Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Fremstilling av DNA-kryssbundet polyakrylamid Hydrogeler

Published: August 27, 2014 doi: 10.3791/51323
Automatic Translation
1, 2,3
1New Jersey Neuroscience Institute, JFK Medical Center, 2Department of Biomedical Engineering, Rutgers University, 3Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Rutgers University

Summary

Vårt laboratorium har utviklet DNA-kryssbundet polyakrylamidprodukter hydrogeler, et dynamisk hydrogel system, for å bedre forstå effektene av modulerende vev stivhet på cellefunksjon. Her gir vi skjemaer, beskrivelser og protokoller for å forberede disse hydrogeler.

Abstract

Mechanobiology er en ny vitenskapelig område som løser den kritiske rollen fysiske signaler i regi cellemorfologi og funksjon. For eksempel er effekten av vev elastisitet på cellefunksjon et stort område av mechanobiology forskning, fordi vev stivhet modulerer med sykdommen, utvikling og skade. Statiske vev-ligne materialer eller materialer som ikke kan endre stivhet når cellene er belagt, er hovedsakelig brukt til å undersøke effektene av vev stivhet på cellefunksjoner. Mens informasjon fra statiske studier er verdifull, disse studiene ikke er indikasjon på de dynamiske egenskapene til den cellulære mikromiljøet in vivo. For bedre å møte effektene av dynamisk stivhet på cellefunksjon, har vi utviklet en DNA-kryssbundet polyakrylamid hydrogel system (DNA gels). I motsetning til andre dynamiske substrater, DNA-geler har evnen til å øke eller minske i stivhet etter fabrikasjon uten stimuli. DNA-gels består av DNA crosslblekk som er polymerisert inn i en polyakrylamid-ryggrad. Legge til og fjerne cross via levering av single-strandet DNA tillater timelige, romlige, og reversibel kontroll av gel elastisitet. Vi har vist i tidligere rapporter som dynamisk modulering av DNA gel elastisitet påvirker fibroblast og neuron atferd. I denne rapporten og video, gir vi en skjematisk som beskriver DNA gel tverrbindingsmekanismer og steg-for-steg instruksjoner om tilberedning DNA gels.

Introduction

Statiske og dynamiske underlag er to kategorier av biomaterialer som ble utviklet for å studere effekter av vev elastisitet eller stivhet på cellefunksjon. Statiske substrater ikke kan endre deres fysikalske egenskaper etter at de er fremstilt og / eller når cellene er belagt. Polyakrylamid (PA) geler ble de første to-dimensjonale, statiske substrater som ble syntetisert for mechanobiology undersøkelser 5,17. PA gels er enkel å tilberede, billig, allsidig og kan være fabrikkert med et bredt spekter av elastiske moduler. Selv om disse tekniske fordelene gjør PA gels en vanlig brukt substrat, statiske underlag er ikke en indikasjon på de dynamiske egenskapene til den ekstracellulære matrise (ECM) og omkringliggende cellulære miljø in vivo. For eksempel gjennomgår ECM stivhets forandringer som et resultat av skade, utvikling eller sykdom. Dynamiske substrater er derfor favorisert som vev-ligne underlaget modeller i mechanobiology studier

Tallrike syntetisk, har naturlige, to-dimensjonale, tredimensjonale, statiske og dynamiske biomaterialer er utviklet for å etterligne vev stivhet 1,3,6,16,23,26. Noen dynamiske underlag trenger varme, UV, elektrisk strøm, ioner og pH-endringer for å endre sine mekaniske egenskaper 2,4,7,8,12,15,16, men disse stimuli kan begrense hydrogel bio-søknad. DNA-kryssbundet polyakrylamid geler hydrogeler (DNA) er dynamiske todimensjonale elastiske underlag. DNA cross tillate timelige, romlige, og reversible modulering av DNA gel stivhet ved tilsetting av single-strandet DNA (ssDNA) til media eller buffer 9-11,13,14,18,21. I motsetning til de nevnte dynamiske geler hvor stimuli benyttes for modulering av elastisitet, DNA-geler er avhengige av diffusjonen av anvendt ssDNA for endring av elastisitet. Derfor er den øvre gel overflaten, hvor cellene er dyrket, er det første området modulert fordi frekvensen of elastisitet modulasjon er avhengig av gel tykkelse.

DNA-geler er lik deres PA gel motstykker ved at de har en ryggrad polyakrylamid, men bis-akrylamid tverrbindinger er erstattet med kryssbinder som består av DNA (figur 1). To ssDNAs (SA1 og SA2) hybridisere med en tverrbinder tråd (L2) for å gjøre opp DNA-tverrbindinger i gelen. SA1 SA2 og har distinkte sekvenser som begge inneholder et Acrydite modifikasjon på 5'enden for effektiv inkorporering i PA-nettverket. For utarbeidelse av geleer, SA1 og SA2 er individuelt polymeriseres inn i en PA ryggrad, og senere, den polymeriserte SA1 og SA2 er blandet sammen. L2, tverrbindingsmiddelet, tilsettes til SA1 SA2 og blandingen. Den L2 basesekvens er komplementær til begge SA1 SA2 og sekvenser og L2 hybridiserer med SA1 SA2 pluss for å danne DNA-tverrbindinger. Initial, DNA gel elastisitet bestemmes av både L2 konsentrasjoner og kryssbinding (tabell 1 2). DNA-gels inneholder like støkiometriske mengder L2, SA1 og SA2 er de stiveste gels fordi SA1 og SA2 er 100% kryssbundet av L2 (utpekt som 100% gels). Lavere konsentrasjoner av L2 resulterer i en lavere prosentandel av DNA-tverrbinding, og derfor mykere DNA-geler. Gels så lavt som 50% kryssbundet (utpekt som 50% gel) har blitt bygget 9-11.

Figur 1
Figur 1. DNA gel tverrbinding og uncrosslinking skjematisk 9-11,13,14,18,21 Trinn 1:. SA1 (rød) og SA2 (blå) er individuelt polymeriseres inn i en polyakrylamid ryggrad (svart). Etter polymerisasjon, er SA1 og SA2 polymeriserte løsninger blandes sammen. Trinn 2: L2 (grønn) tilsettes, og hybridiserer med SA1 SA2 pluss til å danne tverrbindinger i gelen. Trinn 3: R2 hybridiserer med than fotfeste i L2. Trinn 4: fotfeste hybridisering av R2 driver Derigjennom av L2 fra SA1 og SA2.

I motsetning til PA gels, kan DNA-gels stive og myke etter syntese. Av den grunn kan cellene dyrkes på DNA-geler utsettes for dynamiske stivhet forandringer. For å stive celleheftende geler, L2 kan bli tilsatt til kulturmedier lave prosent geler for å øke prosentandelen av tverrbindinger. For å bløtgjøre celleheftende geler, L2 kan bli fjernet for å redusere prosentandel av kryssbinder 10,13,21. L2 har en ekstra fotfeste sekvensen i 3 'enden for å tillate L2 til uncrosslink fra SA1 SA2 og (tabell 1). Fjerning av L2 oppnås ved hybridisering av en reversering tråd kalt R2. R2 er komplementær til den fulle lengden L2 og hybridiseres først med L2 fotfeste. Fotfeste hybridisering driver Derigjennom av L2 fra SA1 og SA2, noe som eliminerer cross og reduserer gel stivhet.

I denne rapporten ogvideo, steg-for-steg instruksjoner gis for utarbeidelse av stivne og mykgjørende DNA gels. Mens 100% og 80% gel-preparater er beskrevet, kan denne protokollen bli skreddersydd for å lage DNA-geler av andre innledende og endelige tverrbundne prosenter. Generelt er 100% og 80% geler fremstilt, immobilisert på glassdekkglass, funksjonalisert og podet med cellene. L2 settes til mediet av 80% geler, og R2 er tilsatt til mediet på 100% geler, 48 timer etter plating. Tilsetningen av L2 til mediet stiver 80% geler til 100% tverrbundet, mens tilsetningen av R2 til mediet mykner 100% geler til 80% tverrbundet. Stivnet gels er utpekt som 80 → 100% gels og myknet gels er utpekt som 100 → 80% gels i teksten. For styring eller statiske geler, ssDNA bestående av Ts eller som blir levert til et annet sett med 100% og 80% geler. Etter et minimum på to dager etter elastisitet modulasjon, kan cellene bli behandlet og analysert.

DNA cross # Av baser Sekvens (fotfeste) Modifisering Smeltetemperatur (T m, ° C) Kommentarer
5 '→ 3'
Design 1 SA1 10 GCA CCT TTG C 5 'Acrydite 34,9
SA2 10 GTC AGA ATG A 5 'Acrydite 23.6
L2 30 TCA TTC TGA C GC AAA GGT GC G CTA CAC TTG 56 En 10 bp fotfeste sekvens er inkludert.
R2 30 CAA GTG TAG CGC ACC TTT GCG TCA GAA TGA R2 er komplementær til L2
Design 2 SA1 14 CGT GGC ATA GGA CT 5 'Acrydite 46,9
SA2 14 GTT TCC CAA TCA GA 5 'Acrydite 40.2
L2 40 TCT GAT TGG GAA AC A GTC CTA TGC CAC G GT TAC CTT CAT C 65.9 En 12 bp sekvens fotfeste er inkludert.
R2 40 GAT GAA GGT AAC CGT GGC ATA GGA CTG TTT CCC AAT CAG A 65.9 R2 er komplementær til L2
Design 3 SA1 20 ACG GAG GTG TAT GCA ATG TC 5 'Acrydite 55
SA2 20 CAT GCT TAG GGA CGA CTG GA 5 'Acrydite 56.6
L2 40 TCC AGT CGT CCC TAA GCA TG G ACA TTG CAT ACA CCT CCG T 68.8 Fotfeste er ikke inkludert.
Kontroll Kontroll 20-40 AAA AAA (osv) eller
TTT TTT (osv)

Tabell 1. Basesekvenser for ssDNA 9-11,13,14,18,21. Cellular og mekaniske studier har benyttet flere different kryssbindings design for å generere DNA-geler med en rekke av statiske og dynamiske mekaniske egenskaper. Parametrene modulert i cross utforming er basesekvensen og sekvens lengde eller cross lengde. Fet og kursiv fonter illustrere baseparing mellom SA1 og L2 og mellom SA2 og L2, henholdsvis.

Design
1 2 3
Akrylamid Konsentrasjon (%) 10 10 10 4
SA1 pluss SA2 hybridisert til L2 (% krysskoblet) 50 80 100 50 80 100 100 100
<strong> elastisitet (kPa, Mean ± SEM) 6.6 ± 0.6 17.1 ± 0.8 29,8 ± 2,5 5.85 ± 0.62 12.67 ± 1.33 22.88 ± 2.77 25,2 ± 0,5 10,4 ± 0,6

Tabell 2. Youngs modulus (E) av DNA-gels 9-11,13,14,18,21. Akrylamid konsentrasjon, crossprosent og cross lengde kan moduleres i DNA-gels. Design 1, 2, og 3 har 20, 28 og 40 bp kryssbindingslengder, henholdsvis. 100% gels for alle design har tilsvarende moduler som indikerer cross lengde påvirker ikke gel elastisitet. Men variasjoner i acrylamidkonsentrasjon endre DNA gel elastisitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: Hele protokollen fra gel forberedelse til celle behandlingen tar minimum seks dager. Estimert tid for gel forberedelse er 8 timers pluss en O / N inkubasjon. Beregnet tid for immobilisering gel og DNA annealing er 8 timers pluss en O / N rensetrinnet. Beregnet tid for gel funksjonalisering er 2 timer. Tid for celleplette og vekst er avhengig kulturtypen og anvendelse, men et minimum på fire dager er nødvendig.

1. Fremstilling av DNA-Gel

MERK: Forbered DNA gels i tre forskjellige trinn. Først individuelt polymer SA1 og SA2 ssDNA inn en PA ryggrad. Disse løsningene er kalt SA1 SA2 polymerisert løsning og polymerisert oppløsning, henholdsvis (§1.1). For det andre, oppløse tverrbinder, reversible tråd, og kontroll ssDNAs. Oppløs det frysetørrede L2 ssDNA (tverrbinder). Dette kalles 100% L2-løsning og blir brukt til å fremstille 100% geler (§1.2). Fortynn en aliquot av 100% L2 løsningentil 80%. Dette kalles 80% L2-løsning og blir brukt til å fremstille 80% geler. Oppløse lyofilisert R2 (reversibel tråd) og kontroll ssDNA å bruke i § 4. For det tredje, bland SA1 polymerisert oppløsning, SA2 polymerisert oppløsning, og 100% eller 80% L2-løsning i et forhold på 10: 10: 6 (SA1: SA2: L2) for å danne 100% og 80% geler, respektivt. (§1.3).

1. Utarbeidelse av SA1 og SA2 polymeriserte Solutions

  1. Velg og rekkefølgen hensiktsmessig SA1, SA2, L2, og R2-basesekvenser fra tabell 1 og 2. Base sekvenser og sekvenslengde ble optimalisert i tidligere rapporter 9-11,13,14.
  2. Beregn alle løsnings formuleringer (tabell 3-4). MERK: Omhyggelig beregninger dokument for feilsøking. Bygging av en Excel-mal er anbefalt og kan brukes flere ganger for DNA gel forberedelse. Vennligst se tabell 3 og 4 for et eksempel på den for tabulering Design 2 (Tabellene 1 og 2). Volumene er angitt i tabell 4 vil bli brukt i denne protokollen, men volumene vil variere med hver delmengde av frysetørret ssDNA.
Løsning Stock Konsentrasjon av Løsning Prosent av Stock Solution i SA1 eller SA2 Polymerisert Solution (v / v) Endelig konsentrasjon på Solution i SA1 eller SA2 Polymerisert Solution
Akrylamid (No-bisacrylamide) 40% 25 10%
SA1 eller SA2 løsning 100% 60 60%
TBE buffer 10x 10 1x
TEMED 20% 2.5 0,50%
APS 2% 2.5 0,05%

Tabell 3. Prosent av løsninger for å fabrikkere SA1 eller SA2 polymeriserte løsninger. Viser den første kolonnen løsninger for utforming av DNA-gels. Den andre kolonnen viser arkivkonsentrasjoner av disse løsninger. Den tredje kolonnen viser hvor stor andel av aksje løsninger i SA1 eller SA2 polymeriserte løsninger (v / v). Den siste kolonnen viser de endelige konsentrasjoner i SA1 og SA2 løsninger.

ssDNA løsninger (§1.1) <tr>
Løsningskomponenter
Løsning Stock Konsentrasjon Den endelige løsningen Konsentrasjon Beregning Beløp Legg Kommentarer
SA1 løsning 320,7 nmol av lyofilisert SA1 ssDNA 3,00 mM 320,7 nmol / 3,00 nmol ul -1 = 107 mL 107 pl av TE-buffer for å lyofilisert ssDNA SA1 løsning er 60% av SA1 polymerisert oppløsning.
107 mL / 0.600 = 178 mL
178 ul er det totale volumet av SA1 polymerisert oppløsning (tabell 3).
SA2 løsning 324.4 nmol av lyofilisert SA2 ssDNA 3,00 mM 324,4 nmol / 3,00 nmol ul -1 = 108 mL 108 pl av TE-buffer for å lyofilisert ssDNA SA2 løsning er 60% av SA2 polymerisert oppløsning.
108 mL / 0.600 = 180 mL
180 ul er det totale volumet av SA2 polymerisert oppløsning (tabell 3).
100% L2 løsningen 657,4 nmol av lyofilisert L2 ssDNA 3,00 mM 657,4 nmol / 3,00 nmol ul -1 = 219 mL 219 pl av TE-buffer for å lyofilisert ssDNA Fortynn en aliquot av 100% til 80% L2 L2 løsningen
80% løsning L2 80 ul av 100% L2 ssDNA 80% - 20 pl av TE-buffer til 80 ul av 100% L2 løsning
Kontrolløsning 332,6 nmol av lyofilisert poly T eller A ssDNA 3,00 mM 332,6 nmol / 3,00 nmol ul <sup> -1 = 111 mL 111 pl av TE-buffer for å lyofilisert ssDNA
R2-løsning 193,8 nmol av lyofiliserte R2 ssDNA 3,00 mM 193,8 nmol / 3,00 nmol ul -1 = 64,6 mL 64,6 pl TE-buffer for å lyofilisert ssDNA
Polymeriserte løsninger (§1.2)
SA1 polymerisert løsning 40% akrylamid 10% 178 mL x 0,25 = 44,5 mL 45 mL Beregn mengden av akrylamid, TBE, APS, og TEMED basert på et totalt volum på 178 ul (se ovenfor og tabell 3).
10x TBE 1x 178 mL x 0,10 = 17,8 mL 18 mL
100% SA1 løsning 60% - 107 mL SA1 løsning er 60% av den SA1 polymerisert oppløsning (se ovenfor og tabell 3).
2% APS 0,05% 178 mL x 0,025 = 4,45 mL 4,5 mL Legg til og bland APS før du legger TEMED.
20% TEMED 0,50% 178 mL x 0,025 = 4,45 mL 4,5 mL
SA2 polymerisert løsningen 40% akrylamid 10% 180 mL x 0,25 = 45 mL 45 mL Beregn mengden av akrylamid, TBE, APS, og TEMED basert på et totalt volum på 180 ul (se ovenfor og tabell 3).
10x TBE 1x 180 mL x 0,10 = 18 mL 18 mL
100% SA2 løsning 60% - 108 mL SA2 løsning er 60% av den SA2 polymerisert oppløsning (se ovenfor og tabell 3).
2% APS 0,05% 180 mL x 0,025 = 4,5 mL 4,5 mL Legg til og bland APS før du legger TEMED
20% TEMED 0,50% 180 mL x 0,025 = 4,5 mL 4,5 mL
Gel løsninger (§1.3)
100% Gel løsning 100% SA1 polymerisert løsning 10 deler - 10 ul Komponere 100% gels med følgende SA1: SA2: L2 ratio, 10: 10: 6.
100% SA2 polymerisert solution 10 deler - 10 ul
100% L2 løsningen 6 deler - 6 mL
80% Gel løsning 100% SA1 polymerisert løsning 10 deler - 10 ul Komponere 80% gels med følgende SA1: SA2: L2 ratio, 10: 10: 6.
100% SA2 polymerisert løsningen 10 deler - 10 ul
80% løsning L2 6 deler - 6 mL
Dynamiske gels (§ 3-4)
80 → 100% gel 80% gel 100% gel Beregning 1: 1 pl av 100% L2 oppløsning i kulturmedier Beregningene er basert på å ha 20 mL gels på dekkglass. Først konvertere de deler av 100% L2 oppløsning i 20 pl gel inn pl. For det andre, beregne mengden (i ul) av 100% L2-løsning som er nødvendig for en ytterligere 20% av tverrbinding. Legg denne mengde av 100% L2 løsning gel.
(20 ul / 26 deler) x 6 deler = 4,6 mL
Beregning 2:
5 mL x 0,2 = 1 mL
100 → 80% gel 100% gel 80% gel Beregning 1: 1 pl av 100% R2 oppløsning i kulturmedier Beregningene er basert på å ha 20 mL gels på dekkglass. Først konvertere the deler av 100% L2 oppløsning i 20 pl gel i pl. For det andre, beregne mengden (i ul) av 100% L2 oppløsning som er nødvendig for å bli fjernet for å komponere en 20% gel. Legg denne mengden R2 løsning gel.
(20 ul / 26 deler) x 6 deler = 4,6 mL
Beregning 2:
5 mL x 0,2 = 1 mL
100% gel (Control) 100% gel 100% gel - 1 mL av kontrollmiddel kultur media Mengde av kontroll løsning er ekvivalent til mengden av R2-løsning tilsatt.
80% gel (Control) 80% gel 80% gel - 1 mL av kontrollmiddel kultur media Mengde av kontroll løsning er ekvivalent til mengden av 100% L2-løsning tilsatt.

Tabell 4. Eksempler på beregninger for DNA-gel preparatet. Mock tall er gitt for å illustrere de beregninger for fremstilling av 80%, 100%, 100 → 80%, og 80 → 100% geler. DNA-geler er designet 2 i tabell 1.

  1. Sentrifuger lyofilisert SA1 ssDNA ved 2000 xg i 15 sek for å sikre at all ssDNA er på bunnen av ampullen. NB: Riktig konsentrasjon av SA1 løsning er avgjørende for DNA gel syntese.
  2. Forbered 3 mM SA1-løsning ved å tilsette 107 ul av 1 x Tris-EDTA, pH 8,0 buffer (TE-buffer) til ampullen (Tabell 3-4).
  3. Varme SA1 i TE-buffer ved 70 ° C i 5 minutter eller inntil ssDNA pelleten fullstendig oppløst. MERK: Oppvarming temperaturen bør være minimum 5 ° C over smeltetemperaturen (T m) for å sikre DNA er i en enkelt-strandet tilstand.
  4. Forbered SA1 polymerisasjon løsning ved å legge til 40% akrylamid og en0x Tris-borat-EDTA (TBE)-buffer ved de indikerte prosenter (tabell 3). I dette eksemplet, tilsett 45 og 18 pl, henholdsvis, til 107 ul av SA1-løsning (tabell 4).
  5. Degas med nitrogengass for 3 min å gjøre blanding. Sett en P200 spiss festet til en nitrogengasskilde inn i løsningen og tillater sakte nitrogengass til å passere gjennom løsningen. Test strømningshastigheten av nitrogengass i vann forut for avgassing SA1 løsning for å hindre sprut.
  6. Sentrifuger i 15 sekunder ved 2000 xg til å samle oppløsningen.
  7. Legg 4,5 pl av 2% ammoniumpersulfat (APS, tabeller 3-4) for å initiere gel-polymerisasjon.
  8. Snu røret flere ganger for å blande.
  9. Sentrifuger i 15 sekunder ved 2000 xg til å samle løsning for homogen polymerisasjon.
  10. Legg 4,5 mL av 20% tetrametyletylendiamin (TEMED, Tabeller 3-4) for å katalysere polymerisasjonen.
  11. Snu røretflere ganger for å blande.
  12. Sentrifuger i 15 sekunder ved 2000 xg til å samle løsning for homogen polymerisasjon.
  13. Degas med nitrogengass for 3-5 minutter for å fullføre polymeriseringen, og minimere ikke-reagerte monomerer.
  14. Inkuber oppløsningen i 10 minutter ved RT for å fullføre polymerisasjonen. MERK: Denne løsningen kalles SA1 polymerisert løsning.
  15. Gjenta trinn 1.1.3-1.1.16 med lyofilisert SA2 ssDNA, men legger til 45, 18, ​​4,5, og 4,5 mL av akrylamid, TBE, APS, og TEMED, henholdsvis til 108 mL av SA2 løsning (Tabell 3-4). MERK: SA1 og SA2 polymeriserte løsninger kan lagres ved 4 ° C i opptil en måned.

2. Utarbeidelse av L2, R2, og kontrolløsninger

  1. Gjenta trinn 1.1.3-1.1.5 med lyofilisert R2 ssDNA men legger 64,4 mL av TE buffer (tabell 4).
  2. Gjenta trinn 1.1.3-1.1.5 med lyofilisert kontroll ssDNA men legge 111 mL av TE buffer (tabell 4
  3. Gjenta trinn 1.1.3-1.1.5 med lyofilisert L2 ssDNA men legge 219 mL av TE buffer (tabell 4). MERK: Dette er 100% L2 løsning. Legge 100% L2 løsning SA1 SA2 og polymeriserte løsninger (se §1.3) vil danne en 100% tverrbundet DNA-gel (100% gel), fordi SA1, SA2, og L2 vil være støkiometrisk ekvivalent.
  4. Fortynn en aliquot av 100% L2-løsning til 80% ved tilsetning av 20 ul av 1 x TE-buffer til 80 ul av 100% L2-løsning (tabell 4). MERK: Denne løsningen er 80% L2 løsning. Legge 80% L2 løsning SA1 SA2 og polymeriserte løsninger (se §1.3) vil danne en 80% kryssbundet DNA-gel (80% gel), fordi bare 80% av SA1 SA2 og vil bli kryssbundet til L2. Løsninger kan lagres ved 4 ° C i opptil en måned.

3. Utarbeidelse av Gel Solutions

  1. Varme SA1 SA2 og polymeriserte oppløsninger ved 70 ° C inntil løsningens viskositet er redusert (omtrent 1 min). Øke temperaturen opp til 80 °C hvis løsning er fortsatt for tyktflytende til pipette.
  2. Tilsett 10 pl eller 10 deler av SA1 polymerisert oppløsning til 10 ul eller 10 deler av SA2 polymerisert oppløsning (tabell 4). MERK: SA1 og SA2 polymeriserte løsninger er ekstremt tyktflytende og vanskelig å pipette. Siden konsentrasjoner er kritiske til gel formasjonen, bruke en fortrengnings pipette fra dette punktet fremover eller se diskusjon for andre behandlingsteknikker. Også, pipette i flere, små alikvoter (> 20 mikroliter) i stedet for et enkelt, stort volum.
  3. Bland SA1 SA2 og polymeriserte løsninger sammen via alternerende oppvarming (etter 15 sek ved 70 ° C) og omrøring (i 15 sek med en pipettespiss) for totalt 1 min.
  4. Tilsett 6 pl eller 6 deler av 100% L2-løsning for å danne en 100% gel (tabell 4).
  5. Bland ved vekslende oppvarming og omrøring som beskrevet i trinn 1.3.3.
  6. Varme gel i 1 time ved den optimale annealing temperatur (35 ° C). Beregn ennnealing temperatur ved å trekke fra 5 ° C fra det ssDNA-sekvensen med det laveste smeltetemperatur (tabell 1).
  7. Pipetter 100% gel den inn i en 60-mm petriskål.
  8. Tillat DNA-kryssbinder for å fortsette å rehybridize gel ved å inkubere i 4 timer ved RT.
  9. Deksel gel med PBS inneholdende kalsium og magnesium og inkuberes O / N ved RT. MERK: Gels vil hovne opp ca tre ganger sin opprinnelige volum. I tillegg vil geler likevekt med buffer og overskudd av akrylamid vil diffundere ut av gelene. Kalsium og magnesium i PBS stabilisere DNA hybridisering og hindre gel sprengning (se diskusjon for toubleshooting gel sprengning).
  10. Fjern gjenværende buffer fra petriskål.
  11. Å dikte 80% gels, gjenta trinn 1.3.1-1.3.10 men erstatte 100% L2 løsning i trinn 1.3.4 med 80% L2 løsning. Lagre 100% og 80% gels ved 4 ° C i opptil en måned. MERK: stivhetsforskjeller mellom 80% og 100% gels er fysisk synlig.
    12. </ Ol>

    2. Gel Immobilisering på Glass

    MERK: Immobilize porsjoner av 100% eller 80% gels på glass dekkglass (figur 2).

    1. Varm 100% gel ved 70 ° C i omtrent 30 sek eller inntil gelen er mindre viskøs pipettering.
    2. Plasser glassdeksel glipper på en 70 ° C varmeblokk og la det varme i 1-2 min.
    3. Tilsett en dråpe optisk lim til hver glassdekselstrimmel.
    4. Tilsett 20 pl av 100% gel til hvert glass dekkglass (tabell 4). MERK: 10-30 mL kan dispenseres ved hvert dekkglass.
    5. Tillat gel å smelte og spredt over glassdekselstrimmel. MERK: Hvis gel topologi ikke vises selv etter smelting, flate gel med et silikonisert glassdekselstrimmel. Imidlertid vil ytterligere hevelse inntreffer i etterfølgende trinn og bidrar til gel ujevnheter.
    6. Fjern glass-holdig gel fra varme blokk og sted inn i en 24-brønns vevskultur parabolen.
    7. Gjenta trinn 02.01 til 02.06 med 8 0% gel.
    8. Varme geler i 1 time ved den optimale annealing temperatur (35 ° C). MERK: Det er normalt for gels å bli tørr og dette vil bli løst når gels inkuberes i PBS.
    9. Eksponer skåler inneholdende 80% og 100% gelene til ultrafiolett (UV, 365 nm) lys i 15 min. MERK: UV eksponering kurer samtidig lim og steriliserer gels. Hvis en UV-kryssbindingskammeret ikke er tilgjengelig, kan gelene bli plassert under en UV-lampe som er utstyrt i en biologisk sikkerhetsskap. Etter UV-eksponering, utføre etterfølgende trinn i denne protokollen under et biologisk sikkerhetskabinett for å opprettholde gel sterilitet. Også bruke sterile løsninger fra dette tidspunktet.
    10. Tillate DNA cross å rehybridize ved RT i 4 timer.
    11. Legg PBS og inkuberes i O / N ved 4 ° C. MERK: PBS inkubasjon skyller, equilibrates, og sveller gels igjen fordi gjentatt oppvarming kan dehydrere gels.

    51323 / 51323fig2highres.jpg "/>
    Figur 2. Skjematisk av gel immobilisering og funksjonalisering. Etter DNA-gels (grå) er forberedt, gels er festet til glass dekkglass (hvite) med optisk lim (grønn). Gels er samtidig herdet og sterilisert ved UV-lys. Etter svelling, geler er ca 1 mm tykt. Deretter blir gels funksjon i en to-trinns prosess (rød skissert boks). Først blir sulfo-SANPAH konjugert til akrylamid på gelen overflater etter eksponering UV-lys. For det andre, blir gelene inkubert med kollagen eller poly-D-lysin, som festes til sulfo-N-hydroksysuccinimid-ester i sulfo-SANPAH. Dette tallet har blitt forandret fra 10.

    3. Gel funksjon

    MERK: DNA gel funksjonalisering er nødvendig for celleadhesjon siden polyakrylamidgeler er inerte materialer (figur 2). I denne seksjonen vil gels bli funksjon i to trinn. Først, N -Sulfosuccinimidyl-6-(4 &# 39; -azido-2'-nitrophenylamino) heksanoat eller sulfo-SANPAH vil bli kovalent bundet ved fotolyse av nitrofenyl azid gruppen til polyakrylamid ryggrad av DNA geler. For det andre, vil det primære aminer i kollagen eller poly-D-lysin feste til sulfo N-hydroksysuccinimid-ester i sulfo-SANPAH å feste proteinene til geloverflaten.

    1. Fjern buffer i brønnene med en pipette og være forsiktig for ikke å suge gel. MERK: Ikke utfør vakuumaspirasjon å redusere sannsynligheten for å aspirere gelen.
    2. Valgfritt) Vasking geler tre ganger i 15 min ved RT for å fjerne overskudd av akrylamidmonomer, TEMED og APS.
    3. Legg 300 mL av sulfo-SANPAH å dekke hver gel.
    4. Eksponer geler for UV-(365 nm) i 5 min.
    5. Fjern sulfo-SANPAH.
    6. Skyll gels gang med PBS for å fjerne overflødig sulfo-SANPAH.
    7. Gjenta trinn 03.03 til 03.06.
    8. Inkuber geler i omtrent 300 pl av 0,2 mg / ml poly-D-lysin i 1 time ved RT, eller O / N ved 4 ° C. MERK: Alternativt, inkuber geler med 0,2 mg / ml av kollagen type 1 O / N ved 4 ° C.
    9. Vask gels to ganger med PBS i 5 minutter for å fjerne overskudd av poly-D-lysin.
    10. Inkuber geler i omtrent 300 pl av mediet i 30 min for å ekvilibrere geler.
    11. Fjern media umiddelbart før plating celler.

    4. celledyrking og bildebehandling

    MERK: I denne delen gir vi detaljer om oppmykning eller avstivede av gels etter celle plating. En detaljert celledyrking protokollen er ikke gitt av flere grunner. Først kan mange celletyper holder seg på DNA-gels og hver celletype vil kreve særskilte tilpasninger av forskeren for celle plating. For det andre er standard celler og vev dyrking teknikker som brukes for disse eksperimentene og kan finnes i en rekke originale artikler, tekniske artikler og oppslagsverk. Teknikker for spesielt plating fibroblaster og nevroner bort på DNA-gels kan bli funnet i Previlige publikasjoner 9-11,19-21.

    1. Plate celler. For protokoller om disseksjon og / eller dyrking av nerveceller eller fibroblaster nevnt i denne artikkelen, kan du se en av følgende publikasjoner 9-11,19-21.
    2. Etter et minimum på 48 timer, modulere gel stivhet ved å pipettere 1 ul av kontroll, L2, eller R2 løsning nær til gel (tabell 4).
      1. For å stive geler fra 80% til 100% tverrbundet (80 → 100% geler), tilsett de resterende 20% av L2 til 80% geler ved å tilsette en ul av 100% L2 løsning nær til gel.
      2. For å myke geler fra 100% til 80% tverrbundet (100 → 80% geler), legge til R2 for å fjerne 20% av tverrbindinger fra 100% geler ved å tilsette en ul av 100% R2 løsning nær til gel.
      3. For kontroller, legger til like volumer av kontrolloppløsning til en delmengde av 100% og 80% geler ved å tilsette en ul av kontroll-løsning nær til gel.
    3. Utføre den ønskede cellebehandling og dataanalyse etteret minimum på 48 timer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Før våre studier ble celle-ECM interaksjoner observert på statiske kompatible biomaterialer eller på irreversible og ensrettede dynamiske underlag. Disse underlag ikke nøyaktig gjenspeiler den dynamiske natur mobilmikromiljøet. Vår arbeidsøkter de eksisterende tekniske paradigmer ved å tilby en mer fysiologisk modell for å studere celle-ECM interaksjoner på oppmykning og stivne dynamiske biomaterialer. I tidligere studier, analyserte vi effektene av dynamiske substrater på celler ved å undersøke forskjellige celle morfologier og fenotyper på disse geler. I ett eksempel har vi fastslått virkningene av substratet stivne på fibroblaster ved å evaluere fibroblast morfologi på dynamiske DNA-geler. L929-celler, en muse-avledet fibroblast-cellelinje, ble platet ut på 80% og 100% geler (Figur 3) 11. To dager etter plettering, 20% ekstra L2-oppløsningen ble tilsatt til mediet for på 80% geler til stive gelene til 100% tverrbundet (80 → 100%, midtpanel). 100% gels og et annet sett med 80% gels fikk kontroll ssDNA å forbli statisk (høyre og venstre panel, henholdsvis). Lysmikroskopi bildene ble tatt to dager etter levering av DNA til media. Bilde uskarphet, som sett i figur 3, var på grunn av gel overflateujevnheter, og er typisk og uunngåelig. Gel hevelse og sammentrekning, som følge av tilsetningen av buffere og L2 18,21, bidrar til gel ujevnheter. Morfologi ble evaluert med ImageJ programvare (NIH, Bethesda, MD) og fungerte som en indikator på funksjon. Fibroblaster dyrket på stivne gels (80 → 100%) hadde ingen endringer i størrelsesforhold, men viste en større projeksjon område enn fibroblaster dyrket på 100% gels 11. Interessant, morfologi av fibroblaster dyrket på statiske geler var ulik den morfologi av fibroblaster dyrket på dynamiske geler. Fibroblaster dyrket på 100% gels hadde en mindre projeksjon området og større sideforhold enn fibroblaster dyrket på 80% gels. Disse retater viser at fibroblast atferd er avhengig av dynamikken i mikromiljøet. I en annen studie ble effekten av underlaget mykgjørende på nevroner bestemmes ved å analysere nevrale fenotyper inkludert Dendritt nummer, dendrite lengde, og axon lengde (figur 4) 10. Rotte-avledet ryggmargs nevronene ble dyrket på 100% og 50% gels. Fire dager etter plating, ble 50% R2 lagt til media av 100% gels å myke opp gels til 50% krysskoblet (100 → 50%, midtfelt). 50% geler og annet sett av 100% geler mottatte styre ssDNA å forbli statisk (høyre og venstre paneler, henholdsvis). Etter tre dager ble nevroner fast og immunostained med dendrittiske markør (MAP2, topplater), en aksonal markør (Tau, midterste paneler), og kjerner (DAPI, bunnplater) for å evaluere fenotyper. Nevroner dyrket på mykgjørende gels (100 → 50%) hadde ingen forskjeller i primær Dendritt nummer eller axon lengde, men utstilt kortere primære dendritter enn nerveceller dyrket o n 50% gels. Som i fibroblast studier, nevrale fenotyper på statiske gels var ulik nevrale fenotyper på dynamiske gels. Nevroner dyrket på 50% gels hadde færre primær dendritter og lengre axoner enn nevroner dyrket på 100% gel. I konklusjonen, fibroblast og nevroner bildene viser at flere celletyper kan studeres på dynamiske og statiske DNA gels, forårsaker DNA gel ujevnheter utfordringer, standard morfologiske og farging teknikker er gjennomførbare, og viktigst oppførselen til cellene er avhengig av underlaget dynamikk.

Figur 3
Figur 3. Fibroblaster dyrket på statiske og dynamiske DNA gels. Representant Lysmikroskopi bilder av L929 fibroblaster dyrket på 80% (venstre panel), 80 → 100% (midtre panelet), og 100% gels (høyre panel). Scale bar er 100 mikrometer. Dette tallet har blitt endret fra 11.href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51323/51323fig3large.jpg" target = "_blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Nerveceller dyrket på DNA-gels. Representative fluorescerende bilder av ryggmargs nevroner dyrket på 100% (venstre panel), 100 → 50% (midtfelt), og 50% (høyre panel) gels. MAP2 farging indikerer dendritter (topp paneler), indikerer Tau-en farging axonene (midterste paneler), og DAPI flekker indikerer nucleus (bunnplater). Scale bar er 100 mikrometer. Dette tallet har blitt forandret fra 10. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Evnen av DNA-geler for å bløtgjøre eller stivne før og etter celleadhesjon gjør dem til en ideell modell for å studere rollen til dynamisk vev stivhet på cellefunksjon. Alle tre utførelser har vært i bruk i mekaniske og biologiske studier. Men alle tre utførelser har lignende elastisiteter ved forskjellige kryssbindings prosenter indikerer kryssbindingslengden påvirker ikke DNA-gel elastisitet (tabell 2). I motsetning til dette påvirker acrylamidkonsentrasjon elastisitet. Disse konstruksjonene kan variere i tverrbindingskinetikken siden gel bristende tendenser, eller tendensen av geler for å oppløse i media eller buffer, avtar med økende tverrbinding lengde. Men kinetisk informasjon om DNA-gels er begrenset, men vi vet ytterligere 30% av kryssbinding oppstår to dager etter L2 levering til 50% DNA gels 11. Ikke desto mindre, generering av ekspansiv og sammentrekningskrefter fra gel mykgjørende og stivne, henholdsvis, er uunngåelig og kan ikke være frikoplet18,21. 100 → 70% gels generere ca 0,5 Pa stress 21, mens 50 → 100% gels bare generere ca 0,04 Pa stress fordi mer energi er nødvendig for å danne bånd mellom de tre stands av ssDNA 18. Derfor, tolkningen av resultatene krever hensynet til stress og press generert av avstivningen og oppmykning av gels.

Tekniske utfordringer kan oppstå når du forbereder DNA gels. Den hyppigste teknisk problem er gel sprengning. Gel sprengning kan oppstå under flere stadier av DNA gel forberedelse inkludert gel hevelse, lagring og cellevekst. Gel sprengning er forårsaket av flere faktorer. Først, kan gel sprengning være et resultat av feil løsning komposisjon. Vanlige feil inkluderer utilstrekkelig oppløsning av lyofilisert ssDNA og feil pipettering av de viskøse væsker. For å unngå pipetteringsutstyr feil, heve oppvarming temperatur for å redusere gel viskositet for enklere pipettering av løsninger eller delmengde ønsket amount av SA1 SA2 og polymerisert oppløsning før det andre nitrogen boblende trinn. Dessuten kan gjentatt oppvarming av de polymeriserte løsninger delvis fordampe oppløsningen og øke løsningens viskositet. Legge noen få mikroliter TE-buffer kan bidra til å redusere viskositeten. For det andre, kan gel sprengning være et resultat av dårlig kvalitet DNA. QA / QC rapporter skal gjennomgås ofte. Hvis QA / QC rapporter er akseptable og gel sprengning vedvarer, kan HPLC renset ssDNA forbedre DNA kvalitet. Tredje, kan gel sprengning skyldes utilstrekkelig DNA annealing. Vi har redusert forekomsten av gel sprengning ved å inkludere annealing trinn og rehybridization trinnene i den opprinnelige protokollen (se trinn 1.3.6 og 2.8, 1.3.8 og 2.10, henholdsvis). Gel sprengning kan forebygges ved å forlenge annealing og avkjølingstider. Imidlertid, for å ytterligere eksponering for varme kan fordampe vannet forårsake en økning i gel løsgjøring fra glasset når geler er re-svulmet. Ved løsgjøring er overdreven for enhver annealing tid, annEaling skritt kan bli eliminert (1.3.6 og 2.8).

En annen hyppig teknisk problem oppstått er utilstrekkelig celle adhesjon. De hovne gels er mykere enn de svellet gels (tabell 2) 18 making celle adhesjon vanskelig. Videre, siden hver celletype reagerer forskjellig på vev stivhet, kan noen celletyper har dette tekniske dilemma mens andre celletyper som ikke gjør det. For å løse noen av problemene adhesjons den følge fremgangsmåten bør vurderes: (1) å bruke en høy pletterings densitet, (2) alternere ECM-proteiner konjugert til sulfo-SANPAH, (3) å modulere stivhetsparametere, (4) øke ECM protein eller sulfo-SANPAH konsentrasjon, og (5) øker inkubasjonstider. Residual toksiske midler slik som akrylamid monomer, APS, og TEMED kan også bidra til mangel på adhesjon og celledød på geler. Vi har ikke opplevd dette problemet siden omfattende vasker innlemmet i protokollen har vist tilstrekkelig, men vi anbefaler perfforme Valgfritt trinn 3.2 hvis dette problemet oppstår.

DNA-geler kan utnyttes mer effektivt å studere en rekke cellefunksjoner under dynamiske eller statiske betingelser. Vi har vist at fibroblaster og neuroner dyrket på DNA-geler påvirkes av modulasjonen av gel elastisitet. Siden celle-matrix interaksjoner er typisk tredimensjonale grensesnitt, informasjon fra tredimensjonale dynamisk matrise studier vil bidra til å produsere mer biologisk relevante data. Derfor er vi for tiden sette denne teknologien inn i en tredimensjonal stillaset. Vi har utviklet en teknikk som erstatter polyakrylamid ryggrad med en mer bioforenelig materiale, og samtidig opprettholde DNA-kryssbindingsteknologi. Denne nye stillaset vil tjene som en tredimensjonal, dynamisk modell og en vev-engineering stillaset. Dens biocompatibility vil åpne muligheter for medisinske programmer på enheten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å takke: Dr. Frank Jiang, Dr. David Lin, Dr. Bernard Yurke og Dr. Uday Chippada for deres medvirkning til å utvikle DNA gel-teknologi; Dr. Norell Hadzimichalis, Smit Shah, Kimberly Peterman, Robert Arter for sine kommentarer og endringer av dette manuskriptet; finansieringskilder inkludert New Jersey Commission on ryggmargsforskning (Grant # 07A-019-SCR1, NAL) og New Jersey Neuroscience Institute (MLP); og utgivere av Tissue Engineering, del A for tillatelse til å trykke figur 2 og 4 og biomaterialer for tillatelse til å trykke Figur 3.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ssDNA Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa)
idtdna.com		 Do not vortex ssDNA. Gentle invert the vial and/or pipette solution to mix.
PBS with calcium and magnesium Any brand.
100x Tris-EDTA buffer (TE buffer) Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)
sigmaldrich.com		 T9285
10x Tris-Borate-EDTA buffer (TBE buffer) Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) 93290 TBE is a reproductive toxin.
40% Acrylamide solution Fisher Scientific (Pittsburg, PA) BP14021 Acrylamide is a toxin.
Ammonium persulfate (APS) Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) A3678 Prepare a 2% solution in TE buffer. APS is a toxin and irratant.
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) T9281 Prepare a 20% solution in TE buffer. TEMED is flammable, a corrosive, and a toxin.
12 mm diameter round coverglass Fisher Scientific (Pittsburg, PA)
fishersci.com		 12-545-82
Norland optical adhesive 72 Norland Products (Cranbury, NJ)
norlandprod.com		 NOA72
24-well tissue culture plate Any brand.
Microcentrifuge tubes Any brand.
Sulfo-SANPAH ProteoChem or Thermo Fisher, (Rockland, IL)
proteochem.com or thermofisher.com		 C111 or 22589 Prepare a 0.315 mg/ml solution in water immediately before use. Dissolve at 37 °C and filter sterilze. It is normal to observe undisolved sulfo-SANPAH in the filter. Sulfo-SANPAH is light sensitive and, therefore, the solution should be protect from light until UV exposure.
Poly-D-Lysine (PDL) Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) P6407 Prepare a 0.2 mg/ml solution in water and filter sterilize.
Collagen Type I Affymetrix (Santa Clara, CA)
affymetrix.com		 13813 Prepare a 0.2 mg/ml solution in 0.2 N acetic acid. Solution needs to remain cold at all times to avoid polymerization. Acetic acid is a flammable, toxic, and corrosive.
22 x 60 cover glass Fisher Scientific (Pittsburg, PA) 12-544-G
Positive-displacement pipette Gilson, Inc (Middletown, WI)
gilson.com		 F148504
Heat block Fisher Scientific (Pittsburg, PA) 11-718
UV light source Place gels as close as possible to the UV light. UV light can cause skin or eye injury.
Thermometer Any brand.
Nitrogen gas GTS-Welco (Flemington, NJ)
www.praxairmidatlantic.com/		 NI 5.0UH-R

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Balaban, N. Q., et al. Force and focal adhesion assembly A close relationship studied using elastic micropatterned substrates. Nat Cell Biol. 3 (5), 466-472 (2001).
  2. Peppas Brannon-Peppas, L., Peppas, N. A. Dynamic and equilibrium swelling behaviour of ph-sensitive hydrogels containing 2-hydroxyethyl methacrylate. Biomaterials. 11 (9), 635-644 (1990).
  3. Charati, M. B., Ifkovits, J. L., Burdick, J. A., Linhardt, J. G., Kiick, K. L. Hydrophilic elastomeric biomaterials based on resilin-like polypeptides. Soft Matter. 5 (18), 3412-3416 (2009).
  4. Davis, K. A., Burke, K. A., Mather, P. T., Henderson, J. H. Dynamic cell behavior on shape memory polymer substrates. Biomaterials. 32 (9), 2285-2293 (2011).
  5. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophys J. 76 (4), 2307-2316 (1999).
  6. Gray, D. S., Tien, J., Chen, C. S. Repositioning of cells by mechanotaxis on surfaces with micropatterned youngs modulus. J Biomed Mater Res A. 66 (3), 605-614 (2003).
  7. Homma, M., Seida, Y., Nakano, Y. Effect of ions on the dynamic behavior of an electrodriven ionic polymer hydrogel membrane. Journal of applied Polymer Science. 82 (1), 76-80 (2001).
  8. Horkay, F., Tasaki, I., Basser, P. J. Osmotic swelling of polyacrylate hydrogels in physiological salt solutions. Biomacromolecules. 1 (1), 84-90 (2000).
  9. Jiang, F. X., Yurke, B., Firestein, B. L., Langrana, N. A. Neurite outgrowth on a DNA crosslinked hydrogel with tunable stiffnesses. Ann Biomed Eng. 36 (9), 1565-1579 (2008).
  10. Jiang, F. X., Yurke, B., Schloss, R. S., Firestein, B. L., Langrana, N. A. Effect of dynamic stiffness of the substrates on neurite outgrowth by using a DNA-crosslinked hydrogel. Tissue Engineering Part A. 16 (6), 1873-1889 (2010).
  11. Jiang, F. X., Yurke, B., Schloss, R. S., Firestein, B. L., Langrana, N. A. The relationship between fibroblast growth and the dynamic stiffnesses of a DNA crosslinked hydrogel. Biomaterials. 31 (6), 1199-1212 (2010).
  12. Kloxin, A. M., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Synthesis of photodegradable hydrogels as dynamically tunable cell culture platforms. Nat Protoc. 5 (12), 1867-1887 (2010).
  13. Lin, D. C., Yurke, B., Langrana, N. A. Mechanical properties of a reversible, DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogel. J Biomech Eng. 126 (1), 104-110 (2004).
  14. Lin, D. C., Yurke, B., Langrana, N. A. Use of rigid spherical inclusions in young's moduli determination: Application to DNA-crosslinked gels. J Biomech Eng. 127 (4), 571-579 (2005).
  15. Luo, Y., Shoichet, M. S. Light-activated immobilization of biomolecules to agarose hydrogels for controlled cellular response. Biomacromolecules. 5 (6), 2315-2323 (2004).
  16. Marklein, R. A., Burdick, J. A. Spatially controlled hydrogel mechanics to modulate stem cell interactions. Soft Matter. 6 (1), 136-143 (2010).
  17. Pelham Jr, R. J., Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13661-13665 (1997).
  18. Previtera, M. L., Chippada, U., Schloss, R. S., Yurke, B., Langrana, N. A. Mechanical properties of DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogels with increasing crosslinker density. BioResearch Open Access. 1 (5), 256-259 (2012).
  19. Previtera, M. L., Langhammer, C. G., Firestein, B. L. Effects of substrate stiffness and cell density on primary hippocampal cultures. J Biosci Bioeng. 110 (4), 459-470 (2010).
  20. Previtera, M. L., Langhammer, C. G., Langrana, N. A., Firestein, B. L. Regulation of dendrite arborization by substrate stiffness is mediated by glutamate receptors. Ann Biomed Eng. 38 (12), 3733-3743 (2010).
  21. Previtera, M. L., Trout, K. L., Verma, D., Chippada, U., Schloss, R. S., Langrana, N. A. Fibroblast morphology on dynamic softening of hydrogels. Ann Biomed Eng. 40 (5), 1061-1072 (2012).
  22. Saxena, T., Gilbert, J., Stelzner, D., Hasenwinkel, J. Mechanical characterization of the injured spinal cord after lateral spinal hemisection injury in the rat. J Neurotrauma. 29 (9), 1747-1757 (2012).
  23. Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. Neurite growth in 3d collagen gels with gradients of mechanical properties. Biotechnol Bioeng. 102 (2), 632-643 (2009).
  24. Wozniak, M. A., Chen, C. S. Mechanotransduction in development A growing role for contractility. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (1), 34-43 (2009).
  25. Wuerfel, J., et al. Mr-elastography reveals degradation of tissue integrity in multiple sclerosis. Neuroimage. 49 (3), 2520-2525 (2012).
  26. Zaari, N., Rajagopalan, P., Kim, S. K., Engler, A. J., Wong, J. Y. Photopolymerization in microfluidic gradient generators Microscale control of substrate compliance to manipulate cell response. Adv Mater. 16 (23-24), 2133-2137 (2004).

Tags

Bioteknologi bioteknologi (generelt) elastisk viskoelastisk bis-akrylamid substrat stivhet dynamisk statisk nervecellen fibroblast compliance ECM mechanobiology fleksibel
Fremstilling av DNA-kryssbundet polyakrylamid Hydrogeler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Previtera, M. L., Langrana, N. A.… More

Previtera, M. L., Langrana, N. A. Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels. J. Vis. Exp. (90), e51323, doi:10.3791/51323 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter