Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

البروتين البروتين التفاعلات تصور من قبل ثنائي الجزيء الإسفار التكملة في Protoplasts التبغ وأوراق

Published: March 9, 2014 doi: 10.3791/51327
Automatic Translation
1, 1
1Department Biologie I, Botanik, Ludwig-Maximilians-Universität, München

Summary

تشكيل مجمعات البروتين في الجسم الحي يمكن تصور من قبل ثنائي الجزيء تكامل مضان. وتنصهر شركاء التفاعل إلى أجزاء مكملة من العلامات الفلورية وأعرب عابر في أوراق التبغ، مما أدى إلى إعادة تشكيل إشارة الفلورسنت على مقربة من البروتينات اثنين.

Abstract

العديد من البروتينات تتفاعل مع بروتينات أخرى عابر أو يتم دمجها في المجمعات متعددة البروتين لأداء الوظيفة البيولوجية الخاصة بهم. تكامل مضان ثنائي الجزيء (BiFC) هو أسلوب في الجسم الحي لرصد هذه التفاعلات في الخلايا النباتية. في بروتوكول المعروضة وتنصهر البروتينات مرشح التحقيق إلى نصفين التكميلية من البروتينات الفلورية وقدم يبني منها في الخلايا النباتية عن طريق التحول بوساطة الأجرعية. بعد ذلك، يتم التعبير عن البروتينات عابر في أوراق التبغ، ويمكن أن يتم الكشف عن إشارات الفلورسنت استعادة مع متحد البؤر المجهر المسح الضوئي ليزر في خلايا سليمة. وهذا يسمح التصور ليس فقط من التفاعل في حد ذاته، ولكن أيضا توطين التحت خلوية من المجمعات البروتين يمكن تحديده. لهذا الغرض، تحتوي على جينات علامة علامة فلوري يمكن coexpressed جنبا إلى جنب مع ثوابت BiFC، وبالتالي تصور الهياكل الخلوية مثل رانه هيولي باطني شبكية، الميتوكوندريا، جهاز جولجي أو غشاء البلازما. يمكن رصد إشارة الفلورسنت إما مباشرة في خلايا البشرة ورقة أو في protoplasts واحد، والتي يمكن عزلها من أوراق التبغ تحول. هي مناسبة بشكل مثالي لدراسة BiFC البروتين البروتين التفاعلات في بيئاتها الطبيعية داخل الخلية الحية. ومع ذلك، فإنه لابد من النظر إلى أن التعبير يجب أن تكون مدفوعة من قبل المروجين قوية والتي يتم تعديلها الشركاء التفاعل بسبب الانصهار من علامات مضان كبيرة نسبيا، والتي قد تتداخل مع آلية التفاعل. ومع ذلك، BiFC هو نهج تكميلية ممتازة لتطبيق أساليب أخرى عادة التحقيق البروتين البروتين التفاعلات، مثل coimmunoprecipitation، في المختبر فحوصات المنسدلة أو التجارب الخميرة اثنين والهجين.

Introduction

دراسة تشكيل مجمعات البروتين والتعريب في الخلايا النباتية في الجسم الحي لا بد من التحقيق في الشبكات الخلوية، مما يشير إلى والعمليات الأيضية. BiFC يسمح التصور من البروتين البروتين التفاعلات في البيئة الطبيعية مباشرة داخل الخلية النباتية الحية 1-5.

في BiFC الاقتراب من تكامل اثنين من شظايا وN-C-محطة nonfluorescent من الرصاص بروتين فلوري إلى بروتين فلوري المعاد. وقد استخدمت أجزاء من العديد من البروتينات الفلورية مختلفة للكشف عن تفاعلات البروتين، مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP) وحامل اللون من الذي يتكون كيميائيا من قبل ثلاثة بقايا متميزة 6. يمكن النصف البروتينات الفلورية ضمن حلقة أو حبلا ß أن ينتج في اثنين من شظايا nonfluorescent التي يمكن تنصهر إلى كل من البروتينات في المصالح. الفحص يمكن استخدامها للكشف عن التفاعلات في أي compartme التحت خلويةNT في أي كائن حي ينمو هوائيا أو الخلايا التي يمكن تعديلها وراثيا في التعبير عن البروتينات الانصهار. إذا كانت البروتينات اثنين حيز مقربة داخل الخلية، وأعيد مضان ويمكن رصدها بواسطة المجهر بدون إضافة fluorophores الخارجية أو الأصباغ 3.

وقد ثبت التبغ (نيكوتيانا benthamiana) ليكون نموذج كائن مريحة لتصور تفاعل البروتينات النباتية، منذ البروتينات يمكن بسهولة أن أعرب عن طريق استخدام بوساطة الأجرعية تحول يترك التبغ مع بنيات ولدت. Agrobacteria استخدام ما يسمى البلازميد تي (الورم حمل) الترميز للأنزيمات التي تتوسط تنبيغ من الجينات في المصالح في الخلايا النباتية. BiFC ينطبق بشكل جيد للذوبان فضلا عن بروتينات الغشاء في جميع المقصورات الخلوية واستخدمت بنجاح خلال السنوات الماضية لتحديد التفاعل البروتينات في الجسم الحي وكذلك لتحليل مواقع التفاعلداخل البروتينات 7-9. على التعبير عن الجينات المدخلة، تفاعل البروتينات الفلورية يمكن تصور مباشرة في الأوراق، والتي هي مناسبة لهياكل الخلوية أكبر، مثل الشبكة الإندوبلازمية (ER)، غشاء البلازما أو البلاستيدات الخضراء. ومع ذلك، لرصد توطين في هياكل أكثر دقة، على سبيل المثال، المغلف بلاستيدات الخضراء، فإنه من المستحسن لتصور مضان في protoplasts معزولة من أوراق التبغ تحول. وهناك مجموعة من ناقلات BiFC يحتوي إما C-محطة أو علامة فلوري N-محطة لابد من استخدامها للنهج BiFC في النباتات 10. تم استخدام بروتوكول المشار إليه فيما بعد لدراسة التفاعل بين البروتين عصاري خلوي الصدمة الحرارية 90 (HSP90) مع تكرار tetratricopeptide (نظام الحماية المؤقت) التي تحتوي على البروتينات مجال الالتحام Toc64 وAtTPR7 المقيمين في المغلف الخارجي بلاستيدات الخضراء والشبكة الإندوبلازمية، على التوالي 11-13. لهذا الغرض، وتنصهر HSP90 إلى طجزء من erminal SCFP (SCFP C). كان العلامة N-عضال تنصهر إلى كوصي لضمان سهولة الوصول للMEEVD عزر ملزم C-محطة من HSP90 لكبح من نوع المجالات نظام الحماية المؤقت. في موازاة ذلك، كانت تنصهر الجزء N-محطة لكوكب الزهرة (فينوس N) إلى المجالات عصاري خلوي من المجال TPR تحتوي على بروتينات الالتحام Toc64 وAtTPR7، على التوالي. كعنصر تحكم السلبية علينا استنساخ-C محطة للذوبان جزء من SCFP C فقط الذي يتواجد في العصارة الخلوية وبالتالي فهي عنصر تحكم المناسبة.

علامات الفلورسنت من البروتينات درس يجب أن تواجه نفس المقصورة الخلوية للسماح مقربة وإعادة تشكيل إشارة الفلورسنت بذلك. لتحديد توطين إشارة الفلورسنت المعاد بروتين تنصهر علامة إلى علامة فلوري مختلفة يمكن cotransformed للتدليل على توطين التحت خلوية من التفاعل. تحولت بروتين ER علامة تنصهر لmCherrry في وقت واحد فيحالة ER تقع AtTPR7 14. وتألق ذاتي الكلوروفيل بمثابة علامة بلاستيدات الخضراء في حالة Toc64. هذا ليس فقط من خلال التفاعل في الجسم الحي من Toc64 وAtTPR7، على التوالي، مع HSP90 كوصي عصاري خلوي يمكن رصدها مباشرة في أوراق التبغ ولكن يمكن أيضا أن يتم التحقيق توطين التحت خلوية من التفاعل.

BiFC يناسب كذلك اتباع نهج متكامل لأساليب أخرى دراسة التفاعلات البروتين البروتين. مقارنة coimmunoprecipitation أو في المختبر التجارب المنسدلة، على سبيل المثال، لا أجسام مضادة محددة يجب أن تكون متاحة للبروتينات من الفائدة، والبروتينات لا يجب أن يتم التعبير recombinantly في المختبر، والتي يمكن أن يكون تحديا، خاصة بالنسبة للبروتينات الغشاء. وعلاوة على ذلك، وأيضا التفاعلات عابرة يمكن رصدها باستخدام BiFC، حيث يتم القبض على البروتينات عن طريق التفاعل من علامات الفلورسنت تنصهر 15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. التحول من يبني BiFC في Agrobacteria

  1. استنساخ يبني BiFC
    1. تضخيم الجين من الفائدة من القالب المناسب باستخدام أليغنوكليوتيد] تحتوي المرافقة مواقع attB. إجراء PCR باستخدام البلمرة تصحيح التجارب المطبعية. التكيف مع طول الخطوة الصلب لمزيج التمهيدي تصميم وطول الخطوة استطالة وفقا لحجم جزء. التحقق من المنتج PCR بواسطة الاغاروز الكهربائي للهلام وتطهيره باستخدام PCR تنظيف كيت.
    2. أداء رد فعل BP مع جزء حصلت وناقلات الدخول باستخدام recombinase BP. مزج 15-150 نانوغرام من المنتج attB-PCR مع 150 نانوغرام من ناقلات الدخول، إضافة 2 ميكرولتر من recombinase BP وتملأ مع TE العازلة إلى وحدة تخزين ما مجموعه 8 ميكرولتر. احتضان رد فعل لمدة 1 ساعة على RT ووقف رد الفعل بإضافة 2 ميكرولتر K بروتين لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    3. تحويل رد فعل بأكمله إلى E. المختصة القولونية DH5α؛ الخلايا وفحص المستعمرات التي حصلت عليها مستعمرة PCR لالإدراج الصحيح للجزء الحمض النووي في ناقلات. يتم تنفيذ تسلسل الحمض النووي من البلازميدات إيجابية للتحقق من عدم وجود الطفرات.
    4. استخدام استنساخ الدخول التي حصل عليها لLR إعادة التركيب مع ناقلات الوجهة المناسبة باستخدام recombinase LR. مزج 50-150 نانوغرام من ناقلات دخول مع 150 نانوغرام من ناقلات الوجهة، إضافة 1 ميكرولتر LR recombinase وتملأ مع TE العازلة إلى وحدة تخزين ما مجموعه 5 ميكرولتر. احتضان رد فعل لمدة 1 ساعة على RT ووقف رد فعل عن طريق إضافة 1 ميكرولتر K بروتين لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    5. تحويل رد فعل كامل في خلايا الإشريكية القولونية DH5α المختصة والشاشة التي تم الحصول عليها عن طريق المستعمرات مستعمرة PCR لالإدراج الصحيح للجزء الحمض النووي في ناقلات. تسلسل الحمض النووي ليس من الضروري في هذه الخطوة.
    6. عزل الحمض النووي البلازميد مع مجموعة البلازميد البسيطة لضمان درجة عالية من النقاء.
  2. إعداد Agrobacteria المختصة كيميائيا (سلالة AGL1، ريفامبيسين والمقاومة كربنيسيلين)
    1. خط من agrobacteria من ثقافة الأسهم وتنمو لمدة 24 ساعة على 28 درجة مئوية.
    2. تطعيم 5 مل LB المتوسطة مع مستعمرة واحدة واحتضان بين عشية وضحاها في 28 درجة مئوية.
    3. تطعيم 50 مل LB المتوسطة مع 2 مل من الثقافة بين عشية وضحاها وتنمو لحوالي 4 ساعة عند 28 درجة مئوية إلى OD 600 من 1.0.
    4. الطرد المركزي الخلايا في 3،000 x ج لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية و resuspend بيليه في 1 مل تعقيمها الجليد الباردة و CaCl 2 (10 ملم). تبقي الخلايا على الجليد بعد هذه الخطوة.
    5. إعداد مأخوذة (100 ميكرولتر) من الخلايا، وتجميد فورا في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية.
  3. تحول المختصة كيميائيا Agrobacteria
    1. ذوبان الجليد قسامة واحدة من الخلايا AGL1 المختصة على الجليد. إضافة 1-2 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد إلى الخلايا. احتضان لمدة 5 دقائق على الجليد، 5 دقائق في النيتروجين السائل و 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. إضافة 600 ميكرولتر LB المتوسطة إلى الخلايا وقنازلي في 650 دورة في الدقيقة لمدة 4 ساعة عند 28 درجة مئوية.
    2. الطرد المركزي الخلايا لمدة 1 دقيقة في 8،000 XG وتجاهل طاف. resuspend وبيليه في 50 ميكرولتر من LB المتوسطة المتبقية وعلى لوحات لوحة LB التي تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة. ختم لوحات واحتضان لمدة 2 أيام في 28 درجة مئوية. المستعمرات الشاشة عن وجود البلازميد من قبل مستعمرة PCR.
    3. تطعيم مستعمرة إيجابية واحدة في 5 مل LB متوسطة تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة واحتضان عند 28 درجة مئوية خلال الليل. مزيج 500 ميكرولتر من الثقافة بين عشية وضحاها مع 500 ميكرولتر 50٪ الجلسرين تعقيمها وتجميدها في -80 درجة مئوية.
    4. تلقيح agrobacteria في LB متوسطة تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة مباشرة من المخزون الجلسرين للتحول عابرة من أوراق التبغ.

2. التحول عابرة من أوراق التبغ

  1. Agrobacteria النمو
    1. إعداد الحلول الأسهم التالية: Acetosyringone (150 ملي، ويحل في 70ETOH٪)، المخزن كما aliquots في -20 درجة مئوية. MES / KOH (0.1 M) درجة الحموضة 5.7، تخزينها في 4 درجة مئوية (تصفية العقيمة من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر لمنع نمو البكتيريا أثناء التخزين الطويل)، MgCl 2 (1 M) الأوراق المالية، وتخزينها في RT.
    2. تطعيم 10 مل LB متوسطة تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة مع 50 ميكرولتر من الجلسرين AGL1 الثقافة الأسهم التي تحتوي على البلازميد من الاهتمام في العقيمة 50 مل أنبوب واحتضان عند 28 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 24 ساعة تهتز في 190 دورة في الدقيقة حتى يتم OD 600 بين 1.0 يتم التوصل إلى -2.0.
    3. البكتيريا الطرد المركزي في 3000 x ج لمدة 15 دقيقة. resuspend الكرية في تقدم طازجة المتوسطة تسلل [MgCl 2 (10 ملم)، MES / KOH (10 ملم) ودرجة الحموضة 5.7، Acetosyringone (150 ميكرومتر)] وضبط التعليق إلى OD 600 من 1.0.
    4. احتضان الخلايا في agrobacteria شاكر النفقات العامة لمدة 2 ساعة في الظلام. ويمكن بعد ذلك أن تستخدم الخلايا للتسلل.
  2. تسلل من أوراق التبغ
    1. استخدام ثلاثةالأسبوع التبغ القديمة (نيكوتيانا benthamiana) النباتات. اختيار العديد من الأوراق القديمة للتسلل.
    2. خلط كميات متساوية من agrobacteria تحمل يبني الفائدة (3 مل لكل منهما). أخذ حقنة 5 مل بدون إبرة للتسلل. التسلل تعليق خلية بعناية في أوراق التبغ عن طريق الضغط على حقنة على الجانب السفلي من الأوراق في العديد من الأماكن.
    3. المياه والنباتات وتركهم في الظلام لمدة يومين.

3. إعداد البروتوبلازم

وقد تم تكييف إعداد البروتوبلازم من أوراق التبغ من كوب وآخرون 16 ومعدلة بشكل طفيف.

  1. إعداد العازلة
    1. إعداد F-بكن المتوسطة:-أملاح ماكرو [كنو 3 (1012 ميكروغرام / مل)، و CaCl 2 • 2H 2 O (440 ميكروغرام / مل)، MgSO 4 • 7H 2 O (370 ميكروغرام / مل)، KH 2 PO 4 ( 170 ميكروغرام / مل)، NH-4 سوسينات [(20 ملم؛ إعداد 2 M الأسهم سولution (سكسينات (236 ميكروغرام / مل) وNH 4 الكلورين (106 ميكروغرام / مل)، وضبط درجة الحموضة إلى 5.8 حل)]، الصغرى، أملاح [EDTA الحديد (III) × نا الملح (40 ميكروغرام / مل)، KJ (0.75 ميكروغرام / مل)، H 3 BO 3 (3 ميكروغرام / مل)، MnSO 4 • H 2 O (10 ميكروغرام / مل)، ZnSO 4 • 7H 2 O (2 ميكروغرام / مل)، وزارة النفط نا 2 4 • 7H 2 O (0.25 ميكروغرام / مل)، كبريتات النحاس 4 • 5H 2 O (0.025 ميكروغرام / مل)، كوكلي 2 • 6H 2 O (0.025 ميكروغرام / مل)]، MES (390 ميكروغرام / مل)، والجلوكوز (حوالي 80 ميكروغرام / مل) الأسمولية 550 الميلي أسمول، ودرجة الحموضة 5.8 (KOH). متجر في aliquots في -20 درجة مئوية.
    2. إعداد المتوسطة F-PIN: جميع المكونات كما F-بكن ولكن بدلا من استخدام الجلوكوز والسكروز (حوالي 110 ميكروغرام / مل)، الأسمولية 550 الميلي أسمول، ودرجة الحموضة 5.8 (KOH). متجر في aliquots في -20 درجة مئوية.
    3. إعداد W5 المتوسطة: 150 ملي مول كلوريد الصوديوم، 125 مم CaCl 2، 5 ملي بوكل، 2 ملي زارة التربية والعلم، الأسمولية 550-580 الميلي أسمول، ودرجة الحموضة 5.7 (KOH). تخزينها في 4 درجات؛ C (تصفية العقيمة من خلال 0.2 ميكرون فلتر لمنع نمو البكتيريا أثناء التخزين الطويل).
    4. إعداد الحل انزيم جديدة لعزل البروتوبلازم (0.1 غ سلولاز، 0.03 غ في 10 مل macerozym F-PIN). احتضان الحل عند 55 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة وبارد لRT. إضافة 100 ميكرولتر من 10٪ إلى 10 مل BSA الحل.
  2. عزل protoplasts
    1. مكان واحد ورقة تسللت إلى طبق بتري وإضافة محلول أنزيم الطازجة. استخدام razorblade جديدة لخفض ورقة في ما يقرب من 0.5 سم 2 قطعة الحجم. نقل أوراق القطع مع الحل الانزيم في قارورة فراغ فراغ تسلل والتسلل لحوالي 20 ثانية حتى تظهر فقاعات الهواء من أوراق (نشرة فراغ بعناية جدا).
    2. هز القارورة لمدة 90 دقيقة في 40 دورة في الدقيقة في الظلام.
    3. إطلاق سراح protoplasts التي تهز لمدة 1 دقيقة في 90 دورة في الدقيقة. تحديد الحل من خلال الشاش (100 ميكرومتر) إلى 15 مل أنبوب الطرد المركزي (القاع وإيابا). تراكب الحل البروتوبلازم مع 2 مل F-بكن العازلة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 70 x ج (تسارع بطيء والتباطؤ) في RT.
    4. protoplasts سليمة تتراكم في واجهة من حل الانزيم وF-بكن. تأخذ واسعة الفوهة 1 مل ماصة لنقل protoplasts سليمة في أنبوب الطرد المركزي الطازجة وتملأ مع العازلة W5. أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 100 x ج (تسارع بطيء والتباطؤ) لتكوير protoplasts.
    5. إزالة طاف بعناية باستخدام ماصة و resuspend بيليه في ما يقرب من 200 ميكرولتر العازلة W5، اعتمادا على كمية من protoplasts.
    6. دائما استخدام نصائح فوهة واسعة لمنع تمزق من protoplasts سليمة.

4. الليزر الضوئي المجهر

  1. إعداد نموذج
    1. لصق قطعتين صغيرة من تسرب حول شريحة المجهر (2 سم بعيدا). وضع 20 ميكرولتر من الحل البروتوبلازم بين شرائح ووضع بعناية غطاء زجاجيعلى القمة. شرائط تسرب تأكد من أن protoplasts لا ممرود من الزجاج غطاء.
    2. لمجموع العينات ورقة قطع 1 سم قطعة من ورقة ووضعها على شريحة المجهر مع الجانب السفلي من ورقة متجهة لأعلى. إضافة حوالي 30 ميكرولتر H 2 O، ووضع غطاء زجاجي على رأس واصلاحها بإحكام بشريط لاصق على الجانبين.
  2. إعدادات التصوير ومتحد البؤر المجهر
    1. يتم إجراء التصوير مع متحد البؤر المسح الضوئي ليزر المجهر من ايكا، النوع: TCS SP5. لاستخدام التكبير عدسة الهدف (HCX PL APO CS) بلغت قوته 63X مع الجلسرين كوسط التصوير. تعيين الفتحة العددية إلى 1.3. استخدام البرنامج لايكا التطبيق جناح / الإسفار المتقدم للتقييم (انظر التكميلي البيانات S1).
    2. تعيين ليزر أرغون إلى 30٪ وقوة الليزر على 488 نانومتر إلى 18٪ من كثافة لرصد إشارة BiFC أعيد تشكيلها في 515 نانومتر، ومجموعة واحدة PMT للكشف عن عرض النطاق الترددي الانبعاثات 495-550. لرصد الكلوروفيل تألق ذاتي تعيين كاشف PMT عرض النطاق الترددي الانبعاثات الثانية 650-705.
    3. لرصد إشارة mCherry استخدام الليزر HeNe 561، تعيين شدة الليزر 561-18٪ وعرض النطاق الترددي انبعاث كاشف PMT الثالث 587-610.
    4. تأكد من أن يتم التقاط الصور من جميع القنوات كاشف PMT مع الإعدادات كسب نفسه (يجب أن يكون بين 800-900 مكسب لاستبعاد الإشارات الخلفية).
    5. التقاط الصور في شكل عرض / ارتفاع 1024 x 1024 بكسل مع سرعة المسح الضوئي 100 هرتز.
    6. لZ-stackings استخدام مسافة أقصاها 0.5 ميكرون بين كل كومة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في هذا المثال استخدمنا طريقة BiFC لرصد التفاعل بين عصاري خلوي الجزيئية HSP90 كوصي مع غشاء بروتينات الالتحام AtTPR7 وToc64. AtTPR7 هو جزء من translocon ثانية ويتفاعل مع المحرمين عصاري خلوي، والتي ربما تقديم preproteins إفرازية لإزفاء آخر متعدية إلى غشاء ER. وبالمثل، Toc64 في المغلف الخارجي بلاستيدات الخضراء تعمل في مجال الاستيراد بعد متعدية من خلال تلقي HSP90 preproteins بلاستيدات الخضراء المرتبطة بها. تضم كلا من البروتينات عصاري خلوي يتعرض نظام الحماية المؤقت المجال الذي يتوسط التفاعل مع MEEVD عزر-C محطة من HSP90.

تم استنساخ البروتينات عن طريق recombinases محددة في ناقلات جهة مناسبة التفجير المجال TPR تحتوي على بروتينات الالتحام لفينوس N، وضمان أن يتم إرفاق علامة فلوري إلى المجال عصاري خلوي وبالتالي لا لا تعيق استهداف وغشاء الإدراج من البروتينات. في حالة HSP90، SCFP C (الشكلان 1 و 2).

تم cotransformed AtTPR7 وHSP90 مع علامة ER (mCherry) للتحقق من توطين بروتين معقد. تم رصد مضان في أوراق سليمة مع مجهر المسح الضوئي ليزر. كعنصر تحكم SCFP C وحده، والذي يقع في العصارة الخلوية (مثل HSP90)، وأعرب جنبا إلى جنب مع AtTPR7 وعلامة ER. تم فحص العديد من الأوراق لمضان وأخذت الصور مع إعدادات المجهر متطابقة. في تجربتنا ينبغي أن يكون إشارة واضحة نموذجية مع إعدادات مكاسب في 800-900، في حين أن السيطرة السلبية يجب أن يظهر فقط مضان الخلفية طفيف للغاية مع هذه الإعدادات (الشكل 3). تم رصد إشارة لإعادة تشكيل فينوس N-AtTPR7 جنبا إلى جنب مع SCFP C-515 نانومتر HSP90 في تداخل مع علامة ER. عدم وجود إشارة لفينوس في N-ويمكن ملاحظة TPR7 والسيطرة السلبية SCFP C.

في حالة Toc64 وHSP90 التعبير، فضلا عن Toc64 وSCFP C، تم عزل protoplasts من أوراق التبغ تسلل، لأنه في الصور المجهرية من كامل يترك توطين بالضبط من الصعب تحديد، على الرغم من مضان هو بالفعل مرئية (4 أرقام و 5). تم استعادة إشارة في 515 نانومتر معربا عن Toc64-N فينوس جنبا إلى جنب مع SCFP C-HSP90 في المغلف بلاستيدات الخضراء، والتي يمكن الكشف عن الهياكل خاتم على شكل البلاستيدات الخضراء المحيطة. على النحو الوارد أعلاه سيطرة تم تصويرها مع الإعدادات المجهر متطابقة ولم تظهر مضان في 515 نانومتر.

الشكل 1
شخصية1. الإجراء الاستنساخ من يبني BiFC. وتضخمت الجينات في المصالح مع أليغنوكليوتيد] يحيط بها مواقع توري B للسماح BP إعادة التركيب إلى ناقلات دخول مع مواقع P توري، وبالتالي استبدال الجين ccdB داخل النواقل. بعد ذلك تم معاد متجه دخول ناقلات مع الوجهة المناسبة باستخدام recombinase LR. تحول هذه التركيبات في أوراق التبغ يسمح التعبير عن البروتينات تنصهر إلى انقسام البروتينات الفلورية وبه للكشف عن الأجسام المضادة. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 2
الشكل 2. العرض التخطيطي للبروتينات المعبر عنها في التجارب BiFC. فينوس N هوإلى جانب إلى الأجزاء عصاري خلوي من Toc64 أو AtTPR7 المقيمين في بلاستيدات الخضراء وER، على التوالي. HSP90 هو N-عضال تنصهر لSCFP C، مما يتيح التفاعل من المجالات من نظام الحماية المؤقت Toc64 وAtTPR7 مع HSP90 محطة سي. وأعرب عن SCFP C وحدها في العصارة الخلوية كمجموعة تحكم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3
الرقم 3. BiFC مع AtTPR7 وHSP90 تصور في خلايا نبات التبغ البشرة. تم cotransformed فينوس N-AtTPR7 وSCFP C-HSP90 مع علامة ER mCherry (لوحة المتوسطة)، وأعرب عن عابر في أوراق التبغ. كما cotransformed عنصر تحكم فينوس N-AtTPR7 مع SCFP الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الشكل 4. BiFC مع Toc64 وHSP90 تصور في خلايا نبات التبغ البشرة. وأعرب عن Toc64-N فينوس وSCFP C-HSP90 عابر في أوراق التبغ. كعنصر تحكم وcotransformed Toc64-N مع فينوس SCFP C وحده (لوحات أسفل). تم رصد مضان أعيد تشكيلها في 515 نانومتر (اللوحة اليسرى). تراكب من سيجنال في 515 نانومتر وتألق ذاتي الكلوروفيل هو مبين (اللوحة اليمنى). ويتم رصد الكلوروفيل تألق ذاتي في 480 نانومتر. أشرطة النطاق: 10 ميكرون الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5. BiFC مع Toc64 وHSP90 تصور في protoplasts التبغ. وأعرب عن Toc64-N فينوس وSCFP C-HSP90 عابر في أوراق التبغ. كعنصر تحكم وcotransformed Toc64-N مع فينوس SCFP C وحده (لوحات أسفل). تم رصد مضان أعيد تشكيلها في 515 نانومتر (اللوحة اليسرى) في protoplasts معزولة. يظهر تراكب للإشارة في 515 نانومتر وتألق ذاتي الكلوروفيل (اللوحة اليمنى). ويتم رصد الكلوروفيل تألق ذاتي في 480 نانومتر. أشرطة النطاق: 10 ميكرون الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

عند التخطيط لتجربة BiFC ينبغي النظر في عدة نقاط. على الرغم من أن ليس لديه معلومات حول هيكلية البروتينات ذات الاهتمام المطلوب، طوبولوجيا أن يكون معروفا عند العمل مع غشاء تمتد البروتينات. البروتينات الفلورية يجب أن تتواجد في نفس المكان التحت خلوية أو مواجهة نفس الجانب من غشاء للسماح التفاعل. وبطبيعة الحال، عند تحليل البروتينات التي تتطلب تسلسل استهداف N-محطة، ويمكن اعتبار فقط علامة-C المحطة. لأنه من الممكن أن العلامة يتداخل مع الاستهداف السليم أو غشاء الإدراج من البروتين من الفائدة فإنه من المستحسن لاختبار توطين التحت خلوية من قبل، على سبيل المثال، من خلال التعبير عن بروتين GFP الموسومة. علاوة على ذلك، ينبغي دائما أن تضمن السيطرة السلبية. في هذا المثال ولدت لدينا بناء معربا فقط SCFP C في العصارة الخلوية. ومع ذلك، أي البروتين الذي من غير المتوقع أن تتفاعل يمكن استخدامها كعنصر تحكم السلبية. للتحقق من التعبير السليم سو يمكن التحقق من التركيبات، وخصوصا إذا لم يكن هناك مضان مرئيا، مقتطفات من البروتين من أوراق تسلل أو protoplasts يمكن أن يتعرضوا لSDS-PAGE والبروتين التعبير مع الأجسام المضادة الموجهة ضد علامات منها.

يمكن رصد إشارات فلوري إما في أوراق سليمة أو protoplasts معزولة. على الرغم من الكشف في أوراق بأكمله هو أسرع، وتصور هياكل إشارات أكثر دقة أفضل في protoplasts. علاوة على ذلك، يتم رصد خلايا البشرة في الغالب عند النظر في ورقة بأكملها، والتي لا تحتوي على البلاستيدات الخضراء. لذلك، عند تحليل البروتينات بلاستيدات الخضراء، عزل protoplasts من المستحسن.

والميزة الرئيسية لهذه التقنية هو إمكانية لمراقبة التفاعلات البروتين البروتين في الخلايا النباتية الحية. ليست هناك حاجة لكسر الخلايا وإلى ذوبان مجمعات البروتين غشاء، كما هو الحال على سبيل المثال في التجارب coimmunoprecipitation. وعلاوة على ذلك، فإن تطبيق بسيطمنذ المواد الوحيدة المطلوبة هي ناقلات، وagrobacteria المجهر مضان القياسية (على الرغم من أن تتحقق صور ذات جودة أعلى مع المجهر متحد البؤر المسح الضوئي ليزر). وعلى النقيض من في المختبر فحوصات المنسدلة مع البروتينات المؤتلف، والتي تسمح الكشف عن التفاعل فقط إذا كان كلا البروتينات والتفاعل مباشرة، BiFC يمكن أيضا الكشف عن البروتين المجمعات التي تتطلب والبروتينات الذاتية إضافية موجودة في الخلية. ومع ذلك، وهذا يعني أيضا أن BiFC لا يقدم أي إثبات للتفاعل المباشر البروتين البروتين، والذي لديه دائما ليتم التحقق منها بواسطة تقنيات أخرى. علاوة على ذلك، نظرا لمن overexpression من قبل المروجين قوية التفاعلات غير محددة قد تحدث، والتي يجب أن تستبعد عن طريق فرض ضوابط السلبية المناسبة. تحقيقا لهذه الغاية بروتين لا يتوقع أن تتفاعل مع بروتين من الفائدة، ولكن يقيم في نفس المكان، أو يبني تفتقر ينبغي أن تستخدم المجالات التفاعل البروتين البروتين. بالإضافة إلى ذلك، سلسلة تخفيف من القرص المضغوط فريسةNA مع كدنا] noninteracting وكذلك مراقبة مضان بطريقة تعتمد وقت بعد التحول يمكن أن تساعد على التحقق من صحة النتائج. لضمان تمييز من إشارات الفلورسنت صحيح والتحف ينبغي قياس الإشارات BiFC ووضع في علاقة إلى أخرى البروتين الفلوري أعرب، على سبيل المثال البروتين علامة 7،8. عيب آخر من طريقة BiFC هو أن التفاعلات بين البروتينات ويمكن أيضا عرقلة من قبل sterically به نيون كبيرة نسبيا.

تطبيق التحول بوساطة الأجرعية في النباتات الأخرى (على سبيل المثال، نبات الأرابيدوبسيس) محدودة، ومع ذلك، فمن الممكن لتحويل الحمض النووي البلازميد مباشرة إما إلى protoplasts نبات الأرابيدوبسيس معزولة أو لتحويل الخلايا باستخدام بندقية الجسيمات. ومع ذلك، البلازميد الحمض النووي يجب أن تكون معزولة باستخدام كيت MAXI، لأنه ينبغي أن تتركز عالية ونقية قدر الإمكان للتحول البروتوبلازم. مشكلة أخرى نحن OBServed بسبب التعبير عالية من البروتينات الهدف كان تجميع غير محددة في العصارة الخلوية، وخاصة عند العمل مع بروتينات غشاء الميتوكوندريا. ويمكن التغلب على هذه المشكلة عن طريق التحول biolistic خلايا البصل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

نود أن نشكر يورغن سول لإجراء مناقشات مفيدة وكريس كاري لقراءة نقدية للمخطوطة. وقد تم تمويل هذا المشروع من قبل وDFG فون دير chemischen اندستري (أرقام المنح SFB 1035 A04 مشروع لSS وهل 187/22 إلى RS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3',5'-Dimethoxy-4'-hydroxyacetophenone Sigma-Aldrich D134406 Acetosyringone
Cellulase, Onozuka-R10 Serva 16419 from Trichoderma viridae
Macerozyme R-10  Serva 28302 from Rhizopus sp.
GATEWAY, BP Clonase II, Enzyme Kit Invitrogen 11789-(020)
GATEWAY, LR Clonase II, Enzyme Kit Invitrogen 11791-(020)
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit Macherey-Nagel 740609-250
pDEST-GWVYNE Invitrogen Gateway-cloning
pDEST-VYNE(R)GW Invitrogen Gateway-cloning
pDEST-SCYCE(R)GW Invitrogen Gateway-cloning

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Citovsky, V., et al. Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta. J. Mol. Biol. 362, 1120-1131 (2006).
  2. Schutze, K., Harter, K., Chaban, C. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells. Methods Mol. Biol. 479, 189-202 (2009).
  3. Weinthal, D., Tzfira, T. Imaging protein-protein interactions in plant cells by bimolecular fluorescence complementation assay. Trends Plant Sci. 14, 59-63 (2009).
  4. Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. The analysis of protein-protein interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation. Plant Physiol. 145, 1090-1099 (2007).
  5. Ohad, N., Yalovsky, S. Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants. Methods Mol. Biol. 655, 347-358 (2010).
  6. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
  7. Lee, L. Y., et al. Screening a cDNA library for protein-protein interactions directly in planta. Plant Cell. 24, 1746-1759 (2012).
  8. McFarlane, H. E., Shin, J. J., Bird, D. A., Samuels, A. L. Arabidopsis ABCG transporters, which are required for export of diverse cuticular lipids, dimerize in different combinations. Plant Cell. 22, 3066-3075 (2010).
  9. Dunschede, B., Bals, T., Funke, S., Schunemann, D. Interaction studies between the chloroplast signal recognition particle subunit cpSRP43 and the full-length translocase Alb3 reveal a membrane-embedded binding region in Alb3 protein. J. Biol. Chem. 286, 35187-35195 (2011).
  10. Gehl, C., Waadt, R., Kudla, J., Mendel, R. R., Hansch, R. New GATEWAY vectors for high throughput analyses of protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation. Mol. Plant. 2, 1051-1058 (2009).
  11. Qbadou, S., et al. The molecular chaperone Hsp90 delivers precursor proteins to the chloroplast import receptor Toc64. EMBO J. 25, 1836-1847 (2006).
  12. Schweiger, R., Muller, N. C., Schmitt, M. J., Soll, J., Schwenkert, S. AtTPR7 is a chaperone docking protein of the Sec translocon in Arabidopsis. J. Cell Sci. , (2012).
  13. Schweiger, R., S, S. AtTPR7 as part of the Arabidopsis Sec post-translocon. Plant Signal Behav. 8, (2013).
  14. Nelson, B. K., Cai, X., Nebenfuhr, A. A multicolored set of in vivo organelle markers for co-localization studies in Arabidopsis and other plants. Plant J. 51, 1126-1136 (2007).
  15. Kerppola, T. K. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis as a probe of protein interactions in living cells. Annu. Rev. Biophys. 37, 465-487 (2008).
  16. Koop, H. U., et al. Integration of foreign sequences into the tobacco plastome via polyethylene glycol-mediated protoplast transformation. Planta. 199, 193-201 (1996).

Tags

علم الأحياء النباتية، العدد 85، Tetratricopeptide تكرار المجال كوصي، البلاستيدات الخضراء، الشبكة الإندوبلازمية، HSP90، معقدة توك، translocon ثانية، BiFC
البروتين البروتين التفاعلات تصور من قبل ثنائي الجزيء الإسفار التكملة في Protoplasts التبغ وأوراق
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schweiger, R., Schwenkert, S.… More

Schweiger, R., Schwenkert, S. Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves. J. Vis. Exp. (85), e51327, doi:10.3791/51327 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter