Summary
היווצרות של קומפלקסי חלבוני in vivo ניתן דמיינו ידי שלמת הקרינה bimolecular. שותפי אינטראקציה הם התמזגו לחלקי משלימים של תגי ניאון והביעו transiently בי טבק, וכתוצאה מכך אות ניאון מחדש על סמיכות של שני חלבונים.
Abstract
חלבונים רבים האינטראקציה transiently עם חלבונים אחרים או משולבים מתחמי חלבון רב כדי לבצע את תפקידם הביולוגי. שלמת bimolecular פלואורסצנטי (BiFC) היא שיטת in vivo כדי לפקח כגון אינטראקציות בתאי צמח. בפרוטוקול המובא חלבוני המועמד חקרו הם התמזגו לחצאים משלימים של חלבוני ניאון ומבני בהתאמה מוכנסי תאי צמח באמצעות שינוי בתיווך Agrobacterium. בהמשך לכך, החלבונים באים לידי ביטוי בtransiently עלי טבק וניתן לאתר אותות ניאון המשוחזר עם לייזר סריקת מיקרוסקופ confocal בתאים שלמים. זה מאפשר הדמיה לא רק של האינטראקציה עצמה, אלא גם לוקליזציה subcellular של קומפלקסי החלבונים ניתן לקבוע. לצורך כך, ניתן coexpressed גנים סמן המכילים תג ניאון יחד עם מבני BiFC, וכך לדמיין מבנים הסלולר כגון tהוא endoplasmic reticulum, מיטוכונדריה, מנגנון Golgi או קרום הפלזמה. אות הניאון ניתן לנטר באופן ישיר בתאי עלה אפידרמיס או בprotoplasts הבודד, אשר יכול להיות מבודד בקלות מהעלים הטבק השתנו. BiFC הוא אידיאלי ללמוד אינטראקציות בין חלבונים בסביבה הטבעית שלהם בתוך התא החי. עם זאת, יש לו כדי להיחשב כי הביטוי צריך להיות מונע על ידי יזמים חזקים וששותפי האינטראקציה משתנים עקב שילוב של תגי הקרינה גדולים יחסית, מה שעלול להפריע למנגנון האינטראקציה. עם זאת, BiFC הוא גישה משלים מצוינת לשיטות נפוצות מיושמות אחרות חוקרים אינטראקציות בין חלבונים, כגון coimmunoprecipitation, במבחני חוץ גופית נפתחים או ניסויי שמרים ושניים-היברידיים.
Introduction
לומד את היווצרות של קומפלקסי חלבונים והלוקליזציה שלהם בתאי צמח in vivo היא חיונית כדי לחקור רשתות סלולריות, איתות ותהליכי חילוף חומרים. BiFC מאפשר הדמיה של אינטראקציות בין חלבונים בסביבה הטבעית שלהם ישירות בתוך תא הצמח החי 1-5.
בBiFC להתקרב לשלמה של שני שברי N-ו-C-מסוף nonfluorescent של עופרת חלבון פלואורסצנטי לחלבון פלואורסצנטי מחדש. שברי חלבוני ניאון רבים ושונים שימשו כדי לזהות אינטראקציות חלבון, למשל החלבון פלואורסצנטי הירוק (GFP) כרומופור של אשר נוצר כימי על ידי שלוש שאריות שונות 6. ניתן לחצות חלבוני ניאון בתוך לולאה או SS-גדיל להביא שני שברי nonfluorescent אשר ניתן התמזגו שני החלבונים של עניין. Assay יכול לשמש כדי לזהות אינטראקציות בכל compartme subcellularnt בכל אורגניזם גדל אירובי או תאים שיכולים להיות מהונדס גנטי כדי לבטא חלבוני ההיתוך. אם שני החלבונים באים בסמיכות בתוך התא, הקרינה היא מחדש והוא יכול להיות במעקב על ידי מיקרוסקופ ללא התוספת של fluorophores או צבעים 3 אקסוגניים.
טבק (benthamiana Nicotiana) הוכיח להיות אורגניזם מודל נוח לדמיין את האינטראקציה של חלבונים צמחיים, שכן בקלות ניתן לבטא חלבונים על ידי ניצול שינוי בתיווך Agrobacterium של טבק עם המבנים שנוצרו. Agrobacteria להשתמש פלסמיד שנקרא Ti (גידול גרימת) קידוד עבור אנזימים שלתווך התמרה של הגן של עניין לתאי צמח. BiFC הוא גם ישים עבור מסיס, כמו גם לחלבוני קרום בתוך כל התאים הסלולריים ושמש בהצלחה בשנים האחרונות לזהות אינטראקציה חלבוני in vivo, כמו גם לנתח אתרי אינטראקציהבתוך החלבונים 7-9. על הביטוי של הגנים הציגו, את האינטראקציה של חלבוני הניאון ניתן דמיינו ישירות בעלים, אשר מתאימה למבנים הסלולר גדולים יותר, כמו reticulum endoplasmic (ER), קרום הפלזמה או כלורופלסטים. עם זאת, כדי לפקח על הלוקליזציה במבנים מעודנים יותר, למשל, את מעטפת הכלורופלסט, רצוי לדמיין את הקרינה בprotoplasts מבודדת מעלי טבק השתנו. קבוצה של וקטורי BiFC המכילים גם C-מסוף או תג ניאון N-מסוף צריך לשמש לגישת BiFC בצמחי 10. הפרוטוקול המתואר להלן שימש כדי לחקור את האינטראקציה חלבון cytosolic הלם חום 90 (Hsp90) של עם חוזר tetratricopeptide תחום (TPR) המכיל חלבוני עגינת Toc64 וAtTPR7 מתגוררים במעטפת החיצונית הכלורופלסט וreticulum endoplasmic, בהתאמה 11-13. לצורך כך, Hsp90 היה התמזגו לCtחלק erminal של SCFP (SCFP C). התג היה N-סופני התמזגו למלווה כדי להבטיח נגישות של המוטיב בטרמינל C-MEEVD המחייב של Hsp90 כדי לצבוט מסוג תחומים TPR. במקביל, חלק N-המסוף של ונוס (Venus N) היה התמזגו לתחומי cytosolic של תחום TPR המכיל חלבוני עגינת Toc64 וAtTPR7, בהתאמה. כביקורת שלילית שאנו משובטים חלק מסיס בטרמינל C-C של SCFP אך ורק בו מתגורר בcytosol ולכן שליטה מתאימה.
תגי הניאון של החלבונים למדו צריכים להתמודד באותו תא סלולארי כדי לאפשר לסמיכות ובכך הכינון מחדש של אות הניאון. כדי לקבוע את הלוקליזציה של אות הניאון מחדש חלבון סמן התמזגו לתג ניאון שונה ניתן cotransformed כדי להדגים את לוקליזציה subcellular של האינטראקציה. חלבון סמן ER התמזגו mCherrry הפך בו זמנית במקרה של ER ממוקם 14 AtTPR7. Autofluorescence של כלורופיל שימש כסמן הכלורופלסט במקרה של Toc64. לפי זה לא רק האינטראקציה in vivo של Toc64 וAtTPR7, בהתאמה, עם מלווה Hsp90 cytosolic ניתן לנטר ישירות בי הטבק אלא גם לוקליזציה subcellular של האינטראקציה יכולה להיחקר.
BiFC מתאים גם כגישה משלים לשיטות אחרות לומדות אינטראקציות בין חלבונים. בהשוואה לcoimmunoprecipitation או בניסויים נפתחים מבחנה, למשל, אין נוגדנים ספציפיים צריכים להיות זמין לחלבונים של עניין, והחלבונים לא צריכים לבוא לידי ביטוי recombinantly במבחנה, מה שיכול להיות מאתגר, במיוחד לחלבונים בממברנה. יתר על כן, גם ניתן לנטר אינטראקציות חולפות באמצעות BiFC, שכן החלבונים שנתפסו על ידי האינטראקציה של תגי הניאון התמזגו 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. טרנספורמציה של BiFC הבונה בAgrobacteria
- שיבוט של מבני BiFC
- להגביר את הגן של עניין מתבנית מתאימה באמצעות oligonucleotides מכילה attB אתרי איגוף. לבצע PCR באמצעות פולימראז הגהה. להתאים את אורך צעד חישול לשילוב פריימר תוכנן ואת אורכו של שלב התארכות בהתאם לגודל השבר. בדוק את המוצר ה-PCR על ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose ולטהר אותו על ידי שימוש בערכת ה-PCR לנקות.
- בצע את תגובת BP עם שבר שהושג ואת וקטור הכניסה באמצעות recombinase BP. מערבבים 15-150 ng של מוצר attB-PCR עם 150 ng של וקטור הכניסה, להוסיף 2 μl של recombinase BP ולהתמלא בTE חיץ להיקף כולל של 8 μl. דגירה התגובה עבור שעה 1 ב RT ולעצור את התגובה על ידי הוספת 2 μl proteinase K 10 דקות ב 37 ° C.
- להפוך כל התגובה לE. המוסמך coli DH5α; תאים ומסך המושבות מתקבלות על ידי המושבה PCR להכנסה נכונה של קטע DNA לתוך הווקטור. רצף ה-DNA של פלסמידים חיוביים מתבצע כדי לוודא היעדר המוטציות.
- השתמש בשיבוט הכניסה מתקבל עבור רקומבינציה LR עם וקטור היעד המתאים באמצעות recombinase LR. מערבבים 50-150 ננוגרם של וקטור הכניסה עם 150 ng של וקטור היעד, להוסיף recombinase LR μl 1 ולהתמלא בTE חיץ להיקף כולל של 5 μl. דגירה התגובה עבור שעה 1 ב RT ולעצור את התגובה על ידי הוספת 1 μl proteinase K 10 דקות ב 37 ° C.
- להפוך כל התגובה לתאים המוסמכים E. coli DH5α ומסך המתקבלים על ידי מושבות המושבה PCR להכנסה נכונה של קטע DNA לתוך הווקטור. רצפי DNA אין צורך בשלב זה.
- לבודד את ה-DNA פלסמיד עם ערכת פלסמיד Mini כדי להבטיח רמה גבוהה של טוהר.
- הכנת Agrobacteria כימית המוסמך (AGL1 המתח, ריפאמפיצין והתנגדות Carbenicillin)
- agrobacteria פס מ תרבות המניה ולגדול ל24 שעות ב28 ° C.
- לחסן 5 מיליליטר מדיום LB עם מושבה אחת ודגירת הלילה בשעה 28 ° C.
- לחסן 50 מיליליטר מדיום LB עם 2 מיליליטר של תרבות הלילה ולגדול לכ 4 שעות ב28 ° C ל OD 600 של 1.0.
- צנטריפוגה התאים ב XG 3,000 15 דקות ב 4 ° C ו resuspend את הכדור ב 1 מיליליטר עיקור קר כקרח CaCl 2 (10 מ"מ). שמור את התאים על קרח לאחר שלב זה.
- הכן aliquots (100 μl) של התאים, להקפיא באופן מיידי בחנקן הנוזלי ולאחסן ב -80 ° C.
- טרנספורמציה של Agrobacteria כימי המוסמך
- הפשירו aliquot אחד מתאי AGL1 המוסמכים על קרח. להוסיף 1-2 מיקרוגרם של ה-DNA פלסמיד לתאים. דגירה במשך 5 דקות על קרח, 5 דקות בחנקן נוזלי ו5 דקות ב37 ° C. הוספת 600 מדיום LB μl לתאים והיםהייק ב650 סל"ד במשך 4 שעות ב28 ° C.
- צנטריפוגה התאים 1 דקות ב8,000 XG וזורקים supernatant. Resuspend את הכדור ב50 μl של המדיום שנותר LB וצלחת על צלחות LB המכילות האנטיביוטיקה המתאימה. לאטום את הצלחות ודגירה עבור 2 ימים ב28 ° C. מושבות מסך לנוכחות של פלסמיד על ידי המושבה PCR.
- לחסן מושבה אחת חיובית ב5 מיליליטר מדיום LB המכיל האנטיביוטיקה המתאימה ולדגור על 28 ° C במשך הלילה. מערבבים 500 μl של תרבות הלילה עם 500 μl 50% גליצרול מעוקר ולהקפיא ב -80 ° C.
- לחסן agrobacteria במדיום LB המכיל האנטיביוטיקה המתאימה ישירות ממניית גליצרול לשינוי זמני של עליי טבק.
2. טרנספורמציה חולפת של עליי טבק
- Agrobacteria צמיחה
- הכן פתרונות המניות הבאים: acetosyringone (150 מ"מ, מתמוסס ב70% EtOH), חנות aliquots ב -20 ° C. pH MES / KOH (0.1 M) 5.7, לאחסן ב 4 ° C (סינון סטרילי דרך מסנן 0.2 מיקרומטר כדי למנוע התפתחות חיידקים במהלך אחסון ארוך יותר), מניית MgCl 2 (ז 1), חנות ב RT.
- לחסן 10 מיליליטר מדיום LB המכיל אנטיביוטיקה המתאימה עם 50 μl של תרבות מניית גליצרול AGL1 המכילה את הפלסמיד של עניין בצינור מיליליטר סטרילי 50 ולדגור על 28 מעלות צלזיוס במשך לפחות 24 שעות רועד ב190 סל"ד עד OD 600 בין 1.0 הוא הגיע -2.0.
- חיידקי צנטריפוגה ב 3,000 XG במשך 15 דקות. Resuspend את הכדור במדיום הסתננות טרי [MgCl 2 (10 מ"מ), pH MES / KOH (10 מ"מ) 5.7, acetosyringone (150 מיקרומטר)] ולהתאים את ההשעיה לOD 600 של 1.0.
- דגירה תאי agrobacteria בייקר תקורה לשעה 2 בחושך. התאים לאחר מכן ניתן להשתמש לחדירה.
- הסתננות של עליי טבק
- להשתמש בשלושטבק ישן שבוע צמחים (benthamiana Nicotiana). בחר כמה עלים מבוגרים להסתננות.
- לערבב כמויות שווה של agrobacteria נושא את המבנים של עניין (3 מיליליטר כל אחד). קח מזרק 5 מיליליטר ללא מחט להסתננות. לחדור את ההשעיה התא בזהירות לתוך עלי הטבק על ידי לחיצה על המזרק בצד התחתון של העלים בכמה מקומות.
- להשקות את הצמחים ולהשאיר אותם בחושך במשך יומיים.
3. Protoplast הכנה
הכנת Protoplast של עליי טבק הותאמה מKoop et al. 16 ושונים מעט.
- הכנת חיץ
- להכין מדיום F-PCN: מאקרו-מלחים [kno 3 (1012 מיקרוגרם / מיליליטר), CaCl 2 • 2H 2 O (440 מיקרוגרם / מיליליטר), 4 MgSO • 7H 2 O (370 מיקרוגרם / מיליליטר), KH 2 PO 4 ( 170 מיקרוגרם / מיליליטר), [4 succinate-NH (20 מ"מ; להכין סול מניית 2 Mution (succinate (236 מיקרוגרם / מיליליטר) ו4 Cl NH (106 מיקרוגרם / מיליליטר), להתאים את ה-pH 5.8 לפזר)], מיקרו מלחים [EDTA-Fe (III) x Na-מלח (40 מיקרוגרם / מיליליטר), KJ (0.75 מיקרוגרם / מיליליטר), H 3 BO 3 (3 מיקרוגרם / מיליליטר), 4 MnSO • H 2 O (10 מיקרוגרם / מיליליטר), 4 ZnSO • 7H 2 O (2 מיקרוגרם / מיליליטר), Na 2 Moo 4 • 7H 2 O (0.25 מיקרוגרם / מיליליטר), 4 CuSO • 5H 2 O (0.025 מיקרוגרם / מיליליטר), CoCl 2 • 6 שעות 2 O (0.025 מיקרוגרם / מיליליטר)], MES (390 מיקרוגרם / מיליליטר), גלוקוז (כ 80 מיקרוגרם / מיליליטר) mOsm osmolarity 550, pH 5.8 (KOH). חנות בaliquots ב -20 ° C.
- להכין מדיום F-PIN: כל המרכיבים כמו F-PCN אבל במקום סוכרוז גלוקוז שימוש (כ 110 מיקרוגרם / מיליליטר), osmolarity 550 mOsm, pH 5.8 (KOH). חנות בaliquots ב -20 ° C.
- להכין מדיום W5: 150 mM NaCl, 125 מ"מ CaCl 2, 5 מ"מ KCl, MES 2 מ"מ, osmolarity 550-580 mOsm, pH 5.7 (KOH). חנות ב 4 °; C (מסנן סטרילי דרך מסנן 0.2 מיקרומטר כדי למנוע התפתחות חיידקים במהלך אחסון ארוך יותר).
- הכן את פתרון אנזים טרי לבידוד protoplast (0.1 cellulase גרם, 0.03 macerozym גרם ב10 מיליליטר F-PIN). דגירה הפתרון ב55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ומגניבות RT. הוספה של BSA 10% 100 μl ל10 מיליליטר פתרון.
- בידוד של protoplasts
- מניחים עלה אחד הסתנן לתוך צלחת פטרי ולהוסיף את פתרון האנזים הטרי. השתמש בסכין גילוח חדש לחתוך את העלה לכ 0.5 סנטימטר 2 חתיכות בגודל. מעביר את העלים החלקים עם פתרון האנזים לתוך בקבוק ואקום חדירה והאבק לחדור לכ 20 שניות עד בועות אוויר יוצאות מהעלים (ואקום שחרורו בזהירות רבה).
- לנער את הבקבוק ל90 דקות ב40 סל"ד בחושך.
- שחרר protoplasts ידי טלטול 1 דקות ב90 סל"ד. סנן את הפתרון באמצעות גזה (100 מיקרומטר) לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר (תחתית עגולה). Overlay פתרון protoplast עם 2 מיליליטר חיץ F-PCN ו צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 70 XG (תאוצה איטית והאטה) ב RT.
- protoplasts ללא פגע לצבור על הממשק של פתרון האנזים וה-F-PCN. קח את קצה פיפטה מיליליטר רחב פתח 1 להעביר protoplasts השלמה לתוך צינור צנטריפוגות טרי ולהתמלא בחיץ W5. צנטריפוגה במשך 2 דקות ב100 XG (האצה האטה איטית) לגלולת protoplasts.
- הסר את supernatant בזהירות באמצעות פיפטה וגלולה resuspend בכ 200 חיץ W5 μl, בהתאם לכמות של protoplasts.
- השתמשו תמיד בטיפי פתח רחבים כדי למנוע פקיעה של protoplasts ללא פגע.
4. לייזר סריקה מיקרוסקופית
- הכנת מדגם
- להדביק שתי רצועות קטנות של חומר איטום סביב שקופיות מיקרוסקופ (למעט 2 סנטימטר). הנח 20 μl של פתרון protoplast בין הרצועות ומניח את מכסה זכוכית בזהירותעל העליונה. רצועות איטום לוודא כי protoplasts אינם נמעך על ידי כיסוי הזכוכית.
- לסך דגימות עלים לחתוך חתיכת 1 סנטימטר מהעלה ולמקם אותו על גבי שקופיות מיקרוסקופ עם הצד התחתון של העלה פונה כלפי מעלה. להוסיף כ 30 μl H 2 O, למקם את כוס על גבי עטיפה ולתקן אותה בחוזקה עם דבק בשני הצדדים.
- הגדרות הדמיה ומיקרוסקופ confocal
- הדמיה מתבצעת באמצעות מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר מיקה, סוג: TCS SP5. להגדלת שימוש בעדשה אובייקטיבית (HCX PL APO CS) עם סדר גודל של 63X עם גליצרול כמדיום הדמיה. הגדר את הצמצם המספרי ל1.3. השתמש בתוכנת Leica Application Suite / מתקדם הקרינה להערכה (ראה משלימה נתונים S1).
- הגדר את לייזר ארגון ל30% וכוח הלייזר ב488 ננומטר לעוצמת 18% לפקח על אות BiFC מחדש ב515 ננומטר ולהגדיר רוחב פס פליטה אחד PMT גלאי 495-550. כדי לפקח autofluorescence כלורופיל להגדיר רוחב פס פליטת גלאי PMT שני 650-705.
- כדי לפקח על אות mCherry להשתמש בליזר HeNe 561, להגדיר את עוצמת הלייזר 561-18% ורוחב פס הפליטה של גלאי PMT שלישי 587-610.
- ודא כי תמונות של כל ערוצי גלאי PMT נלקחות עם אותן הגדרות הרווח (רווח צריך להיות בין 800-900 להוציא אותות רקע).
- צלם תמונות ברוחב / גובה תבנית של 1024 x 1024 פיקסלים עם מהירות סריקה של 100 הרץ.
- עבור Z-stackings להשתמש במרחק מרבי של 0.5 מיקרומטר בין כל ערימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בדוגמא זו השתמשנו בשיטת BiFC לעקוב אחר האינטראקציה של Hsp90 המלווה המולקולרי cytosolic עם חלבוני העגינה קרום AtTPR7 וToc64. AtTPR7 הוא חלק מtranslocon Sec ואינטראקציה עם מלווים cytosolic, שאולי לספק preproteins הפרשה לטרנסלוקציה לאחר translational על קרום ER. כמו כן, Toc64 במעטפת החיצונית הכלורופלסט פועל ביבוא לאחר translational על ידי קבלת preproteins הכלורופלסט קשור Hsp90. שני החלבונים מהווים תחום TPR cytosolic החשוף, אשר מתווך אינטראקציה עם מוטיב MEEVD טרמינל C-של Hsp90.
חלבונים משובטים באמצעות recombinases הספציפי לוקטורי יעד מתאימים פיוזינג תחום TPR המכיל חלבוני עגינה לונוס N, להבטיח כי תג הניאון מחובר לתחום cytosolic ואין וכך לא לעכב את הכניסה מיקוד וקרום של החלבונים. במקרה של Hsp90, SCFP C (איורים 1 ו -2).
AtTPR7 וHsp90 היו cotransformed עם סמן ER (mCherry) כדי לאמת את הלוקליזציה של החלבונים מורכבים. הקרינה הייתה פיקוח בעלים שלמים עם לייזר סריקת מיקרוסקופ. כC שליטת SCFP לבד, הנמצא בcytosol (כמו Hsp90), בא לידי ביטוי יחד עם AtTPR7 וסמן ER. כמה עלים נבדקו לקרינה ותמונות צולמו עם הגדרות מיקרוסקופ זהות. מניסיוננו אות טיפוסית צריכה להיות גלויה עם הגדרות רווח ב800-900, ואילו הביקורת השלילית צריכה להראות הקרינה רקע קלה מאוד עם הגדרות אלה (איור 3) בלבד. אות מחדש עבור ונוס N-AtTPR7 יחד עם SCFP C-Hsp90 ב515 ננומטר הייתה פיקוח חופף עם הסמן בחדר המיון. אין אות לונוס N-ביכולים להיבחן TPR7 וC SCFP ביקורת השלילי.
במקרה של Toc64 וביטוי Hsp90, כמו גם Toc64 וSCFP C, protoplasts בודדו מעליי טבק שחדר, שכן בתמונות מיקרוסקופיות של כל עוזבת את הלוקליזציה המדויקת קשה לקבוע, אם כי הקרינה היא כבר נראה לעין (איורים 4 ו 5). אות ב515 ננומטר שוחזרה להביע Toc64-ונוס N יחד עם SCFP C-Hsp90 במעטפה הכלורופלסט, אשר ניתן היה לזהות כמבני צורת טבעת המקיפים את כלורופלסטים. כאמור השליטה הצטלמה עם הגדרות מיקרוסקופ זהות ולא הראה הקרינה ב515 ננומטר.
דמות1. תהליך שכפול של BiFC בונה. גנים של העניין היו מוגבר עם oligonucleotides מוקפת עו"ד ב 'אתרים כדי לאפשר רקומבינציה BP לתוך וקטור כניסה עם אתרי P עו"ד, ובכך להחליף את גן ccdB בתוך הווקטור. בהמשך לכך וקטור הכניסה היה recombined עם וקטורי יעד מתאימים באמצעות recombinase LR. טרנספורמציה של המבנים הללו לעלי טבק מאפשרת ביטוי של חלבונים התמזגו חלבוני ניאון הפיצול ותגים לגילוי נוגדנים. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 2. מצגת סכמטי של החלבונים המתבטאים בניסויי BiFC. ונוס N הואמצמידים את חלקי cytosolic של Toc64 או AtTPR7 מתגוררים בהכלורופלסט וER, בהתאמה. Hsp90 הוא N-סופני התמזגו SCFP C, מה שמאפשר אינטראקציה של תחומים TPR של Toc64 וAtTPR7 עם Hsp90 C-הסופית. SCFP C לבד בא לידי הביטוי בcytosol כביקורת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. BiFC עם AtTPR7 וHsp90 דמיינו בתאי עלה אפידרמיס טבק. ונוס N-AtTPR7 וSCFP C-Hsp90 היו cotransformed עם סמן ER mCherry (הפנל באמצע) והביעו transiently בי טבק. כביקורת ונוס N-AtTPR7 הייתה cotransformed עם SCFP
איור 4. BiFC עם Toc64 וHsp90 דמיינו בתאי עלה אפידרמיס טבק. Toc64-ונוס N וSCFP C-Hsp90 באו לידי הביטוי בtransiently עלי טבק. כביקורת Toc64-ונוס N היה cotransformed עם SCFP C בלבד (פנלים תחתון). הקרינה מחדש הייתה פיקוח על 515 ננומטר (פנל משמאל). כיסוי של signal ב515 ננומטר וautofluorescence כלורופיל מוצגת (פנל מימין). autofluorescence כלורופיל מנוטר ב480 ננומטר. ברים סולם:. 10 מיקרומטר אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. BiFC עם Toc64 וHsp90 דמיינו בprotoplasts טבק. Toc64-ונוס N וSCFP C-Hsp90 באו לידי הביטוי בtransiently עלי טבק. כביקורת Toc64-ונוס N היה cotransformed עם SCFP C בלבד (פנלים תחתון). הקרינה מחדש הייתה פיקוח על 515 ננומטר (פנל משמאל) בprotoplasts המבודד. כיסוי של האות ב515 ננומטר וautofluorescence כלורופיל מוצג (פנל מימין). autofluorescence כלורופיל מנוטר ב480 ננומטר. ברים סולם:. 10 מיקרומטר אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
על תכנון ניסוי BiFC כמה נקודות צריכה להיחשב. למרות שאין מידע מבני על החלבונים של העניין נדרש, טופולוגיה צריכה להיות ידועה בעת עבודה עם חלבוני קרום פורש. חלבוני הניאון צריכים להתגורר באותו התא subcellular או פנים באותו הצד של קרום כדי לאפשר אינטראקציה. באופן טבעי, בעת ניתוח חלבונים הדורשים רצף מיקוד N-מסוף, יכול להיחשב רק תג C-מסוף. הכיוון שניתן שהתג מפריע להחדרת מיקוד או קרום תקין של החלבון של עניין זה רצוי לבדוק לוקליזציה subcellular לפני כן, למשל, על ידי לבטא חלבון GFP-tagged. יתר על כן, תמיד צריכה להיות כלול ביקורת שלילית. בדוגמא זו אנו נוצרו מבנה מבטא רק SCFP C בcytosol. עם זאת, כל חלבון שלא צפויה אינטראקציה יכול לשמש כביקורת שלילית. כדי לוודא o ביטוי ההולםו המבנים, במיוחד אם אין הקרינה גלויה, תמציות חלבון של עלים או protoplasts הסתננו יכולות להיות נתונה לביטוי SDS-PAGE והחלבון יכולים להיות מאומתים עם נוגדנים המכוונים נגד תגי ההתאמה.
ניתן לנטר אותות ניאון או בעלים שלמים או protoplasts מבודד. למרות זיהוי בכל עלים הוא מהיר יותר, אותות של מבנים מעודנים יותר הם טובים יותר דמיינו בprotoplasts. יתר על כן, תאים בעיקר אפידרמיס נמצאים תחת פיקוח, כאשר מסתכלים על כל העלה, אשר אינם מכיל כלורופלסטים. לכן, בעת ניתוח חלבוני הכלורופלסט, בידוד של protoplasts רצוי.
היתרון הגדול של השיטה הוא האפשרות לעקוב אחר אינטראקציות בין חלבונים בתאי צמח חיים. אין צורך לשבור את התאים וsolubilize קומפלקסי חלבוני קרום, כפי שהוא במקרה של דוגמא בניסויי coimmunoprecipitation. יתר על כן, הבקשה היא פשוטהמאז החומרים הנדרשים היחידים הם הווקטורים, agrobacteria ומיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי (אם כי תמונות באיכות גבוהות יותר מושגות באמצעות מיקרוסקופ לייזר confocal סריקה). בניגוד במבחנה נפתחת מבחני עם חלבונים רקומביננטיים, אשר רק מאפשרים זיהוי של אינטראקציה אם שני החלבונים נמצאים באינטראקציה ישירה, BiFC יכול גם לזהות קומפלקסי חלבונים הדורשים חלבונים נוספים, אנדוגני הנמצאים בתא. עם זאת, זה גם אומר שBiFC מספק שום הוכחה של אינטראקציה בין חלבונים ישירים, שתמיד צריך להיות מאומתים על ידי טכניקות אחרות. יתר על כן, עקב ביטוי יתר על ידי יזמים חזקים אינטראקציות נוקבות עלולות להתרחש, אשר צריך לשלול על ידי בקרות שליליות מתאימות. לשם כך חלבון לא חזה לאינטראקציה עם החלבון של עניין, אך מתגורר באותו התא, או בונה חסרת צריכים לשמש תחומים האינטראקציה בין חלבונים. בנוסף, סדרת דילול של תקליטור הטרףNA עם cDNA noninteracting כמו גם תצפית של הקרינה באופן תלוי בזמן, לאחר שינוי יכול לעזור כדי לאמת את התוצאות. כדי להבטיח אפליה של אותות ניאון אמיתיים וחפצים יש לכמת את אותות BiFC ולהגדיר לביחס לחלבון אחר הביע ניאון, למשל חלבון סמן 7,8. חסרון נוסף של שיטת BiFC הוא, שאינטראקציות של החלבונים יכולות גם להתעכב sterically ידי תגי ניאון גדולים יחסית.
היישום של שינוי בתיווך Agrobacterium בצמחים אחרים (לדוגמא, ארבידופסיס) הוא מוגבל, עם זאת, זה אפשרי להפוך את ה-DNA פלסמיד ישירות או לתוך protoplasts ארבידופסיס מבודד או להפוך את התאים באמצעות אקדח חלקיקים. עם זאת, ה-DNA פלסמיד צריכה להיות מבודדת באמצעות ערכת MAXI, שכן הוא צריך להיות מרוכז מאוד וטהור ככל האפשר לשינוי protoplast. בעיה נוספת שאנחנו OBServed בשל ביטוי גבוה של חלבוני היעד הייתה צבירה נוקבת בcytosol, במיוחד כאשר עובד עם חלבוני הממברנה של המיטוכונדריה. בעיה זו ניתן להתגבר על ידי שינוי biolistic של תאי בצל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להודות ליורגן סול לדיונים מועילים וכריס קארי לקריאה ביקורתית של כתב היד. פרויקט זה מומן על ידי chemischen DFG וFonds der Industrie (SFB מספרי מענקים 1035, A04 פרויקט לאס והאם 187/22 לRS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3',5'-Dimethoxy-4'-hydroxyacetophenone | Sigma-Aldrich | D134406 | Acetosyringone |
| Cellulase, Onozuka-R10 | Serva | 16419 | from Trichoderma viridae |
| Macerozyme R-10 | Serva | 28302 | from Rhizopus sp. |
| GATEWAY, BP Clonase II, Enzyme Kit | Invitrogen | 11789-(020) | |
| GATEWAY, LR Clonase II, Enzyme Kit | Invitrogen | 11791-(020) | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609-250 | |
| pDEST-GWVYNE | Invitrogen | Gateway-cloning | |
| pDEST-VYNE(R)GW | Invitrogen | Gateway-cloning | |
| pDEST-SCYCE(R)GW | Invitrogen | Gateway-cloning |
References
- Citovsky, V., et al. Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta. J. Mol. Biol. 362, 1120-1131 (2006).
- Schutze, K., Harter, K., Chaban, C. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells. Methods Mol. Biol. 479, 189-202 (2009).
- Weinthal, D., Tzfira, T. Imaging protein-protein interactions in plant cells by bimolecular fluorescence complementation assay. Trends Plant Sci. 14, 59-63 (2009).
- Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. The analysis of protein-protein interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation. Plant Physiol. 145, 1090-1099 (2007).
- Ohad, N., Yalovsky, S. Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants. Methods Mol. Biol. 655, 347-358 (2010).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Lee, L. Y., et al. Screening a cDNA library for protein-protein interactions directly in planta. Plant Cell. 24, 1746-1759 (2012).
- McFarlane, H. E., Shin, J. J., Bird, D. A., Samuels, A. L. Arabidopsis ABCG transporters, which are required for export of diverse cuticular lipids, dimerize in different combinations. Plant Cell. 22, 3066-3075 (2010).
- Dunschede, B., Bals, T., Funke, S., Schunemann, D. Interaction studies between the chloroplast signal recognition particle subunit cpSRP43 and the full-length translocase Alb3 reveal a membrane-embedded binding region in Alb3 protein. J. Biol. Chem. 286, 35187-35195 (2011).
- Gehl, C., Waadt, R., Kudla, J., Mendel, R. R., Hansch, R. New GATEWAY vectors for high throughput analyses of protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation. Mol. Plant. 2, 1051-1058 (2009).
- Qbadou, S., et al. The molecular chaperone Hsp90 delivers precursor proteins to the chloroplast import receptor Toc64. EMBO J. 25, 1836-1847 (2006).
- Schweiger, R., Muller, N. C., Schmitt, M. J., Soll, J., Schwenkert, S. AtTPR7 is a chaperone docking protein of the Sec translocon in Arabidopsis. J. Cell Sci. , (2012).
- Schweiger, R., S, S. AtTPR7 as part of the Arabidopsis Sec post-translocon. Plant Signal Behav. 8, (2013).
- Nelson, B. K., Cai, X., Nebenfuhr, A. A multicolored set of in vivo organelle markers for co-localization studies in Arabidopsis and other plants. Plant J. 51, 1126-1136 (2007).
- Kerppola, T. K. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis as a probe of protein interactions in living cells. Annu. Rev. Biophys. 37, 465-487 (2008).
- Koop, H. U., et al. Integration of foreign sequences into the tobacco plastome via polyethylene glycol-mediated protoplast transformation. Planta. 199, 193-201 (1996).
