Summary
Bildung von Protein-Komplexen in vivo kann durch bimolekulare Fluoreszenzkomplementation visualisiert werden. Interaktionspartnern sind, um komplementäre Teile Fluoreszenz-Markierungen geschmolzen und transient in Tabakblättern exprimiert, was zu einem wiederFluoreszenzSignal auf enger Nähe der beiden Proteine.
Abstract
Viele Proteine interagieren transient mit anderen Proteinen oder in Multiproteinkomplexe integriert, um ihre biologische Funktion ausüben. Bimolekulare Fluoreszenzkomplementation (BIFC) ist eine in vivo-Methode, um solche Interaktionen in Pflanzenzellen zu überwachen. Im dargestellten Protokoll untersuchten Kandidatenproteine sind, um komplementäre Hälften der fluoreszierenden Proteinen fusioniert und die jeweiligen Konstrukte sind über Agrobacterium-vermittelte Transformation in die Pflanzenzellen eingeführt. Anschließend werden die Proteine in Tabakblättern transient exprimiert und die restaurierten Fluoreszenzsignale können mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop in den intakten Zellen nachgewiesen werden. Dies ermöglicht nicht nur die Visualisierung der Interaktion selbst, sondern auch die subzelluläre Lokalisation der Proteinkomplexe bestimmt werden. Zu diesem Zweck kann Markergene, die eine fluoreszierende Markierung zusammen mit den Konstrukten BiFC koexprimiert werden, wodurch die Visualisierung Zellstrukturen wie ter endoplasmatischen Retikulum, Mitochondrien, dem Golgi-Apparat oder der Plasmamembran. Das Fluoreszenzsignal kann entweder direkt in Blatt-Epidermiszellen oder in einzelnen Protoplasten, die sich leicht aus den transformierten Tabakblättern isoliert werden, können überwacht werden. BIFC ist ideal geeignet, um Protein-Protein-Interaktionen in ihrer natürlichen Umgebung in der lebenden Zelle zu untersuchen. Es muss jedoch berücksichtigt werden, dass der Ausdruck von starken Promotoren gesteuert werden, und dass die Interaktionspartner werden durch Fusion der relativ großen Fluoreszenz-Tags, die mit der Wechselwirkungsmechanismus stören könnte modifiziert werden. Dennoch ist eine ausgezeichnete BIFC ergänzenden Ansatz zu anderen häufig angewendeten Methoden der Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen, wie Coimmunpräzipitation, in vitro Pulldown-Assays oder Hefe-Zwei-Hybrid-Experimenten.
Introduction
Studieren die Bildung von Proteinkomplexen und ihre Lokalisation in Pflanzenzellen in vivo ist wichtig, Mobilfunknetze zu untersuchen, Signal-und Stoffwechselprozesse. BIFC ermöglicht die Visualisierung von Protein-Protein-Interaktionen in ihrer natürlichen Umgebung direkt in der lebenden Pflanzenzelle 5.1.
Im BiFC Ansatz der Komplementierung von zwei nicht-fluoreszierenden N-und C-terminale Fragmente eines fluoreszierenden Proteins führen zu einem fluoreszierenden Protein rekonstituiert. Fragmente von verschiedenen fluoreszierenden Proteinen verwendet worden, um Protein-Wechselwirkungen zu detektieren, z. B. das grün fluoreszierende Protein (GFP), von denen das Chromophor chemisch durch drei unterschiedliche Reste 6 gebildet. Fluoreszierende Proteine können in einer Schleife oder ß-Strang in den beiden nicht-fluoreszierenden Fragmente, die beiden Proteine von Interesse fusioniert werden kann führen zu halbieren. Der Test kann verwendet werden, um Wechselwirkungen in jedem Fach vier subzellulärer erkennennt in jedem aerob wachsenden Organismus oder Zellen, die genetisch modifiziert werden können, um die Fusionsproteine zu exprimieren. Wenn die beiden Proteine in enge Nähe innerhalb der Zelle zu kommen, wird die Fluoreszenz wieder hergestellt und kann durch Mikroskopie ohne Zugabe von exogenen Fluorophoren oder Farbstoffe 3 überwacht werden.
Tabak (Nicotiana benthamiana) hat sich als praktisch Modellorganismus, um die Wechselwirkung von Pflanzenproteinen zu visualisieren, da Proteine kann leicht durch die Verwendung von Agrobacterium-vermittelten Transformation von Tabakblättern mit den generierten Konstrukte exprimiert werden. Agrobakterien mit einem sogenannten Ti-Plasmid (Tumor-induzierend) für Enzyme, die die Transduktion des Gens in Pflanzenzellen vermitteln Codierung. BiFC ist auch anwendbar für lösliche als auch für Membranproteine in allen zellulären Kompartimenten und wurde erfolgreich in den letzten Jahren verwendet, um interagierende Proteine identifizieren, die in vivo als auch Interaktionsstellen zu analysiereninnerhalb der Proteine 7-9. Nach der Expression der eingeführten Gene, kann die Wechselwirkung der fluoreszierenden Proteine direkt in den Blättern sichtbar gemacht werden, was für größere Zellstrukturen, wie dem endoplasmatischen Retikulum (ER), die Plasmamembran oder Chloroplasten. Um aber die Lokalisation in feiner Strukturen zu überwachen, zum Beispiel die Chloroplasten-Umschlag, ist es ratsam, die Fluoreszenz-in-Protoplasten aus transformierten Tabakblättern getrennt visualisieren. Eine Reihe von Vektoren, die BiFC entweder eine C-terminale oder N-terminale fluoreszierende Markierung hat, um die Pflanzen in BiFC Ansatz 10 verwendet werden. Die im Folgenden beschriebenen Protokoll wurde verwendet, um die Interaktion von cytosolischen Hitzeschockprotein 90 (HSP90) mit der Tetratricopeptid repeat (TPR)-Domäne Docking Proteine Toc64 und AtTPR7 Wohnsitz in der Chloroplasten-Außenhülle und dem endoplasmatischen Retikulum, jeweils von 11 bis 13 enthält, zu studieren. Zu diesem Zweck wurde auf die HSP90 Ct verschmolzenerminal Teil SCFP (SCFP C). Das Tag war N-terminal an das Chaperon fusioniert, um die Zugänglichkeit von der C-terminalen MEEVD Bindungsmotiv von HSP90 TPR-Domänen-Klemme zu gewährleisten. Parallel dazu ist der N-terminale Teil von Venus (Venus N) an die zytosolische Domäne des TPR-Domäne Andocken Proteine Toc64 und AtTPR7 jeweils enthaltend fusioniert wurde. Als Negativkontrolle klonierten wir das lösliche C-terminalen Teil des C SCFP ausschließlich die im Cytosol befindet, und ist daher eine geeignete Steuerung.
Die fluoreszierenden Markierungen der untersuchten Proteine haben den gleichen Zellabteil zugewandt Nähe und dadurch Auflösen des Fluoreszenzsignals zu ermöglichen. Um die Lokalisierung des rekonstituierten Fluoreszenzsignal ein Markerprotein an eine andere fluoreszierende Markierung fusioniert ist cotransformiert die subzelluläre Lokalisation der Wechselwirkung nachzuweisen bestimmen. Ein ER-Markerproteins fusioniert mCherrry wurde gleichzeitig in den transformiertenBei der ER AtTPR7 14 angeordnet. Die Autofluoreszenz des Chlorophylls diente als Chloroplasten-Marker bei Toc64. Dadurch nicht nur die in vivo Interaktion von Toc64 AtTPR7 und jeweils mit der cytosolischen Chaperone HSP90 in den Tabakblättern direkt überwacht werden, sondern auch die subzelluläre Lokalisation der Wechselwirkung untersucht werden.
BIFC ist als Ergänzung zu den anderen Methoden Studium von Protein-Protein-Interaktionen geeignet. Im Vergleich zu Coimmunpräzipitation oder in vitro Pull-down-Experimente, zum Beispiel, haben keine spezifischen Antikörper gegen die Proteine von Interesse vorhanden sein, und die Proteine müssen nicht rekombinant in vitro exprimiert werden, was schwierig sein kann, insbesondere für Membranproteine. Außerdem können auch transiente Interaktionen mit BiFC überwacht werden, da die Proteine durch die Wechselwirkung der kondensierten Fluoreszenzmarkierungen 15 eingefangen.
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Protocol
1. Transformation von Agrobakterien in BIFC Konstruiert
- Klonierung der Konstrukte BIFC
- Amplify das Gen von Interesse aus einer entsprechenden Vorlage mit Oligonukleotiden, die flankierenden attB-Websites. Führen Sie eine PCR unter Verwendung eines Korrekturlesen-Polymerase. Anpassung der Länge der Wärmebehandlungsschritt, um die Primer-Kombination ausgebildet und die Länge des Verlängerungsschritt gemäß der Fragmentgröße. Überprüfen Sie die PCR-Produkts durch Agarose-Gelelektrophorese und Reinigung durch Verwendung eines PCR Clean-up Kit.
- Führen Sie die BP-Reaktion mit dem erhaltenen Fragment und den Eintrag mit einem Vektor-BP-Rekombinase. Mischen Sie 15 bis 150 ng der attB-PCR-Produkt mit 150 ng des Eintrags Vektor, fügen Sie 2 ul der BP-Rekombinase und füllen sich mit TE-Puffer auf ein Gesamtvolumen von 8 ul. Inkubieren der Reaktion für 1 h bei RT und Stoppen der Reaktion durch Zugabe von 2 &mgr; l Proteinase K für 10 Minuten bei 37 ° C.
- Transformieren Sie die gesamte Reaktions in kompetente E. coli DH5a; Zellen und Screening der erhaltenen Kolonien durch Kolonie-PCR für die korrekte Insertion des DNA-Fragments in den Vektor. DNA-Sequenzierung der positiven Plasmiden durchgeführt, um die Abwesenheit von Mutationen zu überprüfen.
- Verwenden Sie die erhaltenen Entry-Klon für LR Rekombination mit dem entsprechenden Ziel-Vektor mit einem LR-Rekombinase. Mischen Sie 50 bis 150 ng des Eintrags Vektor mit 150 ng des Zielvektor, fügen 1 ul LR-Rekombinase und füllen sich mit TE-Puffer auf ein Gesamtvolumen von 5 ul. Inkubieren der Reaktion für 1 h bei RT und Stoppen der Reaktion durch Zugabe von 1 &mgr; l Proteinase K für 10 Minuten bei 37 ° C.
- Transformieren Sie die gesamte Reaktions in kompetente E. coli DH5a Zellen und Bildschirm durch Kolonie-PCR für die korrekte Einführung des DNA-Fragments in den Vektor erhaltenen Kolonien. DNA-Sequenzierung ist in diesem Schritt nicht erforderlich.
- Isolierung von Plasmid-DNA mit einem Plasmid Mini Kit, um eine hohe Reinheit zu gewährleisten.
- Herstellung von chemisch kompetente Agrobakterien (Stamm AGL1, Rifampicin und Carbenicillin-Resistenz)
- Streak aus Agrobakterien aus einer Stammkultur wachsen und für 24 Stunden bei 28 ° C.
- Impfen 5 ml LB-Medium mit einer Einzelkolonie beimpft und über Nacht bei 28 ° C
- Beimpfen von 50 ml LB-Medium mit 2 ml der Übernacht-Kultur wachsen und für etwa 4 h bei 28 ° C bis zu einer OD 600 von 1,0.
- Zentrifugieren der Zellen bei 3000 × g für 15 min bei 4 ° C und das Pellet in 1 ml sterilisiertem eiskaltem CaCl 2 (10 mM). Halten Zellen auf Eis nach diesem Schritt.
- Aliquots (100 ul) der Zellen, sofort in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei -80 ° C
- Transformation von chemisch kompetente Agrobakterien
- Tauwetter ein Aliquot der zuständigen AGL1 Zellen auf Eis. Hinzufügen 1-2 ug Plasmid-DNA in die Zellen. Inkubation für 5 Minuten auf Eis, 5 min in flüssigem Stickstoff und 5 min bei 37 ° C. Add 600 ul LB-Medium zu den Zellen und sSeehecht bei 650 Upm für 4 Stunden bei 28 ° C.
- Zentrifugieren Sie die Zellen für 1 min bei 8.000 xg und den Überstand verwerfen. Das Pellet in 50 &mgr; l der verbleibenden LB-Medium und Platte auf LB-Platten mit den entsprechenden Antibiotika. Verschließen Sie die Platten und Inkubation für 2 Tage bei 28 ° C. Bildschirm Kolonien auf das Vorhandensein des Plasmids durch Kolonie-PCR.
- Impfen eine positive Kolonie in 5 ml LB-Medium mit den entsprechenden Antibiotika und Inkubation bei 28 ° C über Nacht. Mischungs 500 ul der Übernacht-Kultur mit 500 &mgr; l 50% Glycerin sterilisiert und gefrier bei -80 ° C.
- Impfen die Agrobakterien in LB-Medium die entsprechenden Antibiotika enthaltend direkt aus dem Glycerin Lager für transiente Transformation von Tabakblättern.
2. Transient Transformation von Tabakblättern
- Agrobakterien Wachstum
- Die folgenden Stammlösungen: Acetosyringon (150 mM, lösen sich in 70% EtOH), speichern als Aliquots bei -20 ° C. MES / KOH (0,1 M) pH 5,7, Lagerung bei 4 ° C (Sterilfilter durch einen 0,2 um Filter, um das Bakterienwachstum bei längerer Lagerung zu verhindern), MgCl 2 (1 M) Lager, Lagerung bei RT.
- Beimpfen von 10 ml LB-Medium mit den entsprechenden Antibiotika mit 50 ul der AGL1 Glycerin-Stammkultur, die das Plasmid von Interesse in einer sterilen 50 ml-Röhrchen und Inkubation bei 28 ° C für mindestens 24 Stunden unter Schütteln bei 190 rpm, bis eine OD 600 zwischen 1,0 -2.0 erreicht.
- Zentrifuge Bakterien bei 3.000 × g für 15 min. Das Pellet in frisch gemacht Infiltrationsmedium [MgCl 2 (10 mM), MES / KOH (10 mM) pH 5,7, Acetosyringon (150 uM)] und stellen Sie die Suspension bis zu einer OD 600 von 1,0.
- Die Agrobakterien-Zellen Inkubation in einem Überkopfschüttler für 2 Stunden in der Dunkelheit. Die Zellen können dann zur Infiltration verwendet werden.
- Infiltration von Tabakblättern
- Verwenden Sie dreiWochen alten Tabak (Nicotiana benthamiana) Pflanzen. Wählen Sie mehrere ältere Blätter für Infiltration.
- Mix gleiche Volumina der Agrobakterien Durchführung der Konstrukte von Interesse (jeweils 3 ml). Nehmen Sie eine 5-ml-Spritze ohne Nadel zur Infiltration. Infiltrieren die Zellsuspension vorsichtig in den Tabakblättern durch Betätigen der Spritze auf der Unterseite der Blätter in mehreren Stellen.
- Gießen Sie die Pflanzen und lassen sie in der Dunkelheit für zwei Tage.
3. Protoplasten Vorbereitung
Protoplasten Herstellung von Tabakblättern wurde von Koop et al. 16 angepasst und leicht modifiziert.
- Buffer Vorbereitung
- Vorbereitung F-PCN Medium: Macro-Salze [KNO 3 (1012 &mgr; g / ml), CaCl 2 • 2H 2 O (440 &mgr; g / ml), MgSO 4 • 7H 2 O (370 &mgr; g / ml), KH 2 PO 4 ( 170 pg / ml), NH 4-Succinat [(20 mM, bereiten eine 2 M Lager Solution (Succinat (236 ug / ml) und NH 4 Cl (106 &mgr; g / ml) auf pH 5,8 einstellen zu lösen)], Mikro-Salzen [EDTA-Fe (III) x Na-Salz (40 ug / ml), KJ (0,75 ug / ml), H 3 BO 3 (3 &mgr; g / ml), MnSO 4 • H 2 O (10 &mgr; g / ml), ZnSO 4 • 7 H 2 O (2 ug / ml), Na 2 MoO 4 • 7H 2 O (0,25 g / ml), CuSO 4 • 5 H 2 O (0,025 g / ml), CoCl 2 • 6H 2 O (0,025 g / ml)], MES (390 &mgr; g / ml), Glukose (etwa 80 ug / ml) Osmolarität 550 mOsm, pH 5,8 (KOH). Shop bei -20 ° C
- Vorbereitung F-PIN Medium: Alle Inhaltsstoffe wie F-PCN aber anstelle von Glucose Verwendung Saccharose (etwa 110 ug / ml), Osmolarität 550 mOsm, pH 5,8 (KOH). Shop bei -20 ° C
- Vorbereitung W5-Medium: 150 mM NaCl, 125 mM CaCl 2, 5 mM KCl, 2 mM MES, Osmolarität 550-580 mOsm, pH 5,7 (KOH). Lagerung bei 4 °, C (steril durch einen 0,2 &mgr; m-Filter, um das Bakterienwachstum bei längerer Lagerung zu verhindern).
- Bereiten frischer Enzymlösung für Protoplastenisolierung (0,1 g Cellulase, 0,03 g macerozym in 10 ml F-PIN). Inkubation der Lösung bei 55 ° C für 10 min und Abkühlen auf RT. Füge 100 &mgr; l 10% BSA auf 10 ml Lösung.
- Isolation von Protoplasten
- Legen Sie ein Blatt infiltriert in eine Petrischale, und fügen Sie die frische Enzymlösung. Verwenden Sie eine neue Rasierklinge, das Blatt in ca. 0,5 cm 2 große Stücke geschnitten. Übertragen Sie die Blattstücke mit der Enzymlösung in ein Vakuum-Infiltration-Kolben-und Vakuum infiltrieren für ca. 20 Sekunden, bis die Luftblasen entstehen aus den Blättern (Release-Vakuum sehr vorsichtig).
- Der Kolben wird 90 min bei 40 UpM im Dunkeln.
- Lassen Protoplasten durch Schütteln für 1 min bei 90 Umdrehungen pro Minute. Die Lösung wird durch Gaze (100 uM) in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen (Rundboden). Lagern die Protoplastenlösung mit 2 ml F-PCN-Puffer und Zentrifuge für 10 min bei 70 · g (langsame Beschleunigung und Verlangsamung) bei RT.
- Intakten Protoplasten sammeln sich an der Grenzfläche der Enzymlösung und F-PCN. Nehmen Sie eine große Öffnung 1 ml Pipettenspitze auf die intakten Protoplasten in ein frisches Zentrifugenröhrchen übertragen und füllen sich mit W5-Puffer. Zentrifugieren für 2 min bei 100 xg (langsame Beschleunigung und Verzögerung), um die Protoplasten zu pelletieren.
- Den Überstand vorsichtig mit einer Pipette und Pellet in ungefähr 200 &mgr; l W5-Puffer, je nach der Menge von Protoplasten.
- Immer breite Öffnung Tipps, Aufbrechen der intakten Protoplasten zu verhindern.
4. Laser-Scanning-Mikroskopie
- Probenvorbereitung
- Fügen Sie zwei kleine Streifen von Dichtungsmasse um einen Objektträger (2 cm Abstand). Zeigen 20 ul der Protoplastenlösung zwischen den Streifen und vorsichtig ein Deckglasan der Spitze. Die Dichtstreifen um sicherzustellen, dass die Protoplasten nicht durch das Deckglas gequetscht.
- Für Gesamtblattproben schneiden Sie ein Stück von 1 cm aus dem Blatt und legen Sie es auf einen Objektträger mit der unteren Seite des Blattes nach oben. In etwa 30 ul H 2 O, ein Deckglas auf und befestigen Sie sie fest mit Klebeband auf beiden Seiten.
- Die konfokale Bildgebung und Mikroskopeinstellungen
- TCS SP5: Imaging mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop von Leica, Typ durchgeführt. Zur Vergrößerung verwendet eine Objektivlinse (HCX PL APO CS) mit einer Stärke von 63X mit Glycerin als Abbildungsmedium. Stellen Sie die numerische Apertur bis 1,3. Verwenden Sie die Leica Application Suite / Advanced Fluoreszenz-Software für die Auswertung (siehe Zusatzdaten S1).
- Stellen Sie den Argon-Laser bis 30% und die Laserleistung bei 488 nm auf eine Intensität von 18%, um die wiederhergestellten BIFC Signal bei 515 nm zu überwachen und setzen ein PMT-Detektor Emissionsbandbreite von 495 bis 550. Um Chlorophyll Autofluoreszenz überwachen eine zweite PMT-Detektor Emissionsbandbreite von 650 bis 705.
- Zur Überwachung mCherry Signal zu verwenden, die He-Ne-Laser 561, stellen Sie die Intensität des Laser 561-18% und der Emissionsbandbreite eines dritten PMT-Detektor 587-610.
- Stellen Sie sicher, dass die Bilder aller PMT Detektorkanäle sind mit den gleichen Verstärkungseinstellungen (Gewinn sollte zwischen 800-900 sein, um Hintergrundsignale ausschließen) übernommen.
- Nehmen Sie Bilder in einem Format Breite / Höhe von 1024 x 1024 Pixel mit einer Scangeschwindigkeit von 100 Hz.
- Für Z-Tape verwenden einen maximalen Abstand von 0,5 um zwischen jedem Stapel.
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Representative Results
In diesem Beispiel verwendeten wir die BiFC Methode, um die Interaktion des zytosolischen Chaperon Hsp90 mit den Membranproteinen Docking AtTPR7 und Toc64 überwachen. AtTPR7 ist Teil der Sec Translokons und interagiert mit zytosolischen Chaperone, die möglicherweise liefern sekretorischen Präproteinen für post-translationalen Translokation an der ER-Membran. Ebenso Toc64 an der Außenhülle wirkt Chloroplasten in post-translationalen Import durch den Empfang HSP90 assoziiert Chloroplasten Präproteinen. Beide Proteine enthalten einen cytosolischen ausgesetzt TPR-Domäne, die eine Wechselwirkung mit dem C-terminalen MEEVD Motiv HSP90 vermittelt.
Proteine wurden durch spezifische Rekombinasen in geeignete Zielvektoren Verschmelzen des TPR-Domäne enthaltenden Proteine, die Docking Venus N, sicherzustellen, dass die fluoreszierende Markierung an die zytosolische Domäne gebunden ist und somit nicht Targeting und Membran Insertion der Proteine verhindern kloniert. Im Fall von HSP90, SCFP C (Fig. 1 und 2) p> wurde an den N-Terminus fusioniert, um nicht mit der C-terminalen MEEVD Motivs stören.
AtTPR7 und HSP90 wurden mit einem ER-Marker (mCherry) co-transformiert, um die Lokalisierung des Protein-Komplexes zu überprüfen. Die Fluoreszenz wurde in intakten Blättern mit einem Laser-Scanning-Mikroskop überwacht. Als Kontrolle SCFP C alleine, die im Cytosol (wie HSP90) befindet, wurde zusammen mit AtTPR7 und dem ER-Marker exprimiert. Mehrere Blätter wurden für Fluoreszenz überprüft und Bilder wurden mit identischen Mikroskopeinstellungen übernommen. Nach unserer Erfahrung sollte ein typisches Signal mit Verstärkungseinstellungen bei 800-900 sichtbar sein, während die Negativkontrolle sollte nur zeigen sehr geringe Hintergrundfluoreszenz mit diesen Einstellungen (Abbildung 3). Ein Signal für die Rekonstitution Venus N-AtTPR7 zusammen mit SCFP C-HSP90 bei 515 nm wurde überwacht Überschneidungen mit dem ER-Marker. Kein Signal für die Venus N-AnTPR7 und die negative Kontrolle SCFP C beobachtet werden.
Im Fall von Toc64 und HSP90-Expression sowie Toc64 und SCFP C wurden Protoplasten aus Tabakblätter infiltriert isoliert, da in mikroskopischen Bilder der gesamten verlässt die genaue Lokalisierung ist schwer zu bestimmen, obwohl Fluoreszenz bereits sichtbar (Abb. 4 und 5). Ein Signal bei 515 nm wurde restauriert ausdrücken Toc64 Venus-N zusammen mit SCFP C-HSP90 an der Chloroplasten-Umschlag, die als ringförmige Strukturen rund um die Chloroplasten nachgewiesen werden konnte. Wie oben der Kontrolle wurde mit identischen Einstellungen Mikroskop fotografiert und nicht eine Fluoreszenz bei 515 nm zeigen.
Abbildung1. Verfahren der Klonierung BIFC konstruiert. Die Gene von Interesse wurden mit Oligonukleotiden, flankiert von att B Websites, um BP Rekombination in einem Eintrag Vektor mit att P erlauben verstärkt, und ersetzt damit den ccdB Gen in dem Vektor. Anschließend wurde der Eintrag Vektor mit entsprechenden Zielvektoren mit einer LR-Rekombinase rekombiniert. Transformation dieser Konstrukte in Tabakblättern erlaubt die Expression von Proteinen an den geteilten fluoreszierende Proteine und Tags für Antikörper-Nachweis fusioniert. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
2. Schematische Darstellung der Proteine in BIFC Experimenten ausgedrückt. Venus Nden cytosolischen Teile Toc64 oder AtTPR7 wohnhaft in den Chloroplasten und ER gekoppelt. HSP90 ist, N-terminal an SCFP C kondensiert, wodurch die Interaktion der TPR-Domänen Toc64 und AtTPR7 mit HSP90 C-Terminus. Allein SCFP C im Cytosol als Kontrolle ausgedrückt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
3. BIFC mit AtTPR7 und HSP90 in Tabak epidermale Blattzellen visualisiert. Venus N-AtTPR7 und SCFP C-HSP90 wurden mit dem ER mCherry-Marker (Mitte) co-transformiert und transient in Tabakblättern exprimiert. Als eine Kontrolle Venus N-AtTPR7 wurde mit SCFP kotransformiert
4. BIFC mit Toc64 HSP90 und visualisiert in Tabak epidermale Blattzellen. Toc64 Venus-N-und C-SCFP HSP90 wurden transient in Tabakblättern exprimiert. Als Kontrolle Toc64 Venus-N wurde mit allein SCFP C (Bodenplatten) co-transformiert. Wiederhergestellte Fluoreszenz bei 515 nm (links) überwacht. Overlay der signal bei 515 nm und die Chlorophyllautofluoreszenz (rechts) gezeigt. Chlorophyll Autofluoreszenz bei 480 nm überwacht. Maßstabsbalken:. Um 10 Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
5. BIFC mit Toc64 und HSP90 in Tabak-Protoplasten visualisiert. Toc64 Venus-N-und C-SCFP HSP90 wurden transient in Tabakblättern exprimiert. Als Kontrolle Toc64 Venus-N wurde mit allein SCFP C (Bodenplatten) co-transformiert. Wiederhergestellte Fluoreszenz wurde bei 515 nm (links) in isolierten Protoplasten überwacht. Überlagerung des Signals bei 515 nm und die Chlorophyll-Autofluoreszenz gezeigt (rechts). Chlorophyll Autofluoreszenz bei 480 nm überwacht. Maßstabsbalken:. Um 10 Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Bei der Planung einer BIFC Experiment mehrere Punkte berücksichtigt werden. Obwohl keine strukturelle Informationen über die Proteine von Interesse erforderlich ist, hat der Topologie bekannt sein, wenn mit der Membran überspannenden Proteinen. Die fluoreszierenden Proteine in der gleichen subzellulären Kompartiment befinden oder in die gleiche Seite einer Membran, um die Interaktion zu ermöglichen. Natürlich, wenn die Analyse-Proteine, die eine N-terminale Targeting-Sequenz erforderlich ist, kann nur ein C-terminales Tag betrachtet. Da es möglich ist, daß das Etikett mit der richtigen Ausrichtung stört oder Membran Insertion des Proteins von Interesse ist es ratsam, subzelluläre Lokalisation vorher zu testen, beispielsweise durch eine GFP-markierten Protein exprimieren. Darüber hinaus sollte eine Negativkontrolle immer einbezogen werden. In diesem Beispiel erzielten wir ein Konstrukt nur ausdrücken SCFP C in das Cytosol. Jedoch kann jedes Protein, das nicht erwartet wird, zu interagieren als negative Kontrolle verwendet werden. Um die richtige Ausdruck o überprüfenF die Konstrukte, insbesondere, wenn keine Fluoreszenz sichtbar ist, können Protein-Extrakten von infiltrierten Blätter oder Protoplasten SDS-PAGE-und Proteinexpression unterzogen werden können mit Antikörpern gegen die jeweiligen Variablen gerichtet prüft werden.
Fluoreszenzsignale in intakten Blättern oder isolierte Protoplasten überwacht werden entweder. Obwohl im gesamten Erfassungs Blätter schneller werden Signale von feineren Strukturen besser sichtbar in Protoplasten. Zudem sind meist Epidermiszellen überwacht, wenn man die gesamte Blatt, die Chloroplasten enthalten. Deshalb, wenn die Analyse Chloroplasten-Proteine ist die Isolierung von Protoplasten ratsam.
Der Hauptvorteil des Verfahrens ist die Möglichkeit, Protein-Protein-Wechselwirkungen in lebenden Pflanzenzellen überwachen. Es besteht keine Notwendigkeit, um Zellen aufzubrechen und Membranproteinkomplexen zu solubilisieren, wie es beispielsweise der Fall in Coimmunpräzipitation Experimente ist. Darüber hinaus ist die Anwendung einfachda die einzige erforderliche Materialien sind die Vektoren, Agrobakterien und ein Standard-Fluoreszenzmikroskop (obwohl höhere Qualität der Bilder sind mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop erreicht). Im Gegensatz zur in vitro-Pulldown-Assays mit rekombinanten Proteinen, die nur erlauben Nachweis einer Wechselwirkung, wenn beide Proteine direkt interagieren, BiFC können Proteinkomplexe, die zusätzliche, in der Zelle endogen vorliegenden Proteine erfordern erfassen. Jedoch bedeutet dies auch, dass BiFC bietet eine direkte Protein-Protein-Interaktion, die immer durch andere Techniken verifiziert werden nicht nachweisen. Außerdem wird durch die Überexpression von starken Promotoren unspezifische Wechselwirkungen auftreten, die durch entsprechende Negativkontrollen ausgeschlossen werden müssen. Dazu wird ein Protein nicht vorhergesagt, mit dem Protein von Interesse zu interagieren, die aber in der gleichen Kammer, oder Konstrukte ohne die Protein-Protein-Interaktionsdomänen verwendet werden. Zusätzlich wird eine Verdünnungsreihe der Beute cDNA mit einem nicht wechselwirkenden cDNA sowie die Beobachtung der Fluoreszenz in einer zeitabhängigen Weise nach der Umwandlung kann dabei helfen, die Ergebnisse zu validieren. Um eine Diskriminierung der wahren Fluoreszenzsignale und Artefakte die BIFC Signale sollten quantifiziert und in Relation zu einem anderen ausgedrückt fluoreszierendes Protein, zum Beispiel ein Markerprotein 7,8 eingestellt werden gewährleisten. Ein weiterer Nachteil des Verfahrens ist BiFC, dass Wechselwirkungen der Proteine können auch sterisch durch die relativ großen fluoreszierenden Markierungen behindert wird.
Anwendung von Agrobakterium-vermittelte Transformation in anderen Pflanzen (beispielsweise Arabidopsis) begrenzt ist, ist es jedoch möglich, die Plasmid-DNA entweder direkt in isolierte Arabidopsis-Protoplasten oder Zellen zu transformieren unter Verwendung einer Partikelkanone verwandeln. Jedoch sollte die Plasmid-DNA unter Verwendung eines Maxi Kit isoliert werden, da sie sollten hoch konzentriert werden und so rein wie möglich für die Protoplastentransformation. Ein weiteres Problem, das wir obsaufgrund der hohen Expression der Zielproteine wurde erved unspezifische Aggregation im Cytosol, besonders beim Arbeiten mit mitochondrialen Membranproteinen. Dieses Problem kann durch biolistische Transformation von Zwiebelzellen überwunden werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir möchten Jürgen Soll für hilfreiche Diskussionen und Chris Carrie für kritische Durchsicht des Manuskripts danken. Dieses Projekt wurde von der DFG und dem Fonds der chemischen Industrie (Zuschüsse Zahlen SFB 1035, Projekt A04 zu SS und Do 187/22 RS) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3',5'-Dimethoxy-4'-hydroxyacetophenone | Sigma-Aldrich | D134406 | Acetosyringone |
| Cellulase, Onozuka-R10 | Serva | 16419 | from Trichoderma viridae |
| Macerozyme R-10 | Serva | 28302 | from Rhizopus sp. |
| GATEWAY, BP Clonase II, Enzyme Kit | Invitrogen | 11789-(020) | |
| GATEWAY, LR Clonase II, Enzyme Kit | Invitrogen | 11791-(020) | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609-250 | |
| pDEST-GWVYNE | Invitrogen | Gateway-cloning | |
| pDEST-VYNE(R)GW | Invitrogen | Gateway-cloning | |
| pDEST-SCYCE(R)GW | Invitrogen | Gateway-cloning |
References
- Citovsky, V., et al. Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta. J. Mol. Biol. 362, 1120-1131 (2006).
- Schutze, K., Harter, K., Chaban, C. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells. Methods Mol. Biol. 479, 189-202 (2009).
- Weinthal, D., Tzfira, T. Imaging protein-protein interactions in plant cells by bimolecular fluorescence complementation assay. Trends Plant Sci. 14, 59-63 (2009).
- Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. The analysis of protein-protein interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation. Plant Physiol. 145, 1090-1099 (2007).
- Ohad, N., Yalovsky, S. Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants. Methods Mol. Biol. 655, 347-358 (2010).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Lee, L. Y., et al. Screening a cDNA library for protein-protein interactions directly in planta. Plant Cell. 24, 1746-1759 (2012).
- McFarlane, H. E., Shin, J. J., Bird, D. A., Samuels, A. L. Arabidopsis ABCG transporters, which are required for export of diverse cuticular lipids, dimerize in different combinations. Plant Cell. 22, 3066-3075 (2010).
- Dunschede, B., Bals, T., Funke, S., Schunemann, D. Interaction studies between the chloroplast signal recognition particle subunit cpSRP43 and the full-length translocase Alb3 reveal a membrane-embedded binding region in Alb3 protein. J. Biol. Chem. 286, 35187-35195 (2011).
- Gehl, C., Waadt, R., Kudla, J., Mendel, R. R., Hansch, R. New GATEWAY vectors for high throughput analyses of protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation. Mol. Plant. 2, 1051-1058 (2009).
- Qbadou, S., et al. The molecular chaperone Hsp90 delivers precursor proteins to the chloroplast import receptor Toc64. EMBO J. 25, 1836-1847 (2006).
- Schweiger, R., Muller, N. C., Schmitt, M. J., Soll, J., Schwenkert, S. AtTPR7 is a chaperone docking protein of the Sec translocon in Arabidopsis. J. Cell Sci. , (2012).
- Schweiger, R., S, S. AtTPR7 as part of the Arabidopsis Sec post-translocon. Plant Signal Behav. 8, (2013).
- Nelson, B. K., Cai, X., Nebenfuhr, A. A multicolored set of in vivo organelle markers for co-localization studies in Arabidopsis and other plants. Plant J. 51, 1126-1136 (2007).
- Kerppola, T. K. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis as a probe of protein interactions in living cells. Annu. Rev. Biophys. 37, 465-487 (2008).
- Koop, H. U., et al. Integration of foreign sequences into the tobacco plastome via polyethylene glycol-mediated protoplast transformation. Planta. 199, 193-201 (1996).
