Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Fremstilling af DNA-tværbundet polyacrylamid Hydrogeler

Published: August 27, 2014 doi: 10.3791/51323
Automatic Translation
1, 2,3
1New Jersey Neuroscience Institute, JFK Medical Center, 2Department of Biomedical Engineering, Rutgers University, 3Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Rutgers University

Summary

Vores laboratorium har udviklet DNA-tværbundet polyacrylamid hydrogeler, et dynamisk hydrogel-system, for bedre at forstå virkningerne af modulerende væv stivhed på celle funktion. Her giver vi skemaer, beskrivelser og protokoller for at forberede disse hydrogeler.

Abstract

Mechanobiology er en ny videnskabelig område, der omhandler kritiske rolle fysiske signaler i at lede celle morfologi og funktion. For eksempel effekten af ​​væv elasticitet på celle funktion er et stort område af mechanobiology forskning, fordi væv stivhed modulerer med sygdom, udvikling og skade. Statiske vævsbaseret efterligne materialer eller materialer, der ikke kan ændre stivhed, når celler er belagt, er hovedsagelig anvendes til at undersøge virkningerne af væv stivhed på cellefunktioner. Mens oplysninger indsamlet fra statiske undersøgelser er værdifulde, disse undersøgelser er ikke udtryk for den dynamiske karakter af den cellulære mikromiljø in vivo. For bedre at imødegå konsekvenserne af den dynamiske stivhed på celle funktion, har vi udviklet en DNA-tværbundet polyacrylamid hydrogel-system (DNA geler). I modsætning til andre dynamiske substrater DNA geler har evnen til at øge eller mindske stivhed efter fremstilling uden stimuli. DNA-geler består af DNA crossltrykfarver, der polymeriseres i en polyacrylamid rygrad. Tilføjelse og fjernelse af tværbindinger via levering af enkeltstrenget DNA tillader tidsmæssige, rumlige og reversibel kontrol gel elasticitet. Vi har vist i tidligere rapporter, at dynamisk graduering af DNA gel elasticitet påvirker fibroblast og neuron adfærd. I denne rapport og video, giver vi en skematisk, der beskriver DNA-gel tværbin- mekanismer og trin-for-trin instruktioner om forberedelse DNA geler.

Introduction

Statiske og dynamiske substrater er to kategorier af biomaterialer, som blev udviklet til at studere virkningerne af vævets elasticitet eller stivhed på cellefunktion. Faste substrater er i stand til at ændre deres fysiske egenskaber, efter at de er fremstillet og / eller når cellerne udplades. Polyacrylamid (PA) geler var de første to-dimensionale, statiske substrater, der blev syntetiseret til mechanobiology undersøgelser 5,17. PA geler er nemt at forberede, billig, alsidig og kan fremstilles med en bred vifte af elasticitetsmoduler. Selvom disse tekniske fordele gør PA geler anvendes en fælles substrat, statiske substrater er ikke udtryk for den dynamiske karakter af den ekstracellulære matrix (ECM) og omgivende cellulære miljø in vivo. For eksempel ECM undergår stivhed ændringer som følge af skade, udvikling eller sygdom. Dynamiske substrater er derfor begunstiget som væv-efterligne substrat modeller i mechanobiology undersøgelser

Talrige syntetisk, har naturlige, to-dimensionelle, tre-dimensionelle, statiske og dynamiske biomaterialer blevet udviklet til at efterligne væv stivhed 1,3,6,16,23,26. Nogle dynamiske substrater kræver varme, UV, elektrisk strøm, ioner og pH-ændringer for at ændre deres mekaniske egenskaber 2,4,7,8,12,15,16, men disse stimuli kan begrænse hydrogel bio-ansøgning. DNA-tværbundet polyacrylamid hydrogeler (DNA geler) er dynamiske todimensionale elastiske substrater. DNA-tværbindinger mulighed for tidsmæssige, rumlige og reversibel modulering af DNA-gel-stivhed ved tilsætning af enkeltstrenget DNA (ssDNA) til medier eller puffer 9-11,13,14,18,21. I modsætning til de førnævnte dynamiske geler hvor stimuli ansøgt om graduering af elasticitet, DNA geler stole på udbredelsen af ​​anvendt ssDNA til ændring af elasticitet. Derfor øvre gel overfladen, hvor celler dyrkes, er det første område moduleres fordi satsen of elasticitet modulation afhængig af gelen tykkelse.

DNA-geler svarer til deres PA gel kolleger i, at de har en polyacrylamid rygrad, men de bis-acrylamid tværbindinger er erstattet med tværbindinger sammensat af DNA (Figur 1). To ssDNAs (SA1 og SA2) hybridiserer med en tværbinder streng (L2) for at gøre op DNA tværbindingerne af gelen. SA1 og SA2 har forskellige sekvenser, som både indeholder et Acrydite modifikation ved 5'ende for effektiv inkorporering i PA-netværket. Til fremstilling af geler, SA1 og SA2 er individuelt polymeriseres til et PA-rygrad og efterfølgende den polymeriserede SA1 og SA2 blandes sammen. L2, tværbinderen tilsættes til SA1 og SA2 blanding. L2 basesekvens er komplementær til både SA1 og SA2-sekvenser og L2 hybridiserer med SA1 plus SA2 at danne DNA tværbindingerne. Indledende DNA gel elasticitet bestemmes af både L2 koncentrationer og tværbinding (tabel 1 2). DNA-geler, der indeholder lige støkiometriske mængder af L2, SA1 og SA2 er de stiveste geler fordi SA1 og SA2 er 100% tværbundet ved L2 (betegnet som 100% geler). Lavere koncentrationer af L2 resulterer i en lavere procentdel af DNA-tværbinding og derfor, blødere DNA geler. Geler så lave som 50% tværbundet (betegnet som 50% geler) er blevet konstrueret 9-11.

Figur 1
Figur 1. DNA-gel-tværbinding og uncrosslinking skematisk 9-11,13,14,18,21 Trin 1:. SA1 (rød) og SA2 (blå) er individuelt polymeriseres i en polyacrylamid rygrad (sort). Efter polymerisering er SA1 og SA2 polymeriserede løsninger blandet sammen. Trin 2: L2 (grøn) tilsættes, og hybridiserer med SA1 plus SA2 at danne tværbindinger i gelen. Trin 3: R2 hybridiserer med than fodfæste L2. Trin 4: fodfæste hybridisering af R2 fremdriftsmiddel unzipping L2 fra SA1 og SA2.

I modsætning PA geler kan DNA geler stivne og blødgøre efter syntese. Derfor kan celler dyrket på DNA-geler underkastes dynamiske stivhed ændringer. For at afstive celle-klæbende geler, kan L2 sættes til dyrkningsmediet af lave procentvise geler til at øge procentdelen af ​​tværbindinger. At blødgøre celle-klæbende geler, kan L2 fjernes for at sænke den procentdel af tværbindinger 10,13,21. L2 har en ekstra fodfæste sekvens ved 3'ende for at tillade L2 uncrosslink fra SA1 og SA2 (tabel 1). Fjernelse af L2 opnås ved hybridisering af en tilbageførsel streng kaldet R2. R2 er komplementær til den fulde længde af L2 og hybridiserer først med L2 fodfæste. Fodfæste hybridisering fremdriftsmiddel unzipping L2 fra SA1 og SA2, hvilket eliminerer krydsbinding og reducerer gelen stivhed.

I denne rapport ogvideo, trin-for-trin instruktioner om tilberedning af afstivende og blødgørende DNA geler. Mens 100% og 80% Gel præparater er beskrevet, kan denne protokol skræddersys til at skabe DNA-geler af andre indledende og afsluttende tværbundne procenter. I almindelighed er 100% og 80% geler fremstilles, immobiliseret på dækglas, funktionaliseret og podet med celler. L2 sættes til mediet af 80% geler og R2 sættes til mediet på 100% geler, 48 timer efter udpladning. Tilføjelsen af ​​L2 til medier stivner 80% geler til 100% tværbundet, hvorimod tilsætning af R2 til medier blødgør 100% geler til 80% tværbundet. Afstivede geler er udpeget som 80 → 100% geler og blødgjort geler er betegnet som 100 → 80% geler i teksten. Til kontrol eller statiske geler, ssDNA bestående af Ts eller som leveres til et andet sæt af 100% og 80% geler. Efter mindst to dage efter elasticitet graduering kan celler behandlet og analyseret.

DNA-tværbinding # Af baser Sekvens (fodfæste) Ændring Smeltetemperaturen (T m ° C) Kommentarer
5 '→ 3'
Design 1 SA1 10 GCA FTT TTG C 5'Acrydite 34.9
SA2 10 GTC AGA ATG A 5'Acrydite 23.6
L2 30 TCA TTC TGA C GC AAA GGT GC G CTA CAC TTG 56 En 10 bp fodfæste sekvens er inkluderet.
R2 30 CAA GTG TAG CGC ACC TTT GCG TCA GAA TGA R2 er et supplement til L2
Design 2 SA1 14 CGT GGC ATA GGA CT 5'Acrydite 46,9
SA2 14 GTT TCC CAA TCA GA 5'Acrydite 40.2
L2 40 TCT GAT TGG GAA AC A GTC CTA TGC CAC G GT TAC CTT CAT C 65,9 En 12 bp-sekvens fodfæste er inkluderet.
R2 40 GAT GAA GGT AAC CGT GGC ATA GGA CTG TTT CCC AAT KAG A 65,9 R2 er et supplement til L2
Design 3 SA1 20 ACG GAG GTG TAT GCA ATG TC 5'Acrydite 55
SA2 20 CAT GCT TAG GGA CGA CTG GA 5'Acrydite 56.6
L2 40 TCC AGT CGT CCC TAA GCA TG G ACA TTG CAT ACA FTT CCG T 68,8 Fodfæste er ikke inkluderet.
Kontrol Kontrol 20-40 AAA AAA (osv), eller
TTT TTT (mm)

Tabel 1. Base sekvenser for ssDNA 9-11,13,14,18,21. Cellulær og mekaniske undersøgelser har udnyttet flere different tværbindinger motiver til at generere DNA-geler med en række statiske og dynamiske mekaniske egenskaber. Parametrene moduleret i krydsbindinger design er basesekvens og sekvens længde eller tværbinde længde. Fed og kursiv skrifttyper illustrerer baseparring mellem SA1 og L2 og mellem SA2 og L2.

Design
1 2 3
Acrylamid Koncentration (%) 10 10 10 4
SA1 plus SA2 hybridiseret til L2 (% tværbundet) 50 80 100 50 80 100 100 100
<strong> Elasticitet (kPa Mean ± SEM) 6,6 ± 0,6 17,1 ± 0,8 29,8 ± 2,5 5,85 ± 0,62 12,67 ± 1,33 22,88 ± 2,77 25,2 ± 0,5 10,4 ± 0,6

Tabel 2. Youngs modul (E) af DNA-geler 9-11,13,14,18,21. Akrylamid koncentration crosslink procent og crosslink længde kan moduleres i DNA-geler. Design 1, 2 og 3 har 20, 28, og 40 bp tværbindinger længder hhv. 100% geler til alle designs har lignende moduler indikerer crosslink længde påvirker ikke gel elasticitet. Men variationer i acrylamid koncentration ændre DNA-gel-elasticitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: Hele protokol fra gelfremstillingen til celle behandlingen tager mindst seks dage. Estimeret tid til forberedelse gel er 8 timer plus en O / N inkubation. Estimeret tid for gel immobilisering og DNA udglødning er 8 timer plus en O / N skylningstrin. Estimeret tid for gel funktionalisering er 2 timer. Tid til celleudpladning og vækst er afhængig af kultur art og anvendelse, men et minimum på fire dage er påkrævet.

1. Fremstilling af DNA Gels

BEMÆRK: Forbered DNA geler i tre forskellige trin. Først individuelt polymerisere SA1 og SA2 ssDNA i et PA-rygrad. Disse løsninger kaldes SA1 polymeriseret løsning og SA2 polymeriseret løsning, henholdsvis (§1.1). For det andet, opløse tværbinderen, reversibel streng, og kontrol ssDNAs. Opløs det frysetørrede L2 ssDNA (tværbinder). Dette kaldes 100% L2 opløsning og anvendes til at fremstille 100% geler (§1.2). Fortyndes en portion af 100% L2 opløsningtil 80%. Dette kaldes 80% L2 opløsning og anvendes til fremstilling af 80% geler. Opløs frysetørret R2 (reversibel streng) og kontrol ssDNA at bruge i § 4. For det tredje, blandes SA1 polymeriseret opløsning, SA2 polymeriseret opløsning, og 100% eller 80% L2 opløsning i et forhold på 10: 10: 6 (SA1: SA2: L2) til dannelse af 100% og 80% geler hhv. (§1.3).

1. Fremstilling af SA1 og SA2 Polymeriserede Løsninger

  1. Vælg og bestille passende SA1, SA2, L2 og R2 basesekvenser fra tabel 1 og 2. Base sekvenser og sekvens længde blev optimeret i tidligere rapporter 9-11,13,14.
  2. Beregn alle opløsningsformuleringer (tabel 3-4). BEMÆRK: omhyggeligt beregninger dokument i forbindelse med fejlfinding. Opførelse af et Excel-skabelon der anbefales, og kan bruges gentagne gange til forberedelse DNA gel. Se tabel 3 og 4 for et eksempel på den tabelopstilling for Design 2 (Tabel 1 og 2). De i tabel 4 mængder vil blive brugt i hele denne protokol, men mængder vil variere med hver portion af frysetørret ssDNA.
Løsning Stock opløsningskoncentration Andel af stamopløsning i SA1 eller SA2 Polymerized Solution (v / v) Endelig koncentration af opløsningen i SA1 eller SA2 Polymerized Solution
Acrylamid (nr-bisacrylamid) 40% 25 10%
SA1 eller SA2 løsning 100% 60 60%
TBE-buffer 10x 10 1x
TEMED 20% 2.5 0,50%
APS 2% 2.5 0,05%

Tabel 3. Procentdel af løsninger til fremstilling SA1 eller SA2 polymeriserede løsninger. Den første kolonne viser de løsninger til at formulere DNA geler. Den anden kolonne viser bestanden koncentrationer af disse løsninger. Den tredje kolonne viser procentdelen af ​​stamopløsninger i SA1 eller SA2 polymeriserede opløsninger (v / v). Den sidste kolonne afspejler de endelige koncentrationer i SA1 og SA2-løsninger.

ssDNA løsninger (§1.1) <tr>
Løsningskomponenter
Løsning Stock Koncentration Endlösung Koncentration Beregning Værdi for at tilføje Kommentarer
SA1 løsning 320,7 nmol frysetørret SA1 ssDNA 3,00 mM 320,7 nmol / 3,00 nmol pi -1 = 107 ul 107 ul TE-buffer til frysetørret ssDNA SA1 opløsning er 60% af SA1 polymeriseret opløsning.
107 ul / 0.600 = 178 pi
178 pi er det totale volumen af SA1 polymeriseret opløsning (Tabel 3).
SA2 løsning 324,4 nmol frysetørret SA2 ssDNA 3,00 mM 324,4 nmol / 3,00 nmol pi -1 = 108 ul 108 ul TE-buffer til frysetørret ssDNA SA2 opløsning er 60% af SA2 polymeriseret opløsning.
108 ul / 0.600 = 180 pi
180 pi er det totale volumen af SA2 polymeriseret opløsning (Tabel 3).
100% L2 opløsning 657,4 nmol frysetørret L2 ssDNA 3,00 mM 657,4 nmol / 3,00 nmol pi -1 = 219 ul 219 ul TE-buffer til frysetørret ssDNA Fortyndes en alikvot på 100% L2 til 80% L2 opløsning
80% L2 opløsning 80 ul 100% L2 ssDNA 80% - 20 ul TE-buffer til 80 ul 100% L2 opløsning
Kontrol løsning 332,6 nmol frysetørret poly T eller A ssDNA 3,00 mM 332,6 nmol / 3,00 nmol pi <sup> -1 = 111 ul 111 ul TE-buffer til frysetørret ssDNA
R2 løsning 193,8 nmol frysetørret R2 ssDNA 3,00 mM 193,8 nmol / 3,00 nmol pi -1 = 64,6 ul 64,6 ul TE-buffer til frysetørret ssDNA
Polymeriserede løsninger (§1.2)
SA1 polymeriseret løsning 40% acrylamid 10% 178 pi x 0,25 = 44,5 pi 45 pi Mængden af acrylamid, TBE, APS og TEMED baseret på et samlet volumen på 178 pi (se ovenfor og tabel 3).
10x TBE 1x 178 pi x 0,10 = 17,8 pi 18 pi
100% SA1 løsning 60% - 107 ul SA1 opløsning er 60% af SA1 polymeriserede opløsning (se ovenfor og tabel 3).
2% APS 0,05% 178 pi x 0,025 = 4.45 pi 4,5 pi Tilføj og bland APS før du tilføjer TEMED.
20% TEMED 0,50% 178 pi x 0,025 = 4.45 pi 4,5 pi
SA2 polymeriseret løsning 40% acrylamid 10% 180 pi x 0,25 = 45 ul 45 pi Mængden af acrylamid, TBE, APS og TEMED baseret på et samlet volumen på 180 pi (se ovenfor og tabel 3).
10x TBE 1x 180 pi x 0.10 = 18 ul 18 pi
100% SA2 opløsning 60% - 108 ul SA2 opløsning er 60% af SA2 polymeriserede opløsning (se ovenfor og tabel 3).
2% APS 0,05% 180 pi x 0,025 = 4,5 pi 4,5 pi Tilføj og bland APS før du tilføjer TEMED
20% TEMED 0,50% 180 pi x 0,025 = 4,5 pi 4,5 pi
Gel-løsninger (§1.3)
100% Gelopløsning 100% SA1 polymeriseret opløsning 10 dele - 10 ul Sammensæt 100% geler med følgende SA1: SA2: L2 forholdet 10: 10: 6.
100% SA2 polymeriseret solution 10 dele - 10 ul
100% L2 opløsning 6 dele - 6 pi
80% Gelopløsning 100% SA1 polymeriseret opløsning 10 dele - 10 ul Sammensæt 80% geler med følgende SA1: SA2: L2 forholdet 10: 10: 6.
100% SA2 polymeriseret opløsning 10 dele - 10 ul
80% L2 opløsning 6 dele - 6 pi
Dynamiske geler (§3-4)
80 → 100% gel 80% gel 100% gel Beregning 1: 1 ml af 100% L2 opløsning i dyrkningsmedier Beregningerne er baseret på at have 20 ul geler på dækglas. Først konvertere de dele af 100% L2 opløsning i de 20 pi gel i gl. For det andet, beregne det beløb (i pi) på 100% L2 løsning nødvendig for yderligere 20% af krydsbinding. Tilføj dette beløb på 100% L2 løsning gel.
(20 ul / 26 dele) x 6 dele = 4.6 pi
Beregning 2:
5 ul x 0,2 = 1 gl
100 → 80% gel 100% gel 80% gel Beregning 1: 1 ml af 100% R2 opløsning i dyrkningsmedier Beregningerne er baseret på at have 20 ul geler på dækglas. Først konverteres than dele af 100% L2 opløsning i de 20 pi gel i gl. For det andet, beregne det beløb (i pi) på 100% L2 Løsningen skulle fjernes for at komponere en 20% gel. Tilføj dette beløb R2 løsning på gel.
(20 ul / 26 dele) x 6 dele = 4.6 pi
Beregning 2:
5 ul x 0,2 = 1 gl
100% gel (kontrol) 100% gel 100% gel - 1 ml af kontrol opløsning i dyrkningsmedier Mængden af ​​kontrolopløsningen er ækvivalent med mængden af ​​R2-opløsning tilsat.
80% gel (kontrol) 80% gel 80% gel - 1 ml af kontrol opløsning i dyrkningsmedier Mængden af ​​kontrol løsning svarer til et beløb på 100% L2 opløsning tilsat.

Tabel 4. Eksempel beregninger for forberedelse DNA gel. Mock numre er tilvejebragt for at illustrere beregningerne til fremstilling af 80%, 100%, 100 → 80% og 80 → 100% geler. DNA-geler Design 2 i tabel 1.

  1. Centrifuger lyofiliseret SA1 ssDNA ved 2.000 xg i 15 sek for at sikre, at alle ssDNA er i bunden af ​​hætteglasset. BEMÆRK: Korrekt koncentration af SA1 løsning er kritisk for DNA-gel syntese.
  2. Forbered 3 mM SA1 ved tilsætning af 107 pi 1x Tris-EDTA, pH 8,0 puffer (TE-buffer) til hætteglasset (tabel 3-4).
  3. Varme SA1 i TE-buffer ved 70 ° C i 5 minutter, eller indtil ssDNA pelleten er fuldstændig opløst. BEMÆRK: Opvarmning temperatur bør være mindst 5 ° C over smeltetemperaturen (Tm) for at sikre, at DNA er i en enkeltstrenget tilstand.
  4. Forbered SA1 polymerisationsopløsningen ved tilsætning af 40% acrylamid og 10x Tris-borat-EDTA (TBE) puffer ved de angivne procenter (tabel 3). I dette eksempel tilsættes 45 og 18 pi henholdsvis 107 pi SA1 opløsning (Tabel 4).
  5. Degas med nitrogen gas i 3 minutter for at lette blanding. Indsæt en p200 spids fastgjort til en nitrogengas kilde i opløsningen og langsomt tillader nitrogengas at passere gennem opløsningen. Test strømningshastigheden af ​​nitrogengas i vand før afgasning SA1 løsning for at forhindre sprøjt.
  6. Centrifuger i 15 sekunder ved 2.000 xg at samle løsning.
  7. Tilføj 4,5 pi 2% ammoniumpersulfat (APS, tabel 3-4) at indlede gelpolymerisering.
  8. Vend røret flere gange for at blande.
  9. Centrifuger i 15 sekunder ved 2.000 xg at samle løsning til homogen polymerisation.
  10. Tilføj 4,5 pi 20% tetramethylethylendiamin (TEMED, tabel 3-4) til at katalysere polymerisering.
  11. Vend røretflere gange for at blande.
  12. Centrifuger i 15 sekunder ved 2.000 xg at samle løsning til homogen polymerisation.
  13. Degas med nitrogen gas i 3-5 min for at fuldføre polymeriseringen og minimere un-reagerede monomerer.
  14. Inkuber opløsningen i 10 minutter ved stuetemperatur for at fuldføre polymeriseringen. BEMÆRK: Denne løsning hedder SA1 polymeriseret løsning.
  15. Gentag trin 1.1.3-1.1.16 med frysetørret SA2 ssDNA, men tilføjer 45, 18, ​​4,5, og 4,5 ul acrylamid, TBE, APS og TEMED henholdsvis 108 pi SA2-opløsning (tabel 3-4). BEMÆRK: SA1 og SA2 polymeriserede løsninger kan opbevares ved 4 ° C i op til en måned.

2. Fremstilling af L2, R2 og Control Solutions

  1. Gentag trin 1.1.3-1.1.5 med frysetørret R2 ssDNA men tilføjer 64,4 ul TE-buffer (tabel 4).
  2. Gentag trin 1.1.3-1.1.5 med frysetørret kontrol ssDNA'et men tilføjer 111 ul TE-buffer (tabel 4
  3. Gentag trin 1.1.3-1.1.5 med frysetørret L2 ssDNA men tilføjer 219 ul TE-buffer (tabel 4). BEMÆRK: Dette er 100% L2-opløsning. Tilføjelse 100% L2 løsning SA1 og SA2 polymeriserede løsninger (se §1.3), vil danne en 100% tværbundet DNA-gel (100% gel), fordi SA1, SA2 og L2 vil være støkiometrisk ækvivalente.
  4. Fortyndes en alikvot på 100% L2 opløsning til 80% ved tilsætning af 20 pi 1x TE-buffer til 80 pi 100% L2-opløsning (Tabel 4). BEMÆRK: Denne løsning er 80% L2-opløsning. Tilføjelse af 80% L2 løsning SA1 og SA2 polymeriserede opløsninger (se §1.3) vil danne en 80% tværbundet DNA-gel (80% gel), fordi kun 80% af SA1 og SA2 vil tværbindes til L2. Løsninger kan opbevares ved 4 ° C i op til en måned.

3. Fremstilling af Gel Løsninger

  1. Varme SA1 og SA2 polymeriserede opløsninger ved 70 ° C, indtil opløsningens viskositet er reduceret (ca. 1 minut). Hæv temperaturen op til 80 °C, hvis opløsning er stadig for viskøs til pipette.
  2. Tilsæt 10 ul eller 10 dele SA1 polymeriseret løsning til 10 ul eller 10 dele SA2 polymeriseret opløsning (tabel 4). BEMÆRK: SA1 og SA2 polymeriserede løsninger er ekstremt tyktflydende og vanskelige at pipette. Da koncentrationer er afgørende for geldannelse bruge en positiv-fortrængning pipette fra dette punkt frem eller se diskussionen til anden håndtering teknikker. Også pipette i multiple, små portioner (> 20 ul) snarere end en enkelt, stor volumen.
  3. Bland SA1 og SA2 polymeriserede løsninger sammen via skiftevis opvarmning (i 15 sekunder ved 70 ° C) og omrøring (i 15 sekunder med en pipettespids) for i alt 1 min.
  4. Tilføj 6 pi eller 6 dele 100% L2 opløsning til dannelse af et 100% gel (tabel 4).
  5. Bland ved skiftevis opvarmning og omrøring som beskrevet i trin 1.3.3.
  6. Heat gel i 1 time ved den optimale annealingstemperatur (35 ° C). Beregn ennnealing temperatur ved at trække 5 ° C fra den ssDNA sekvens med den laveste smeltetemperatur (tabel 1).
  7. Pipette 100% gelen i en 60 mm petriskål.
  8. Tillad DNA krydsbindinger fortsat rehybridize ved at inkubere gelen i 4 timer ved stuetemperatur.
  9. Cover gel med PBS indeholdende calcium og magnesium og inkuberes O / N-ved stuetemperatur. BEMÆRK: Gels vil svulme omkring 3 gange deres oprindelige volumen. Desuden vil geler ligevægt med puffer og overskydende acrylamid vil diffundere ud af gelerne. Calcium og magnesium i PBS stabilisere DNA-hybridisering og forhindre gelen sprængning (se Diskussion til toubleshooting gel bristning).
  10. Fjern resterende buffer fra petriskål.
  11. At fabrikere 80% geler Gentag trin 1.3.1-1.3.10 men erstatte 100% L2 opløsning i trin 1.3.4 med 80% L2-opløsning. Opbevar 100% og 80% geler ved 4 ° C i op til en måned. BEMÆRK: Stivheden forskelle mellem 80% og 100% geler er fysisk skelnes.
    12. </ Ol>

    2. Gel Immobilisering på glas

    BEMÆRK: Immobilisere portioner af 100% eller 80% geler på dækglas (figur 2).

    1. Varm 100% gel ved 70 ° C i omkring 30 sekunder, eller indtil gelen er mindre viskos til pipettering.
    2. Placer dækglas på en 70 ° C varme blok og lad det varme i 1-2 min.
    3. Tilføj en dråbe af optisk lim til hvert dækglas.
    4. Tilsæt 20 ul 100% gel til hvert glas dækglas (tabel 4). BEMÆRK: 10-30 pi kan udleveres på hvert dækglas.
    5. Tillad gelen at smelte og spredes over dækglas. BEMÆRK: Hvis gel topologi ikke vises, selv efter smeltning, flatten gel med en silikoniseret dækglas. Dog vil yderligere hævelse forekomme i efterfølgende trin og bidrage til gel ujævnheder.
    6. Fjern glas-holdige gel fra varmeblokken og sted i en 24-brønds vævsdyrkningsskål.
    7. Gentag trin 2.1-2.6 med 8 0% gelen.
    8. Heat geler i 1 time ved den optimale annealingstemperatur (35 ° C). BEMÆRK: Det er normalt, at geler bliver tør og dette vil blive løst, når geler inkuberes i PBS.
    9. Expose plader indeholdende 80% og 100% geler for ultraviolet (UV, 365 nm) lys i 15 min. BEMÆRK: UV-eksponering samtidig hærder lim og steriliserer geler. Hvis en UV krydsbinding kammer ikke er tilgængelig, kan geler placeres under en UV-lys, der er udstyret i et biologisk sikkerhedsskab. Efter UV-eksponering, udføre følgende trin i denne protokol under et biologisk sikkerhedsskab at opretholde gel sterilitet. Også bruge sterile opløsninger fra dette punkt fremad.
    10. Tillad DNA krydsbindinger at rehybridize ved stuetemperatur i 4 timer.
    11. Tilføj PBS og inkuberes O / N-ved 4 ° C. BEMÆRK: PBS-inkubation skylninger, equilibrates og svulmer geler igen, fordi gentagen opvarmning kan dehydrere gelerne.

    51323 / 51323fig2highres.jpg "/>
    Figur 2. Skematisk gel immobilisering og funktionalisering. Efter DNA-geler (grå) er forberedt, er geler fastgjort til dækglas (hvid) med optiske lim (grøn). Geler samtidigt hærdes og steriliseret med UV-lys. Efter hævelse, geler er cirka 1 mm tykt. Dernæst geler funktionaliseret i en to-trins proces (rød skitseret boks). Først sulfo-SANPAH konjugeret til acrylamid på gel flader med UV-lys. For det andet er geler inkuberet med collagen eller poly-D-lysin, som er knyttet til sulfo-N-hydroxysuccinimid-ester i sulfo-SANPAH. Dette tal er blevet ændret fra 10.

    3. Gel Funktionalisering

    BEMÆRK: DNA-gel funktionalisering er nødvendig for celleadhæsion siden polyacrylamidgeler er inerte materialer (figur 2). I dette afsnit vil geler funktionaliseres i to trin. Først N -Sulfosuccinimidyl-6 (4 &# 39; -azido-2'-nitrophenylamino) hexanoat eller sulfo-SANPAH vil være kovalent bundet ved fotolyse af nitrophenyl azidgruppe til polyacrylamid rygraden i DNA-geler. For det andet vil de primære aminer i collagen eller poly-D-lysin vedhæfte sulfonamidgruppen N-hydroxysuccinimid-ester i sulfo-SANPAH at fastgøre proteiner geloverfladen.

    1. Fjern buffer i brønde med en pipette og være omhyggelig med ikke at aspirere gelen. BEMÆRK: Du må ikke udføre vakuum aspiration for at reducere sandsynligheden for at aspirere gelen.
    2. Valgfrit) Vask geler tre gange i 15 min ved RT for at fjerne overskydende acrylamidmonomer, TEMED og APS.
    3. Tilføj omkring 300 ul sulfo-SANPAH at dække hver gel.
    4. Bring geler til UV (365 nm) i 5 minutter.
    5. Fjern sulfo-SANPAH.
    6. Skyl geler én gang med PBS for at fjerne overskydende sulfo-SANPAH.
    7. Gentag trin 3,3-3,6.
    8. Inkuber geler omkring 300 pi 0,2 mg / ml poly-D-lysin i 1 time ved stuetemperatur eller O / N ved 4 ° C. BEMÆRK: Alternativt inkuberes geler med 0,2 mg / ml kollagen type 1 O / N-ved 4 ° C.
    9. Vask geler to gange med PBS i 5 minutter for at fjerne overskydende poly-D-lysin.
    10. Inkubér geler i omkring 300 ul medier i 30 minutter for at komme i ligevægt geler.
    11. Fjern mediet umiddelbart før udpladning celler.

    4. celledyrkning og billedbehandling

    BEMÆRK: I dette afsnit giver vi oplysninger om blødgøring eller afstivning af geler efter celleudpladning. En detaljeret celledyrkning protokol er ikke fastsat af flere grunde. For det første kan mange celletyper klæbe på DNA-geler, og hver celle type vil kræve specifikke tilpasninger af forskeren til celleudpladning. For det andet er standard celler og væv dyrkningsteknikker, der anvendes til disse forsøg, og kan findes i en lang række originale artikler, tekniske artikler og opslagsværker. Teknikker til specifikt plating fibroblaster og neuroner onto DNA geler kan findes i landingsskellige publikationer 9-11,19-21.

    1. Plate celler. For protokoller om dissektion og / eller dyrkning af neuroner eller fibroblaster nævnt i denne artikel, henvise til en af følgende publikationer 9-11,19-21.
    2. Efter mindst 48 timer, modulere gel stivhed ved pipettering 1 pi af kontrol, L2 eller R2 løsning tæt på gelen (tabel 4).
      1. For at afstive geler fra 80% til 100% tværbundet (80 → 100% geler), tilsættes de resterende 20% af L2 til 80% geler ved tilsætning af 1 ml af 100% L2 løsning tæt på gelen.
      2. At blødgøre geler fra 100% til 80% tværbundet (100 → 80% geler), tilsættes R2 for at fjerne 20% af de krydsbindinger fra 100% geler ved tilsætning af 1 ml af 100% R2 løsning tæt på gelen.
      3. Til kontrol tilsættes lige volumener af kontrol opløsning til en delmængde af 100% og 80% geler ved tilsætning af 1 pi af kontrol løsning tæt på gelen.
    3. Udfør den ønskede celle databehandling og-analyse efteret minimum på 48 timer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Forud for vores undersøgelser blev celle-ECM interaktioner observeret på statiske kompatible biomaterialer eller irreversible og ensrettede dynamiske substrater. Disse substrater ikke nøjagtigt afspejler den dynamiske karakter af den cellulære mikromiljø. Vores arbejde flytter de eksisterende tekniske paradigmer ved at give en mere fysiologisk model til at studere celle-ECM interaktioner på blødgøring og afstivende dynamiske biomaterialer. I tidligere undersøgelser, vi analyserede virkningerne af dynamiske substrater på celler ved at undersøge forskellige celle morfologier og fænotyper på disse geler. I et eksempel vi bestemt virkningerne af substrat afstivning på fibroblaster ved at evaluere fibroblast morfologi på Dynamic DNA geler. L929-celler, en mus-afledt fibroblast-cellelinie, blev udpladet på 80% og 100% geler (figur 3) 11. To dage efter udpladning, 20% yderligere L2 opløsning blev tilsat til mediet på 80% geler at afstive gelerne til 100% tværbundet (80 → 100%, midterpanelet). 100% geler og et andet sæt af 80% geler fik kontrol ssDNA at forblive statisk (højre og venstre panel, henholdsvis). Lysmikroskopi billeder blev fanget to dage efter levering af DNA til medierne. Billede sløring, som ses i figur 3, skyldtes gel ujævnheder og er typisk og uundgåelig. Gel hævelse og sammentrækning som følge af tilsætning af buffere og L2 18,21 bidrager til gel ujævnheder. Morfologi blev evalueret med ImageJ software (NIH, Bethesda, MD) og tjente som en indikator for funktion. Fibroblaster dyrket på afstivende geler (80 → 100%) havde ingen ændringer i skærmformat, men udviste en større projektion område end fibroblaster dyrket på 100% geler 11. Interessant morfologi fibroblaster dyrkes på statiske geler var ulig morfologi fibroblaster dyrkes på dynamiske geler. Fibroblaster dyrket på 100% geler havde en mindre projektion område og større aspekt ratio end fibroblaster dyrket på 80% geler. Disse retater viser, at fibroblast adfærd er afhængig af den dynamiske karakter af mikromiljø. I en anden undersøgelse blev effekten af substrat blødgørende på neuroner bestemmes ved analyse af neuronale fænotyper herunder dendritceller nummer, dendritceller længde, og Axon længde (figur 4) 10. Rotte-afledte rygmarvsneuroner blev dyrket på 100% og 50% geler. Fire dage efter udpladning blev 50% R2 tilsat til mediet af 100% geler at blødgøre gelerne til 50% tværbundet (100 → 50%, center paneler). 50% geler og et andet sæt af 100% geler fik kontrol ssDNA at forblive statisk (højre og venstre paneler, henholdsvis). Efter tre dage blev neuroner fikseret og immunfarvet med en dendritisk markør (MAP2, øverste paneler), en axonal markør (Tau midterste paneler) og kerner (DAPI, bundpaneler) at evaluere fænotyper. Neuroner dyrket på blødgørende geler (100 → 50%) havde ingen forskelle i primær dendritceller nummer eller Axon længde, men udviste kortere primære dendritter end neuroner dyrket o n 50% geler. Som i fibroblast undersøgelser neurale fænotyper på statiske geler var ulig neurale fænotyper om dynamiske geler. Neuroner dyrket på 50% geler havde færre primære dendritter og længere axoner end neuroner dyrket på 100% gel. Konklusionen er, fibroblast og neuron billeder viser, at flere celletyper kan studeres på dynamiske og statiske DNA geler, DNA gel ujævnhed forårsager billeddannelse udfordringer, standard morfologiske og immunfarvning teknikker er gennemførlige, og vigtigst opførslen af ​​celler er afhængig af substrat dynamik.

Figur 3
Figur 3. Fibroblaster dyrkes på statiske og dynamiske DNA geler. Repræsentant lysmikroskopi billeder af L929 fibroblaster dyrket på 80% (venstre panel), 80 → 100% (center panel), og 100% geler (højre panel). Målestokken er 100 um. Dette tal er blevet ændret fra den 11.href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51323/51323fig3large.jpg" target = "_blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Neuroner dyrket på DNA-geler. Repræsentative fluorescerende billeder af rygmarvsneuroner dyrket på 100% (venstre paneler), 100 → 50% (center paneler), og 50% (højre paneler) geler. MAP2 immunfarvning indikerer dendritter (toppaneler), Tau-1-immunfarvning indikerer axoner (midterste paneler) og DAPI farvning indikerer kerne (nederst paneler). Målestokken er 100 um. Dette tal er blevet ændret fra 10. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Evnen af ​​DNA-geler til at blødgøre eller stivne før og efter celleadhæsion gør dem til en ideel model for at undersøge den rolle, dynamisk væv stivhed cellefunktion. Alle tre motiver er blevet anvendt i mekaniske og biologiske undersøgelser. Men alle tre motiver har lignende elasticitet på forskellige tværbindinger procenter angiver tværbinder længde påvirker ikke DNA-gel-elasticitet (tabel 2). I modsætning hertil acrylamid fusion påvirker elasticitet. Disse mønstre kan variere i tværbindende kinetik siden gel brister tendenser eller tendensen af ​​geler til at opløse i medierne eller puffer, falder med stigende krydsbindinger længde. Men kinetiske oplysninger om DNA-geler er begrænset, men vi kender en yderligere 30% af tværbinding sker to dage efter L2 levering til 50% DNA geler 11. Ikke desto mindre generation af ekspansiv og kontraktile styrker fra gel blødgøring og afstivning henholdsvis er uundgåelig, og kan ikke afkobles18,21. 100 → 70% geler generere omkring 0,5 Pa stress 21, mens 50 → 100% geler kun generere omkring 0,04 Pa stress, da det kræver mere energi til at danne bindinger mellem de tre bevoksninger af ssDNA 18. Derfor fortolkning af resultaterne kræver overvejelse af stress og belastning genereret af stivhed og blødgøring af geler.

Tekniske udfordringer kan opstå, når fremstilling af DNA geler. Den hyppigste tekniske spørgsmål er gel sprængning. Gel sprængning kan forekomme under flere faser af DNA-gel forberedelse, herunder gel hævelse, opbevaring og cellevækst. Gel sprængning forårsages af flere faktorer. For det første kan gel sprængfyldt være et resultat af forkert løsning sammensætning. Almindelige fejl omfatter utilstrækkelig opløsning af frysetørret ssDNA og forkert pipettering af tyktflydende væsker. For at undgå pipetteringsfejl, hæve varme temperatur for at reducere gel viskositet lettere pipettering af løsninger eller udportionerer den krævede amount af SA1 og SA2 polymeriseret opløsning forud for det andet nitrogengennembobling trin. Desuden kan gentagne opvarmning af de polymeriserede opløsninger delvis opløsningen inddampes og øge opløsningsviskositet. Tilføjelse af et par mikroliter TE-buffer kan bidrage til at reducere viskositeten. For det andet kan gel sprængfyldt være et resultat af dårlig DNA kvalitet. QA / QC rapporter skal gennemgås jævnligt. Hvis QA / QC rapporter er acceptable og gel sprængning stadig forekommer, kan HPLC oprenset ssDNA forbedre DNA-kvalitet. For det tredje kan gel sprængning skyldes utilstrækkelig DNA udglødning. Vi har reduceret forekomsten af ​​gel sprænges ved at inkludere udglødning trin og rehybridisering skridt i den oprindelige protokol (se trin 1.3.6 og 2.8, 1.3.8 og 2.10, henholdsvis). Gel sprængning kan hindres ved at udvide udglødning og afkøling gange. Men for at yderligere udsættelse for varme kan fordampe vand forårsage en stigning i gel løsrivelse fra glasset, når geler er re-svulmede. Hvis detachement er for stor for enhver annealing tid, annEaling trin kan elimineres (1.3.6 og 2.8).

Anden hyppig teknisk problem, er utilstrækkelig celleadhæsion. De hævede geler er blødere end de ukvældede geler (tabel 2) 18 gør celleadhæsion vanskelig. Eftersom hver celletype reagerer forskelligt på væv stivhed, kan nogle celletyper opleve denne tekniske dilemma mens andre celletyper ikke. For at løse vedhæftning problemer nogle af de følgelinks skridt bør overvejes: (1) at bruge en høj udpladningsdensitet, (2) suppleant ECM-proteiner konjugeret til sulfo-SANPAH, (3) modulere stivhedsparametre, (4) at øge ECM protein eller sulfo-SANPAH koncentration og (5) at øge inkubationstider. Resterende giftige stoffer, såsom acrylamidmonomer, APS og TEMED kunne også bidrage til manglende vedhæftning og celledød på geler. Vi har ikke oplevet dette problem, da omfattende vasker indsættes i protokollen har vist tilstrækkelig, men vi anbefaler performing valgfrit trin 3.2, hvis dette problem opstår.

DNA-geler kan anvendes til mere effektivt at studere en række cellefunktioner under dynamiske eller statiske forhold. Vi har vist, at fibroblaster og neuroner dyrkes på DNA-geler er påvirket af modulering af gelen elasticitet. Eftersom celle-matrix-interaktioner er typisk tredimensionale grænseflader, information fra tre-dimensionelle dynamisk matrix undersøgelser vil bidrage til at producere mere biologisk relevante data. Derfor er vi i øjeblikket omsætte denne teknologi i et tredimensionelt stillads. Vi er ved at udvikle en teknik, der erstatter polyacrylamid backbone med en mere biokompatibelt materiale, samtidig med at den DNA-tværbinding teknologi. Denne nye stillads vil tjene som en tredimensional, dynamisk model og en vævsmanipulering stillads. Dens biokompatibilitet vil åbne muligheder for medicinsk udstyr applikationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Dr. Frank Jiang, Dr. David Lin, Dr. Bernard Yurke og Dr. Uday Chippada for deres bidrag til udviklingen af ​​DNA-gel teknologi; Dr. Norell Hadzimichalis, Smit Shah, Kimberly Peterman, Robert Arter for deres kommentarer og redigeringer af dette manuskript; finansieringskilder, herunder New Jersey Kommissionen om Spinal Cord Forskning (Grant # 07A-019-SCR1, NAL), og New Jersey Neuroscience Institute (MLP); og udgivere af Tissue Engineering, del A, for tilladelse til at genoptrykke figur 2 og 4 og biomaterialer om tilladelse til at genoptrykke figur 3.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ssDNA Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa)
idtdna.com		 Do not vortex ssDNA. Gentle invert the vial and/or pipette solution to mix.
PBS with calcium and magnesium Any brand.
100x Tris-EDTA buffer (TE buffer) Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)
sigmaldrich.com		 T9285
10x Tris-Borate-EDTA buffer (TBE buffer) Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) 93290 TBE is a reproductive toxin.
40% Acrylamide solution Fisher Scientific (Pittsburg, PA) BP14021 Acrylamide is a toxin.
Ammonium persulfate (APS) Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) A3678 Prepare a 2% solution in TE buffer. APS is a toxin and irratant.
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) T9281 Prepare a 20% solution in TE buffer. TEMED is flammable, a corrosive, and a toxin.
12 mm diameter round coverglass Fisher Scientific (Pittsburg, PA)
fishersci.com		 12-545-82
Norland optical adhesive 72 Norland Products (Cranbury, NJ)
norlandprod.com		 NOA72
24-well tissue culture plate Any brand.
Microcentrifuge tubes Any brand.
Sulfo-SANPAH ProteoChem or Thermo Fisher, (Rockland, IL)
proteochem.com or thermofisher.com		 C111 or 22589 Prepare a 0.315 mg/ml solution in water immediately before use. Dissolve at 37 °C and filter sterilze. It is normal to observe undisolved sulfo-SANPAH in the filter. Sulfo-SANPAH is light sensitive and, therefore, the solution should be protect from light until UV exposure.
Poly-D-Lysine (PDL) Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) P6407 Prepare a 0.2 mg/ml solution in water and filter sterilize.
Collagen Type I Affymetrix (Santa Clara, CA)
affymetrix.com		 13813 Prepare a 0.2 mg/ml solution in 0.2 N acetic acid. Solution needs to remain cold at all times to avoid polymerization. Acetic acid is a flammable, toxic, and corrosive.
22 x 60 cover glass Fisher Scientific (Pittsburg, PA) 12-544-G
Positive-displacement pipette Gilson, Inc (Middletown, WI)
gilson.com		 F148504
Heat block Fisher Scientific (Pittsburg, PA) 11-718
UV light source Place gels as close as possible to the UV light. UV light can cause skin or eye injury.
Thermometer Any brand.
Nitrogen gas GTS-Welco (Flemington, NJ)
www.praxairmidatlantic.com/		 NI 5.0UH-R

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Balaban, N. Q., et al. Force and focal adhesion assembly A close relationship studied using elastic micropatterned substrates. Nat Cell Biol. 3 (5), 466-472 (2001).
  2. Peppas Brannon-Peppas, L., Peppas, N. A. Dynamic and equilibrium swelling behaviour of ph-sensitive hydrogels containing 2-hydroxyethyl methacrylate. Biomaterials. 11 (9), 635-644 (1990).
  3. Charati, M. B., Ifkovits, J. L., Burdick, J. A., Linhardt, J. G., Kiick, K. L. Hydrophilic elastomeric biomaterials based on resilin-like polypeptides. Soft Matter. 5 (18), 3412-3416 (2009).
  4. Davis, K. A., Burke, K. A., Mather, P. T., Henderson, J. H. Dynamic cell behavior on shape memory polymer substrates. Biomaterials. 32 (9), 2285-2293 (2011).
  5. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophys J. 76 (4), 2307-2316 (1999).
  6. Gray, D. S., Tien, J., Chen, C. S. Repositioning of cells by mechanotaxis on surfaces with micropatterned youngs modulus. J Biomed Mater Res A. 66 (3), 605-614 (2003).
  7. Homma, M., Seida, Y., Nakano, Y. Effect of ions on the dynamic behavior of an electrodriven ionic polymer hydrogel membrane. Journal of applied Polymer Science. 82 (1), 76-80 (2001).
  8. Horkay, F., Tasaki, I., Basser, P. J. Osmotic swelling of polyacrylate hydrogels in physiological salt solutions. Biomacromolecules. 1 (1), 84-90 (2000).
  9. Jiang, F. X., Yurke, B., Firestein, B. L., Langrana, N. A. Neurite outgrowth on a DNA crosslinked hydrogel with tunable stiffnesses. Ann Biomed Eng. 36 (9), 1565-1579 (2008).
  10. Jiang, F. X., Yurke, B., Schloss, R. S., Firestein, B. L., Langrana, N. A. Effect of dynamic stiffness of the substrates on neurite outgrowth by using a DNA-crosslinked hydrogel. Tissue Engineering Part A. 16 (6), 1873-1889 (2010).
  11. Jiang, F. X., Yurke, B., Schloss, R. S., Firestein, B. L., Langrana, N. A. The relationship between fibroblast growth and the dynamic stiffnesses of a DNA crosslinked hydrogel. Biomaterials. 31 (6), 1199-1212 (2010).
  12. Kloxin, A. M., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Synthesis of photodegradable hydrogels as dynamically tunable cell culture platforms. Nat Protoc. 5 (12), 1867-1887 (2010).
  13. Lin, D. C., Yurke, B., Langrana, N. A. Mechanical properties of a reversible, DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogel. J Biomech Eng. 126 (1), 104-110 (2004).
  14. Lin, D. C., Yurke, B., Langrana, N. A. Use of rigid spherical inclusions in young's moduli determination: Application to DNA-crosslinked gels. J Biomech Eng. 127 (4), 571-579 (2005).
  15. Luo, Y., Shoichet, M. S. Light-activated immobilization of biomolecules to agarose hydrogels for controlled cellular response. Biomacromolecules. 5 (6), 2315-2323 (2004).
  16. Marklein, R. A., Burdick, J. A. Spatially controlled hydrogel mechanics to modulate stem cell interactions. Soft Matter. 6 (1), 136-143 (2010).
  17. Pelham Jr, R. J., Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13661-13665 (1997).
  18. Previtera, M. L., Chippada, U., Schloss, R. S., Yurke, B., Langrana, N. A. Mechanical properties of DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogels with increasing crosslinker density. BioResearch Open Access. 1 (5), 256-259 (2012).
  19. Previtera, M. L., Langhammer, C. G., Firestein, B. L. Effects of substrate stiffness and cell density on primary hippocampal cultures. J Biosci Bioeng. 110 (4), 459-470 (2010).
  20. Previtera, M. L., Langhammer, C. G., Langrana, N. A., Firestein, B. L. Regulation of dendrite arborization by substrate stiffness is mediated by glutamate receptors. Ann Biomed Eng. 38 (12), 3733-3743 (2010).
  21. Previtera, M. L., Trout, K. L., Verma, D., Chippada, U., Schloss, R. S., Langrana, N. A. Fibroblast morphology on dynamic softening of hydrogels. Ann Biomed Eng. 40 (5), 1061-1072 (2012).
  22. Saxena, T., Gilbert, J., Stelzner, D., Hasenwinkel, J. Mechanical characterization of the injured spinal cord after lateral spinal hemisection injury in the rat. J Neurotrauma. 29 (9), 1747-1757 (2012).
  23. Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. Neurite growth in 3d collagen gels with gradients of mechanical properties. Biotechnol Bioeng. 102 (2), 632-643 (2009).
  24. Wozniak, M. A., Chen, C. S. Mechanotransduction in development A growing role for contractility. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (1), 34-43 (2009).
  25. Wuerfel, J., et al. Mr-elastography reveals degradation of tissue integrity in multiple sclerosis. Neuroimage. 49 (3), 2520-2525 (2012).
  26. Zaari, N., Rajagopalan, P., Kim, S. K., Engler, A. J., Wong, J. Y. Photopolymerization in microfluidic gradient generators Microscale control of substrate compliance to manipulate cell response. Adv Mater. 16 (23-24), 2133-2137 (2004).

Tags

Bioengineering bioteknologi (generelt) elastisk viskoelastiske bis-acrylamid underlag stivhed dynamisk statisk neuron fibroblast overholdelse ECM mechanobiology justerbar
Fremstilling af DNA-tværbundet polyacrylamid Hydrogeler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Previtera, M. L., Langrana, N. A.… More

Previtera, M. L., Langrana, N. A. Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels. J. Vis. Exp. (90), e51323, doi:10.3791/51323 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter