Summary
In vivo protein komplekslerinin oluşumu bimoleküler floresan tamamlanmasıyla görselleştirilebilir. Etkileşim ortakları floresan etiketler tamamlayıcı bölümlerine bağlı ve geçici olarak tütün yaprakları olarak ifade edilen iki protein arasında yakın üzerine yeniden flüoresan sinyal elde edilir.
Abstract
Çoğu protein, diğer proteinler ile geçici olarak etkileşebilir ya da biyolojik işlevi gerçekleştirmek için, çok-protein kompleksleri halinde entegre edilmiştir. Bimoleküler floresan tamamlama (BiFC), bitki hücrelerindeki bu tür etkileşimlerin görüntülenmesi için bir in vivo bir yöntemdir. Sunulan protokol, incelenen aday proteinlerin floresan proteinleri tamamlayıcı yarılarına kaynaşmış ve ilgili yapılan, Agrobacterium aracılı transformasyon yoluyla bitki hücrelerine dahil edilir. Daha sonra, proteinler, geçici tütün yapraklarının olarak ifade edilmiştir ve geri floresan sinyalleri sağlam hücrelerde konfokal lazer tarama mikroskobu ile tespit edilebilir. Bu etkileşimin kendisinin sadece görselleştirme sağlar, aynı zamanda protein komplekslerinin hücre içi lokalizasyonu belirlenebilir. Bu amaçla, bir fluoresan etiketi ihtiva eden marker genleri böylece bu t olarak hücresel yapılarının görselleştirme, BiFC konstruktları ile birlikte eksprese edilebilirO retikulum, mitokondri, Golgi aygıtı ya da plazma zarı endoplazmik. Flüoresan sinyal ya doğrudan yaprak epidermal hücrelerde ya da kolayca dönüştürülmüş tütün yapraklarından izole edilebilir tek protoplastlar içinde izlenebilir. BiFC ideal olarak canlı hücre içinde kendi doğal ortamda, protein-protein etkileşimleri incelemek için uygundur. Bununla birlikte, bu ifade, güçlü promotörler ile tahrik edilecek ve etkileşim ortakları nedeniyle etkileşim mekanizması ile etkileşebilir nispeten büyük floresan etiketler, füzyonu için modifiye olduğu olduğu kabul edilmelidir. Bununla birlikte, bu tür BiFC coimmunoprecipitation gibi protein-protein etkileşimleri, in vitro pull-down testleri ya da maya iki-hibrid deneylerini araştıran diğer yaygın olarak uygulanan yöntemler için mükemmel tamamlayıcı bir yaklaşımdır.
Introduction
Protein komplekslerinin oluşumunu incelenmesi ve in vivo olarak bitki hücrelerinde hücresel lokalizasyonu ağları araştırmak için gereklidir, sinyalizasyon ve metabolik süreçleri. BiFC doğrudan canlı bitki hücresine 1-5 içinde, doğal ortamda, protein-protein etkileşimleri görselleştirme sağlar.
BiFC bir yeniden floresan protein için bir floresan protein kurşun iki özelliğine sahip olmayan N-ve C-terminal parçalarının tamamlanmasını yaklaşım. Birçok farklı floresan proteinlerin fragmanları da bu, yeşil floresan proteini (GFP), kimyasal olarak üç farklı artıkları 6 tarafından oluşturulduğu bir kromofor, örneğin, protein etkileşimlerini tespit etmek için kullanılmıştır. Floresan proteinleri ilgi iki proteinlere kaynaştırılabilir iki nonfluorescent parçalarının neden olduğu bir ilmek ya da beta-iplikçik içinde yarıya indirilebilir. Deney, bir hücre içi compartme etkileşimleri tespit etmek için kullanılabilirgenetik füzyon proteinleri ifade etmek için modifiye edilebilir bir aerobik olarak büyüyen bir organizmaya veya hücrelerde nt. , Iki proteinin hücre içinde yakın ilişkiye de zorlamaktadır geliyorsa, floresan kurulur ve dışsal florofor veya boyalarla 3 ilavesi olmadan mikroskobu ile izlenebilir.
Proteinler, kolaylıkla üretilen tütün konstruktları ile yaprak arasında Agrobacterium aracılı transformasyon kullanılarak ifade edilebilir çünkü Tütün (Nicotiana benthamiana), bitki protein etkileşimini görselleştirmek için uygun bir model organizma olduğu kanıtlanmıştır. Agrobacteria bitki hücrelerine ilgi konusu genin iletimine aracılık enzim için kodlama yapan bir sözde Ti plazmidi (tümör indükleyici) kullanın. BiFC çözünür hem de bütün hücre bölmesi içinde zar proteinleri için de uygulanabilir olduğunu ve in vivo olarak başarılı bir şekilde etkileşen proteinleri tespit etmek hem de etkileşim bölgelerine analiz etmek için son yıllarda kullanılmıştır7-9 proteinler içinde. Katılan genlerin sentezlenmesi üzerine, floresan protein etkileşimi gibi, endoplazmik retikulum (ER), plazma membranı veya kloroplast gibi daha büyük hücre yapıları için uygun olan, yaprak doğrudan görselleştirilebilir. Ancak, daha fazla rafine yapılarda lokalizasyonunu izlemek için, örneğin kloroplast zarf, bu dönüştürülmüş tütün yapraklarından izole edilmiş protoplastlarda floresan görselleştirmek için tavsiye edilir. Bir C-terminal veya N-terminal floresan etiket bitkiler 10 BiFC yaklaşım için kullanılacak olan ya da ihtiva eden BiFC vektörler bir dizi. Aşağıda açıklanan protokol tetratricopeptide tekrar yanaşan proteinleri Toc64 ve AtTPR7 kloroplast dış zarf ve sırasıyla endoplazmik retikulum, 11-13 ikamet içeren (TPR) etki ile sitozolik ısı şok proteini 90 (HSP90) etkileşimini incelemek için kullanılmıştır. Bu amaçla, HSP90 Ct kaynaştırılmıştırSCFP (SCFP C) erminal parçasıdır. Etiket, N-terminal TPR etki tipte kelepçe HSP90'ın C-terminal MEEVD bağlanma motifi erişim sağlamak için şaperon kaynaşmış oldu. Buna paralel olarak, Venüs (Venus N) en N-ucu kısmı yerleştirme proteinleri sırasıyla Toc64 ve AtTPR7 içeren TPR etki sitosolik etki ile kaynaştırılır. Negatif kontrol olarak, sitosol içinde yer alır ve bu nedenle, uygun bir kontrol olarak yalnızca SCFP C çözünür C-terminal parçası klonlandı.
Üzerinde çalışılan proteinlerin floresan etiketler yakın ve bu şekilde floresan sinyalinin sulandırma izin vermek üzere, aynı hücre bölmesi yüz vardır. Farklı bir floresan etiket ile kaynaşmış bir işaretleyici protein etkileşimi hücre içi lokalizasyonu göstermek için ortak transforme edilebilir yeniden floresan sinyalinin lokalizasyonunu belirlemek. MCherrry kaynaşık bir ER markör proteinin aynı anda dönüştürülmüştürAtTPR7 14 bulunan ER durumda. Klorofil otofloresansı Toc64 durumunda kloroplast marker olarak görev yaptı. Bu sayede sadece sitosolik HSP90 ile, sırasıyla şaperon Toc64 ve AtTPR7, in vivo etkileşim tütün yapraklarının doğrudan izlenebilir değil, aynı zamanda etkileşim hücre içi lokalizasyonu araştırılabilir.
BiFC, protein-protein etkileşimlerini incelemek için diğer yöntemler için tamamlayıcı bir yaklaşım olarak uygundur. Coimmunoprecipitation ya da nitro pull-down deneylerde göre, örneğin, herhangi bir özel antikorlar ilgi konusu proteinleri için kullanılabilir olması gerekir, ve proteinler, özellikle membran proteinleri için, zor olabilir, in vitro olarak rekombinant ifade edilmesi gerekmez. Proteinler kaynaşık floresan etiketler 15 etkileşimi ile yakalanır Üstelik, aynı zamanda geçici etkileşimler, BIFC kullanılarak izlenebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. BiFC transformasyonu, Agrobacterium içerisinde oluşturur
- BiFC yapıların klonlanması
- Yan attB siteleri içeren oligonükleotidler kullanılarak uygun bir şablonundan ilgilenilen geni yükseltin. Bir düzeltme polimeraz kullanılarak, bir PCR gerçekleştirin. Tasarlanan primer kombinasyonu tavlama aşamasının uzunluğunu ve parça büyüklüğüne göre uzama aşamasının uzunluğu ayarlayın. Agaroz jel elektroforezi ile PCR ürünü kontrol ediniz ve bir PCR Temizleme Kit kullanılarak kendisini saflaştırmak.
- Elde edilen fragmanı ile BP reaksiyonu ve bir BP rekombinaz kullanılarak giriş vektörü yapın. Giriş 150 ng vektör ile attB-PCR ürününün 15-150 ng karıştırın, BP rekombinazın 2 ul ekleyin ve 8 ul bir toplam hacme TE tampon maddesi ile doldurmak. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edin ve reaksiyonu 37 ° C'de 10 dakika boyunca 2 ul Proteinaz K eklenerek reaksiyonu durdurmak
- , Yeterli E. içine tüm reaksiyon Transform coli DH5a, Hücreleri ve vektör içine DNA fragmanının sokulması için doğru bir koloni PCR ile elde edilen koloniler ekran. Pozitif DNA sekanslama plasmidlerin mutasyonların varlığını doğrulamak için gerçekleştirilir.
- Bir LR recombinase kullanarak uygun hedef vektörü ile LR rekombinasyon için elde edilen giriş klonu kullanın. Hedef vektör 150 ng giriş vektörü 50-150 ng karıştırın, 1 ul LR rekombinazı ilave edin ve 5 ul bir toplam hacme TE tampon maddesi ile doldurmak. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edin ve reaksiyonu 37 ° C'de 10 dakika boyunca 1 ul Proteinaz K eklenerek reaksiyonu durdurmak
- Vektöre DNA fragmanının sokulması için doğru koloni PCR ile elde edilen koloniler, yeterli E. coli DH5a hücreleri ve ekran içine tüm reaksiyon dönüşümü. DNA diziliş analizi, bu aşamada gerekli değildir.
- Yüksek bir saflık derecesine ulaşmak için bir plazmid mini kiti ile plazmid DNA izole edilir.
- Kimyasal olarak yetkili Agrobacteria (hazırlanmasısuşu AGL1, Rifampisin ve Carbenisilin direnci)
- Çizgi Bir stok kültüründen Agrobakterium ve 28 ° C'de 24 saat için büyümeye
- Tek bir koloni, 5 ml LB ortamı aşılamak ve 28 ° C de bir gece inkübe
- Inoküle 50 2, gece boyunca kültürün ml ve 1.0 OD 600 ile 28 ° C de yaklaşık 4 saat için büyümeye sahip ml LB ortamı.
- 4 ° C'de 15 dakika boyunca 3000 x g'de santrifüj ve hücreler buz soğukluğunda CaCl2 (10 mM) steril 1 ml pelletini. Bu adımdan sonra hücreleri buz üzerinde tutun.
- -80 ° C'de, sıvı azot ve mağaza hemen dondurma, hücrelerin alikotları (100 ul) hazırlayın
- Kimyasal olarak yetkili Agrobacterium transformasyonu
- Buz üzerinde yetkili AGL1 hücrelerinin bir kısım Çözülme. Hücrelere plasmid DNA 1-2 ug ekleyin. Buz üzerinde 5 dakika, 37 ° C de sıvı azot ile 5 dakika içinde 5 dakika boyunca inkübe Hücre ve s 600 ul LB ortamı ilave edin28 ° C'de 4 saat boyunca 650 rpm'de hake
- 8,000 xg'de 1 dakika için hücreler santrifüj ve süpernatant atılır. Uygun antibiyotikler ihtiva eden LB plakaları üzerinde kalan LB ortamı ve plaka 50 ul pelet tekrar. Plakları kapatın ve 28 ° C'de 2 gün boyunca inkübe Koloni PCR ile plazmidin varlığı için ekran kolonileri.
- Uygun antibiyotik içeren 5 ml LB ortamı içinde bir pozitif koloni inoküle ve gece boyunca 28 ° C'de inkübe edin. 500 ul% 50 gliserol ile sterilize edilmiş, gece boyunca kültürün 500 ul karıştırın ve -80 ° C'de dondurularak
- Tütün yapraklarının geçici transformasyon için gliserol stoğundan doğrudan uygun bir antibiyotik ihtiva eden LB ortamı içinde Agrobacteria'yı inoküle.
2. Tütün Yapraklarının geçici Dönüşüm
- Agrobacteria'ı büyüme
- Aşağıdaki stok çözümleri hazırlayın: Acetosyringone (150 mm, 70 çözülür-20 ° C 'de parçalar olarak% EtOH), mağaza MES / KOH (0.1 M), pH 5.7, 4 ° C (daha uzun süre depolama sırasında bakteri gelişimini önlemek için bir 0.2 uM filtre aracılığıyla steril filtre) saklayın, MgCl2 (1 M), hisse senedi, oda sıcaklığında saklayın.
- Bir steril 50 ml tüp içinde, ilgi konusu plazmidi içeren AGL1 gliserol stok kültüründen 50 ul ile uygun bir antibiyotik ihtiva eden 10 ml LB ortamı aşılamak ve en az 24 saat 1.0 arasında bir OD 600 kadar, 190 rpm'de çalkalanarak 28 ° C'de inkübe -2.0 ulaşılır.
- Santrifüj bakteriler 15 dakika boyunca 3.000 xg'de. Taze infiltrasyon ortam içinde pelet [MgCI2 (10 mM), MES / KOH (10 mM), pH 5.7, Acetosyringone (150 uM)] yeniden süspanse edin ve 1.0 OD 600 için süspansiyon ayarlayın.
- Karanlıkta, 2 saat için bir havai çalkalayıcıda Agrobacteria hücreleri inkübe edin. Hücreler daha sonra sızma için kullanılabilir.
- Tütün yaprakları Sızma
- Üç kullanınhaftalık tütün (Nicotiana benthamiana) bitkileri. Süzülmesi için birkaç eski yaprakları seçin.
- Ilgilenilen yapıları (her biri 3 mi) taşıyan agrobakteri eşit hacimlerde karıştırın. Infiltrasyon için bir iğne olmayan bir 5 ml şırınga al. Çeşitli yerlerde yaprakların alt tarafında şırınga basarak tütün yaprakları dikkatli bir hücre süspansiyonu sızmak.
- Bitkilerin su ve iki gün boyunca karanlıkta onları bırakın.
3. Protoplast Hazırlık
Tütün yapraklarının Protoplast hazırlanması Koop et al. 16 uyarlanmıştır ve biraz değiştirilmiştir.
- Tampon hazırlanması
- F-PCN orta hazırlayın: makro tuzları, [3 (1012 ug / ml) KNO, CaCl2 • 2H 2 O (440 ug / ml), MgSO 4 • 7H 2 O (370 ug / ml), KH 2 PO 4 ( 170 ug / ml), NH 4-süksinat [(20 mM, bir 2 M stok eriyiği hazırlamakution] (süksinat (236 ug / ml) ve NH4CI (106 ug / ml), çözünmesi için pH 5.8 'e ayarlayın), mikro tuzları [EDTA-Fe (III), Na-tuzu (40 ug / ml) x KJ (0.75 ug / ml), 3 H BO 3 (3 ug / ml), 4 MnSO • H2O (10 ug / ml), 4 ZnSO • 7H 2 O (2 ug / ml), Na 2 MoO 4 • 7H 2 O (0.25 ug / ml), • 4 CuSO 5H 2 O (0.025 ug / ml), CoCl2 • 6H 2 O (0.025 ug / ml)], MES (390 ug / ml), glikoz (yaklaşık 80 ug / ml), ozmotik basıncı 550 mOsm, pH 5.8 (KOH). -20 ° C 'de parçalar halinde saklayın
- F-PIN orta hazırlayın: F-PCN olarak yerine glikoz kullanımı sukroz (yaklaşık olarak 110 ug / ml), osmolarite 550 mOsm, pH 5.8 (KOH) bütün katkı maddeleri. -20 ° C 'de parçalar halinde saklayın
- W5 orta hazırlayın: 150 mM NaCI, 125 mM CaCl2, 5 mM KCI, 2 mM MES, osmolaritesi 550-580 mOsm, pH 5.7 (KOH). 4 ° Mağazası, C (daha uzun depolama sırasında bakteri gelişimini önlemek için bir 0.2 mikron filtre içinden, steril filtre).
- Protoplast izolasyonu (0.1 g selülaz, 10 ml F-PIN 0.03 g macerozym) için taze enzim çözeltisi hazırlayın. 10 dakika ve oda sıcaklığına soğutun boyunca 55 ° C'de çözelti inkübe edin. 10 ml çözeltiye,% 10 BSA, 100 ul ekleyin.
- Protoplastların izolasyonu
- Bir Petri kutusu içine bir infiltre yaprak koyun ve taze enzim çözeltisi ekleyin. Yaklaşık olarak 0.5 cm büyüklüğünde parçalar halinde 2 yaprak kesmek için yeni bir jilet kullanın. Bir vakum-infiltrasyon şişeye enzim çözeltisi ile yaprak parçaları transfer ve hava kabarcıkları (çok dikkatli bir şekilde serbest bırakma vakum) yaprakların ortaya kadar vakum yaklaşık olarak 20 saniye boyunca sızmak.
- Karanlıkta 40 rpm'de 90 dakika boyunca çalkalanır.
- 90 rpm'de 1 dakika boyunca çalkalanarak protoplast serbest bırakın. Bir 15 ml santrifüj tüpüne (yuvarlak alt) içine gazlı bez (100 uM) ile solüsyon filtre. 70 x g'de oda sıcaklığında (yavaş hızlanma ve yavaşlama) 10 dakika boyunca 2 ml F-PCN tampon ve santrifüj ile protoplast çözelti Yerleşimi.
- Bozulmamış protoplastlar enzim çözeltisi ve F-PCN arayüzünde birikir. Yeni bir santrifüj tüpü içine sağlam protoplastlarını aktarmak ve W5 tamponu ile doldurmak için geniş bir delik 1 ml pipet alın. Protoplast pelet 100 x g (yavaş hızlanma ve yavaşlama) 2 dakika boyunca santrifüjleyin.
- Protoplast miktarına bağlı olarak, yaklaşık olarak 200 ul W5 tamponu içinde bir pipet ve pelet tekrar süspansiyon kullanılarak dikkatli bir şekilde süpernatantı.
- Her zaman olduğu gibi protoplast yırtılmasının önlenmesi için geniş delikli ipuçlarını kullanın.
4. Lazer Tarama Mikroskopi
- Örnek hazırlanması
- Bir mikroskop lamı etrafında sızdırmazlık iki küçük şeritler (2 cm arayla) yapıştırın. Şeritler arasındaki protoplast çözeltisinin 20 ul koyun ve dikkatli bir şekilde bir cam kapak yerüstüne. Sızdırmazlık şeritleri Protoplastlar cam kapak tarafından ezilmiş olmadığından emin olun.
- Toplam yaprak örnekleri yaprak 1 cm parça kesip yukarı bakacak yaprağın alt tarafı ile bir mikroskop lamı üzerine yerleştirin için. , Yaklaşık 30 ul H 2 O ekleyin üstüne bir kapak cam yerleştirin ve her iki tarafta yapışkan bantla sıkıca sabitleyin.
- Konfokal görüntüleme ve mikroskop ayarları
- TCS SP5: Görüntüleme Leica, Tipi konfokal lazer tarama mikroskobu ile yapılır. Büyütme için görüntüleme ortamı olarak gliserol ile 63X bir şiddetinde bir objektif (HCX PL APO CS) kullanın. Sayısal açıklık 1.3 ayarlayın. Değerlendirme için Leica Application Suite / Gelişmiş Flüoresan yazılımını (Ek Bilgi S1 bakınız) kullanın.
- 515 nm 'de yeniden BiFC sinyalinin izlenmesi ve bir PMT 495-550 detektör emisyon bant genişliğini ayarlamak için% 18 oranında bir yoğunluğu 488 nm'de% 30 Argon lazer ve lazer gücü. Klorofil otoflüoresanı izlemek için 650-705 ikinci PMT detektör emisyon bant genişliğini ayarlayabilirsiniz.
- MCherry sinyali HeNe lazer kullanmak 561 izlemek için, lazerin yoğunluğu 561-18 ve% 587-610 üçüncü PMT detektörün emisyon bant genişliği ayarlanır.
- Tüm PMT detektör kanallarına fotoğraf aynı kazanç ayarları (kazancı arka plan sinyallerini dışlamak 800-900 arasında olmalıdır) ile alınır emin olun.
- 100 Hz tarama hızı ile 1024 x 1024 piksel bir biçim genişlik / yükseklik fotoğraflar çekin.
- Z-stackings her yığını arasında 0.5 mikron maksimum mesafe kullanmak için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu örnekte, zar proteinleri yerleştirme AtTPR7 ve Toc64 ile sitosolik moleküler şaperon HSP90'ın etkileşimini izlemek için BiFC yöntemi kullanılır. AtTPR7 Sec translokon bir parçası olan ve muhtemelen ER membranına translasyon sonrası translokasyon için salgılama preproteins teslim sitosolik şaperonlar, ile etkileşime girer. Aynı şekilde, kloroplast dış zarfa Toc64 HSP90 ilişkili kloroplast preproteins alarak post-translasyon ithalat davranır. Her iki protein de HSP90'ın C-terminal MEEVD motifi ile etkileşim aracılık eden bir sitosolik maruz TPR alanı içermektedir.
Proteinler floresan etiket, sitosolik alanına bağlı olduğu ve bu yüzden proteinlerin hedeflenmesi ve membran ekleme engellemeyecek sağlanması, Venus N yerleştirme proteinleri içeren füzyon TPR alanı uygun bir hedef vektörlere özel rekombinaz vasıtasıyla klonlanmıştır. HSP90, SCFP C olması durumunda (Şekil 1 ve 2).
AtTPR7 ve HSP90 protein kompleksinin yerelleştirme doğrulamak için bir ER işaretleyici (mCherry) ile transforme edildi. Florasan bir lazer tarama mikroskobu ile sağlam yaprak izlenmiştir. (HSP90) gibi sitoplazmada bulunan tek bir kontrol SCFP C, olarak, AtTPR7 ve ER işaretleyici ile birlikte ifade edildi. Çeşitli yapraklar floresan için kontrol edildi ve aynı resim mikroskop ayarlarıyla alındı. Negatif kontrol sadece bu ayarlar ile çok hafif arka plan floresan (Şekil 3) göstermesi gerekir oysa bizim deneyim tipik bir sinyal, 800-900 de kazanç ayarları ile görünür olmalıdır. Bir arada 515 nm'de SCFP C-HSP90 ile Venus N-AtTPR7 için bir yeniden sinyali ER marker ile üst üste izlenmiştir. Venüs N-At sinyali yokTPR7 ve negatif kontrol SCFP C gözlenebilir.
Bütün şeklinde mikroskobik resimlerde tam yeri floresan önce (Şekil 4 görünür olmasına rağmen, belirlemek zordur ve yaprakları bu yana Toc64 ve HSP90 ifadesi, hem de Toc64 ve SCFP C durumunda, protoplastlar, infiltre tütün yapraklarından izole edilmiştir 5). 515 nm de bir sinyal kloroplast çevreleyen halka şeklinde yapılar olarak tespit edilebilir kloroplast zarf, bir araya SCFP C-HSP90'ın ile Toc64-Venüs N ifade restore edildi. Yukarıda belirtildiği gibi kontrol özdeş mikroskop ayarları ile fotoğraflandı ve 515 nm 'de bir floresan göstermemiştir.
Rakam1.. BiFC Klonlama prosedürü oluşturur. Ilgi genleri vektör içinde ccdb geni yerine, att P siteleri ile bir giriş vektörü içine BP rekombinasyona izin vermek için att B bölgeleri tarafından takviye oligonükleotidler ile amplifiye edilmiştir. Daha sonra, giriş vektörü bir LR rekombinaz kullanılarak uygun hedef vektörleri ile yeniden birleştirildi. Tütün yapraklarının içine bu yapıların dönüşümü bölünmüş floresan proteinleri ve antikor tespiti için etiketleri kaynaşmış proteinlerin ifadesi. Olanak büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.
Şekil 2. BiFC deneyler içinde ifade edilen proteinlerin şematik sunumu. Venus N'dirsırasıyla, kloroplast ve ER 'in içinde bulunan Toc64 veya AtTPR7 sitozolik bölgelerine bağlanmıştır. HSP90 N-terminal HSP90 C-terminali ile Toc64 ve AtTPR7 en TPR etki etkileşimi sağlayan SCFP C kaynaştırılır. Yalnız SCFP C kontrol olarak sitosolde ifade edilir. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Şekil 3,. AtTPR7 ve tütün yaprak epidermal hücrelerinde görüntülenmiştir HSP90 ile BiFC. Venus N-AtTPR7 ve SCFP C-HSP90 ER MCherry işaretleyici (orta panel) ile transforme edilmiş tütün yaprakları ve geçici olarak ifade edildi. Bir kontrol Venus N-AtTPR7 SCFP ile transforme edildiği gibi
Şekil 4. Toc64 ve HSP90 ile BiFC tütün yaprak epidermal hücrelerinde görüntülenmiştir. Toc64-Venus N ve C-SCFP HSP90 geçici tütün yapraklarının olarak ifade edildi. Bir kontrol olarak Toc64-Venüs N yalnız SCFP C (alt panel) ile transforme edildi. Sulandırılmış floresan 515 nm (sol panel) de izlenmiştir. Sig Yerleşimi515 nm ve klorofil otoflüoresanla de nal (sağ panel) gösterilir. Klorofil otofloresan 480 nm 'de monitorlanır. Ölçek çubukları:. 10 um bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Şekil 5,. Tütün protoplastlarında görüntülenmiştir Toc64 ve HSP90 ile BiFC. Toc64-Venus N ve C-SCFP HSP90 geçici tütün yapraklarının olarak ifade edildi. Bir kontrol olarak Toc64-Venüs N yalnız SCFP C (alt panel) ile transforme edildi. Sulandırılmış floresan izole edilmiş protoplastlarda 515 nm (sol panel) de izlenmiştir. 515 nm ve klorofil otofloresansı sinyalin Kaplama (gösterilmiştirsağ panel). Klorofil otofloresan 480 nm 'de monitorlanır. Ölçek çubukları:. 10 um bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bir BiFC deney planlama üzerine birkaç nokta dikkate alınmalıdır. Ilgilenilen protein ile ilgili yapısal bilgi gerekli olduğundan, topoloji zar kapsayan proteinleri ile çalışan bilinen zorundadır. Floresan proteinleri aynı hücre içi kabininde bulunan ya da etkileşim sağlamak için bir zarın aynı yan yüz gerekir. Bir N-terminal hedefleme sekansı gerekli proteinleri analiz Doğal olarak, yalnızca C-ucu işareti olarak kabul edilebilir. Bu etiket, bir GFP-etiketli proteini ifade ile, örneğin, daha önce hücre içi lokalizasyonu test etmek için tavsiye edilir, ilgi konusu proteinin uygun hedefleme veya zar yerleştirilmesi müdahale mümkündür beri. Ayrıca, negatif kontrol, her zaman dahil edilmelidir. Bu örnekte, sadece sitosol içinde SCFP C ifade eden bir yapı oluşturulur. Bununla birlikte, etkileşim beklenmemektedir herhangi bir protein, bir negatif kontrol olarak da kullanılabilir. Uygun ifade o doğrulamak içinf hiçbir floresanın görünür olduğunu, özellikle de nüfuz yaprak veya protoplast protein ekstreleri SDS-PAGE ile protein ekspresyonu tabi olabilir yapıları, ayrı ayrı etiketlere karşı antikorlar ile doğrulanabilir.
Flüoresan sinyalleri sağlam yaprak ya da izole edilen protoplastlardan ya izlenebilir. Tüm yapraklarda tespiti daha yüksek olmasına karşın, daha ince yapılar işaretleri daha iyi protoplastlarda görselleştirilmektedir. Kloroplast içermeyen tüm yaprak, bakarken Ayrıca, çok epidermal hücreler izlenir. Kloroplast proteinleri analiz, bu nedenle, protoplastların izolasyonu tavsiye edilir.
Tekniğin en büyük avantajı, oturma, bitki hücrelerinde, protein-protein etkileşimleri izlemek için olasılığıdır. Bu coimmunoprecipitation deneylerde, örneğin olduğu gibi, hücreler kırmak ve membran protein komplekslerinin çözündürülmesi için bir ihtiyaç vardır. Ayrıca, uygulama basitsadece gerekli malzeme vektörler, Agrobakterium ve standart bir floresan mikroskobu (daha yüksek kalitede görüntüler, konfokal lazer tarama mikroskobu ile elde edilir, ancak) olduğu. Sadece bir etkileşimin saptanmasını sağlayacak rekombinant proteinleri ile in vitro pull-down deneylerinde aksine her iki proteinin de, doğrudan etkileşim halinde, BiFC ayrıca, hücre içinde mevcut olmayan ilave, endojen proteinler gerektiren protein kompleksleri tespit edebilir. Ancak, bu da BiFC hiçbir zaman diğer tekniklerle doğrulanması gereken bir direkt protein-protein etkileşimi, kanıtı olmaması demektir. Ayrıca, uygun negatif kontroller tarafından ekarte edilmesi gereken spesifik etkileşimler oluşabilir güçlü yararlanıcı tarafından aşın nedeniyle. Bu amaçla, bir protein ilgilenilen protein ile etkileşim tahmin değil, ancak aynı yerde bulunan veya protein-protein etkileşimleri etki kullanılmalıdır eksik oluşturur. Buna ek olarak, av CD'nin bir seyreltme serisiDönüşüm sonra zamana bağlı bir şekilde bir noninteracting cDNA hem de floresan gözlem ile NA sonuçları doğrulamak için yardımcı olabilir. Gerçek floresan sinyalleri ve BiFC sinyalleri, örneğin başka bir ifade floresan proteini, bir işaretleyici protein 7,8 ile ilişkisi içine ölçülmesi ve ayarlanması gerekir eserler ayrımcılığı sağlamak. BiFC yöntemin bir diğer dezavantajı, proteinlerin etkileşimleri aynı zamanda, nispeten büyük floresan etiketler ile sterik olarak engellenmiş olabilir olmasıdır.
Diğer bitkilerde, Agrobacterium-aracılı transformasyon uygulanması (örneğin, Arabidopsis) Bununla birlikte, izole edilmiş Arabidopsis protoplastlara ya da bir partikül tabancası kullanılarak hücrelerini dönüştürmek için ya doğrudan plasmid DNA'nın dönüştürmek mümkündür sınırlıdır. Bununla birlikte, plasmid DNA son derece konsantre edildi ve protoplast dönüşümü için mümkün olduğu kadar saf olmalıdır, çünkü bir MAXI Kiti kullanılarak izole edilmelidir. Biz OBS başka bir sorundolayı, hedef proteinlerin yüksek ekspresyon için erved sitosolde spesifik çekiş mitokondriyal membran proteinleri ile çalışan, özellikle oldu. Bu sorun, soğan hücre biyolistik transformasyonu ile aşılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz yazının eleştirel okuma için yararlı tartışmalar ve Chris Carrie için Jürgen Soll teşekkür etmek istiyorum. Bu proje DFG ve Fonds der Chemischen Industrie (hibe numaraları SFB 1035, SS proje A04 ve RS 187/22 yapın) tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3',5'-Dimethoxy-4'-hydroxyacetophenone | Sigma-Aldrich | D134406 | Acetosyringone |
| Cellulase, Onozuka-R10 | Serva | 16419 | from Trichoderma viridae |
| Macerozyme R-10 | Serva | 28302 | from Rhizopus sp. |
| GATEWAY, BP Clonase II, Enzyme Kit | Invitrogen | 11789-(020) | |
| GATEWAY, LR Clonase II, Enzyme Kit | Invitrogen | 11791-(020) | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609-250 | |
| pDEST-GWVYNE | Invitrogen | Gateway-cloning | |
| pDEST-VYNE(R)GW | Invitrogen | Gateway-cloning | |
| pDEST-SCYCE(R)GW | Invitrogen | Gateway-cloning |
References
- Citovsky, V., et al. Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta. J. Mol. Biol. 362, 1120-1131 (2006).
- Schutze, K., Harter, K., Chaban, C. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells. Methods Mol. Biol. 479, 189-202 (2009).
- Weinthal, D., Tzfira, T. Imaging protein-protein interactions in plant cells by bimolecular fluorescence complementation assay. Trends Plant Sci. 14, 59-63 (2009).
- Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. The analysis of protein-protein interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation. Plant Physiol. 145, 1090-1099 (2007).
- Ohad, N., Yalovsky, S. Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants. Methods Mol. Biol. 655, 347-358 (2010).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Lee, L. Y., et al. Screening a cDNA library for protein-protein interactions directly in planta. Plant Cell. 24, 1746-1759 (2012).
- McFarlane, H. E., Shin, J. J., Bird, D. A., Samuels, A. L. Arabidopsis ABCG transporters, which are required for export of diverse cuticular lipids, dimerize in different combinations. Plant Cell. 22, 3066-3075 (2010).
- Dunschede, B., Bals, T., Funke, S., Schunemann, D. Interaction studies between the chloroplast signal recognition particle subunit cpSRP43 and the full-length translocase Alb3 reveal a membrane-embedded binding region in Alb3 protein. J. Biol. Chem. 286, 35187-35195 (2011).
- Gehl, C., Waadt, R., Kudla, J., Mendel, R. R., Hansch, R. New GATEWAY vectors for high throughput analyses of protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation. Mol. Plant. 2, 1051-1058 (2009).
- Qbadou, S., et al. The molecular chaperone Hsp90 delivers precursor proteins to the chloroplast import receptor Toc64. EMBO J. 25, 1836-1847 (2006).
- Schweiger, R., Muller, N. C., Schmitt, M. J., Soll, J., Schwenkert, S. AtTPR7 is a chaperone docking protein of the Sec translocon in Arabidopsis. J. Cell Sci. , (2012).
- Schweiger, R., S, S. AtTPR7 as part of the Arabidopsis Sec post-translocon. Plant Signal Behav. 8, (2013).
- Nelson, B. K., Cai, X., Nebenfuhr, A. A multicolored set of in vivo organelle markers for co-localization studies in Arabidopsis and other plants. Plant J. 51, 1126-1136 (2007).
- Kerppola, T. K. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis as a probe of protein interactions in living cells. Annu. Rev. Biophys. 37, 465-487 (2008).
- Koop, H. U., et al. Integration of foreign sequences into the tobacco plastome via polyethylene glycol-mediated protoplast transformation. Planta. 199, 193-201 (1996).
