prima di aggiungere TEMED
20% TEMED 0,50% 180 microlitri x 0.025 = 4,5 ml 4,5 microlitri
Le soluzioni Gel (§1.3)
Soluzione Gel 100% 100% soluzione polimerizzato SA1 10 pezzi - 10 microlitri Comporre 100% gel con il seguente SA1: SA2: rapporto L2, 10: 10: 6.
100% SA2 sol polimerizzatoution 10 pezzi - 10 microlitri
100% soluzione L2 6 pezzi - 6 ml
Soluzione Gel 80% 100% soluzione polimerizzato SA1 10 pezzi - 10 microlitri Comporre 80% gel con il seguente SA1: SA2: rapporto L2, 10: 10: 6.
100% soluzione polimerizzato SA2 10 pezzi - 10 microlitri
80% soluzione L2 6 pezzi - 6 ml
Gel dinamici (§3-4)
80 → 100% gel 80% gel 100% gel Calcolo 1: 1 ml di soluzione 100% L2 nella cultura dei media I calcoli si basano su avere 20 microlitri gel su vetrini. In primo luogo, convertire le parti del 100% soluzione L2 nei 20 ml di gel in microlitri. In secondo luogo, calcolare la quantità (in ml) del 100% soluzione L2 necessario per un ulteriore 20% di reticolazione. Aggiungi questo importo di 100% soluzione L2 a gel.
(20 microlitri / 26 pezzi) x 6 pezzi = 4,6 ml
Calcolo 2:
5 ml x 0.2 = 1 microlitri
100 → 80% gel 100% gel 80% gel Calcolo 1: 1 ml di soluzione 100% R2 nella cultura dei media I calcoli si basano su avere 20 microlitri gel su vetrini. In primo luogo, convertire tegli parti del 100% soluzione L2 nei 20 ml di gel in microlitri. In secondo luogo, calcolare la quantità (in ml) del 100% di soluzione L2 bisogno di essere rimosso per comporre un gel al 20%. Aggiungi questa quantità di soluzione R2 a gel.
(20 microlitri / 26 pezzi) x 6 pezzi = 4,6 ml
Calcolo 2:
5 ml x 0.2 = 1 microlitri
100% gel (controllo) 100% gel 100% gel - 1 ml di soluzione di controllo nella cultura dei media Quantità di soluzione di controllo è equivalente alla quantità di soluzione R2 aggiunto.
80% gel (controllo) 80% gel 80% gel - 1 ml di soluzione di controllo nella cultura dei media Quantità di soluzione di controllo è equivalente alla quantità di 100% di soluzione L2 aggiunto.

Tabella 4 Esempi di calcolo per la preparazione del gel di DNA. Falsa numeri vengono forniti per illustrare i calcoli per la preparazione di 80%, 100%, 100 → 80%, e 80 → 100% gel. Gel di DNA sono Design 2 in Tabella 1.

  1. Centrifugare liofilizzato SA1 ssDNA a 2.000 xg per 15 sec a garantire tutte ssDNA è al fondo della fiala. NOTA: la concentrazione corretta della soluzione SA1 è fondamentale per la sintesi del DNA in gel.
  2. Preparare 3 mM di SA1 soluzione con l'aggiunta di 107 ml di 1x Tris-EDTA, pH 8.0 tampone (tampone TE) al flaconcino (tabelle 3-4).
  3. SA1 calore in tampone TE a 70 ° C per 5 minuti o fino ssDNA pellet è completamente sciolto. NOTA: la temperatura di riscaldamento dovrebbe essere un minimo di 5 ° C sopra la temperatura di fusione (Tm) al fine di garantire il DNA è in uno stato a singolo filamento.
  4. Preparare la soluzione di polimerizzazione SA1 con l'aggiunta del 40% di acrilammide e 10x Tris-borato-EDTA (TBE) tampone alle percentuali indicate (tabella 3). In questo esempio, aggiungere 45 e 18 microlitri, rispettivamente, a 107 ml di soluzione SA1 (Tabella 4).
  5. Degas con gas azoto per 3 min per facilitare la miscelazione. Inserire la punta p200 collegato a una fonte di gas azoto nella soluzione e lentamente azoto permettono di passare attraverso la soluzione. Testare la velocità di flusso del gas di azoto in acqua prima soluzione SA1 degassamento per evitare splatter.
  6. Centrifugare per 15 secondi a 2.000 xg per raccogliere soluzione.
  7. Aggiungere 4,5 ml di 2% di ammonio persolfato (APS, tabelle 3-4) per avviare la polimerizzazione del gel.
  8. Capovolgere la provetta diverse volte per mescolare.
  9. Centrifugare per 15 secondi a 2.000 xg per raccogliere soluzione per polimerizzazione omogenea.
  10. Aggiungere 4,5 ml di 20% tetrametiletilendiammina (TEMED, tabelle 3-4) per catalizzare la polimerizzazione.
  11. Invertire il tubopiù volte per mescolare.
  12. Centrifugare per 15 secondi a 2.000 xg per raccogliere soluzione per polimerizzazione omogenea.
  13. Degas con gas azoto per 3-5 minuti per completare la polimerizzazione e minimizzare monomeri non-reagito.
  14. Incubare la soluzione per 10 minuti a RT per completare la polimerizzazione. NOTA: Questa soluzione si chiama SA1 soluzione polimerizzato.
  15. Ripetere i punti 1.1.3-1.1.16 con liofilizzato SA2 ssDNA, ma aggiungere 45, 18, ​​4.5, e 4.5 ml di acrilammide, TBE, APS, e TEMED rispettivamente, a 108 ml di soluzione SA2 (tabelle 3-4). NOTA: SA1 e SA2 soluzioni polimerizzati possono essere conservati a 4 ° C per un massimo di un mese.

2 Preparazione di L2, R2, e Control Solutions

  1. Ripetere i punti 1.1.3-1.1.5 con liofilizzato R2 ssDNA ma aggiungere 64,4 ml di tampone TE (Tabella 4).
  2. Ripetere i punti 1.1.3-1.1.5 con liofilizzato ssDNA controllo, ma aggiungere 111 ml di tampone TE (Tabella 4
  3. Ripetere i punti 1.1.3-1.1.5 con liofilizzato L2 ssDNA ma aggiungere 219 ml di tampone TE (Tabella 4). NOTA: Questo è il 100% soluzione L2. Aggiunta al 100% soluzione L2 per SA1 e SA2 soluzioni polimerizzati (vedi §1.3) formeranno un reticolato gel DNA 100% (100% gel) perché SA1, SA2, e L2 sarà stechiometricamente equivalente.
  4. Diluire un'aliquota del 100% di soluzione L2 al 80% con l'aggiunta di 20 microlitri di tampone 1x TE a 80 ml ​​di soluzione 100% L2 (Tabella 4). NOTA: Questa soluzione è l'80% soluzione L2. L'aggiunta di 80% soluzione L2 per SA1 e SA2 soluzioni polimerizzati (vedi §1.3) formerà un gel di DNA reticolato 80% (80% gel), perché solo l'80% dei SA1 e SA2 sarà reticolato a L2. Le soluzioni possono essere conservati a 4 ° C per un massimo di un mese.

3 Preparazione di gel Solutions

  1. Calore SA1 e SA2 soluzioni polimerizzati a 70 ° C fino soluzione viscosità viene ridotta (circa 1 min). Alzare la temperatura fino a 80 °C se la soluzione è ancora troppo viscoso per pipetta.
  2. Aggiungere 10 ml o 10 parti di soluzione polimerizzata SA1 a 10 microlitri o 10 parti di soluzione polimerizzata SA2 (Tabella 4). NOTA: SA1 e SA2 soluzioni polimerizzati sono estremamente viscoso e difficile da pipetta. Dal momento che le concentrazioni sono fondamentali per la formazione di gel, utilizzare una pipetta a spostamento positivo da questo punto in avanti o di discussione per vedere altre tecniche di manipolazione. Inoltre, pipetta in più, piccole aliquote (> 20 ml), piuttosto che un unico, grande volume.
  3. Soluzioni polimerizzati Mix SA1 e SA2 insieme tramite alternata riscaldamento (per 15 sec a 70 ° C) e mescolando (per 15 sec con un puntale) per un totale di 1 min.
  4. Aggiungere 6 ml o 6 parti di 100% soluzione L2 per formare un gel 100% (Tabella 4).
  5. Mescolare alternando riscaldamento e agitazione come descritto al punto 1.3.3.
  6. Gel di calore per 1 ora alla temperatura ottimale di annealing (35 ° C). Calcolare unnnealing temperatura sottraendo 5 ° C dalla sequenza ssDNA con la temperatura di fusione più bassa (Tabella 1).
  7. Pipettare il gel al 100% in una piastra di Petri di 60 mm.
  8. Consenti legami crociati DNA a continuare a rehybridize incubando gel per 4 ore a temperatura ambiente.
  9. Copertura del gel con PBS contenente calcio e magnesio e incubare O / N a RT. NOTA: Gel si gonfiano di circa 3 volte il loro volume iniziale. Inoltre, i gel saranno equilibrare con tampone e eccesso acrilammide si diffonderà su gel. Calcio e magnesio nel PBS stabilizzare ibridazione DNA e prevenire gel scoppio (vedi la discussione per toubleshooting gel scoppio).
  10. Rimuovere restante buffer dalla piastra di Petri.
  11. Per fabbricare 80% gel, ripetere i punti 1.3.1-1.3.10 ma sostituire al 100% la soluzione L2 al passo 1.3.4 con l'80% di soluzione di L2. Conservare al 100% e 80% gel a 4 ° C per un massimo di un mese. NOTA: Le differenze di rigidità tra il 80% e il 100% gel sono fisicamente distinguibili.
  12. </ Ol>

    2 Gel Immobilizzazione su vetro

    NOTA: Immobilizzare aliquote di 100% o 80% gel su vetrini di vetro (Figura 2).

    1. Riscaldare 100% gel a 70 ° C per circa 30 secondi o fino a quando il gel è meno viscoso per pipettare.
    2. Luogo copertura in vetro scivola su un blocco di calore 70 ° C e lasciare scaldare per 1-2 min.
    3. Aggiungere una goccia di adesivo ottico per ogni vetrino in vetro.
    4. Aggiungere 20 ml di 100% gel di ciascun vetrino di vetro (Tabella 4). NOTA: 10-30 ml può essere erogato su ogni vetrino.
    5. Lasciare gel per sciogliere e si sviluppa su vetrino di vetro. NOTA: Se la topologia gel non viene visualizzato anche dopo la fusione, appiattire gel con una copertura in vetro siliconato antiscivolo. Tuttavia, gonfiore supplementare avverrà in fasi successive e contribuire al gel irregolarità.
    6. Rimuovere contenenti vetro gel dal blocco termico e posto in una piastra di coltura tissutale da 24 pozzetti.
    7. Ripetere i passaggi 2,1-2,6 con 8 0% gel.
    8. Gel di calore per 1 ora alla temperatura di ricottura ottimale (35 ° C). NOTA: E 'normale che i gel a diventare secco e questo sarà risolto quando i gel sono incubati in PBS.
    9. Esporre piastre contenenti 80% e il 100% gel ai raggi ultravioletti (UV, 365 nm) di luce per 15 min. NOTA: l'esposizione ai raggi UV cure contemporaneamente colla e sterilizza gel. Se una camera di reticolazione UV non è disponibile, gel possono essere posti sotto una luce UV che è dotato di una cappa di sicurezza biologica. Dopo l'esposizione ai raggi UV, effettuare le successive fasi di questo protocollo sotto una cappa di sicurezza biologica per mantenere la sterilità gel. Inoltre, utilizzare soluzioni sterili da questo punto in avanti.
    10. Consenti legami crociati DNA a rehybridize a temperatura ambiente per 4 ore.
    11. Aggiungi PBS e incubare O / N a 4 ° C. NOTA: PBS incubazione risciacqua, equilibra e si gonfia di nuovo gel perché il riscaldamento ripetuto può disidratare i gel.

    51323 / 51323fig2highres.jpg "/>
    Figura 2 Schema di gel di immobilizzazione e di funzionalizzazione. Dopo gel DNA (grigio) sono preparati, i gel sono allegati alla scivola copertura in vetro (bianco) di colla ottica (verde). I gel sono simultaneamente curati e sterilizzati dalla luce UV. Dopo il gonfiore, i gel sono circa di spessore 1 mm. Avanti, gel sono funzionalizzati in un processo a due fasi (rosso scatola delineato). In primo luogo, solfo-SANPAH è coniugato a acrilamide sulle superfici gel di esposizione alla luce UV. In secondo luogo, i gel vengono incubati con collagene o poli-D-lisina, che attribuisce al ester solfo-N-idrossisuccinimmide in solfo-SANPAH. Questo dato è stato modificato da 10.

    3. Gel Funzionalizzazione

    È necessaria DNA gel funzionalizzazione per l'adesione cellulare dal gel di poliacrilammide sono materiali inerti (Figura 2): NOTA. In questa sezione, gel verranno funzionalizzati in due fasi. In primo luogo, N -Sulfosuccinimidyl-6-(4 &# 39; -azido-2'-nitrophenylamino) esanoato o solfo-SANPAH sarà covalentemente legata da fotolisi del gruppo nitrofenil azide alla spina dorsale poliacrilammide del gel del DNA. In secondo luogo, ammine primarie in collagene o poli-D-lisina attribuirà alla sulfo- N estere -hydroxysuccinimide in solfo-SANPAH per fissare le proteine ​​alla superficie del gel.

    1. Rimuovere buffer in pozzetti con una pipetta e fare attenzione a non aspirare il gel. NOTA: Non eseguire l'aspirazione a vuoto per ridurre la probabilità di aspirare il gel.
    2. Opzionale) gel Lavare tre volte per 15 minuti a RT per rimuovere l'eccesso di acrilammide monomero, TEMED, e APS.
    3. Aggiungere circa 300 ml di solfo-SANPAH per coprire ogni gel.
    4. Esporre gel di UV (365 nm) per 5 min.
    5. Rimuovere solfo-SANPAH.
    6. Gel Risciacquare una volta con PBS per rimuovere l'eccesso solfo-SANPAH.
    7. Ripetere i passaggi 3,3-3,6.
    8. Incubare gel in circa 300 ml di 0,2 mg / ml di poli-D-lisina per 1 ora a RT o O / N a 4 ° C. NOTA: In alternativa, incubare gel con 0,2 mg / ml di collagene di tipo 1 O / N a 4 ° C.
    9. Lavare gel due volte con PBS per 5 minuti per rimuovere l'eccesso poli-D-lisina.
    10. Incubare gel in circa 300 ml di media per 30 minuti per equilibrare gel.
    11. Rimuovere i supporti immediatamente prima placcatura cellule.

    4. Coltura Cellulare e Imaging

    NOTA: In questa sezione, noi forniamo i dettagli riguardanti il ​​rammollimento o irrigidimento dei gel dopo placcatura cellulare. Un protocollo dettagliato coltura delle cellule non è disponibile per diversi motivi. In primo luogo, numerosi tipi di cellule possono aderire su gel di DNA e ogni tipo di cellula richiederanno adeguamenti specifici da parte del ricercatore per la placcatura delle cellule. In secondo luogo, le tecniche di cellule e tessuti di coltura standard sono utilizzati per questi esperimenti e possono essere trovati in numerosi articoli originali, articoli tecnici e libri di riferimento. Tecniche per la particolare placcatura fibroblasti e neuroni sul gel di DNA possono essere trovati in previpubblicazioni UO 9-11,19-21.

    1. Cellule Plate. Per i protocolli in materia di dissezione e / o coltura di neuroni o fibroblasti citati in questo articolo, fare riferimento a una delle seguenti pubblicazioni 9-11,19-21.
    2. Dopo un minimo di 48 ore, modulare gel rigidità pipettando 1 ml di controllo, soluzione L2 o R2 vicino al gel (Tabella 4).
      1. Per irrigidire gel dal 80% al 100% reticolato (80 → 100% gel), aggiungere il restante 20% di L2 a 80% gel aggiungendo 1 ml di soluzione 100% L2 vicino al gel.
      2. Per ammorbidire gel dal 100% al 80% reticolato (100 → 80% gel), aggiungere R2 per rimuovere il 20% dei legami crociati di 100% gel aggiungendo 1 ml di soluzione 100% R2 vicino al gel.
      3. Per i controlli, aggiungere volumi uguali di soluzione di controllo a un sottoinsieme di 100% e l'80% gel con l'aggiunta di 1 ml di soluzione di controllo vicino al gel.
    3. Eseguire l'analisi del trattamento delle cellule e dei dati desiderato dopoun minimo di 48 ore.

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Representative Results

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Prima i nostri studi, le interazioni cellula-ECM sono stati osservati sui biomateriali compatibili statici o su supporti dinamici irreversibili e unidirezionali. Questi substrati non riflettono con precisione la natura dinamica del microambiente cellulare. Il nostro lavoro si sposta i paradigmi tecnici esistenti, fornendo un modello più fisiologica per lo studio delle interazioni cellula-ECM sul rammollimento e irrigidimento biomateriali dinamici. In studi precedenti, abbiamo analizzato gli effetti dei supporti dinamici sulle cellule esaminando varie morfologie cellulari e fenotipi su questi gel. In un esempio, abbiamo determinato gli effetti del substrato irrigidimento sui fibroblasti valutando fibroblasti morfologia su gel di DNA dinamici. Cellule L929, una linea cellulare di fibroblasti di topo-derivati, sono state piastrate su 80% e 100% gel (Figura 3) 11. Due giorni dopo la placcatura, il 20% soluzione aggiuntiva L2 è stato aggiunto al supporto del 80% gel per irrigidire i gel al 100% reticolato (80 → 100%, pannello centrale). 100% gel e un altro set di 80% gel ricevuti controllo ssDNA a rimanere statico (destra e pannello di sinistra, rispettivamente). Immagini al microscopio ottico sono stati catturati due giorni dopo la consegna del DNA ai media. Sfocatura immagine, come si vede in figura 3, è dovuto al gel superficie irregolarità ed è tipico e inevitabile. Gel gonfiore e contrazione, risultante dall'aggiunta di buffer e L2 18,21, contribuisce a gel irregolarità. Morfologia è stata valutata con il software ImageJ (NIH, Bethesda, MD) e servito come un indicatore di funzione. I fibroblasti coltivati ​​su gel di irrigidimento (80 → 100%) non avevano alterazioni nel rapporto di aspetto, ma hanno mostrato una proiezione maggiore di fibroblasti coltivati ​​in 100% gel 11. È interessante notare che la morfologia dei fibroblasti coltivati ​​in gel statiche era dissimile alla morfologia dei fibroblasti coltivati ​​su gel dinamici. I fibroblasti coltivati ​​su 100% gel avevano una proiezione piccole e grandi proporzioni che fibroblasti coltivati ​​in 80% gel. Questi rerisultati indicano che il comportamento fibroblasti dipende dalla natura dinamica del microambiente. In un altro studio, gli effetti del substrato ammorbidente sui neuroni è stata determinata analizzando fenotipi neuronali tra cui il numero dendrite, lunghezza dendrite, e la lunghezza assone (Figura 4) 10. Neuroni del midollo spinale di ratto-derivata sono state coltivate su 100% e il 50% gel. Quattro giorni dopo la placcatura, il 50% R2 è stato aggiunto ai media di 100% gel per ammorbidire i gel al 50% reticolato (100 → 50%, pannelli centrali). 50% gel e un altro set di 100% gel ricevuti controllo ssDNA di rimanere (pannelli destro e sinistro rispettivamente) statiche. Dopo tre giorni, i neuroni sono stati fissati e immunostained con un pennarello dendritiche (MAP2, pannelli superiori), un indicatore assonale (Tau, pannelli centrali), e nuclei (DAPI, pannelli in basso) per valutare fenotipi. I neuroni coltivati ​​su gel emollienti (100 → 50%) non avevano differenze nel numero dendrite primaria o lunghezza dell'assone, ma esposti dendriti primarie più brevi di neuroni coltivati ​​o n 50% gel. Come negli studi di fibroblasti, fenotipi neurali su gel statici erano dissimili da fenotipi neurali su gel dinamici. I neuroni coltivati ​​su 50% gel hanno avuto un minor numero di dendriti e degli assoni primari più lunghi rispetto neuroni coltivati ​​al 100% gel. In conclusione, le immagini fibroblasti e neuroni dimostrano che più tipi di cellule possono essere studiate su gel di DNA dinamiche e statiche, gel DNA irregolarità provoca sfide di imaging, tecniche morfologiche e immunostaining normali sono fattibili, e soprattutto il comportamento delle cellule dipende da dinamiche substrato.

Figura 3
Figura 3. fibroblasti coltivati ​​in gel di DNA statiche e dinamiche. Luce Rappresentante immagini di microscopia di L929 fibroblasti coltivati ​​80% (pannello di sinistra), 80 → 100% (pannello centrale), e 100% gel (pannello di destra). Barra della scala è di 100 micron. Questo dato è stato modificato da 11.href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51323/51323fig3large.jpg" target = "_blank"> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. neuroni coltivati ​​su gel di DNA. Immagini fluorescenti rappresentative dei neuroni del midollo spinale coltivate su 100% (pannelli a sinistra), 100 → 50% (centrale), e il 50% (pannelli di destra) gel. MAP2 immunostaining indica dendriti (pannelli superiori), Tau-1 immunoistochimica indica assoni (pannelli centrali), e la colorazione DAPI indica nucleo (pannelli inferiori). Barra della scala è di 100 micron. Questo dato è stato modificato da 10. Cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

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La capacità del gel di DNA per ammorbidire o irrigidire prima e dopo l'adesione cellulare li rende un modello ideale per studiare il ruolo della rigidità dei tessuti dinamica sulla funzione delle cellule. Tutti e tre i disegni sono stati utilizzati in studi meccanici e biologici. Tuttavia, tutti e tre i disegni hanno elasticità simili in varie percentuali di reticolazione, indicante la lunghezza di reticolazione non influenza l'elasticità del gel del DNA (Tabella 2). Al contrario, la concentrazione di acrilamide colpisce elasticità. Questi disegni possono differire in cinetica di reticolazione dal tendenze gel di rottura, o la tendenza di gel da sciogliere in media o tampone, diminuisce con l'aumentare della lunghezza di reticolazione. Tuttavia cinetica informazioni su gel di DNA è limitato, ma sappiamo un ulteriore 30% di reticolazione avviene due giorni dopo la consegna L2 al 50% gel di DNA 11. Tuttavia, la generazione di forze espansive e contrattili di gel di rammollimento e irrigidimento, rispettivamente, è inevitabile e non può essere disaccoppiato18,21. 100 → 70% gel generano circa 0,5 Pa di stress 21, mentre il 50 → 100% gel generano solo circa 0,04 Pa di stress in quanto è necessaria più energia per formare legami tra i tre stand di ssDNA 18. Pertanto, l'interpretazione dei risultati richiede la considerazione di stress e la tensione generata dal irrigidimento e ammorbidimento di gel.

Sfide tecniche possono sorgere durante la preparazione gel di DNA. Il problema tecnico più frequente è gel scoppio. Gel di rottura può verificarsi durante le varie fasi di preparazione del DNA gel tra cui gonfiore gel, stoccaggio, e la crescita delle cellule. Gel di rottura è causata da molteplici fattori. In primo luogo, il gel di rottura può essere un risultato di impropria composizione soluzione. Gli errori più comuni sono insufficienti dissoluzione di ssDNA liofilizzato e pipettaggio improprio dei liquidi viscosi. Per evitare errori di pipettaggio, aumentare la temperatura di riscaldamento per ridurre la viscosità del gel per facilitare il pipettaggio di soluzioni o di un'aliquota del mattino richiestaount di SA1 e SA2 soluzione polimerizzato prima alla seconda fase di bubbling azoto. Inoltre, il riscaldamento ripetuto delle soluzioni polimerizzati può parzialmente evaporare la soluzione e aumentare viscosità della soluzione. L'aggiunta di un paio di microlitri di tampone TE può contribuire a ridurre la viscosità. In secondo luogo, il gel di rottura può essere il risultato di una scarsa qualità del DNA. Rapporti di QA / QC devono essere rivisti frequentemente. Se i rapporti QA / QC sono accettabili e gel scoppio si verifica ancora, HPLC purificato ssDNA può migliorare la qualità del DNA. In terzo luogo, il gel di rottura può essere causata da insufficiente ricottura DNA. Abbiamo ridotto l'incidenza di gel scoppio includendo passaggi di ricottura e passi rehybridization nel protocollo originale (vedere i passi 1.3.6 e 2.8, 1.3.8 e 2.10, rispettivamente). Gel scoppio potrebbe essere evitato estendendo ricottura e raffreddamento volte. Tuttavia, dosi aggiuntive di calore può evaporare l'acqua a causare un aumento distacco gel da vetro quando gel sono ri-gonfiarono. Se il distacco è eccessivo per qualsiasi momento ricottura, la annpassi Ealing possono essere eliminati (1.3.6 e 2.8).

Un altro problema tecnico frequente riscontrato è l'adesione cellulare insufficiente. I gel gonfie sono più morbide rispetto ai gel unswollen (Tabella 2) 18 il processo di adesione delle cellule difficile. Inoltre, dal momento che ogni tipo di cellula risponde in modo diverso alla rigidità dei tessuti, alcuni tipi di cellule possono sperimentare questo dilemma tecnico, mentre altri tipi di cellule non lo fanno. Per risolvere i problemi di adesione alcuni dei passi successivi devono essere considerati: (1) utilizzare una densità di placcatura, (2) alternare le proteine ​​ECM coniugati a solfo-SANPAH, (3) modulare i parametri di rigidezza, (4) aumentare proteine ​​ECM o concentrazione solfo-SANPAH, e (5) aumentare i tempi di incubazione. Agenti tossici residui quali acrilammide monomero, APS, e TEMED potrebbero anche contribuire alla mancanza di adesione e morte cellulare in gel. Non abbiamo sperimentato questo problema dal momento che vaste lavaggi incorporati nel protocollo hanno dimostrato sufficiente, ma si consiglia di performing Passo opzionale 3.2 se si verifica questo problema.

Gel di DNA possono essere utilizzati per studiare più efficacemente una varietà di funzioni cellulari in condizioni statiche o dinamiche. Abbiamo dimostrato che i fibroblasti e neuroni coltivati ​​su gel di DNA sono influenzati dalla modulazione di elasticità del gel. Dal momento che le interazioni cellula-matrice sono tipicamente interfacce tridimensionali, informazioni dagli studi di matrice dinamica tridimensionali contribuirà a produrre più biologicamente dati rilevanti. Pertanto, stiamo traducendo questa tecnologia in uno scaffold tridimensionale. Stiamo sviluppando una tecnica che sostituisce l'ossatura poliacrilammide con un materiale più biocompatibile, pur mantenendo la tecnologia di reticolazione DNA. Questo nuovo scaffold servirà come un modello dinamico tridimensionale e una impalcatura ingegneria tessutale. La sua biocompatibilità aprirà opportunità per le applicazioni di dispositivi medici.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Gli autori desiderano ringraziare: Dr. Frank Jiang, il dottor David Lin, il Dr. Bernard Yurke e il Dr. Uday Chippada per i loro contributi sullo sviluppo della tecnologia del gel del DNA; Dr. Norell Hadzimichalis, Smit Shah, Kimberly Peterman, Robert Arter per i loro commenti e le modifiche di questo manoscritto; fonti di finanziamento, tra cui il New Jersey Commissione su Spinal Cord Research (Grant # 07A-019-SCR1, NAL) e New Jersey Neuroscience Institute (MLP); e editori di Ingegneria Tissutale, parte A, per il permesso di ristampare figure 2 e 4 e Biomateriali per il permesso di ristampare figura 3.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ssDNA Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa)
idtdna.com
Do not vortex ssDNA. Gentle invert the vial and/or pipette solution to mix.
PBS with calcium and magnesium Any brand.
100x Tris-EDTA buffer (TE buffer) Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)
sigmaldrich.com
T9285
10x Tris-Borate-EDTA buffer (TBE buffer) Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) 93290 TBE is a reproductive toxin.
40% Acrylamide solution Fisher Scientific (Pittsburg, PA) BP14021 Acrylamide is a toxin.
Ammonium persulfate (APS) Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) A3678 Prepare a 2% solution in TE buffer. APS is a toxin and irratant.
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) T9281 Prepare a 20% solution in TE buffer. TEMED is flammable, a corrosive, and a toxin.
12 mm diameter round coverglass Fisher Scientific (Pittsburg, PA)
fishersci.com
12-545-82
Norland optical adhesive 72 Norland Products (Cranbury, NJ)
norlandprod.com
NOA72
24-well tissue culture plate Any brand.
Microcentrifuge tubes Any brand.
Sulfo-SANPAH ProteoChem or Thermo Fisher, (Rockland, IL)
proteochem.com or thermofisher.com
C111 or 22589 Prepare a 0.315 mg/ml solution in water immediately before use. Dissolve at 37 °C and filter sterilze. It is normal to observe undisolved sulfo-SANPAH in the filter. Sulfo-SANPAH is light sensitive and, therefore, the solution should be protect from light until UV exposure.
Poly-D-Lysine (PDL) Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) P6407 Prepare a 0.2 mg/ml solution in water and filter sterilize.
Collagen Type I Affymetrix (Santa Clara, CA)
affymetrix.com
13813 Prepare a 0.2 mg/ml solution in 0.2 N acetic acid. Solution needs to remain cold at all times to avoid polymerization. Acetic acid is a flammable, toxic, and corrosive.
22 x 60 cover glass Fisher Scientific (Pittsburg, PA) 12-544-G
Positive-displacement pipette Gilson, Inc (Middletown, WI)
gilson.com
F148504
Heat block Fisher Scientific (Pittsburg, PA) 11-718
UV light source Place gels as close as possible to the UV light. UV light can cause skin or eye injury.
Thermometer Any brand.
Nitrogen gas GTS-Welco (Flemington, NJ)
www.praxairmidatlantic.com/
NI 5.0UH-R

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References

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Preparazione di DNA-reticolato poliacrilammide idrogel
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Previtera, M. L., Langrana, N. A. Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels. J. Vis. Exp. (90), e51323, doi:10.3791/51323 (2014).More

Previtera, M. L., Langrana, N. A. Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels. J. Vis. Exp. (90), e51323, doi:10.3791/51323 (2014).

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