Summary
생체 내에서 단백질 복합체의 형성은 이분자 형광 보완하여 시각하실 수 있습니다. 상호 작용 파트너는 형광 태그의 보완적인 부분에 융합 일시적으로 담배 잎으로 표현, 두 단백질의 근접에 따라 재구성 형광 신호의 결과로되어있다.
Abstract
많은 단백질은 다른 단백질과 상호 작용을 일시적으로 또는 생물학적 기능을 수행하기 위해 다중 단백질 복합체에 통합되어 있습니다. 이분자 형광 보완 (BiFC)는 식물 세포에서 이러한 상호 작용을 모니터링 할 수있는 생체 내 방법입니다. 제시된 프로토콜 추궁 후보 단백질이 형광 단백질의 상보 반쪽에 융합되고, 각 구조물은 아그로 박테 리움 - 매개 형질 전환을 통해 식물 세포 내로 도입된다. 이어서, 단백질은 일시적으로 담배 잎에서 발현되고 복원 된 형광 신호는 그대로 셀의 공 초점 레이저 주사 현미경으로 검출 할 수있다. 이것은 상호 작용 자체뿐만 아니라 시각화를 허용하지만, 또한 단백질 복합체의 세포 내 지역화는 결정될 수있다. 이를 위해, 형광 태그를 함유하는 표지 유전자는 이와 같은 t 셀룰러 구조를 시각화 BiFC 구조와 함께 공 발현 될 수있다그는 세망, 미토콘드리아, 골지체 또는 원형질막을 세포질. 형광 신호를 직접 표피 잎 세포 또는 쉽게 변형 담배 잎으로부터 단리 할 수있다 단일 원형질체에서 모니터링 할 수있다. BiFC 이상적으로 살아있는 세포 내에서 자연 환경에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하기에 적합합니다. 그러나, 식 강한 프로모터에 의해 구동되어야하고 상호 작용 파트너 인해 상호 작용 메카니즘을 방해 할 수있는 비교적 큰 형광 태그의 융합으로 변성되어 있음을 고려하여야한다. 그럼에도 불구하고, BiFC는 coimmunoprecipitation 같은 단백질 - 단백질 상호 작용, 생체 풀다운 분석 또는 효모 두 하이브리드 실험을 조사하고 다른 일반적으로 적용되는 방법에 대한 훌륭한 보완적인 접근 방식입니다.
Introduction
단백질 복합체의 형성을 공부하고 생체 내에서 식물 세포에서의 현지화는 셀룰러 네트워크를 조사하는 것이 필수적입니다, 신호 및 신진 대사 과정. BiFC 직접 살아있는 식물 세포 1-5 내에서의 자연 환경에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 시각화 할 수 있습니다.
BiFC에서 재구성 형광 단백질에 형광 단백질 리드의 두 비 형광 N-및 C-말단 조각의 보완에 접근. 많은 다른 형광 단백질의 단편은 녹색 형광 단백질 (GFP) 화학적 세 가지 잔기 (6)에 의해 형성되어있는 발색단 예 : 단백질 상호 작용을 검출하기 위해 사용되어왔다. 형광 단백질은 관심의 두 단백질에 융합 될 수있는 두 개의 비 형광 조각 될 수있는 루프 또는 ß-가닥 내 반감 될 수있다. 분석은 어떤 세포 내 compartme에 상호 작용을 검출하는데 사용될 수있다유전자 융합 단백질을 표현하기 위해 수정 될 수있는 기적으로 성장하는 유기체 또는 세포 NT. 이 단백질은 세포 내에서 근접에 오면, 형광 재구성되고 외인성 또는 형광 염료 (3)의 추가없이 현미경에 의해 모니터링 될 수있다.
단백질은 쉽게 담배 생성 구문 남긴다의 아그로 박테 리움 - 매개 형질 전환을 이용하여 표현 될 수 있기 때문에, 담배 (는 담배 benthamiana)는, 식물성 단백질의 상호 작용을 시각화하기 편리한 모델 생물로 입증되었다. 아그로 박테리아는 식물 세포로 그 유전자의 전달을 매개하는 효소를 코딩하는 소위의 Ti 플라스미드 (종양 유도)를 사용한다. BiFC는 가용성뿐만 아니라 모든 세포 구획 내에서 막 단백질 잘 적용하고 성공적으로 생체 내에서 단백질 상호 작용을 식별 할뿐만 아니라 상호 작용 사이트를 분석하기 위해 지난 몇 년 동안 사용되었습니다7-9 단백질 내. 도입 된 유전자의 발현시에, 형광 단백질의 상호 작용은 소포체 (ER), 세포막 또는 엽록체 같은 큰 셀룰러 구조 위해 적당한, 나뭇잎에 직접 시각화 될 수있다. 그러나,보다 세련된 구조에서 지역화을 모니터링, 예를 들어, 엽록체 봉투, 그것은 변형 담배 잎에서 분리 된 원형질체에서 형광을 시각화하는 것이 바람직하다. C-말단 또는 N-말단 형광 태그 식물 10 BiFC 접근을 위해 사용되어야하는 하나를 함유 BiFC 벡터들의 집합. 이하 설명 프로토콜은 tetratricopeptide 반복 도킹 단백질 Toc64 및 AtTPR7는 엽록체 외부 봉투와 각각 소포체, 11-13에 거주를 포함 (TPR) 도메인과 세포질 열 충격 단백질 90 (HSP90)의 상호 작용을 연구하는 데 사용되었다. 이를 위해, HSP90은 캐럿에 융합시켰다SCFP (SCFP C)의 erminal 부분. 태그는 N-말단 TPR 도메인 형 클램프 HSP90의 C-말단 MEEVD 결합 모티프의 접근성을 보장하기 위해 보호자에 융합했다. 병행 금성 (비너스 N)의 N-말단 부분은 도킹 단백질 각각 Toc64 및 AtTPR7을 함유 TPR 도메인의 세포질 도메인에 융합시켰다. 음성 대조군으로 우리는 세포질에 존재하고, 따라서 적절한 컨트롤입니다 전적으로 SCFP C의 수용성 C-말단 부분을 복제.
연구 단백질의 형광 태그는 근접시켜 형광 신호의 재구성을 할 수 있도록 동일한 세포 구획을 직시해야합니다. 다른 형광 태그에 융합 마커 단백질이 상호 작용의 세포 내 현지화를 보여 cotransformed 할 수있는 재구성 된 형광 신호의 지역화를 결정합니다. mCherrry에 융합 ER 마커 단백질에 동시에 형질 전환AtTPR7 14에 위치한 ER 경우. 엽록소의 형광도는 Toc64의 경우에는 엽록체 마커로 봉사했다. 이것에 의해뿐만 아니라 세포질 HSP90의 보호자와 각각 Toc64 및 AtTPR7,,의 생체 상호 작용은 담배 잎에 직접 모니터링 할 수 있습니다뿐만 아니라 상호 작용의 세포 내 현지화를 조사 할 수 있습니다.
BiFC 잘 단백질 - 단백질 상호 작용을 공부하는 다른 방법에 대한 보완 방법으로 적합합니다. coimmunoprecipitation에 또는 시험 관내 풀다운 실험에 비교하여, 예를 들면, 특정의 항체는 관심의 단백질에 해당 될 필요없고, 단백질은 특히 막 단백질에 대한 도전 일 수있는 재조합 적으로 시험 관내에서 발현 될 필요가 없다. 단백질 융합 형광 태그 (15)의 상호 작용에 의해 포착되기 때문에 더욱, 또한 과도 상호 작용은 BiFC을 사용하여 모니터링 할 수있다.
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Protocol
1. BiFC의 변환은 아그로 박테리아에 구축
- BiFC 구조의 클로닝
- 측면에서는 attB - 사이트를 포함하는 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 적절한 템플릿에서 관심의 유전자를 증폭. 교정 중합 효소를 사용하여 PCR을 수행합니다. 설계된 프라이머 조합 어닐링 단계의 길이와 단편 크기에 따른 연신 공정의 길이를 적응시킨다. 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 PCR 생성물을 확인 PCR 클린 - 업 키트를 사용하여 정제.
- 얻어진 단편 BP 반응과 BP의 재조합 효소를 사용하여 입력 벡터를 수행합니다. 항목 벡터의 150 NG와 attB-PCR 제품의 15-150 NG를 혼합, BP의 재조합 효소의 2 μl를 추가하고 8 μL의 총 부피에 TE 버퍼와 입력합니다. 실온에서 1 시간 동안 반응을 품어 37 ℃에서 10 분 동안 2 μL 테 K를 추가하여 반응을 중지
- 관할 E.으로 전체 반응을 변환 대장균 DH5α, 세포와 벡터에 DNA 단편의 해당 위치에 식민지 PCR에 의해 얻어진 식민지 화면. 양의 플라스미드 DNA 서열은 돌연변이의 부재를 확인하기 위해 수행된다.
- LR의 재조합 효소를 사용하여 해당 대상 벡터와 LR 재결합을 위해 얻어진 항목 복제를 사용합니다. 대상 벡터의 150 NG와 입력 벡터의 50 ~ 150 NG를 혼합, 1 μL의 LR의 재조합 효소를 추가하고 5 μL의 총 부피에 TE 버퍼와 입력합니다. 실온에서 1 시간 동안 반응을 품어 37 ℃에서 10 분 동안 1 μL 테 K를 추가하여 반응을 중지
- 벡터에 DNA 단편의 해당 위치에 식민지 PCR에 의해 식민지를 획득 능력 대장균 DH5α 세포와 화면에 전체 반응을 변환 할 수 있습니다. DNA의 염기 서열이 단계에서 필요하지 않습니다.
- 높은 순도를 보장하기 위해 플라스미드 미니 키트 플라스미드 DNA를 분리.
- 화학적 능력 아그로 박테리아 (준비변형 AGL1, 리팜피신 및 실린 저항)
- 행진 중 주식 문화에서 아그로 박테리아 및 28 ℃에서 24 시간 동안 성장
- 하나의 식민지로 5 ㎖ LB 배지에 접종하고 28 ℃에서 하룻밤 배양
- 접종 50 2 하룻밤 문화 ㎖의 OD 1.0 600 28 ° C에서 약 4 시간 동안 성장과 ml의 LB 배지.
- 4 ° C에서 15 분 동안 3,000 XG에서 세포를 원심 분리기와 얼음처럼 차가운 염화칼슘 (10 ㎜) 멸균 된 1 ㎖에 펠렛을 재현 탁. 이 단계 후 얼음에 세포를 보관하십시오.
- -80 ° C에서 액체 질소와 저장소에 즉시 동결 세포의 분취 량 (100 μL)를 준비
- 화학적 능력 아그로 박테리아의 변환
- 얼음에 유능한 AGL1 세포의 하나 나누어지는 해동. 세포에 플라스미드 DNA의 1-2 μg을 추가합니다. 얼음에 5 분, 37 ℃에서 액체 질소와 5 분에서 5 분 알을 품다 세포와의 600 μL LB 매체를 추가28 ℃에서 4 시간 동안 650 rpm에서 메르 루사
- 8,000 XG에서 1 분 동안 세포를 원심 분리기 및 뜨는 폐기하십시오. 적절한 항생제를 포함하는 LB 플레이트 상에, 나머지 LB 배지 플레이트 50 μL에 펠렛을 재현 탁. 플레이트를 밀봉하고 28 ℃에서 2 일 동안 배양 식민지 PCR에 의한 플라스미드의 존재를위한 스크린 식민지.
- 적절한 항생제를 포함하는 5 ㎖ LB 배지에서 하나의 긍정적 인 식민지의 예방과 밤 동안 28 ° C에서 알을 품다. 500 ㎕의 50 % 살균 글리세롤 하룻밤 문화의 500 μl를 혼합하여 -80 ℃에서 동결
- 담배 잎의 일시적인 변화를위한 글리세롤 주식에서 직접 적절한 항생제를 포함하는 LB 배지에서 아그로 박테리아를 접종한다.
2. 담배 잎의 과도 변환
- 아그로 박테리아 성장
- 다음 주식 솔루션을 준비 : 아세토 시린 곤 (150 MM은 70에서 용해-20 ° C에서 분주 % 정도의 EtOH), 저장 MES / KOH (0.1 M)의 pH 5.7, 4 ° C (이상 보관시 세균의 증식을 방지하기 위해 0.2 μm의 필터를 통해 살균 필터)에서 저장, MgCl2를 (1 M) 주식, 실온에서 저장.
- 멸균 50 ML 튜브에 대한 관심의 플라스미드를 포함하는 AGL1 글리세롤 주식 문화의 50 μL와 적절한 항생제를 포함하는 10 ㎖의 LB 배지에 접종하고 적어도 24 시간이 1.0 사이의 OD 600까지 190 rpm으로 흔들어 28 ° C에서 알을 품다 -2.0가 도달한다.
- 원심 분리기 박테리아 15 분 3,000 XG에. 갓 침투 매체에서 펠렛 [MgCl2를 (10 ㎜), MES / KOH (10 ㎜)의 pH 5.7, 아세토 시린 곤 (150 μM)]을 재현 탁하고 OD 1.0 600 서스펜션을 조정합니다.
- 어둠 속에서 2 시간 동안 오버 헤드 통에 아그로 박테리아 세포를 품어. 세포는 침투를 위해 사용될 수있다.
- 담배 잎의 침투
- 세 가지를 사용주 이전 담배 (는 담배 benthamiana) 식물. 침투에 대한 몇 가지 오래된 잎을 선택합니다.
- 관심의 구조 (3 ml의 각을) 들고 아그로 박테리아의 동일한 볼륨을 섞는다. 침투를위한 바늘없이 5 ML의 주사기를 가져 가라. 여러 위치에서 잎의 밑면에 주사기를 눌러 잎담배에 신중 세포 현탁액을 침투.
- 식물을 물과 이틀 동안 어둠 속에서 그들을두고.
3. 원형질체 준비
담배 잎의 원형질체 준비는 쿠프 등. 16에서 적응 약간 수정되었습니다.
- 버퍼 준비
- F-PCN 매체를 준비 매크로 염 [3 (1012 ㎍ / ㎖) KNO, 염화칼슘 2 • 2H 2 O (440 ㎍ / ㎖), 망초 • 7H 2 O (370 ㎍ / ㎖), KH 2 PO 4 ( 170 ㎍ / ㎖), NH 4-숙시 네이트 [(20 ㎜, 2 M 주식 졸을 준비의 ution (숙시 네이트 (236 ㎍ / ㎖)과 NH 4 망할 CIA (106 ㎍ / ㎖)을, 용해 pH를 5.8로 조정), 마이크로 염은 [EDTA-FE (III), 나 소금 (40 ㎍ / ㎖의) × KJ (825 ㎍ / ㎖), H 3 BO 3 (3 ㎍ / ㎖) MnSO 4 • H 2 O (10 ㎍ / ml)에 ZnSO 4 • 7H 2 O (2 ㎍ / ㎖) 나 2 무 4 • 7H 2 O (0.25 ㎍ / ㎖), CuSO 4 • 5 H 2 O (0.025 ㎍ / ㎖)의 CoCl2 2 • 6H 2 O (0.025 ㎍ / ㎖)], MES (390 ㎍ / ㎖), 포도당 (약 80 μg / ㎖) 삼투압이 550 mOsm, pH가 5.8 (KOH). -20 ° C에서 분주에 보관
- F-PIN 매체를 준비 F-PCN으로 대신 포도당을 사용 자당 (약 110 ㎍ / ㎖), 삼투압이 550 mOsm, pH가 5.8 (KOH)의 모든 성분. -20 ° C에서 분주에 보관
- W5 매체를 준비 : 150 밀리미터의 NaCl, 125 mM의 염화칼슘, 5 밀리미터의 KCl, 2 MM의 MES, 삼투압 550-580 mOsm, pH가 5.7 (KOH)을. 4 °에서 보관; C (이상 보관 중에 박테리아의 성장을 방지하기 위해 0.2 ㎛의 필터를 통해 필터 멸균).
- 원형질체 분리 (0.1 g 셀룰라아제, 10 ㎖ F-PIN에 0.03 g의 macerozym) 신선한 효소 솔루션을 준비합니다. 10 분, 실온으로 냉각을 위해 55 ° C에서 솔루션을 품어. 10 ㎖ 용액에 10 % BSA 100 μl를 추가합니다.
- 원형질체의 분리
- 페트리 접시에 하나의 침투 잎을 배치하고 신선한 효소 솔루션을 추가합니다. 약 0.5 cm 2 크기의 조각으로 잎을 잘라 새로운 면도칼을 사용합니다. 진공 침투 플라스크에 효소 용액으로 잎 조각을 전송하고 기포가 (매우 신중하게 릴리스 진공) 잎에서 나올 때까지 진공은 약 20 초 동안 침투.
- 어둠 속에서 40 rpm으로 90 분 동안 플라스크를 흔들어.
- 90 rpm에서 1 분간 흔들어 원형질체를 놓습니다. 15 ㎖의 원심 분리 관 (둥근 바닥)에 거즈 (100 μM)를 통해 솔루션을 필터링합니다. 70 XG RT에서 (느린 가속 및 감속)에서 10 분 동안 2 ㎖ F-PCN 버퍼와 원심 분리 원형질체 용액 오버레이.
- 본래 원형질체는 효소액 및 F-PCN의 계면에 축적된다. 신선한 원심 분리 관에 그대로 원형질체를 전송하고 W5 버퍼에 채우기 위해 넓은 구멍 1 ㎖ 피펫 팁을 가져 가라. 원형질체 펠렛 100 XG (느린 가속과 감속)에서 2 분 동안 원심 분리기.
- 원형질체의 양에 따라 약 200 μL 5,000 버퍼에 피펫에 resuspend 펠렛을 사용하여 조심스럽게 뜨는을 제거합니다.
- 항상 그대로 원형질체의 파열을 방지하기 위해 다양한 오리피스 팁을 사용합니다.
4. 레이저 스캐닝 현미경
- 샘플 준비
- 현미경 슬라이드 정도 밀봉 두 개의 작은 스트립 (2cm 간격)을 붙여 넣습니다. 스트립 사이의 원형질 용액 20 μl를 놓고 조심스럽게 덮개 유리를 배치상단에. 밀봉 스트립은 원형질체는 커버 유리에 의해 숙청하지 있는지 확인하십시오.
- 총 잎 샘플은 잎에서 1cm 조각을 잘라 위쪽으로 향하게 잎의 바닥면과 현미경 슬라이드에 배치하십시오. 약 30 μL의 H 2 O를 추가 상단에 커버 유리를 배치하고 양쪽에 접착 테이프로 단단히 고정합니다.
- 공 촛점 이미징 및 현미경 설정
- TCS SP5 : 이미지는 라이카, 형식에서 공 초점 레이저 주사 현미경으로 수행됩니다. 확대를 위해 영상 매체로 글리세롤 63X의 크기와 대물 렌즈 (HCX PL APO CS)를 사용합니다. 개구 수를 1.3로 설정합니다. 평가를위한 라이카 응용 프로그램 제품군 / 고급 형광 소프트웨어를 (추가 데이터 S1 참조)를 사용합니다.
- 515 nm에서 재구성 BiFC 신호를 모니터링 및 495-550 개의 PMT 검출기 방출 대역폭을 설정하는 18 %의 강도로 488 nm에서 30 % 아르곤 레이저 및 레이저 파워를 설정한다. 엽록소 형광도를 모니터링하려면 650-705 두 번째 PMT 검출기 방출 대역폭을 설정합니다.
- mCherry 신호 헬륨 네온 레이저 (561)를 사용하여 모니터링하기 위해, 레이저의 강도 561-18% 및 587-610 제 PMT 검출기의 방사 대역폭을 설정한다.
- 모든 PMT 검출기 채널의 사진은 동일한 게인 설정 (게인 배경 신호를 제외하는 800 ~ 900 사이 여야합니다)로 촬영되어 있는지 확인합니다.
- 100 Hz의 스캔 속도와 1024 × 1024 픽셀의 형식 너비 / 높이에서 사진을 촬영합니다.
- Z-스태킹 각 스택에서 0.5 ㎛의 최대 거리를 사용하십시오.
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Representative Results
이 예에서는 막 도킹 단백질 AtTPR7 및 Toc64와 세포질 분자 샤페론 HSP90의 상호 작용을 모니터링하는 BiFC 방법을 사용했다. AtTPR7는 초 translocon의 일부이며 아마도 ER 막에 번역 후 전위에 대한 분비 preproteins을 제공 세포질 보호자와 상호 작용합니다. 마찬가지로, 엽록체 외부 봉투에 Toc64는 HSP90 관련 엽록체 preproteins를 수신하여 번역 후 수입의 역할을합니다. 두 단백질 HSP90의 C-말단 MEEVD 모티브와의 상호 작용을 매개 세포질 노출 TPR 도메인을 포함한다.
단백질은 형광 태그가 세포질 도메인에 연결되어 있으며, 따라서 단백질의 타겟팅 및 막 삽입을 방해하지 않는 것을 보장 금성 N에 도킹 단백질을 함유 TPR 도메인 융합 적합한 대상 벡터로 특정 콤비 네이즈에 의해 클로닝 하였다. HSP90, SCFP C의 경우 (그림 1과 2).
AtTPR7 및 HSP90은 단백질 복합체의 현지화을 확인 ER 마커 (mCherry)와 cotransformed했다. 형광, 레이저 주사 현미경으로 그대로 나뭇잎에 모니터링 하였다. (HSP90 등) 세포질에 위치한 단독 제어 SCFP의 C로, AtTPR7 및 ER 마커와 함께 표현했다. 몇몇 잎은 형광을 검사하고, 사진은 동일한 현미경 설정으로 촬영했다. 음성 대조군은 이러한 설정과 아주 약간의 배경 형광 (그림 3)를 표시해야합니다 반면, 우리의 경험에서 일반적인 신호는 800 ~ 900의 게인 설정을 볼 수 있어야합니다. 함께 515 nm에서 SCFP C-HSP90 비너스 N-AtTPR7에 대한 재구성 된 신호는 ER 마커와 중복 모니터링 하였다. 금성 N-시에 대한 신호 없음TPR7 및 음성 대조군 SCFP의 C 관찰 할 수있다.
전체의 현미경 사진에 실 지역화 형광 이미 (도 4 가시적이지만 결정하기 어렵고 나뭇잎 이후 Toc64 및 HSP90의 발현뿐만 아니라 Toc64 및 SCFP C의 경우, 원형질체는 침투 담배 잎으로부터 분리 하였다 5). 515 nm에서의 신호는 엽록체를 둘러싼 고리 모양의 구조로 감지 할 수있는 엽록체 봉투, 함께 SCFP C-HSP90와 Toc64 - 비너스 N을 표현 복원되었습니다. 제어 이상으로 동일한 현미경 설정으로 촬영했다 및 515 nm에서 형광을 보여주지 않았다.
그림1. BiFC의 복제 과정은 구성한다. 관심의 유전자가 이렇게 벡터 내에서 ccdB 유전자를 교체, AT & T의 P 사이트와 입력 벡터에 BP의 재결합을 허용하는 AT & T의 B 사이트에 의해 측면에 올리고 증폭되었다. 이어서 엔트리 벡터는 LR 재조합 효소를 사용하여 적절한 대상 벡터 재결합 하였다. 담배 잎에 이러한 구조의 변환은 분할 형광 단백질 및 항체 검출을위한 태그에 융합 단백질의 발현이. 수있는 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. BiFC 실험에 표현 된 단백질의 도식 표현. 비너스 N은각각 엽록체와 ER에 거주하는 Toc64 또는 AtTPR7의 세포질 부분에 결합. HSP90은 N-말단 HSP90 C-말단과 Toc64 및 AtTPR7의 TPR 도메인의 상호 작용을 가능하게 SCFP C에 융합이다. 혼자 SCFP C가 컨트롤로 세포질로 표현된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. AtTPR7 담배 잎 표피 세포에서 시각화 HSP90와 BiFC은. 비너스 N-AtTPR7 및 SCFP C-HSP90은 ER mCherry 마커 (중간 패널)와 cotransformed 및 일시적으로 담배 잎으로 표현되었다. 제어 금성 N-AtTPR7는 SCFP으로 cotransformed되면서
그림 4. Toc64 및 HSP90과 BiFC 담배 잎 표피 세포에서 시각화. Toc64 - 비너스 N과 SCFP C-HSP90이 일시적으로 담배 잎으로 표현되었다. 컨트롤로 Toc64 - 비너스 N 단독 SCFP C (아래 패널)와 cotransformed했다. 재구성 된 형광은 515 nm의 (왼쪽 패널)에서 관찰되었다. SIG의 오버레이515 nm의 엽록소 형광도의 NAL은 (오른쪽 패널) 표시됩니다. 엽록소 형광도는 480 nm에서 모니터링된다. 스케일 바 :. 10 ㎛가 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. 담배 원형질체 시각화 Toc64 및 HSP90와 BiFC는. Toc64 - 비너스 N과 SCFP C-HSP90은 일시적으로 담배 잎으로 표현되었다. 컨트롤로 Toc64 - 비너스 N 단독 SCFP C (아래 패널)와 cotransformed했다. 재구성 된 형광 고립 된 원형질체에서 515 nm의 (왼쪽 패널)에서 모니터링 하였다. 515 ㎚, 엽록소 형광도에서 신호의 오버레이 (도시오른쪽 패널). 엽록소 형광도는 480 nm에서 모니터링된다. 스케일 바 :. 10 ㎛가 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
BiFC 실험 계획에 여러 지점이 고려되어야한다. 관심의 단백질에 대한 구조적 정보가 필요하지 않지만, 토폴로지는 막 단백질에 걸친 작업을 할 때 알고 있어야합니다. 형광 단백질은 동일한 세포 내 구획에서 상주하거나 상호 작용을 허용하는 멤브레인의 동일 측면에 직면한다. N-말단 서열을 타겟팅 필요 단백질을 분석 할 때 당연히, 단지 C-말단 태그가 고려 될 수있다. 그 태그는 GFP-태그 된 단백질을 발현함으로써, 예를 들면, 미리 세포 내 현지화를 테스트하는 것이 바람직하다 또한 단백질의 적절한 표적 또는 막 삽입을 방해하는 것이 가능하기 때문이다. 또한, 음성 대조군은 항상 포함되어야한다. 이 예에서 우리는 세포질에 SCFP C를 표현하는 구조를 생성합니다. 그러나, 상호 작용하는 것으로 예상되지 않은 단백질은 음성 대조군으로 사용할 수있다. 적절한 표현 (을)를 확인하려면F 형광가 보이지 특히, 침투 나뭇잎이나 원형질체의 단백질 추출물을 SDS-PAGE 및 단백질 발현을 실시 할 수있는 구조는, 각각의 태그에 대한 항체가 확인 될 수있다.
형광 신호는 그대로 유지 또는 격리 원형질체에 하나를 모니터링 할 수 있습니다. 전체 잎에서 검출 빠르게이지만, 더 세련된 구조의 신호는 더 원형질체의 시각입니다. 엽록체를 포함하지 않는 전체 잎을 볼 때 또한, 대부분의 표피 세포는 모니터링됩니다. 엽록체 단백질을 분석 할 때 따라서, 원형질체의 분리가 바람직하다.
기술의 주요 이점은 살아있는 식물 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 모니터링 할 수있는 가능성이다. 그것이 coimmunoprecipitation 실험에서, 예를 들면 경우와 같이 세포를 파괴하고 세포막 단백질 복합체를 용해 할 필요는 없다. 또한, 애플리케이션은 심플유일한 필수 물질은 벡터, 아그로 박테리아와 표준 형광 현미경 (높은 품질의 이미지를 공 초점 레이저 주사 현미경으로 달성되지만) 때문에. 오직 상호 작용의 검출을 허용하는 재조합 단백질과 시험 관내 풀다운 분석 달리 양쪽 단백질에 직접 작용하는 경우, BiFC 또한 셀 내에 존재 외, 내인성 단백질을 필요 단백질 복합체를 검출 할 수있다. 그러나, 이것은 또한 BiFC 더 항상 다른 기술에 의해 검증되어야 직접적인 단백질 - 단백질 상호 작용의 증명을 제공하지 않는다는 점을 의미한다. 또한, 해당 음의 컨트롤에 의해 배제 될 필요가 불특정 상호 작용이 발생할 수 있습니다 강력한 프로모터에 의해 과발현에 의한. 이를 위해 단백질은 또한 단백질과 상호 작용할 예측 아니지만, 동일 구획에 상주하거나, 단백질 - 단백질 상호 작용 도메인 표기 결여 구성한다. 또한, 먹이 CD의 희석 시리즈변환 후 시간 의존적으로 비 간섭의 cDNA뿐만 아니라 형광 관찰과 NA 결과를 확인하는 데 도움이 될 수 있습니다. 진정한 형광 신호 및 BiFC 신호가 예를 들어 다른 표현 형광 단백질 마커 단백질 7,8의 관계로 정량화하고 설정해야 아티팩트의 차별을 보장한다. BiFC 방법의 또 다른 단점은 단백질의 상호 작용은 또한 비교적 큰 형광 태그에 의해 입체 장애 될 수 있다는 것이다.
다른 식물에서 아그로 박테 리움 - 매개 형질 전환의 적용 (예를 들어, 애기 장대)은 그러나, 절연 애기 원형질체로 또는 입자 총을 사용하여 세포를 형질 전환하는 직접 플라스미드 DNA를 변형하는 것이 가능하고, 제한된다. 그러나, 플라스미드 DNA는 고도로 농축 원형질체 형질 전환 가능한 순수해야하기 때문에, MAXI 키트를 이용하여 분리한다. 우리는 OBS 또 다른 문제때문에 표적 단백질의 고 발현에 erved 세포질에있는 불특정 집계는 미토콘드리아 막 단백질 작업, 특히이었다. 이 문제는 양파 세포의 biolistic 변환에 의해 극복 될 수있다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
우리는 원고의 비판적 읽기에 도움이 토론과 크리스 캐리에 대한 위르겐 Soll에 감사를드립니다. 이 프로젝트는 DFG 및 드퐁 데르 chemischen 인더스트리 (부여 번호 SFB 1035 SS에 프로젝트 A04 및 RS 187 개의 22 / 수행)에 의해 투자되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3',5'-Dimethoxy-4'-hydroxyacetophenone | Sigma-Aldrich | D134406 | Acetosyringone |
| Cellulase, Onozuka-R10 | Serva | 16419 | from Trichoderma viridae |
| Macerozyme R-10 | Serva | 28302 | from Rhizopus sp. |
| GATEWAY, BP Clonase II, Enzyme Kit | Invitrogen | 11789-(020) | |
| GATEWAY, LR Clonase II, Enzyme Kit | Invitrogen | 11791-(020) | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609-250 | |
| pDEST-GWVYNE | Invitrogen | Gateway-cloning | |
| pDEST-VYNE(R)GW | Invitrogen | Gateway-cloning | |
| pDEST-SCYCE(R)GW | Invitrogen | Gateway-cloning |
References
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