Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Белок-белковых взаимодействий визуализируется бимолекулярного флуоресценции комплементации табачными протопластов и листья

Published: March 9, 2014 doi: 10.3791/51327
Automatic Translation
1, 1
1Department Biologie I, Botanik, Ludwig-Maximilians-Universität, München

Summary

Формирование белковых комплексов в естественных условиях могут быть визуализированы бимолекулярного флуоресценции дополнения. Взаимодействие партнеров сливают с дополнительными частями флуоресцентных меток и временно экспрессированного в листьях табака, в результате чего восстановленного флуоресцентного сигнала при непосредственной близости от двух белков.

Abstract

Многие белки взаимодействуют временно с другими белками или интегрированы в мульти-белковых комплексов выполнять свою биологическую функцию. Бимолекулярного флуоресценции комплементация (BiFC) является методом в естественных условиях для мониторинга таких взаимодействий в клетках растений. В представленном протокола исследованные белки-кандидаты слиты с дополнительными половин флуоресцирующих белков и соответствующие конструкции вводятся в клетки растений через агробактериальной трансформации. Впоследствии белки временно экспрессируется в листьях табака и восстановленные флуоресцентные сигналы могут быть обнаружены с конфокальной лазерной сканирующей микроскопии в неповрежденных клетках. Это позволяет не только визуализацию самого взаимодействия, но и внутриклеточной локализации белковых комплексов может быть определена. Для этой цели маркерные гены, содержащие флуоресцентной метки можно коэкспрессируются вместе с конструкциями BiFC, таким образом визуализации клеточных структур, таких как Тон эндоплазматической сети, митохондрий, аппарата Гольджи или плазматическую мембрану. Флуоресцентный сигнал можно контролировать либо непосредственно в эпидермальных клетках листьев или в отдельных протопластов, которые могут быть легко выделенных из трансформированных листьев табака. BiFC идеально подходит для изучения белок-белковых взаимодействий в их естественной среде в живой клетке. Тем не менее, он должен считать, что выражение должно быть обусловлен сильных промоторов и что партнеры взаимодействия изменяются в результате синтеза относительно больших меток флуоресценции, которые могут помешать механизма взаимодействия. Тем не менее, BiFC является отличным дополнительный подход к другим обычно применяемых методов следственных белок-белковых взаимодействий, таких как коиммунопреципитации подтверждено, в пробирке выпадающие анализов или дрожжей двугибридная эксперименты.

Introduction

Изучение образование белковых комплексов и их локализация в клетках растений в естественных условиях имеет важное значение для расследования сотовых сетей, сигнализации и метаболические процессы. BiFC позволяет визуализировать белок-белковых взаимодействий в их естественной среде непосредственно внутри живой клетки растения 1-5.

В BiFC подойти к комплементации двух нефлуоресцирующих N-и С-концевых фрагментов флуоресцентного белка приводит к восстановленной флуоресцентного белка. Фрагменты многих различных флуоресцентных белков были использованы для обнаружения белковых взаимодействий, например, зеленый флуоресцентный белок (GFP) хромофор, который химически образована тремя различными остатками 6. Флуоресцентные белки можно сократить вдвое в течение цикла или бета-цепи, чтобы привести в двух нефлуоресцирующих фрагментов, которые могут быть слиты с обоих белков, представляющих интерес. Анализ может быть использован для обнаружения взаимодействий в любом субклеточном compartmeнт в любом аэробно растущего организма или клетки, которые могут быть генетически модифицированной для экспрессии слитых белков. Если эти два белка вступают в непосредственной близости внутри клетки, флуоресценция восстанавливают и могут быть проверены с помощью микроскопии без добавления экзогенных флуорофоров или красители 3.

Табак (Nicotiana benthamiana) оказалась удобной моделью организм визуализировать взаимодействие растительных белков, так как белки могут быть легко выражены с использованием агробактериальной преобразование табачные листья с сгенерированных конструкций. Agrobacteria использовать так называемый Ti плазмиду (опухоли) индуцировать кодирующих ферменты, которые опосредуют трансдукцию интересующего гена в клетках растений. BiFC хорошо применимы для растворимого, а также для мембранных белков внутри всех сотовых отсеков и успешно используется на протяжении последних лет для выявления взаимодействующих белков в естественных условиях, а также для анализа места взаимодействияв белках 7-9. При экспрессии введенных генов, взаимодействие флуоресцирующих белков могут быть визуализированы непосредственно в листьях, который подходит для более крупных клеточных структур, таких как эндоплазматический ретикулум (ER), плазматической мембране или хлоропластов. Тем не менее, для контроля локализации в более совершенных конструкций, например, хлоропласт конверт, желательно, чтобы визуализировать флуоресценцию в протопласты, выделенных из трансформированных листьев табака. Набор BiFC векторов, содержащих либо С-концевой или N-концевой флуоресцентной метки должен быть использован для подхода BiFC в растениях 10. Описанный протокол далее был использован для изучения взаимодействия цитозольным белка теплового шока 90 (HSP90) с tetratricopeptide повторения домена (TPR), содержащий Док белки Toc64 и AtTPR7 проживающих в хлоропластов внешней оболочки и эндоплазматической сети, соответственно 11-13. Для этой цели HSP90 был слит с Cterminal часть SCFP (SCFP C). Тег был N-терминальной слит с компаньонкой, чтобы обеспечить доступность С-концевой MEEVD обязательного мотивом HSP90 чтобы пресечь типа TPR доменов. Параллельно с этим, N-концевая часть Венеры (Venus N) был присоединен к цитозольными доменов домена TPR, содержащей Док белки Toc64 и AtTPR7 соответственно. В качестве отрицательного контроля мы клонировали растворимого С-концевой частью SCFP С исключительно которая находится в цитозоле и, следовательно, соответствующий контроль.

Флуоресцентные метки изучаемых белков должны столкнуться с той же сотовой отсек, чтобы позволить непосредственной близости и тем самым воссоздание флуоресцентного сигнала. Чтобы определить локализацию восстановленного флуоресцентного сигнала маркер белок, слитый с другом флуоресцентной метки можно котрансформировали, чтобы продемонстрировать внутриклеточную локализацию взаимодействия. ER белковый маркер слит с mCherrry была преобразована одновременно вСлучай ЭР расположенного AtTPR7 14. Аутофлюоресценция хлорофилла служил хлоропластов маркера в случае Toc64. Под этим не только взаимодействие в естественных условиях Toc64 и AtTPR7, соответственно, с цитозольной HSP90 шаперона можно контролировать непосредственно в листьях табака, но и внутриклеточной локализации взаимодействия могут быть исследованы.

BiFC хорошо подходит в качестве дополнительного подхода к другим методам, обучающихся белок-белковых взаимодействий. По сравнению с коиммунопреципитации подтверждено или в пробирке эксперименты ниспадающих, например, нет специфических антител не должны быть доступны для представляющих интерес белков, а белки не должны быть рекомбинантно экспрессировали в пробирке, который может быть сложным, особенно для мембранных белков. Кроме того, также переходные взаимодействия можно контролировать с помощью BiFC, так как белки захвачен взаимодействия конденсированных флуоресцентных меток 15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Трансформация BiFC Создает в Agrobacteria

  1. Клонирование BiFC конструкций
    1. Amplify интересующий ген из соответствующего шаблона с использованием олигонуклеотидов, содержащих фланкирующие attB-сайтов. Выполнение ПЦР с использованием полимеразы корректуры. Адаптация длину стадии отжига до проектируемой грунтовки комбинации и длину шага растяжения в зависимости от размера фрагмента. Проверьте ПЦР-продукта с помощью электрофореза в агарозном геле и очищают его с помощью ПЦР Очистка Kit.
    2. Выполните реакцию ВР с полученного фрагмента и вектор входа с помощью рекомбиназу BP. Смешайте 15-150 нг продукта ПЦР-attB с 150 нг вектора входа, добавить 2 мкл рекомбиназы ВР и заполнить с ТЕ-буфера до общего объема 8 мкл. Инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч при комнатной температуре и останавливают реакцию добавлением 2 мкл протеиназы К в течение 10 мин при 37 ° С
    3. Transform всю реакцию в компетентный E. палочка DH5α; Клетки и скрининг полученных колоний ПЦР колоний для правильной вставки фрагмента ДНК в вектор. Секвенирование ДНК положительных плазмид выполняется для проверки на отсутствие мутаций.
    4. Используйте полученную запись клон для LR рекомбинации с соответствующим вектором назначения с использованием LR рекомбиназу. Смешайте 50-150 нг вектора входа с 150 нг вектора назначения, добавить 1 мкл LR рекомбиназу и заполнить с ТЕ-буфера до общего объема 5 мкл. Инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч при комнатной температуре и останавливают реакцию добавлением 1 мкл протеиназы К в течение 10 мин при 37 ° С
    5. Преобразование всей реакции в компетентные клетки Е.coli DH5α клетках и экран, полученных колоний ПЦР колоний для правильной вставки фрагмента ДНК в вектор. Секвенирование ДНК нет необходимости на этом шаге.
    6. Изолировать плазмидной ДНК с помощью набора плазмида Mini, чтобы обеспечить высокую степень чистоты.
  2. Получение химически компетентных Agrobacteria (штамм AGL1, рифампицин и сопротивление Карбенициллин)
    1. Серия из агробактерии от исходной культуры и растут в течение 24 часов при 28 ° С
    2. Инокулировать 5 мл LB среды с одной колонии и инкубировать в течение ночи при 28 ° С.
    3. Привить 50 мл LB среды с 2 мл ночной культуры и расти в течение приблизительно 4 ч при 28 ° С до OD 600 1,0.
    4. Центрифуга клетки при 3000 х г в течение 15 мин при 4 ° С и ресуспендируют осадок в 1 мл стерилизованной ледяной CaCl 2 (10 мМ). Держите клетки на льду после этого шага.
    5. Подготовка аликвоты (100 мкл) ячеек, немедленно заморозить в жидком азоте и хранить при температуре -80 ° С.
  3. Трансформация химически компетентным Agrobacteria
    1. Оттепель один аликвоты компетентных AGL1 клеток на льду. Добавить 1-2 мкг плазмидной ДНК в клетки. Выдержите в течение 5 мин на льду, 5 мин в жидком азоте и 5 мин при 37 ° С Добавить 600 мкл LB среды к клеткам и схек при 650 оборотах в минуту в течение 4 часов при 28 ° С.
    2. Центрифуга клетки течение 1 мин при 8000 х г и отбросить супернатант. Ресуспендируют гранул в 50 мкл оставшейся LB среды и пластины на LB-планшеты, содержащие соответствующие антибиотики. Уплотнение тарелки и инкубировать в течение 2 дней при 28 ° С Колонии экрана на присутствие плазмиды с помощью ПЦР колоний.
    3. Инокулировать один положительный колонию в 5 мл LB-среды, содержащей соответствующие антибиотики и инкубировать при 28 ° С в течение ночи. Смешайте 500 мкл ночной культуры с 500 мкл 50% стерилизованного глицерина и заморозить при температуре -80 ° С.
    4. Инокулировать агробактерии в LB среде, содержащей соответствующие антибиотики непосредственно из раствора в глицерине для временной трансформации табачных листьев.

2. Переходные Трансформация табачных листьев

  1. Agrobacteria рост
    1. Подготовьте следующие растворы: ацетосирингона (150 мм, растворяются в 70% EtOH), магазин виде аликвот при -20 ° С. МЭС / КОН (0,1 М) рН 5,7, хранят при температуре 4 ° C (стерильных фильтров через 0,2 мкм фильтр, чтобы предотвратить рост бактерий в течение более длительного хранения), MgCl 2 (1 М) акции, хранить при комнатной температуре.
    2. Инокулировать 10 мл LB среды, содержащей соответствующие антибиотики с 50 мкл AGL1 глицерина исходной культуры, содержащей плазмиду интереса в стерильной 50 мл пробирку и инкубируют при 28 ° С в течение по меньшей мере 24 ч встряхивании при 190 оборотах в минуту до тех пор, наружным диаметром 600 между 1,0 -2.0 достигается.
    3. Центрифуга бактерии при 3000 х г в течение 15 мин. Ресуспендируют осадок в свежеприготовленный инфильтрации среды [MgCl 2 (10 мМ), MES / KOH (10 мМ) рН 5,7, ацетосирингона (150 мкМ)] и регулировать подвеску к OD 600 1,0.
    4. Выдержите агробактерии клеток в накладных шейкере в течение 2 часов в темноте. Клетки затем могут быть использованы для инфильтрации.
  2. Проникновение листьев табака
    1. Используйте тринеделя табачные (Nicotiana benthamiana) растения. Выберите несколько старых листьях для инфильтрации.
    2. Смешайте равные объемы агробактерии несущих конструкций, представляющих интерес (3 мл каждый). Возьмем 5 мл шприц без иглы для инфильтрации. Проникнуть клеточной суспензии осторожно в листьях табака, нажав на шприц на нижней стороне листьев в нескольких местах.
    3. Поливают растения и оставить их в темноте в течение двух дней.

3. Протопластов Подготовка

Протопластов подготовка листьев табака был адаптирован из Куп и др.. 16 и слегка изменен.

  1. Подготовка буфера
    1. Подготовьте F-PCN среды: Макро-соли [KNO 3 (1012 мкг / мл), CaCl 2 • 2H 2 O (440 мкг / мл), MgSO 4 • 7H 2 O (370 мкг / мл), KH 2 PO 4 ( 170 мкг / мл), NH 4-сукцинат [(20 мМ; подготовить 2 М исходного золяution (сукцинат (236 мкг / мл) и NH 4 Cl (106 мкг / мл), чтобы отрегулировать рН 5,8 до растворения)], микро-соли [ЭДТА Fe (III) х Na-соль (40 мкг / мл), KJ (0,75 мкг / мл), H 3 BO 3 (3 мкг / мл), MnSO 4 • H 2 O (10 мкг / мл), ZnSO 4 • 7H 2 O (2 мкг / мл), Na 2 MoO 4 • 7H 2 O (0,25 мкг / мл), CuSO 4 • 5H 2 O (0,025 мкг / мл), CoCl 2 • 6H 2 O (0,025 мкг / мл)], MES (390 мкг / мл), глюкоза (около 80 мкг / мл) осмолярность 550 мОсм, рН 5,8 (КОН). Хранить в аликвоты при -20 ° С.
    2. Подготовка F-PIN-носитель: Все ингредиенты как F-PCN но вместо глюкозы использования сахарозы (примерно 110 мкг / мл), осмолярность 550 мОсм, рН 5,8 (KOH). Хранить в аликвоты при -20 ° С.
    3. Подготовка W5 среды: 150 мм NaCl, 125 мМ CaCl 2, 5 мМ KCl, 2 мм MES, осмолярность 550-580 мОсм, рН 5,7 (КОН). Хранить при 4 °; С (стерильный фильтр через фильтр 0,2 мкм для предотвращения роста бактерий в течение более длительного хранения).
    4. Подготовьте свежий раствор фермента для протопластов изоляции (0,1 г целлюлазы, 0,03 г macerozym в 10 мл F-контактный). Инкубируйте раствор при 55 ° С в течение 10 мин и охлаждают до комнатной температуры. Добавьте 100 мкл 10% BSA в 10 мл раствора.
  2. Выделение протопластов
    1. Поместите один лист проникли в чашку Петри и добавить свежий раствор фермента. Используйте новую бритву, чтобы сократить лист в примерно 0,5 см 2 части размера. Трансфер жуков-части с ферментного раствора в вакуум-инфильтрации колбу и вакуум проникнуть примерно 20 сек, пока пузырьки воздуха не появляются из листьев (выпуск вакуумных очень тщательно).
    2. Встряхнуть флакон в течение 90 мин при 40 оборотах в минуту в темноте.
    3. Выпуск протопластов путем встряхивания в течение 1 мин при 90 оборотах в минуту. Раствор фильтруют через марлю (100 мкМ) в 15 мл центрифужную пробирку (с круглым дном). Наложение протопластов решение с 2 мл F-PCN буфера и центрифуги в течение 10 мин при 70 мкг (медленно ускорения и замедления) при комнатной температуре.
    4. Интактные протопласты накапливаться на поверхности раствора фермента и F-PCN. Возьмите широкий отверстие 1 мл пипетки для передачи нетронутыми протопластов в свежем трубки центрифуги и залейте W5 буфера. Центрифуга в течение 2 мин при 100 мкг (медленно ускорения и замедления) для осаждения протопластов.
    5. Удалить супернатант осторожно с помощью пипетки и ресуспендируют осадок в приблизительно 200 мкл буфера W5, в зависимости от количества протопластов.
    6. Всегда используйте широкие советы диафрагм для предотвращения разрыву неповрежденных протопластов.

4. Лазерной сканирующей микроскопии

  1. Подготовка образца
    1. Вставить две маленькие полоски герметика вокруг предметное стекло микроскопа (2 см друг от друга). Поместите 20 мкл протопластов решения между полосками и осторожно поместите покровного стеклана вершине. Герметика ленты убедитесь, что протопласты не раздавлены покровного стекла.
    2. Для всего пробы листьев вырезать кусок 1 см от листа и поместить его на предметное стекло микроскопа с нижней стороны листа вверх. Добавьте примерно 30 мкл H 2 O, разместить покровного стекла на вершине и исправить ее плотно скотчем с обеих сторон.
  2. Конфокальной микроскопии и микроскоп настройки
    1. Изображений осуществляется с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии от Leica, Тип: TCS SP5. Для увеличения использовать объектив (НСХ PL APO CS) с магнитудой 63x с глицерином, как изображения среды. Установите числовую апертуру до 1,3. Используйте программное обеспечение Leica Application Suite / Расширенный флуоресценции для оценки (см. дополнительные данные S1).
    2. Установите лазер аргона до 30% и мощность лазера 488 нм к интенсивности 18% для мониторинга водостойких сигнал BiFC при 515 нм и установить один PMT пропускная способность излучения детектор от 495-550. Для контроля хлорофилла аутофлюоресценция установить второй полосы пропускания излучения детектор ФЭУ от 650-705.
    3. Для мониторинга сигнала mCherry использовать гелий-неоновый лазер 561, установить интенсивность лазера 561 до 18% и полосу пропускания излучения третьего детектора ФЭУ от 587-610.
    4. Убедитесь, что фотографии всех каналов детектора ФЭУ взяты с теми же настройками чувствительности (усиления должен быть между 800-900 исключить фоновые сигналы).
    5. Сфотографируйте в формате ширины / высоты 1024 x 1024 пикселей со скоростью сканирования 100 Гц.
    6. Для Z-stackings использовать максимальное расстояние 0,5 мкм между каждого стека.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В этом примере мы использовали метод BiFC контролировать взаимодействие цитозольный молекулярной шаперонной HSP90 с мембранных док белков AtTPR7 и Toc64. AtTPR7 является частью транслокона Sec и взаимодействует с цитозольными сопровождающих, которые, возможно, доставить секреторных препротеинов для пост-трансляционной транслокации в мембране ЭР. Кроме того, Toc64 на хлоропластов внешней оболочки действует в пост-трансляционной импорта, получив HSP90 связанные хлоропластов препротеинов. Оба белка включают цитозольного подвергается TPR домен, который опосредует взаимодействие с С-концевым мотивом MEEVD HSP90.

Белки были клонированы с помощью конкретных рекомбиназ в подходящие векторы назначения дублирующих домен, содержащий TPR Док белки Венеры N, гарантируя, что флуоресцентный тег прикреплен к цитозольного домена и таким образом, не мешать прицеливания и мембраны введение белков. В случае HSP90, SCFP C (фиг. 1 и 2).

AtTPR7 и HSP90 были котрансформировали с ER маркера (mCherry) проверить локализацию белкового комплекса. Флуоресценции контролировали в неповрежденных листьев с лазерным сканирующим микроскопом. В качестве контрольной SCFP только C, который находится в цитозоле (как HSP90) была выражена, наряду с AtTPR7 и ER маркера. Несколько листья были проверены на флуоресценции и фотографии были сделаны с одинаковыми настройками микроскопа. По нашему опыту типичный сигнал должен быть виден с настройками усиления на 800-900, в то время как отрицательный контроль должен только показать очень небольшой фоновой флуоресценции с этими настройками (рис. 3). Воссоздана сигнал для Венеры N-AtTPR7 вместе с SCFP C-HSP90 при 515 нм контролировали перекрытия с ER маркера. Нет сигнала для Венеры N-AtTPR7 и отрицательный контроль SCFP C можно было наблюдать.

В случае Toc64 и выражения HSP90, а также Toc64 и SCFP С протопласты были изолированы от проникших листьев табака, так как в микроскопических снимков всей оставляет точная локализация трудно определить, хотя флуоресценции уже видно (рис. 4 и 5). Сигнал на 515 нм была восстановлена ​​выражения Toc64-венерный N вместе с SCFP C-HSP90 в оболочке хлоропластов, который может быть обнаружен как кольцевых структур, окружающих хлоропласты. Как над регулятором сфотографировался с идентичными настройками микроскопа и не показали флуоресценцию 515 нм.

Рисунок 1
Фигура1. Клонирование процедура BiFC строит. Гены, представляющие интерес, усиливается с олигонуклеотидов окружении ДОП В сайтов, чтобы позволить BP рекомбинации в вектор входа с сайтов ATT P, тем самым заменяя ген БДКК в векторе. Впоследствии вектор запись была рекомбинации с соответствующими векторами назначения с использованием LR рекомбиназу. Трансформация этих конструкций в листьях табака позволяет выражение белков, слитых с расщепленных флуоресцентных белков и тегов для выявления антител. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 2
Рисунок 2. Схематическое представление белков, выраженных в BiFC экспериментов. Венера N являетсясоединен с цитозольными частях Toc64 или AtTPR7 проживающих в хлоропластов и ER соответственно. HSP90 является N-конце, слитый с SCFP С, что позволяет взаимодействие TPR доменов Toc64 и AtTPR7 с HSP90 С-конца. Одна SCFP C выражается в цитозоле в качестве контроля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. BiFC с AtTPR7 и HSP90 визуализируется в табачных эпидермального клетках листа. Венера N-AtTPR7 и SCFP С-HSP90 были котрансформировали с маркером ER mCherry (средняя панель) и временно экспрессируется в листьях табака. В качестве контроля Венера N-AtTPR7 котрансформировали с SCFP Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4. BiFC с Toc64 и HSP90 визуализируются в табачных эпидермального клетках листа. Toc64-Венера N и SCFP С-HSP90 были временно экспрессируется в листьях табака. В качестве контроля Toc64-Венера N котрансформировали с только SCFP C (нижняя панели). Восстановленный флуоресценции контролировали при 515 нм (слева). Наложение сигНАЛ при 515 нм и хлорофилла автофлуоресценции показано (правая панель). Хлорофилл аутофлюоресценция контролируется при 480 нм. Масштабные бары:. 10 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5. BiFC с Toc64 и HSP90 визуализируется в протопластов табака. Toc64-Венера N и SCFP С-HSP90 были временно экспрессируется в листьях табака. В качестве контроля Toc64-Венера N котрансформировали с только SCFP C (нижняя панели). Восстановленный флуоресценции контролировали при 515 нм (левая панель) в изолированных протопластов. Наложение сигнала на 515 нм и флуоресценции хлорофилла показано (правая панель). Хлорофилл аутофлюоресценция контролируется при 480 нм. Масштабные бары:. 10 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

По планируете эксперимент BiFC несколько точек должны быть рассмотрены. Хотя никакого структурного информация о представляющих интерес белков не требуется, топология должен быть известен при работе с мембраной белков. Флуоресцентные белки должны находиться в том же субклеточной отделении или сталкиваются с теми же сторону мембраны, чтобы позволить взаимодействие. Естественно, при анализе белков, которые требуют N-концевой последовательности прицеливания, только С-концевой тег может быть и речи. Поскольку возможно, что тег мешает правильной направленную доставку или мембраны вставки интересующего белка это целесообразно тестировать внутриклеточную локализацию заранее, например, путем экспрессии GFP-меченый белок. Кроме того, отрицательный контроль всегда должны быть включены. В этом примере мы получили конструкцию только с выражением SCFP C в цитозоле. Однако любой белок, который не оказывает взаимодействовать могут быть использованы в качестве отрицательного контроля. Чтобы убедиться в правильности выражения Oе конструкты, особенно если нет флуоресценции не видно, белковые экстракты из проникших листьев или протопласты могут быть подвергнуты SDS-PAGE и белка выражения можно проверить с помощью антител, направленных против соответствующих тегов.

Флуоресцентные сигналы могут контролироваться либо в неповрежденных листьев или изолированных протопластов. Хотя обнаружение в целых листьев быстрее, сигналы более тонких структур лучше визуализируются в протопластов. Кроме того, в основном клетки эпидермиса контролируются при взгляде на весь лист, которые не содержат хлоропласты. Поэтому при анализе хлоропластов белки, изоляция протопластов является целесообразным.

Основным преимуществом метода является возможность контролировать белок-белковых взаимодействий в живых клетках растений. Там нет необходимости нарушить клетки и для солюбилизации мембраны белковые комплексы, как это имеет место, например, в коиммунопреципитации подтверждено экспериментами. Кроме того, применение просттак как только необходимые материалы векторы, агробактерии и стандартный флуоресцентный микроскоп (хотя более высокое качество изображения достигается с конфокальной лазерной сканирующей микроскопии). В отличие от в пробирке выпадающих анализов с рекомбинантными белками, которые только позволяют обнаруживать взаимодействие если оба белка взаимодействуют непосредственно, BiFC также может обнаружить белковые комплексы, которые требуют дополнительных, эндогенные белки, присутствующие в клетке. Однако, это также означает, что BiFC не предоставляет доказать прямого взаимодействия белок-белок, который всегда должен быть проверен с помощью других методик. Кроме того, из-за повышенной экспрессией по сильных промоторов могут возникнуть неспецифические взаимодействия, которые должны быть исключены с помощью соответствующих отрицательных контролей. Для этого белок не прогнозируется взаимодействовать с белком интересов, но проживающий в том же отделении, или строит хватает домены белок-белковых взаимодействий должны быть использованы. Кроме того, серия разбавление хищных CDН.А. с невзаимодействующей кДНК, а также наблюдения флюоресценции за время зависимым образом после преобразования может помочь для проверки результатов. Для обеспечения дискриминации истинных сигналов люминесцентных и артефактов сигналы BiFC следует количественно и установить в отношении другого выраженной флуоресцентного белка, например маркер белка 7,8. Другим недостатком метода BiFC в том, что взаимодействие белков также может быть затруднено стерически по относительно больших флуоресцентных меток.

Применение агробактериальной трансформации в других растений (например, Arabidopsis) ограничивается, однако, можно трансформировать ДНК плазмиды непосредственно либо в изолированных протопластов Arabidopsis или для трансформации клеток с использованием ружья для частиц. Тем не менее, плазмидную ДНК должны быть изолированы с помощью MAXI комплект, так как он должен быть сконцентрированы и как можно более чистым для трансформации протопластов. Еще одна проблема, мы OBServed из-за высокой экспрессией белков-мишеней был неспецифический агрегации в цитозоле, особенно при работе с митохондриальных мембранных белков. Эта проблема может быть преодолена путем баллистической трансформации клеток лука.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить Юргена Soll за полезные обсуждения и Крис Кэрри за критическое прочтение рукописи. Этот проект финансировался DFG и Fonds дер Chemischen Industrie (гранты цифры SFB 1035, проекта A04 к СС и ли 187/22 для РС).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3',5'-Dimethoxy-4'-hydroxyacetophenone Sigma-Aldrich D134406 Acetosyringone
Cellulase, Onozuka-R10 Serva 16419 from Trichoderma viridae
Macerozyme R-10  Serva 28302 from Rhizopus sp.
GATEWAY, BP Clonase II, Enzyme Kit Invitrogen 11789-(020)
GATEWAY, LR Clonase II, Enzyme Kit Invitrogen 11791-(020)
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit Macherey-Nagel 740609-250
pDEST-GWVYNE Invitrogen Gateway-cloning
pDEST-VYNE(R)GW Invitrogen Gateway-cloning
pDEST-SCYCE(R)GW Invitrogen Gateway-cloning

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Citovsky, V., et al. Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta. J. Mol. Biol. 362, 1120-1131 (2006).
  2. Schutze, K., Harter, K., Chaban, C. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells. Methods Mol. Biol. 479, 189-202 (2009).
  3. Weinthal, D., Tzfira, T. Imaging protein-protein interactions in plant cells by bimolecular fluorescence complementation assay. Trends Plant Sci. 14, 59-63 (2009).
  4. Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. The analysis of protein-protein interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation. Plant Physiol. 145, 1090-1099 (2007).
  5. Ohad, N., Yalovsky, S. Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants. Methods Mol. Biol. 655, 347-358 (2010).
  6. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
  7. Lee, L. Y., et al. Screening a cDNA library for protein-protein interactions directly in planta. Plant Cell. 24, 1746-1759 (2012).
  8. McFarlane, H. E., Shin, J. J., Bird, D. A., Samuels, A. L. Arabidopsis ABCG transporters, which are required for export of diverse cuticular lipids, dimerize in different combinations. Plant Cell. 22, 3066-3075 (2010).
  9. Dunschede, B., Bals, T., Funke, S., Schunemann, D. Interaction studies between the chloroplast signal recognition particle subunit cpSRP43 and the full-length translocase Alb3 reveal a membrane-embedded binding region in Alb3 protein. J. Biol. Chem. 286, 35187-35195 (2011).
  10. Gehl, C., Waadt, R., Kudla, J., Mendel, R. R., Hansch, R. New GATEWAY vectors for high throughput analyses of protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation. Mol. Plant. 2, 1051-1058 (2009).
  11. Qbadou, S., et al. The molecular chaperone Hsp90 delivers precursor proteins to the chloroplast import receptor Toc64. EMBO J. 25, 1836-1847 (2006).
  12. Schweiger, R., Muller, N. C., Schmitt, M. J., Soll, J., Schwenkert, S. AtTPR7 is a chaperone docking protein of the Sec translocon in Arabidopsis. J. Cell Sci. , (2012).
  13. Schweiger, R., S, S. AtTPR7 as part of the Arabidopsis Sec post-translocon. Plant Signal Behav. 8, (2013).
  14. Nelson, B. K., Cai, X., Nebenfuhr, A. A multicolored set of in vivo organelle markers for co-localization studies in Arabidopsis and other plants. Plant J. 51, 1126-1136 (2007).
  15. Kerppola, T. K. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis as a probe of protein interactions in living cells. Annu. Rev. Biophys. 37, 465-487 (2008).
  16. Koop, H. U., et al. Integration of foreign sequences into the tobacco plastome via polyethylene glycol-mediated protoplast transformation. Planta. 199, 193-201 (1996).

Tags

Биологии растений выпуск 85 Tetratricopeptide повторите домена сопровождающий хлоропласты эндоплазматическая сеть HSP90 TOC комплекс § транслокон BiFC
Белок-белковых взаимодействий визуализируется бимолекулярного флуоресценции комплементации табачными протопластов и листья
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schweiger, R., Schwenkert, S.… More

Schweiger, R., Schwenkert, S. Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves. J. Vis. Exp. (85), e51327, doi:10.3791/51327 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter