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Biology

Préparation de l'ADN réticulé polyacrylamide hydrogels

Published: August 27, 2014 doi: 10.3791/51323
Automatic Translation
1, 2,3
1New Jersey Neuroscience Institute, JFK Medical Center, 2Department of Biomedical Engineering, Rutgers University, 3Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Rutgers University

Summary

Notre laboratoire a développé des hydrogels de polyacrylamide ADN réticulé, un système d'hydrogel dynamique, afin de mieux comprendre les effets de la modulation de la rigidité des tissus sur la fonction cellulaire. Ici, nous fournissons des schémas, des descriptions et des protocoles pour préparer ces hydrogels.

Abstract

Mécanobiologie est un domaine scientifique émergent qui porte sur le rôle critique de repères physiques dans la direction de la morphologie et de la fonction des cellules. Par exemple, l'effet de l'élasticité des tissus sur la fonction cellulaire est un domaine de recherche important de mécanobiologie car la rigidité des tissus module à la maladie, le développement, et les blessures. Statique des matériaux de tissus imitant ou des matériaux qui ne peuvent pas modifier la rigidité fois que les cellules sont étalées, sont principalement utilisés pour étudier les effets de la rigidité des tissus sur les fonctions cellulaires. Bien que les informations recueillies à partir d'études statiques est précieux, ces études ne sont pas représentatifs de la nature dynamique du microenvironnement cellulaire in vivo. Pour mieux cerner les effets de la rigidité dynamique sur la fonction cellulaire, nous avons développé un système hydrogel de polyacrylamide ADN réticulé (gels d'ADN). Contrairement à d'autres substrats dynamiques, des gels d'ADN sont capables de diminuer ou d'augmenter la rigidité après la fabrication sans stimuli. les gels sont constitués d'ADN de l'ADN crossldes encres qui sont polymérisés dans un squelette de polyacrylamide. Ajout et suppression de liaisons transversales par délivrance d'ADN simple brin permet temporelle, spatiale, et le contrôle réversible de gel élasticité. Nous avons montré que dans les rapports précédents modulation dynamique de gel d'ADN élasticité influe sur le comportement des fibroblastes et des neurones. Dans le présent rapport et la vidéo, nous fournissons un schéma qui décrit le gel d'ADN mécanismes de réticulation et des instructions étape-par-étape sur les gels d'ADN de préparation.

Introduction

Substrats statiques et dynamiques sont deux catégories de biomatériaux qui ont été développés pour étudier les effets de l'élasticité des tissus ou de la rigidité sur la fonction cellulaire. Substrats statiques sont incapables de modifier leurs propriétés physiques après ils sont fabriqués et / ou une fois les cellules sont étalées. Polyacrylamide (PA) ont été les premiers gels, des substrats statiques à deux dimensions qui ont été synthétisés pour les enquêtes sur mécanobiologie 5,17. Gels PA sont faciles à préparer, peu coûteux, polyvalent, et peuvent être fabriqués avec une large gamme de modules d'élasticité. Bien que ces avantages techniques font PA gélifie un substrat communément appliqué, substrats statiques ne sont pas représentatifs de la nature dynamique de la matrice extracellulaire (MEC) et entourant environnement cellulaire in vivo. Par exemple, l'ECM subit des altérations rigidité à la suite de blessures, le développement ou la maladie. Substrats dynamiques sont donc favorisés que les modèles de substrat tissus imitant dans les études de mécanobiologie

De nombreux synthétique, deux dimensions, biomatériaux, en trois dimensions, statiques, dynamiques et naturelles ont été développées pour imiter la rigidité des tissus 1,3,6,16,23,26. Certains supports dynamiques ont besoin de chaleur, UV, le courant électrique, les ions, et des changements de pH de modifier leurs propriétés mécaniques 2,4,7,8,12,15,16, mais ces stimuli peuvent restreindre bio-demande de l'hydrogel. Hydrogels de polyacrylamide ADN réticulé (gels d'ADN) sont des substrats élastiques en deux dimensions dynamiques. réticulations d'ADN permettent la modulation temporelle, spatiale et réversible de rigidité de gel de l'ADN par addition de l'ADN simple brin (ADNsb) un support ou un tampon 9-11,13,14,18,21. Contrairement aux gels dynamiques mentionnées ci-dessus, où les stimuli sont appliqués pour la modulation de l'élasticité, les gels d'ADN s'appuient sur la diffusion de l'ADN sb appliquée pour la modification de l'élasticité. Par conséquent, la surface supérieure du gel, où les cellules sont cultivées, la première zone est modulé en raison du taux of élasticité modulation dépend de l'épaisseur du gel.

des gels d'ADN sont identiques à leurs homologues de gel PA en ce sens qu'ils ont un squelette de polyacrylamide, cependant, les liaisons croisées de bis-acrylamide sont remplacées par des liaisons transversales composées d'ADN (Figure 1). Deux ADNsb (SA1 et SA2) s'hybrident avec un brin d'agent de réticulation (L2) pour compenser les réticulations d'ADN du gel. SA1 et SA2 ont des séquences distinctes qui contiennent tous deux une modification Acrydite à la fin 5'pour l'incorporation effective dans le réseau d'aires protégées. Pour la préparation de gels, SA1 et SA2 sont polymérisés individuellement dans un squelette PA et, par la suite, le SA1 et SA2 polymérisé sont mélangés ensemble. L2, l'agent de réticulation, on ajoute à la SA1 et SA2 mélange. La séquence de bases L2 est complémentaire à la fois des séquences SA1 et SA2 et L2 s'hybride avec SA1 SA2 ainsi que pour former les liaisons de reticulation de l'ADN. Initial, le gel de l'ADN est déterminée par l'élasticité des deux concentrations de réticulation et L2 (tableaux 1 2). gels d'ADN contenant des quantités stoechiométriques égales de L2, SA1, SA2 et les gels rigides parce SA1 et SA2 sont 100% réticulé par L2 (désigné comme 100% de gels). Des concentrations plus faibles de résultat L2 dans un pourcentage plus faible de l'ADN réticulation et, par conséquent, plus doux gels d'ADN. Gels aussi bas que 50% réticulé (désigné comme 50% de gels) ont été construits 9-11.

Figure 1
Figure 1: gel de l'ADN réticulation et uncrosslinking schématique 9-11,13,14,18,21. Etape 1: SA1 (rouge) et SA2 (bleu) sont polymérisés individuellement dans un squelette de polyacrylamide (noir). Après la polymérisation, les solutions polymérisées SA1 et SA2 sont mélangés ensemble. Etape 2: L2 (en vert) est ajouté et s'hybride avec SA1 SA2 en plus pour former les liaisons de reticulation du gel. Étape 3: R2 s'hybride avec til prendre pied de L2. Étape 4: hybridation prendre pied de R2 propulse la décompression de L2 de SA1 et SA2.

Contrairement gels PA, gels d'ADN peuvent durcir et adoucir après la synthèse. Pour cette raison, les cellules cultivées sur des gels d'ADN peuvent être soumis à des modifications de la raideur dynamique. Pour rigidifier les gels de cellules adhérentes, L2 peut être ajouté au milieu de culture de gels faibles pourcentages d'augmenter le pourcentage de liaisons de réticulation. Pour ramollir des gels de cellules adhérentes, L2 peut être enlevé pour diminuer le pourcentage de liaisons transversales 10,13,21. L2 a une séquence complémentaire de prendre pied à l'extrémité 3 'afin de permettre à L2 uncrosslink de SA1 et SA2 (tableau 1). L'élimination de L2 est réalisée par hybridation d'un brin d'inversion appelé R2. R2 est complémentaire de la longueur de L2 et s'hybride avec le premier prendre pied L2. Prendre pied hybridation propulse la décompression de L2 de SA1 et SA2, ce qui élimine la réticulation et réduit la rigidité de gel.

Dans le présent rapport etvidéo, étape par étape, des instructions sont fournies pour la préparation de gels de raidissement et l'adoucissement de l'ADN. Alors que 100% et 80% des préparations de gel sont décrits, ce protocole peut être adapté pour créer des gels d'ADN d'autres pourcentages réticulé initial et final. En général, 100% et 80% de gels sont préparés, immobilisées sur des lamelles de verre, fonctionnalisés, et ensemencées avec des cellules. L2 est ajouté au milieu de 80% de gels et R2 est ajouté au milieu de 100% de gels, de 48 h après l'ensemencement. L'ajout de L2 aux médias raidit 80% de gels à 100% réticulé, tandis que l'addition de R2 aux médias adoucit 100% de gels à 80% réticulé. Gels raidies sont désignés comme 80 → 100% de gels et gels adoucies sont désignés comme 100 → 80% de gels dans le texte. Pour le contrôle ou gels statiques, ADN simple brin constitué de Ts ou As est livré à un autre ensemble de 100% et 80% de gels. Après un minimum de deux jours suivants élasticité modulation, les cellules peuvent être traitées et analysées.

ADN réticulation # De bases Séquence (prendre pied) Modification La température de fusion (T m, ° C) Commentaires
5 '→ 3'
Design 1 SA1 10 GCA CCT TTG C 5 'Acrydite 34,9
SA2 10 GTC AGA ATG A 5 'Acrydite 23,6
L2 30 TCA TTC TGA C GC AAA GGT GC G CTA CAC TTG 56 Une séquence de 10 pb prendre pied est inclus.
R2 30 CAA GTG TAG CCG CAC TTT GCG TCA GAA TGA R2 est complémentaire de L2
Design 2 SA1 14 CGT GGC ATA GGA CT 5 'Acrydite 46,9
SA2 14 GTT TCC CAA TCA GA 5 'Acrydite 40,2
L2 40 TCT GAT TGG GAA AC A GTC CTA TGC CAC G GT TAC CTT CAT C 65,9 Une séquence prendre pied 12 pb est inclus.
R2 40 GAT GAA GGT AAC CGT GGC ATA GGA CTG TTT CCC AAT CAG A 65,9 R2 est complémentaire de L2
Design 3 SA1 20 ACG GAG GTG TAT GCA ATG TC 5 'Acrydite 55
SA2 20 CAT GCT TAG GGA CGA CTG GA 5 'Acrydite 56,6
L2 40 TCC AGT CGT CCC TAA GCA TG TTG G ACA ACA CAT CCT GCC T 68,8 Prendre pied n'est pas inclus.
Contrôle Contrôle 20-40 AAA AAA (etc.) ou
TTT TTT (etc.)

Tableau 1: séquences de base pour ssADN 9-11,13,14,18,21. Cellulaire et des études mécaniques ont utilisés plusieurs dconceptions de réticulation ifférents pour générer des gels d'ADN avec une gamme de propriétés mécaniques statiques et dynamiques. Les paramètres modulés dans la conception de réticulation sont séquence de base et durée de la séquence ou de la longueur de réticulation. Les caractères gras et en italique illustrent appariement de bases entre SA1 et SA2 entre L2 et L2 et, respectivement.

Conception
1 2 3
Acrylamide Concentration (%) 10 10 10 4
SA1 SA2, plus hybride à L2 (% réticulé) 50 80 100 50 80 100 100 100
<strong> Elasticité (kPa, moyenne ± SEM) 6,6 ± 0,6 17,1 ± 0,8 29,8 ± 2,5 5,85 ± 0,62 12,67 ± 1,33 22,88 ± 2,77 25,2 ± 0,5 10,4 ± 0,6

Tableau 2 Le module de Young (E) de gels d'ADN. 9-11,13,14,18,21 concentration de l'acrylamide, le pourcentage de reticulation, et la durée de reticulation peut être modulée dans des gels d'ADN. Designs 1, 2, et 3 ont 20, 28 et 40 pb longueurs de réticulation, respectivement. 100% de gels pour tous les modèles ont des modules semblables indiquant la longueur de réticulation ne pas affecter gel élasticité. Cependant, les variations de la concentration d'acrylamide modifient gel d'ADN élasticité.

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Protocol

NOTE: Le protocole de l'ensemble de préparation d'un gel de traitement de cellule prend un minimum de six jours. Temps estimé pour la préparation de gel est de 8 heures, plus un O / N incubation. Estimation du temps d'immobilisation de gel et l'ADN recuit est 8 heures, plus une étape O / N rinçage. Temps estimé pour gel fonctionnalisation est de 2 h. Durée de placage et la croissance cellulaire est dépendante du type de culture et à l'application, mais un minimum de quatre jours est nécessaire.

1 Préparation de gels d'ADN

NOTE: Préparer les gels d'ADN en trois étapes distinctes. Tout d'abord, polymériser individuellement SA1 et SA2 ADN simple brin dans un squelette PA. Ces solutions sont appelées solution polymérisée SA1 et SA2 solution polymérisée, respectivement (§ 1.1). Deuxièmement, dissoudre l'agent de réticulation, brin réversible, et ADNsb de contrôle. Dissoudre le lyophilisé L2 ADN simple brin (agent de réticulation). Ceci est appelé solution L2 100% et est utilisé pour fabriquer des gels (100% § 1.2). Diluer une partie aliquote de la solution L2 100%à 80%. C'est ce qu'on appelle 80% solution et L2 est utilisée pour fabriquer 80% de gels. Dissoudre lyophilisée R2 (toron réversible) et le contrôle ADN simple brin à utiliser au § 4. Troisièmement, mélanger la solution polymérisée SA1, SA2 solution polymérisée, et de 100% ou L2 solution à 80% dans un rapport de 10: 10: 6 (SA1: SA2: L2) pour former 100% et 80% de gels, respectivement. (§ 1.3).

1 Préparation de SA1 et SA2 Solutions polymérisées

  1. Choisir et commander le SA1 échéant, SA2, L2, R2 et des séquences de bases dans les tableaux 1 et 2. Séquences de base et la longueur de la séquence ont été optimisées dans les rapports précédents 9-11,13,14.
  2. Calculer toutes les formulations de solutions (tableaux 3-4). REMARQUE: calculs de documents méticuleusement à des fins de dépannage. Construction d'un modèle Excel est recommandée et peut être utilisé plusieurs fois pour la préparation du gel de l'ADN. S'il vous plaît voir les tableaux 3 et 4 pour un exemple de la tabulation pour Design 2 (Les tableaux 1 et 2). Les volumes indiqués dans le tableau 4 seront utilisés tout au long de ce protocole mais les volumes varient en fonction de chaque aliquote de ssADN lyophilisée.
Solution Stock concentration de la solution Pourcentage de la solution mère dans SA1 ou SA2 polymérisé en solution (v / v) Concentration finale de la solution dans SA1 ou SA2 Solution polymérisé
Acrylamide (Pas-bis-acrylamide) 40% 25 10%
solution de SA1 ou SA2 100% 60 60%
Tampon TBE 10x 10 1x
TEMED 20% 2.5 0,50%
APS 2% 2.5 0,05%

Tableau 3. Pourcentage de solutions pour la fabrication d'SA1 ou SA2 solutions polymérisées. La première colonne indique les solutions pour la formulation des gels d'ADN. La deuxième colonne indique les actions concentrations de ces solutions. La troisième colonne indique le pourcentage de solutions mères dans SA1 ou SA2 solutions polymérisées (v / v). La dernière colonne indique les concentrations finales dans les solutions de SA1 et SA2.

solutions "8" ADN simple brin (§ 1.1) <tr>
composants de la solution
Solution Stock Concentration Concentration de la solution finale Calcul Montant Ajouter Commentaires
Solution SA1 320,7 nmol de lyophilisé SA1 ssADN 3.00 mM 320,7 nmol / 3,00 nmol ul -1 = 107 ul 107 pl de tampon TE à lyophilisée ADNsb Solution SA1 est de 60% de la solution polymérisée SA1.
107 ul / 0,600 = 178 ul
178 pi est le volume total de solution polymérisée SA1 (tableau 3).
Solution SA2 324,4 nmol de lyophilisé SA2 ssADN 3.00 mM 324,4 nmol / 3,00 nmol ul -1 = 108 pi 108 pl de tampon TE à lyophilisée ADNsb Solution SA2 est de 60% de la solution polymérisée SA2.
108 ul / 0,600 = 180 ul
180 pi est le volume total de solution polymérisée SA2 (tableau 3).
L2 solution à 100% 657,4 nmol de lyophilisé L2 ssADN 3.00 mM 657,4 nmol / 3,00 nmol ul -1 = 219 pi 219 pl de tampon TE à lyophilisée ADNsb Diluer une partie aliquote de 100% de L2 L2 solution à 80%
L2 solution à 80% 80 ul de 100% L2 ADNsb 80% - 20 pl de tampon TE à 80 ul de solution L2 100%
La solution de contrôle 332,6 nmol de lyophilisé poly T ou A ssADN 3.00 mM 332,6 nmol / ul <3,00 nmolsup> -1 = 111 pi 111 pl de tampon TE à lyophilisée ADNsb
Solution R2 193,8 nmol de lyophilisé R2 ssADN 3.00 mM 193,8 nmol / 3,00 nmol ul -1 = 64,6 pi 64,6 pi de tampon TE à lyophilisée ADNsb
Solutions polymérisées (§ 1.2) de
Solution polymérisée SA1 40% d'acrylamide 10% 178 pi x 0,25 = 44,5 pi 45 pl Calculer la quantité d'acrylamide, TBE, APS et TEMED basé sur un volume total de 178 pi (voir ci-dessus et le tableau 3).
10x TBE 1x 178 pi x 0,10 = 17,8 pi 18 ul
Solution de SA1 à 100% 60% - 107 ul SA1 solution est de 60% ​​de la solution polymérisée SA1 (voir ci-dessus et dans le tableau 3).
2% APS 0,05% 178 pi x 0,025 = 4,45 pi 4,5 pl Ajouter et mélanger APS avant d'ajouter TEMED.
20% TEMED 0,50% 178 pi x 0,025 = 4,45 pi 4,5 pl
Solution polymérisée SA2 40% d'acrylamide 10% 180 pi x 0,25 = 45 pi 45 pl Calculer la quantité d'acrylamide, TBE, APS et TEMED basé sur un volume total de 180 pi (voir ci-dessus et le tableau 3).
10x TBE 1x 180 pi x 0,10 = 18 pi 18 ul
Solution à 100% SA2 60% - 108 ul SA2 solution est de 60% ​​de la solution polymérisée SA2 (voir ci-dessus et dans le tableau 3).
2% APS 0,05% 180 pi x 0,025 = 4,5 pl 4,5 pl Ajouter et mélanger APS avant d'ajouter TEMED
20% TEMED 0,50% 180 pi x 0,025 = 4,5 pl 4,5 pl
solutions de gel (§ 1.3)
Solution de gel de 100% 100% SA1 solution polymérisée 10 parties - 10 pl Composez 100% de gels avec le SA1 suivante: SA2: rapport L2, 10: 10: 6.
100% SA2 sol polymériséution 10 parties - 10 pl
L2 solution à 100% 6 parties - 6 pi
Gel de solution à 80% 100% SA1 solution polymérisée 10 parties - 10 pl Composez 80% de gels avec le SA1 suivante: SA2: rapport L2, 10: 10: 6.
100% SA2 solution polymérisée 10 parties - 10 pl
L2 solution à 80% 6 parties - 6 pi
Gels dynamiques (§3-4)
Gel 80 → 100% Gel à 80% Ge 100%l Calcul 1: 1 ul de solution L2 100% dans un milieu de culture Les calculs sont basés sur des gels ayant 20 pi sur des lamelles. Tout d'abord, convertir les parties de solution L2 de 100% dans les 20 ul de gel en pi. Deuxièmement, calculer la quantité (en pi) d'une solution 100% L2 nécessaire pour un 20% supplémentaire de réticulation. Ajouter cette quantité de solution L2 de 100% de gel.
(20 pl / 26 parties) x 6 pièces = 4,6 pi
Calcul 2:
5 pi x 0,2 = 1 pi
Gel 100 → 80% Gel de 100% Gel à 80% Calcul 1: 1 ul de solution R2 100% dans un milieu de culture Les calculs sont basés sur des gels ayant 20 pi sur des lamelles. Tout d'abord, convertir til se sépare de la solution 100% L2 dans les 20 pi de gel dans ul. Deuxièmement, calculer la quantité (en pi) d'une solution 100% L2 devait être enlevé pour composer un gel de 20%. Ajouter cette quantité de solution R2 de gel.
(20 pl / 26 parties) x 6 pièces = 4,6 pi
Calcul 2:
5 pi x 0,2 = 1 pi
Gel de 100% (témoin) Gel de 100% Gel de 100% - 1 ul de la solution de contrôle dans les milieux de culture Montant de la solution de commande est équivalente à la quantité de solution ajoutée R2.
Gel à 80% (témoin) Gel à 80% Gel à 80% - 1 ul de la solution de contrôle dans les milieux de culture Montant de la solution de contrôle est équivalente à la quantité de solution 100% L2 ajouté.

Tableau 4: Exemples de calcul pour la préparation du gel de l'ADN. Mock chiffres sont donnés pour illustrer les calculs pour la préparation de 80%, 100%, 100% → 80 et 80 → 100% de gels. des gels d'ADN sont de conception 2 dans le tableau 1.

  1. Centrifugeuse lyophilisée SA1 ADNsb à 2000 xg pendant 15 s afin d'assurer toute ADNsb se trouve au fond de la fiole. Remarque: la concentration appropriée de solution SA1 est essentielle pour la synthèse d'ADN sur gel.
  2. Préparer mM de SA1 solution 3 en ajoutant 107 pi de 1x Tris-EDTA, pH 8,0 tampon (tampon TE) dans le flacon (tableaux 3-4).
  3. SA1 à la chaleur dans du tampon TE à 70 ° C pendant 5 minutes ou jusqu'à ce que l'ADN sb culot est complètement dissous. REMARQUE: La température de chauffage doit être au minimum de 5 ° C supérieure à la température de fusion (T m) pour assurer l'ADN est dans un état ​​simple brin.
  4. Préparer la solution de polymérisation SA1 en ajoutant 40% d'acrylamide et 10x Tris Borate-EDTA (TBE) à des pourcentages indiqués (tableau 3). Dans cet exemple, ajouter 45 ul et 18, respectivement, pour 107 ul de solution SA1 (tableau 4).
  5. Degas avec de l'azote gazeux pendant 3 min pour faciliter le mélange. Insérer une pointe de p200 reliée à une source de gaz d'azote dans la solution et permettre lentement de l'azote gazeux de passer à travers la solution. Tester le débit de gaz d'azote de l'écoulement de l'eau avant de SA1 solution de dégazage pour éviter les éclaboussures.
  6. Centrifuger pendant 15 s à 2000 xg pour recueillir solution.
  7. Ajouter 4,5 ul de 2% de persulfate d'ammonium (APS, Tableaux 3-4) pour amorcer la polymérisation de gel.
  8. Retourner le tube plusieurs fois pour mélanger.
  9. Centrifuger pendant 15 s à 2000 xg pour recueillir solution pour la polymérisation homogène.
  10. Ajouter 4,5 ul de 20% tétraméthyléthylènediamine (TEMED, tableaux 3-4) pour catalyser la polymérisation.
  11. Inverser le tubeplusieurs fois pour mélanger.
  12. Centrifuger pendant 15 s à 2000 xg pour recueillir solution pour la polymérisation homogène.
  13. Degas avec de l'azote gazeux pour 3-5 minutes pour terminer la polymérisation et de minimiser les monomères n'ayant pas réagi.
  14. Incuber la solution pendant 10 min à température ambiante pour achever la polymérisation. NOTE: Cette solution est appelée SA1 solution polymérisée.
  15. Répéter les étapes 1.1.3-1.1.16 avec lyophilisée SA2 ADNsb, mais ajouter 45, 18, ​​4,5, et 4,5 pi d'acrylamide, TBE, APS, et TEMED, respectivement, à 108 ul de solution SA2 (tableaux 3-4). REMARQUE: SA1 et SA2 solutions polymérisées peuvent être conservés à 4 ° C pendant un mois.

2 Préparation de L2, R2, et Solutions de contrôle

  1. Répéter les étapes 1.1.3-1.1.5 lyophilisée avec R2 ADNsb mais ajouter 64,4 ul de tampon TE (tableau 4).
  2. Répétez les étapes 1.1.3-1.1.5 avec lyophilisée ssADN de contrôle, mais ajouter 111 ul de tampon TE (tableau 4
  3. Répéter les étapes 1.1.3-1.1.5 avec lyophilisée L2 ADNsb mais ajouter 219 pl de tampon TE (tableau 4). NOTE: Ceci est la solution L2 de 100%. Ajout d'une solution à 100% de L2 SA1 et SA2 polymérisés solutions (voir § 1.3) va former un gel réticulé d'ADN de 100% (gel de 100%) car SA1, SA2, et L2 sera équivalent stoechiométrique.
  4. Diluer une partie aliquote de la solution L2 de 100% à 80% par addition de 20 pi de tampon 1 x TE à 80 ul de solution L2 de 100% (tableau 4). NOTE: Cette solution est une solution L2 de 80%. L'ajout de solution à 80% de L2 SA1 et SA2 polymérisés solutions (voir § 1.3) va former un gel réticulé d'ADN de 80% (gel de 80%), car seulement 80% de SA1 et SA2 est réticulé à L2. Les solutions peuvent être stockées à 4 ° C pendant jusqu'à un mois.

3 Préparation des solutions de gel

  1. SA1 à la chaleur et des solutions polymérisées SA2 à 70 ° C jusqu'à ce que la viscosité de la solution est réduit (environ 1 min). Élever la température jusqu'à 80 °C si la solution est encore trop visqueux pour pipette.
  2. Ajouter 10 ul ou 10 parties de solution polymérisée SA1 à 10 pi ou 10 parties de solution polymérisée SA2 (tableau 4). REMARQUE: SA1 et SA2 solutions polymérisées sont extrêmement visqueux et difficile à pipette. Comme les concentrations sont essentiels à la formation de gel, utiliser une pipette à déplacement positif de ce point vers l'avant ou voir la discussion à d'autres techniques de manipulation. De plus, la pipette dans de multiples petites aliquotes (> 20 pl) au lieu d'un seul grand volume.
  3. Solutions polymérisées Mix SA1 et SA2 ensemble via chauffage alternatif (15 sec à 70 ° C) et sous agitation (pendant 15 secondes avec une pointe de pipette) pour un total de 1 min.
  4. Ajouter 6 ul ou 6 parties d'une solution à 100% L2 pour former un gel de 100% (tableau 4).
  5. Mélanger en alternant chauffage et agitation, comme décrit à l'étape 1.3.3.
  6. gel de la chaleur pendant 1 heure à la température optimale de recuit (35 ° C). Calculer unnnealing en soustrayant la température de 5 ° C à partir de la séquence ADN à un brin avec la température de fusion la plus basse (Tableau 1).
  7. Introduire à la pipette le gel de 100% dans une boîte de Pétri de 60 mm.
  8. Permettre réticulations d'ADN de continuer à rehybridize gel par incubation pendant 4 heures à température ambiante.
  9. Couverture de gel avec du PBS contenant du calcium et du magnésium et incuber O / N à la température ambiante. REMARQUE: Gels va gonfler environ 3 fois leur volume initial. En outre, les gels seront s'équilibrer avec le tampon et l'excès d'acrylamide se diffuser hors des gels. Calcium et magnésium dans le PBS stabiliser hybridation de l'ADN et empêchent gel éclatement (voir discussion pour gel toubleshooting éclatement).
  10. Enlevez les restes tampon de boîte de Pétri.
  11. Pour fabriquer 80% de gels, répéter les étapes 1.3.1-1.3.10 mais remplacer solution L2 de 100% dans l'étape 1.3.4 L2 avec une solution à 80%. Rangez 100% et 80% de gels à 4 ° C pendant un mois. Remarque: les différences de rigidité entre 80% et 100% de gels sont physiquement distinguées.
    12. </ Ol>

    2 Gel Immobilisation sur verre

    REMARQUE: Immobiliser aliquotes de 100% ou 80% de gels sur des lamelles de verre (Figure 2).

    1. Chauffer gel de 100% à 70 ° C pendant environ 30 secondes ou jusqu'à ce que le gel visqueux est inférieure à la pipette.
    2. Lieu couvercle en verre glisse sur un bloc chauffant à 70 ° et laisser chauffer pendant 1-2 min.
    3. Ajouter une goutte de colle optique pour chaque lamelle de verre.
    4. Ajouter 20 ul de gel de 100% pour chaque lamelle couvre-objet en verre (tableau 4). REMARQUE: 10-30 pi peut être distribué sur chaque lamelle.
    5. Laisser gel pour faire fondre et étalé sur la couverture de verre glissement. REMARQUE: Si gel topologie n'apparaît pas, même après fusion, aplatir gel siliconé avec un couvercle en verre glissement. Toutefois, un gonflement supplémentaire se fera dans les étapes ultérieures et contribuer à gel irrégularités.
    6. Retirer le gel contenant du verre de bloc de feu et placer dans une boîte de culture de tissus de 24 puits.
    7. Répétez les étapes 2.1 à 2.6 avec 8 Gel de 0%.
    8. gels de chaleur pendant 1 heure à la température optimale de recuit (35 ° C). NOTE: Il est normal pour les gels à devenir sec et ce sera résolu lorsque les gels sont incubés dans du PBS.
    9. Exposer des plaques contenant 80% et 100% de gels à ultraviolet (UV, 365 nm) pendant 15 min. REMARQUE: l'exposition aux UV guérit simultanément colle et stérilise gels. Si une chambre de réticulation UV n'est pas disponible, les gels peuvent être placés sous une lampe UV qui est équipé d'une enceinte de sécurité biologique. Après l'exposition aux UV, effectuez les étapes suivantes de ce protocole dans une enceinte de sécurité biologique pour maintenir gel stérilité. En outre, utiliser des solutions stériles partir de ce point.
    10. Permettent des liaisons transversales ADN pour rehybridize à la température ambiante pendant 4 heures.
    11. Ajouter PBS et incuber O / N à 4 ° C. REMARQUE: PBS incubation rince, s'équilibre, et gonfle à nouveau gels parce que le chauffage répétée peut déshydrater les gels.

    51323 / 51323fig2highres.jpg "/>
    Figure 2: Représentation schématique de l'immobilisation de gel et de fonctionnalisation. Après gels d'ADN (en gris) sont préparés, les gels sont fixés aux lamelles de verre (blanc) de colle optique (vert). Les gels sont simultanément durcies et stérilisés par de la lumière UV. Après gonflement, gels sont d'environ 1 mm d'épaisseur. Ensuite, les gels sont fonctionnalisés dans un processus en deux étapes (boîte rouge souligné). Tout d'abord, le sulfo-SANPAH est conjugué à l'acrylamide sur les surfaces de gel par exposition à la lumière UV. Ensuite, les gels sont incubés avec du collagène ou de poly-D-lysine, qui se fixe à l'ester sulfo-N-hydroxysuccinimide dans le sulfo-SANPAH. Ce chiffre a été modifié depuis 10.

    3 Gel fonctionnalisation

    REMARQUE: gel fonctionnalisation de l'ADN est nécessaire pour l'adhérence cellulaire depuis des gels de polyacrylamide sont des matériaux inertes (figure 2). Dans cette section, les gels seront fonctionnalisés en deux étapes. Tout d'abord, N -Sulfosuccinimidyl-6 (4 &N ° 39; -azido-2'-nitrophénylamino) hexanoate de sulfo-SANPAH ou est lié de manière covalente par photolyse du groupe nitrophényl azide au squelette de polyacrylamide des gels d'ADN. Deuxièmement, les amines primaires dans le collagène ou la poly-D-lysine se fixer à l'extrémité N-hydroxysuccinimide ester sulfo dans sulfo-SANPAH pour fixer les protéines à la surface du gel.

    1. Retirer tampon dans les puits avec une pipette et faire attention de ne pas aspirer le gel. NOTE: Ne pas effectuer l'aspiration pour réduire la probabilité d'aspirer le gel.
    2. Facultatif) gels de lavage trois fois pendant 15 min à température ambiante pour éliminer l'excès de monomère d'acrylamide, TEMED, et APS.
    3. Ajouter environ 300 pi de sulfo-SANPAH pour couvrir chaque gel.
    4. Expose de gels UV (365 nm) pendant 5 min.
    5. Retirer sulfo-SANPAH.
    6. Gels Rincer une fois avec du PBS pour éliminer l'excès de sulfo-SANPAH.
    7. Répétez les étapes 3.3 à 3.6.
    8. Incuber les gels dans 300 ul de 0,2 mg / ml de poly-D-lysine pendant 1 heure à température ambiante ou O / N à 4 ° C. REMARQUE: Vous pouvez incuber gels avec 0,2 mg / ml de collagène de type 1 O / N à 4 ° C.
    9. Laver deux fois avec du PBS gels pendant 5 min pour éliminer le poly-D-lysine en excès.
    10. Incuber les gels dans 300 ul de milieu pendant 30 min à équilibrer les gels.
    11. Retirez le support immédiatement avant étalement des cellules.

    4 cellules en culture et d'imagerie

    NOTE: Dans cette section, nous fournissons des détails concernant le ramollissement ou de renforcement des gels après l'étalement de la cellule. Un protocole de mise en culture de cellules détaillée n'est pas disponible pour plusieurs raisons. Tout d'abord, de nombreux types de cellules peuvent adhérer sur des gels d'ADN et de chaque type de cellule vont nécessiter des ajustements spécifiques par le chercheur pour le placage des cellules. Deuxièmement, les techniques cellulaire et tissulaire culture standard sont utilisées pour ces expériences et peuvent être trouvés dans de nombreux articles originaux, des articles techniques et des livres de référence. Les techniques de placage spécifiquement les fibroblastes et les neurones sur des gels d'ADN peuvent être trouvés dans précépublications UO 9-11,19-21.

    1. cellules de la plaque. Pour les protocoles concernant la dissection et / ou la culture de neurones ou des fibroblastes mentionnées dans cet article, reportez-vous à l'une des publications suivantes 9-11,19-21.
    2. Après un minimum de 48 heures, de moduler la rigidité de gel par pipetage de 1 pi de contrôle, la solution L2, R2 ou à proximité du gel (tableau 4).
      1. Pour rigidifier les gels de 80% à 100% réticulé (80 → 100% de gels), ajouter les 20% restants de L2 à 80% de gels en ajoutant 1 ul de solution à 100% L2 proche du gel.
      2. Pour ramollir des gels de 100% à 80% réticulé (100 → 80% de gels), ajouter R2 pour éliminer 20% des liaisons de réticulation de 100% de gels par addition de 1 ul d'une solution 100% de R2 à proximité du gel.
      3. Pour les témoins, ajouter des volumes égaux de la solution de contrôle à un sous-ensemble de 100% et 80% de gels par addition de 1 ul de la solution de contrôle à proximité du gel.
    3. Effectuer le traitement et les données de la cellule analyse souhaitée aprèsun minimum de 48 heures.

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Representative Results

Avant nos études, les interactions cellule-ECM ont été observés sur les biomatériaux conformes statiques ou dynamiques sur des substrats irréversibles et unidirectionnels. Ces substrats ne reflètent pas fidèlement la nature dynamique du microenvironnement cellulaire. Notre travail déplace les paradigmes techniques existantes en fournissant un modèle plus physiologique pour étudier les interactions cellule-ECM sur le ramollissement et de renforcement des biomatériaux dynamiques. Dans des études précédentes, nous avons analysé les effets de substrats dynamiques sur les cellules en examinant différentes morphologies cellulaires et les phénotypes de ces gels. Dans un exemple, on a déterminé les effets du substrat raidisseur sur des fibroblastes par l'évaluation de la morphologie des fibroblastes sur des gels d'ADN dynamiques. L929, une lignée cellulaire de fibroblastes de souris, dérivées ont été étalées sur 80% et 100% de gels (figure 3) 11. Deux jours après l'étalement, solution à 20% supplémentaire L2 a été ajouté aux milieux de 80% de gels de rigidifier les gels réticulés à 100% (100% → 80, le panneau central). 100% de gels et un autre ensemble de 80% de gels reçu contrôle ADN simple brin de rester statique (à droite et panneau de gauche, respectivement). Images de microscopie optique ont été capturés deux jours après la livraison de l'ADN aux médias. Image floue, comme le montre la figure 3, est due à gel surface irrégularités et est typique et inévitable. Gel gonflement et la contraction, résultant de l'addition de tampons et L2 18,21, contribue à la gélification des irrégularités. La morphologie a été évaluée avec le logiciel ImageJ (NIH, Bethesda, MD) et a servi d'indicateur de la fonction. Fibroblastes cultivés sur raidissement gels (80 → 100%) n'avaient pas de modifications dans le rapport d'aspect, mais présentaient une surface de projection plus grande que les fibroblastes cultivés sur 100% de gels 11. Fait intéressant, la morphologie des fibroblastes cultivés sur des gels statiques était différente de la morphologie des fibroblastes cultivés sur des gels dynamiques. Les fibroblastes cultivés sur 100% de gels ont une aire de projection plus petit et plus grand rapport d'aspect de fibroblastes cultivés sur 80% de gels. Ces rerésultats indiquent que des fibroblastes comportement dépend de la nature dynamique du micro-environnement. Dans une autre étude, les effets de ramollissement sur ​​les neurones substrat a été déterminée par l'analyse des phénotypes neuronaux incluant le nombre de dendrites, la longueur des dendrites et des axones longueur (figure 4) 10. Les neurones de la moelle épinière de rat dérivées ont été cultivées sur 100% et 50% de gels. Quatre jours après l'étalement, 50% R2 a été ajouté au milieu de 100% de gels pour adoucir les gels à 50% réticulé (100 → 50%, du milieu). 50% de gels et une autre série de 100% de gels reçu contrôle ADN simple brin de rester (panneaux de droite et de gauche, respectivement) statiques. Après trois jours, les neurones ont été fixés et immunocolorées avec un marqueur dendritique (MAP2, panneaux supérieurs), un marqueur axonal (Tau, panneaux du milieu), et les noyaux (DAPI, panneaux de fond) afin d'évaluer les phénotypes. Neurones cultivés sur des gels de ramollissement (100 → 50%) n'avaient pas de différence dans le nombre de dendrites primaire ou la longueur de l'axone, mais exposées dendrites primaires de moins de neurones cultivés o n 50% de gels. Comme dans les études fibroblastes, les phénotypes neuronaux sur des gels statiques étaient différents phénotypes neuronaux sur des gels dynamiques. Les neurones cultivés sur des gels 50% avaient moins de dendrites primaires et les axones des neurones cultivés plus longues que le gel de 100%. En conclusion, fibroblastes et neurones images montrent que plusieurs types de cellules peuvent être étudiés sur des gels dynamiques et statiques ADN, gel d'ADN inégalité provoque défis d'imagerie, les techniques morphologiques et immunocoloration standards sont réalisables, et surtout le comportement des cellules dépend de la dynamique de substrat.

Figure 3
Figure 3 fibroblastes cultivés sur des gels d'ADN statiques et dynamiques. Images de microscopie de lumière représentant des fibroblastes L929 cultivés sur 80% (panneau de gauche), 80 → 100% (panneau central), et 100% de gels (panneau de droite). La barre d'échelle est de 100 um. Ce chiffre a été modifié depuis 11.href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51323/51323fig3large.jpg" target = "_blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Les neurones cultivés sur des gels d'ADN. D'images fluorescentes représentatifs de neurones de la moelle épinière cultivés sur 100% (panneaux de gauche), 100 → 50% (du milieu), et 50% (panneaux de droite) gels. MAP2 immunomarquage indique dendrites (panneaux supérieurs), Tau-1 immunomarquage indique axones (panneaux du milieu), et la coloration DAPI indique noyau (panneaux inférieurs). La barre d'échelle est de 100 um. Ce chiffre a été modifié depuis 10. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

La capacité de gels d'ADN pour adoucir ou raidir avant et après l'adhésion cellulaire en fait un modèle idéal pour étudier le rôle de la raideur dynamique en fonction du tissu cellulaire. Ces trois modèles ont été utilisés dans les études biologiques et mécaniques. Toutefois, les trois modèles ont des élasticités semblables à différents pourcentages de réticulation, indiquant la longueur de réticulation n'influence pas l'élasticité de gel d'ADN (tableau 2). En revanche, la concentration d'acrylamide affecte élasticité. Ces dessins peuvent différer de la cinétique de réticulation depuis tendances gel de rupture, ou la tendance des gels à se dissoudre dans les médias ou tampon, diminue avec l'augmentation de la longueur de réticulation. Cependant cinétique informations sur des gels d'ADN est limitée, mais nous ne savons 30% supplémentaires de réticulation intervient deux jours après la livraison L2 à 50% de gels d'ADN 11. Toutefois, la génération de forces d'expansion et de contraction de ramollissement de gel et de raidissement, respectivement, est inévitable et ne peut pas être découplée18,21. 100 → 70% de gels génèrent environ 0,5 Pa de stress 21, tandis que 50 → 100% de gels ne génèrent environ 0,04 Pa de stress depuis plus d'énergie est nécessaire pour former des liaisons entre les trois peuplements de ssADN 18. Par conséquent, l'interprétation des résultats nécessite la prise en compte du stress et la fatigue générée par le renforcement et l'assouplissement des gels.

Défis techniques peuvent survenir lors de la préparation des gels d'ADN. La question technique la plus fréquente est le gel éclatement. Gel rupture peut se produire au cours de plusieurs étapes de préparation d'un gel d'ADN, notamment un gonflement de gel, le stockage et la croissance cellulaire. Gel rupture est provoquée par plusieurs facteurs. Tout d'abord, le gel éclatement peut être le résultat d'une composition de solution incorrecte. Les erreurs courantes comprennent dissolution insuffisante de ssADN lyophilisée et un mauvais pipetage des liquides visqueux. Pour éviter les erreurs de pipetage, élever la température de chauffage pour réduire la viscosité du gel pour faciliter le pipetage de solutions ou aliquoter l'am requisontant de SA1 et SA2 solution polymérisée avant la deuxième étape de barbotage d'azote. Aussi, chauffage répété des solutions polymérisées peut partiellement évaporer la solution et augmenter la viscosité de la solution. L'ajout de quelques microlitres de tampon TE peut aider à réduire la viscosité. Deuxièmement, gel éclatement peut être le résultat d'une mauvaise qualité de l'ADN. Rapports d'AQ / CQ doivent être réexaminées régulièrement. Si AQ / CQ rapports sont acceptables et gel à l'éclatement encore, HPLC purifiée ADN simple brin peut améliorer la qualité de l'ADN. Troisièmement, gel éclatement peut résulter de l'insuffisance recuit d'ADN. Nous avons réduit l'incidence de gel éclatement en incluant les étapes de recuit et les étapes de réhybridation dans le protocole original (voir les étapes 1.3.6 et 2.8; 1.3.8 et 2.10, respectivement). Gel éclatement peut être empêché par l'extension de recuit et de refroidissement fois. Toutefois, l'exposition à la chaleur supplémentaire peut évaporer l'eau pour provoquer une augmentation de détachement de gel de verre lorsque les gels sont re-gonflé. Si le détachement est excessif pour une durée de recuit, la annEaling étapes peuvent être éliminées (1.3.6 et 2.8).

Un autre problème technique est fréquemment rencontré l'adhésion cellulaire insuffisante. Les gels gonflés sont plus doux que les gels non gonflées (tableau 2), 18 l'adhésion cellulaire fabrication difficile. En outre, étant donné que chaque type de cellule réagit différemment à la rigidité des tissus, certains types de cellules peuvent avoir ce dilemme technique alors que d'autres types cellulaires ne sont pas. Pour résoudre les problèmes d'adhérence certains des mesures de suivi doivent être pris en compte: (1) utiliser une haute densité de placage, (2) d'alterner les protéines de la MEC conjugués à sulfo-SANPAH, (3) de moduler les paramètres de rigidité, (4) augmenter les protéines de l'ECM ou concentration sulfo-SANPAH, et (5) d'augmenter les temps d'incubation. Des agents toxiques résiduels tels que l'acrylamide monomère, APS, et TEMED pourraient également contribuer à un manque d'adhérence et la mort des cellules sur les gels. Nous n'avons pas rencontré ce problème depuis des lavages poussés incorporés dans le protocole ont prouvé suffisamment, mais nous vous recommandons performer étape facultative 3.2 si ce problème se produit.

des gels d'ADN peuvent être utilisés pour étudier de façon plus efficace une variété de fonctions cellulaires, dans des conditions statiques ou dynamiques. Nous avons montré que les fibroblastes et les neurones cultivés sur des gels d'ADN sont affectés par la modulation de l'élasticité du gel. Depuis interactions cellule-matrice sont généralement des interfaces en trois dimensions, de l'information à partir d'études de la matrice dynamique en trois dimensions permettra de produire plus de données pertinentes biologiquement. Par conséquent, nous sommes en train de traduire cette technologie dans une matrice tridimensionnelle. Nous préparons une technique qui remplace le squelette de polyacrylamide avec un matériau biocompatible plus, tout en maintenant la technologie de l'ADN de réticulation. Cette nouvelle échafaudage servira, un modèle dynamique en trois dimensions et un échafaudage de l'ingénierie tissulaire. Sa biocompatibilité ouvrira des opportunités pour des applications de dispositifs médicaux.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier: Dr Frank Jiang, le Dr David Lin, le Dr Bernard Yurke et le Dr Uday Chippada pour leurs contributions sur le développement de la technologie d'ADN sur gel; Dr Norell Hadzimichalis, Smit Shah, Kimberly Peterman, Robert Arter pour leurs commentaires et modifications de ce manuscrit; sources de financement, y compris la Commission du New Jersey sur la moelle épinière de la recherche (subvention no 07A-019-SCR1, NAL) et du New Jersey Institut des Neurosciences (MLP); et les éditeurs de génie tissulaire, la partie A pour obtenir la permission de réimprimer les figures 2 et 4 et des biomatériaux pour l'autorisation de reproduire la figure 3.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ssDNA Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa)
idtdna.com		 Do not vortex ssDNA. Gentle invert the vial and/or pipette solution to mix.
PBS with calcium and magnesium Any brand.
100x Tris-EDTA buffer (TE buffer) Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)
sigmaldrich.com		 T9285
10x Tris-Borate-EDTA buffer (TBE buffer) Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) 93290 TBE is a reproductive toxin.
40% Acrylamide solution Fisher Scientific (Pittsburg, PA) BP14021 Acrylamide is a toxin.
Ammonium persulfate (APS) Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) A3678 Prepare a 2% solution in TE buffer. APS is a toxin and irratant.
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) T9281 Prepare a 20% solution in TE buffer. TEMED is flammable, a corrosive, and a toxin.
12 mm diameter round coverglass Fisher Scientific (Pittsburg, PA)
fishersci.com		 12-545-82
Norland optical adhesive 72 Norland Products (Cranbury, NJ)
norlandprod.com		 NOA72
24-well tissue culture plate Any brand.
Microcentrifuge tubes Any brand.
Sulfo-SANPAH ProteoChem or Thermo Fisher, (Rockland, IL)
proteochem.com or thermofisher.com		 C111 or 22589 Prepare a 0.315 mg/ml solution in water immediately before use. Dissolve at 37 °C and filter sterilze. It is normal to observe undisolved sulfo-SANPAH in the filter. Sulfo-SANPAH is light sensitive and, therefore, the solution should be protect from light until UV exposure.
Poly-D-Lysine (PDL) Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) P6407 Prepare a 0.2 mg/ml solution in water and filter sterilize.
Collagen Type I Affymetrix (Santa Clara, CA)
affymetrix.com		 13813 Prepare a 0.2 mg/ml solution in 0.2 N acetic acid. Solution needs to remain cold at all times to avoid polymerization. Acetic acid is a flammable, toxic, and corrosive.
22 x 60 cover glass Fisher Scientific (Pittsburg, PA) 12-544-G
Positive-displacement pipette Gilson, Inc (Middletown, WI)
gilson.com		 F148504
Heat block Fisher Scientific (Pittsburg, PA) 11-718
UV light source Place gels as close as possible to the UV light. UV light can cause skin or eye injury.
Thermometer Any brand.
Nitrogen gas GTS-Welco (Flemington, NJ)
www.praxairmidatlantic.com/		 NI 5.0UH-R

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References

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Previtera, M. L., Langrana, N. A. Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels. J. Vis. Exp. (90), e51323, doi:10.3791/51323 (2014).

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